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血液 DNA 提取及 PCR 扩增

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分子流行病学实验. 血液 DNA 提取及 PCR 扩增. DNA 提取. 经典 DNA 提取法 1. 在弱碱和螯合剂的条件下行组织匀浆,溶解胞、核膜。 2. 去垢剂( SDS )与蛋白酶消化蛋白,分离 DNA 。 3. 有机溶剂(酚与氯仿)去除蛋白,萃取 DNA 。 4. 乙醇与盐类沉淀 DNA 。. DNA 提取 基本步骤. 1. 样品处理:分离细胞,低渗盐水( 0.2% )或细胞悬浮液。( 10mmol/L Tris-HClpH8.0,0.1mol/LEDTA,20mg/ml 胰 RNA 酶 ,0.5%SDS )。 - PowerPoint PPT Presentation

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Page 1: 血液 DNA 提取及 PCR 扩增

分子流行病学实验

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经典 DNA提取法1.在弱碱和螯合剂的条件下行组织匀浆,溶解胞、核膜。

2.去垢剂( SDS)与蛋白酶消化蛋白,分离DNA。

3.有机溶剂(酚与氯仿)去除蛋白,萃取DNA。

4.乙醇与盐类沉淀 DNA。

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1.样品处理:分离细胞,低渗盐水( 0.2%)或细胞悬浮液。( 10mmol/L Tris-HClpH8.0,0.1mol/LEDTA,20mg/ml 胰RNA酶 ,0.5%SDS)。

2.消 化: TNE缓冲液 ( 15mmol/L Tris-HClpH8.0,15mmol/LEDTA, 5mmol/L NaCl) 4ml, 10%SDS0.45 ml , 10mg/ml蛋白酶 K (终浓度, 100μg/ml),混匀, 50 3h℃ , 45℃ 过夜。

3.DNA 分离:等体积饱和酚;等体积饱和酚 / 氯仿 / 异戊醇( 25/24/1);氯仿 / 异戊醇( 24/1)。 500r/min,10min。

4.沉淀 DNA: 1/10体积 3mol/L NaAc, 2 倍无水乙醇 -70%乙醇。离心,挥干。可加醋酸钠(终浓度: 0.3mol/L)并低温。10-20分钟。

5.溶解 DNA:适量 TE( 10mmol/L Tris-HClpH8.0,1mmol/LEDTA ) , 长时间。

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1.Chelex-100提取 DNA基本成分:含有亚氨基二乙酸盐离子的苯乙烯 - 二乙基苯 共聚

物。基本方法:沉淀细胞; 5%试剂 200μl; 56 0.5h℃ 以上;

100 8min℃ ;剧烈震荡;离心上清。注意:离心彻底。2.硅珠法提取 DNA基本成分: GuSCN(硫氰酸胍,蛋白变性),二氧化硅(硅珠,

核酸吸附)。基本方法:血液( 1-4μl) TES( 100μl) SDS( 20μl)煮沸

5min; 300μl GuSCN溶液与 20μl硅珠液保温 15 min;离心后加 GuSCN溶液;离心加乙醇漂洗; TES56 10 min℃ 离心取上清。

3.直接煮沸法 100 10min℃

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1.如消化不完全,可用 TNE溶解后再重提。2.消化时间宜长不宜短。3.操作轻柔。4.混匀要充分。5.挥干不宜过度。

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1.凝胶电泳半定量分析法:参照标准分析。2.分光光度计分析基本原理: 260nm波长为核酸吸收峰, 1OD值为50μg/μl双链核酸( 40μg/μl单链核酸),根据OD值可计算 DNA含量。

计算方法: DNA浓度( μg/μl) =OD×50×稀释倍数 ÷1000

例: 40倍稀释液, OD值为 1.7 DNA浓度 =1.7×50×40÷1000=3.4μg/μl 280nm波长为蛋白吸收峰, 260/280比检测核酸纯

度。 1.6-1.8(八) DNA纯化

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聚合酶链式反应( polymerase chain reaction , PCR):在模板DNA 和 4 种脱氧核苷酸存在的条件下,由一对特异性引物限定的靶 DNA片段,经DNA聚合酶催化的体外合成过程。 100万倍,由数 pg- 数 μg。

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1.变性( denaturation) : 在加热的条件下( 94℃ 左右),模板 DNA配对碱基间氢键断裂,DNA双链变成单链。

2.退火 / 复性( annealing):在降温的条件下( 55 -62℃ ℃ ),引物与其互补的模板 DNA片段(靶片段的側翼序列)结合形成杂交双链。

3.延伸( extension):在合适的温度下( 68 -72℃ ℃ ),经 DNA聚合酶催化 4 种脱氧核苷酸,由引物的 3ˊ 端为起始点,从 5ˊ 向 3ˊ 端延伸,合成新的与 DNA 靶片段互补的 DNA链。

每反应一个循环,靶 DNA片段数量增加一倍,并以指数的量堆积,经 30余次循环,产物量可达到2×105-7个拷贝。几个循环后扩增产物作为模板。

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标准体系为 50-100μl,常用 20μl。 DNA模板 10-50ng DNA聚合酶 0.5-1.0U 一对引物 0.1-0.5μmol/L 4 种脱氧核苷酸 40μmol/L 缓冲液 反应条件: 95 4-5min,94 50s/55 -℃ ℃ ℃62 30-60s/72 30-60s,30℃ ℃ 各循环后72 5-10min℃ 。

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1. 熟练掌握从外周血快速提取基因组 DNA 的方法;

2. 理解 PCR 的原理,了解 PCR 操作过程;3. 熟悉琼脂糖凝胶电泳的实验过程。

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KI0.9%NaCl异丙醇乙醇Eppendorf 管微量加样器等

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外周血基因组DNA的提取 1 、取抗凝血 100μl2 、加无菌重蒸水 500μl ; 10 000r/ 分钟离心 3 分钟3 、加 20μl 5mol/L KI ,旋涡振荡 30 秒 ;4 、 0.9%NaCl 100μl, 振荡 30 秒; 10 000r/ 分钟离心

5 分钟5 、吸上清 100μl 加异丙醇 100μl ,轻轻混匀, 10

000r/ 分钟离心 5 分钟6 、加冷无水乙醇 500μl , 10 000r/ 分钟离心 5 分钟7 、弃去无水乙醇,自然干燥; 50μl 无菌重蒸水,混匀

溶解备用。

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( 1 )制作 PCR 反应 MIX( 2 ) PCR 循环扩增程序: 94℃ 30s → 65

℃ 30s → 72℃ 60s ,循环 35 次,最后在72℃ 保温 10min 。

( 3 )结束反应, PCR 产物放置于 4℃ 待电泳检测或 -20℃ 长期保存。

( 4 ) PCR 的电泳检测:直接取 10μl 电泳检测。

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取 10μl 的 PCR 产物与 DNA Ladder Marker 进行琼脂糖凝胶电泳分析,分析结果采用紫外灯照相。