Embed Size (px)
Citation preview
Η δομή του DNA.
H αντιγραφή του γενετικού υλικού.
Α. Ηλιόπουλος Καθηγητής Βιολογίας & Γενετικής
Δομή του μαθήματος
• Δομή του νουκλεοτιδίου
• Σύνθεση πολυ-νουκλεοτιδικών αλυσίδων
• Οργάνωση των πολυνουκλεοτιδικών αλυσίδων
στο DNA
• Αντιγραφή του DNA
• Εφαρμογή του μηχανισμού αντιγραφής στη
τεχνολογία PCR
DNA: Το μακρομόριο που περιέχει τις
μεταβιβαζόμενες γενετικές πληροφορίες οι οποίες, σε
αλληλοεξάρτηση με το περιβάλλον, καθορίζουν τα
γνωρίσματα ενός οργανισμού (φαινότυπο).
Το νουκλεοτίδιο είναι η βασική μονάδα του DNA
Δομή του νουκλεοτιδίου
N-γλυκοσυλικός δεσμός Phoebus Aaron Theodore Levene,
1929
Cν (H2O)ν
Δομή του νουκλεοτιδίου
Δομή του νουκλεοτιδίου
νουκλεοσίδιο
Ονοματολογία
Χωροπληρωτικό μοντέλο Δομικός χημικός τύπος
Δισδιάστατη vs Τρισδιάστατη δομή του νουκλεοτιδίου
Λειτουργίες των νουκλεοτιδίων πέρα του δομικού τους ρόλου
Στα μόρια DNA τα νουκλεοτίδια συνδέονται μεταξύ
τους με ομοιοπολικούς φωσφοδιεστερικούς
δεσμούς
Στα μόρια DNA τα νουκλεοτίδια συνδέονται μεταξύ
τους με ομοιοπολικούς φωσφοδιεστερικούς
δεσμούς
Οι πολυνουκλεοτιδικές αλυσίδες
χαρακτηρίζονται από:
δομική πολικότητα
(οργάνωση)
Αρνητικό φορτίο
Άτομα με δυνατότητα
σχηματισμού «δεσμών
υδρογόνου»: αλληλεπιδράσεις
με μόρια RNA, DNA,
πρωτεϊνών.
Οργάνωση των πολυνουκλεοτιδικών αλυσίδων
στο DNA Δεσμοί σε μόρια DNA:
• ομοιοπολικοί φωσφοδιεστερικοί • υδρογόνου
Σημασία της συμπληρωματικότητας
των βάσεων
• Κάθε έλικα του DNA μπορεί να αποτελέσει το καλούπι (οδηγίες) για τη σύνθεση ενός νέου κλώνου που θα είναι ταυτόσημος με τη συμπληρωματική της έλικα.
• Έτσι, κάθε μόριο DNA καθοδηγεί την ίδια του την αντιγραφή.
• Η συμπληρωματικότητα των βάσεων χρησιμοποιείται για τη σύνθεση μονόκλωνης αλυσίδας RNA (μεταγραφή).
Οργάνωση των πολυνουκλεοτιδικών
αλυσίδων στο DNA με αντι-παράλληλη
διάταξη
O
P
O - CH2 P Ο
O - CH2 P Ο
O
O
O
P
O - CH2 Ο
O - CH2 P Ο
O
O - CH2
P Ο
O
Ο
O - CH2
P Ο
Ο
5’
5’
3’
3’
O
O
O
…
Θα μπορούσαν οι κλώνοι να είναι παράλληλοι?
ΟΧΙ! Κλώνοι είναι αντιπαράλληλοι γιατί μόνο
D-ισομερή νουκλεοτιδίων υπάρχουν στην φύση!
Σχηματίζει δεξιόστροφη έλικα.
Αντιπαράλληλες αλυσίδες.
Περίπου 10 βάσεις (base
pairs bp) ανά στροφή έλικας.
Μία στροφή της έλικας είναι
34 Å.
Οι βάσεις διατάσσονται στο
εσωτερικό, οι φωσφορικές
ομάδες στο εξωτερικό της
έλικας.
Περίληψη δομής DNA
Τρισδιάστατη δομή και σταθερότητα DNA:
1. Δεσμοί υδρογόνου
Τρισδιάστατη δομή και σταθερότητα DNA:
2. Δεσμοί Van der Waals – πλήρωση χώρου
Τρισδιάστατη δομή και σταθερότητα DNA:
2. Δεσμοί Van der Waals – πλήρωση χώρου
Τρισδιάστατη δομή και σταθερότητα DNA:
3. Δεσμοί υδρογόνου μεταξύ βάσεων σε
παράλληλα επίπεδα
Πλεονεκτήματα της διπλής
έλικας
• Σταθερότητα: προστατεύει τις βάσεις από
προσβολή από υδατοδιαλυτά μόρια ή/και από
μόρια H2O.
• Παρέχει ευκολία στον μηχανισμό αντιγραφής.
Αποδιάταξη του DNA
Αποδιάταξη του DNA
H θερμοκρασία στην οποία το ½ του δείγματος DNA έχει
αποδιαταχθεί ονομάζεται «θερμοκρασία αποδιάταξης»
(melting temperature (Tm)
Προφιλ αποδιάταξης DNA
DS
SS
SS
Ab260
Tm
Temperature
Το προφιλ αποδιάταξης μπορεί να διαφοροποιήσει δίκλωνο
(double stranded) από μονόκλωνο (single stranded) DNA
Προφιλ αποδιάταξης DNA
Το προφιλ αποδιάταξης μπορεί να διαφοροποιήσει μόρια DNA με
διαφορετικό ποσοστό G-C και A-T.
• Περιοχές πλούσιες σε A═T αποδιατάσσονται πρώτα (χαμηλή Tm)
• Περιοχές πλούσιες σε G≡C αποδιατάσσονται τελευταία (υψηλή Tm)
DS
SS
GC rich DNA
AT rich DNA
GC/AT DNA
Tm1 Tm2 Tm3
Δομή του μαθήματος
• Δομή του νουκλεοτιδίου
• Σύνθεση πολύ-νουκλεοτιδικών αλυσίδων
• Οργάνωση των πολυνουκλεοτιδικών αλυσίδων
στο DNA
• Αντιγραφή του DNA
• Εφαρμογή του μηχανισμού αντιγραφής στη
τεχνολογία PCR
Ποιός είναι ο ρόλος του DNA?
Πως μεταβιβάζεται με πιστότητα η γενετική πληροφορία?
Κάθε κλώνος του DNA παίζει το ρόλο εκμαγείου για την
σύνθεση ενός καινούργιου κλώνου.
Κάθε κλώνος του DNA παίζει το ρόλο εκμαγείου για την
σύνθεση ενός καινούργιου κλώνου.
C – G A -T
Συμπληρωματικότητα Βάσεων:
Η αντιγραφή του DNA είναι ημισυντηρητική
Αντιγραφή στο E.coli
• Κυκλικό DNA περίπου 4.6x106 bp
• H αντιγραφή αρχίζει στην (1) αφετηρία αντιγραφής (origin of replication : OriC)
• H αντιγραφή κινείται προς τις 2 κατευθύνσεις μέχρι να συναντηθούν (θέση τερματισμού - termination site)
• H αντιγραφή επιτυγχάνεται μέσω μιας πρωτεϊνικής μηχανής (replisome).
• H διχάλα της αντιγραφής κινείται 1000 bp/sec – έτσι το χρωμόσωμα του E.coli αντιγράφεται σε 38 min = 2280 s.
Αντιγραφή στο E.coli
• Κυκλικό DNA περίπου 4.6x106 bp
• H αντιγραφή αρχίζει στην (1) αφετηρία αντιγραφής (origin of replication : OriC)
• H αντιγραφή κινείται προς τις 2 κατευθύνσεις μέχρι να συναντηθούν (θέση τερματισμού - termination site)
• H αντιγραφή επιτυγχάνεται μέσω μιας πρωτεϊνικής μηχανής (replisome).
• H διχάλα της αντιγραφής κινείται 1000 bp/sec – έτσι το χρωμόσωμα του E.coli αντιγράφεται σε 38 min = 2280 s.
• Λαμβάνει χώρα στο κυτταρόπλασμα
• Η διαδικασία διακρίνεται σε έναρξη (initiation), επιμήκυνση (elongation) και τερματισμό (termination)
• Πρωτεϊνικά σύμπλοκα «καταλύουν» κάθε τμήμα της διαδικασίας.
Αντιγραφή στο E.coli
• Λαμβάνει χώρα στον πυρήνα
• Η διαδικασία διακρίνεται σε έναρξη (initiation), επιμήκυνση (elongation) και τερματισμό (termination)
• Πρωτεϊνικά σύμπλοκα «καταλύουν» κάθε τμήμα της διαδικασίας
• Πολλαπλά σημεία έναρξης της αντιγραφής
Αντιγραφή στα ευκαρυωτικά
κύτταρα
Η αντιγραφή στο ευκαρυωτικό κύτταρο ξεκινάει από
πολλαπλές ‘αφετηρίες αντιγραφής’ (origins of replication)
Κάθε κλώνος του DNA παίζει το ρόλο εκμαγείου για την
σύνθεση ενός καινούργιου κλώνου.
• εκκινητής
• dNTPs
• εκμαγείο
• πολυμεράση
• Κατεύθυνση
αντιγραφής 5’ 3’
Μερικές από τις πρωτεΐνες που ρυθμίζουν την διαδικασία
της αντιγραφής στα ευκαρυωτικά κύτταρα
DNA replication: a summary
Μερικές από τις πρωτεϊνες που ρυθμίζουν την διαδικασία
της αντιγραφής
• Στον καθυστερημένο κλώνο, η κίνηση του ενζύμου γίνεται προς
αντίστροφη κατεύθυνση από την κατεύθυνση ξεδιπλώματος.
• Επομένως η αντιγραφή γίνεται τμηματικά (~1000): Okazaki
fragments
• Η DNA Pol απομακρύνει τον εκκινητή RNA
• DNA λιγκάση συνδέει τα τμήματα Okazaki
DNA replication: a summary
a: εναρκτήρια (πριμάση)
d: Επιμήκυνση και επιδιόρθωση
e: Επιμήκυνση και επιδιόρθωση (μύκητες)
b: Επιδιόρθωση
g: Αντιγραφή μιτοχονδριακού DNΑ
Οι ευκαρυωτικές DNA πολυμεράσες
Το πρόβλημα της αντιγραφής στα άκρα των χρωμοσωμάτων
Το πρόβλημα της αντιγραφής στα άκρα των χρωμοσωμάτων
Το πρόβλημα της αντιγραφής στα άκρα των χρωμοσωμάτων
Tελομερή και τελομεράση
GGGGTTA
Το πρόβλημα της αντιγραφής στα άκρα των χρωμοσωμάτων
λύνεται από τις τελομεράσες…
Τα τρία στοιχεία αλληλουχιών που είναι απαραίτητα
για την σωστή αντιγραφή του DNA στα χρωμοσώματα.
Δομή του μαθήματος
• Δομή του νουκλεοτιδίου
• Σύνθεση πολύ-νουκλεοτιδικών αλυσίδων
• Οργάνωση των πολυνουκλεοτιδικών αλυσίδων
στο DNA
• Αντιγραφή του DNA
• Εφαρμογή του μηχανισμού αντιγραφής στη
τεχνολογία PCR
Melting
94 oC
Tem
per
atu
re
100
0
50
T i m e
5’ 3’
3’ 5’
Melting
94 oC
Tem
per
atu
re
100
0
50
T i m e
3’ 5’
5’ 3’
Heat
Melting
94 oC Annealing
Primers
50 oC
Extension
72 oC T
emp
erat
ure
100
0
50
T i m e
3’ 5’
5’ 3’ 5’
5’
Melting
94 oC
Melting
94 oC
Melting
94 oC Annealing
Primers
50 oC
Extension
72 oC T
emp
erat
ure
100
0
50
T i m e
30x
3’ 5’
5’ 3’
Heat
Heat
5’
5’
5’
Melting
94 oC
Melting
94 oC Annealing
Primers
50 oC
Extension
72 oC T
emp
erat
ure
100
0
50
T i m e
30x
3’ 5’
5’ 3’ 5’
5’
5’
5’
5’
5’
Melting
94 oC
Melting
94 oC Annealing
Primers
50 oC
Extension
72 oC T
emp
erat
ure
100
0
50
T i m e
30x
3’ 5’
5’ 3’ 5’
5’
5’
5’
5’
5’
Heat
Heat
Melting
94 oC
Melting
94 oC Annealing
Primers
50 oC
Extension
72 oC T
emp
erat
ure
100
0
50
T i m e
30x
3’ 5’
5’ 3’ 5’
5’
5’
5’
5’
5’
5’
5’
5’
5’
Fragments of
defined length
Melting
94 oC
Melting
94 oC Annealing
Primers
50 oC
Extension
72 oC T
emp
erat
ure
100
0
50
T i m e
30x
3’ 5’
5’ 3’ 5’
5’
5’
5’
5’
5’
5’
5’
5’
5’
DNA Between The Primers Doubles With
Each Thermal Cycle
0
Cycles
Number
1
3
8
2
4
1
2
4
16
5
32
6
64
Περισσότεροι κύκλοι= περισσότερο DNA
Number of cycles
0 10 15 20 25 30
Size
Marker
