β-ESTRADIOL PELO PROCESSO DE OZONIZAÇÃO Daniele Maia …livros01.livrosgratis.com.br/cp013052.pdf · desregulador endÓcrino 17β-estradiol pelo processo de ozonizaÇÃo daniele

DEGRADAÇÃO E REMOÇÃO DA ATIVIDADE ESTROGÊNICA DO

DESREGULADOR ENDÓCRINO 17β-ESTRADIOL PELO PROCESSO DE

OZONIZAÇÃO

Daniele Maia Bila

TESE SUBMETIDA AO CORPO DOCENTE DA COORDENAÇÃO DOS

PROGRAMAS DE PÓS-GRADUAÇÃO DE ENGENHARIA DA UNIVERSIDADE

FEDERAL DO RIO DE JANEIRO COMO PARTE DOS REQUISITOS

NECESSÁRIOS PARA A OBTENÇÃO DO GRAU DE DOUTOR EM CIÊNCIAS

EM ENGENHARIA QUÍMICA.

Aprovada por:

________________________________________________

Profª Márcia Walquíria de Carvalho Dezotti, D.Sc.

________________________________________________ Prof. Antonio Filipe Falcão de Montalvão, D.Sc.

________________________________________________ Prof. Geraldo Lippel Sant'Anna Junior, Dr.Ing.

________________________________________________ Profª Juacyara Carbonelli Campos, D.Sc.

________________________________________________ Prof. Antonio Carlos Silva Costa Teixeira, D.Sc.

________________________________________________ Profª Leda dos Reis Castilho, Dr.-Ing.

RIO DE JANEIRO, RJ - BRASIL

JULHO DE 2005

i

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BILA, DANIELE MAIA

Degradação e Remoção da Atividade Estro-

gênica do Desregulador Endócrino 17β-Estradi-

ol pelo Processo de Ozonização [Rio de Janeiro]

2005

XIX, 281 p. 29,7 cm (COPPE/UFRJ, D.Sc.,

Engenharia Química, 2005)

Tese - Universidade Federal do Rio de

Janeiro, COPPE

1. Ozonização

2. Desreguladores Endócrinos

3. Atividade Estrogênica

I. COPPE/UFRJ II. Título ( série )

ii

Como muito amor dedico este trabalho ao

João Marcello, Maria Clara, meus pais e

sogros.

iii

AGRADECIMENTOS

À minha orientadora professora Márcia Dezotti por seu empenho,

companheirismo e amizade, principalmente nos momentos em que, algumas vezes,

acreditou mais em meu trabalho do que eu mesma.

Ao orientador e amigo Antonio Filipe Montalvão pelo apoio, principalmente na

planta de ozonização e que sempre esteve disponível em todas as etapas desse estudo.

Ao amigo professor Geraldo Lippel Sant’Anna Jr. pelos conselhos e críticas

construtivas nestes quase 6 anos de aprendizado.

Aos professores Juacyara Carbonelli Campos, Antonio Carlos Silva Costa

Teixeira e Leda dos Reis Castilho por terem aceito fazer parte da banca de tese.

Ao professor John P. Sumpter da Universidade de Brunel, Uxbrige, UK pela

cepa de Saccharomyces cerevisiae para os ensaios de YES.

À professora Elisabetta Agradi e seus alunos Andre, Simone, Sara, Frederica,

Elisa, Daniela e Elisa do Instituto de Ciências Farmacológicas da Universidade de

Milão pela paciência e ajuda nos procedimentos dos ensaios de atividade estrogênica.

Ao CNPq pela concessão da bolsa de Doutorado que possibilitou o

desenvolvimento deste estudo e apresentações em congressos nacionais e internacionais.

Aos professores Lina Zingali e Robson do CCS/UFRJ pelo auxílio na leitura das

microplacas dos ensaios YES.

Aos professores Francisco Radler e Débora de Azevedo e a técnica Ana Paula do

IQ/UFRJ pelas orientações nas análises de GC/EM.

Aos amigos Herval, Ana Karla, Rossano, Cândida, Ariane, Leandro, Ana

Carolina e Lívia do Laboratório de Bioprocessos do PEQ/COPPE/UFRJ pela ajuda

imprescindível nos ensaios de atividade estrogênica.

Aos grandes amigos Simone, Milena, Alessandra, Jackson, Tatiana, Thaís,

Carolina, Amanda, Eduardo Bessa, Alexandre Torres, Nilson e Antônio do Laboratório

de Poluição de Águas do PEQ/COPPE/UFRJ pelo companheirismo, amizade e

incentivo em todas as horas.

Aos meus pais Cremilto e Regina e aos meus irmãos Alisson e Heriston pelo

constante apoio e incentivo em mais esta etapa da minha vida.

Aos meus sogros Rogério e Glória pelo apoio.

À Maria Clara e João Marcello pela paciência e compreensão pelos meses em

que levei trabalho para casa.

iv

Resumo da Tese apresentada à COPPE/UFRJ como parte dos requisitos necessários

para a obtenção do grau de Doutor em Ciências (D.Sc.)

DEGRADAÇÃO E REMOÇÃO DA ATIVIDADE ESTROGÊNICA DO

DESREGULADOR ENDÓCRINO 17β-ESTRADIOL PELO PROCESSO DE

OZONIZAÇÃO

Daniele Maia Bila

Julho/2005

Orientadores: Márcia Walquíria de Carvalho Dezotti

Antonio Filipe Falcão de Montalvão

Programa: Engenharia Química

Atualmente, há um crescente interesse de grupos científicos em micropoluentes

presentes no meio ambiente que podem interferir no sistema endócrino, afetando a

saúde e a reprodução de humanos e animais. Essas substâncias são conhecidas como

“Desreguladores Endócrinos (DE)”. Várias são as classes de substâncias classificadas

como DE, tais como, os pesticidas, substâncias usadas e produzidas nas indústrias

químicas e estrogênios naturais e sintéticos. Os DE podem ser encontrados em esgoto

doméstico, efluentes de estações de tratamento de esgoto, águas naturais e potável.

Neste estudo, investigou-se a ozonização do 17β-estradiol. Foram estudadas a influência

do pH e diferentes dosagens de ozônio na degradação do 17β-estradiol, na formação de

seus subprodutos e na remoção da atividade estrogênica. A ozonização mostrou-se um

eficiente processo na remoção do 17β-estradiol, alcançando-se altas remoções (>99,1%)

com baixos consumos de ozônio (1,0 mg.L-1). Contudo, em pH 7 e 11, a atividade

estrogênica não foi totalmente removida, mesmo com aumento da dosagem de ozônio,

indicando que provavelmente, subprodutos estrogênicos foram formados.

v

Abstract of Thesis presented to COPPE/UFRJ as a partial fulfillment of the

requirements for the degree of Doctor of Science (D.Sc.)

DEGRADATION AND THE ESTROGENIC ACTIVITY REMOVAL OF THE

ENDOCRINE DISRUPTER CHEMICAL 17β-ESTRADIOL BY OZONATION

PROCESS

Daniele Maia Bila

July/2005

Orientadores: Márcia Walquíria de Carvalho Dezotti

Antonio Filipe Falcão de Montalvão

Department: Chemical Engineering

There is an increasing interest in micropollutants in the environment that can

interfere in the endocrine system, affecting health, growth and reproduction of animals

and humans. These substances are known as “Endocrine Disrupters Chemicals” (EDCs).

There are numerous classified to be as ED, such as pesticides, chemicals used and

produced in chemical industries and natural and synthetic estrogens. ED can be found in

domestic sewage, domestic wastewater treatment plant effluent, natural and potable

waters. This work investigates the influence of pH and ozone dosage in the degradation

of 17β-estradiol and the formation of byproducts. Ozonation proved to be a highly

efficient process for the removal of 17β-estradiol (>99.1 % of degradation) with low

levels of ozone consumption (1.0 mg.L-1). However, at pH’s 7 and 11, the estrogenic

activity was not completely removed, even for higher ozone dosages, which is an

indication that estrogenic byproducts have probably been formed.

vi

ÍNDICE GERAL

I. INTRODUÇÃO E OBJETIVOS...................................................................... 1 II. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA........................................................................ 6

II.1. DESREGULADORES ENDÓCRINOS.................................................. 6 II.1.1 Definição - O que é um Desregulador Endócrino?............................... 7 II.1.2. Histórico e Estado Atual do Conhecimento......................................... 9 II.1.3. Estratégias Internacionais para Avaliar o Problema dos DE............... 11 II.1.4. Substâncias Classificadas como Desreguladores Endócrinos............. 13 II.1.5. Meios de Exposição aos Desreguladores Endócrinos......................... 19 II.1.6. Ocorrência de Desreguladores Endócrinos no Meio Ambiente.......... 22 II.1.7. Mecanismos de Ação dos Desreguladores Endócrinos....................... 24

II.1.7.1. Sistema Endócrino....................................................................... 24 II.1.7.2. Os diferentes mecanismos de ação dos DE.................................. 27

II.1.7.2.a. Via receptores de hormônios esteróides............................... 27 II.1.7.2.b. Mecanismos independentes dos receptores hormonais........ 34

II.1.7.3. Atividade estrogênica................................................................... 35 II.1.7.4. Relação estrutura-atividade biológica.......................................... 35 II.1.7.5. Efeitos de combinação aditivos................................................... 37

II.1.8. Efeitos Causados pela Exposição aos Desreguladores Endócrinos..... 37 II.1.8.1. Efeitos relatados em animais silvestres e de laboratório............. 38 II.1.8.2. Efeitos relatados em humanos……………………………….… 44 II.1.8.3. Efeitos em fetos ou espécies jovens…………………………… 46

II.1.9. Estrogênios Naturais e Sintéticos………………………………….... 47 II.1.9.1. Hormônios sexuais……………………………………………... 47 II.1.9.2. Propriedades físico-químicas dos estrogênios............................. 49 II.1.9.3. Uso e produção............................................................................ 51 II.1.9.4. Ocorrência e destino no meio ambiente....................................... 52

II.1.9.4.a. Excreção de estrogênios natural e sintético e seus metabólitos............................................................................................. 52 II.1.9.4.b. Estrogênios no esgoto doméstico e efluente de ETE: Destino e remoção dos estrogênios nas ETE......................................... 52 II.1.9.4.c. Estrogênios em águas naturais.............................................. 57 II.1.9.4.d. Estrogênios em detritos de animais....................................... 57

II.1.9.5. Estudos relevantes da avaliação dos efeitos de potencial do 17β-estradiol.............................................................................. 58

II.2. MÉTODOS DE ENSAIOS USADOS PARA AVALIAR OS DE......... 59 II.2.1. Ensaios in vivo..................................................................................... 61

II.2.1.1. Ensaios em roedores.................................................................... 61 II.2.1.2. Ensaio da indução da síntese de vitelogenina (VTG).................. 62

II.2.2. Ensaios in vitro.................................................................................... 64 II.2.2.1. Ensaio de ligação competitiva nos receptores dos hormônios

esteróides.................................................................................... 65 II.2.2.2. Ensaios de proliferação celular.................................................... 66 II.2.2.3. Ensaios de gene repórter recombinante........................................ 67

II.2.2.3.a. Ensaios gene repórter baseado em células de mamíferos...... 68 II.2.2.3.b. Ensaios gene repórter baseado em células de levedura......... 69

II.2.3. Sistemas de análises............................................................................ 75

vii

II.3 FÁRMACOS RESIDUAIS........................................................................ 77 II.3.1. Ocorrência de Fármacos no Meio Ambiente....................................... 78

II.3.1.1. Fármacos monitorados no Brasil................................................. 81 II.3.2. Aplicação e Destino dos Fármacos no Meio Ambiente....................... 83

II.3.2.1. Degradação de fármacos no meio ambiente................................ 86 II.3.3. Possíveis Efeitos da Presença de Fármacos ao Meio Ambiente.......... 88 II.3.4. Avaliação do Impacto Ambiental de Fármacos em Ambientes

Aquáticos............................................................................................ 91 II.4. MÉTODOS ANALÍTICOS UTILIZADOS NA DETERMINAÇÃO

DE FÁRMACOS E ESTROGÊNIOS EM MATRIZES AMBIENTAIS............................................................................................. 93

II.5. A OZONIZAÇÃO E OS PROCESSOS OXIDATIVOS AVANÇADOS............................................................................................. 98

II.5.1. Introdução............................................................................................ 98 II.5.2. Geração do Ozônio e Propriedades Químicas e Físicas....................... 100 II.5.3. Instabilidade do Ozônio na Água......................................................... 101 II.5.4. Aplicações do Ozônio nas Plantas de Tratamento de Água e

Efluentes............................................................................................. 107 II.5.5. Reações de Oxidação Durante a Ozonização....................................... 109 II.5.6. Oxidação de Compostos Orgânicos Durante a Ozonização................. 112

II.5.6.1. Cinética das reações de oxidação durante a ozonização.............. 113 II.5.7. Formação de Subprodutos Indesejáveis na Ozonização...................... 118 II.5.8. Oxidação de Micropoluentes Orgânicos.............................................. 118

II. 5.8.1. Oxidação de desreguladores endócrinos e fármacos.................. 119 II.6. TRATAMENTOS APLICADOS NA REMOÇÃO DE FÁRMACOS

E PERTURBADORES ENDÓCRINOS EM SISTEMAS AQUOSOS................................................................................................... 122

II.6.1. Ozonização de Fármacos...................................................................... 123 II.6.2. Ozonização de Estrogênios.................................................................. 126 II.6.3. Os POA na Remoção de Fármacos e Desreguladores Endócrinos...... 127 II.6.4. Outros Tratamentos Empregados na Remoção de Fármacos e DE...... 129

II.7 SUBPRODUTOS FORMADOS DURANTE A OXIDAÇÃO DE COMPOSTOS ORGÂNICOS................................................................... 133

II.7.1. Introdução............................................................................................ 133 II.7.2. Subprodutos Formados da Oxidação do 17β-Estradiol....................... 135 II.7.3. Metabolismo do 17β-estradiol no corpo.............................................. 142

II.8. REMOÇÃO DA ATIVIDADE ESTROGÊNICA POR PROCESSOS OXIDATIVOS.................................................................... 143

III. MATERIAIS E MÉTODOS.......................................................................... 146

III.1. REAGENTES......................................................................................... 146 III.2. PREPARO DAS SOLUÇÕES DE 17β-ESTRADIOL........................ 147 III.3. EXPERIMENTO DE OZONIZAÇÃO................................................ 147 III.4. METODOLOGIA ANALÍTICA.......................................................... 150

III.4.1. Extração por Fase Sólida (EFS)......................................................... 151 III.4.2. Derivatização...................................................................................... 152 III.4.3. Aparatos e Condições da Cromatografia Gasosa (CG)...................... 153 III.4.4. Aparatos e Condições da Cromatografia Gasosa / Espectrometria

de Massa (CG/EM)............................................................................. 153 III.4.5. Preparação da Curva de Calibração.................................................... 156

viii

III.4.6. Avaliação da Eficiência do Processo de Extração.............................. 156 III.4.7. Avaliação do Limite de Detecção da Metodologia Experimental...... 157 III.4.8. Espectrofotometria no UV................................................ 157 III.4.9. Determinação da Atividade Estrogênica pelo Ensaio YES (YEAST

ESTROGEN SCREEN)............................... 158 III.4.9.1. Ensaio YES................................................................................ 158 III.4.9.2. Cepa de levedura (Saccharomyces cerevisiae) recombinante... 160 III.4.9.3. Preparação do meio de crescimento........................................... 161 III.4.9.4. Cultivo da cepa de levedura de Saccharomyces cerevisiae....... 162 III.4.9.5. Preparação do meio de análise................................................... 162 III.4.9.6. Preparação das amostras para os ensaios YES.......................... 162 III.4.9.7. Procedimento de análise do ensaio YES.................................... 163

III.4.9.7.a. Procedimento de análise YES para amostras sem preparo prévio..................................................................................................... 165 III.4.9.7.b. Procedimento de análise YES para amostras com preparo prévio..................................................................................................... 165

III.4.9.8. Análise dos dados............................................................................ 166 III.5. TESTE DE TOXICIDADE COM Ceriodaphia dúbia......................... 168

IV. RESULTADOS E DISCUSSÃO.................................................................... 169

IV.1. DETERMINAÇÃO DO 17β-ESTRADIOL......................................... 169 IV.2. AVALIAÇÃO DA METODOLOGIA ANALÍTICA UTILIZADA.. 170

IV.2.1. Avaliação da Eficiência do Processo de Extração e Detecção........... 170 IV.2.2. Limite de Detecção............................................................................ 171

IV.3. REMOÇÃO DO 17β-ESTRADIOL NAS MATRIZES INVESTIGADAS........................................................................................ 171

IV.3.1. Remoção do 17β-Estradiol em Solução Aquosa................................ 171 IV.3.2. Remoção do 17β-estradiol em Solução Aquosa e Efluente de ETE.. 178

IV.4. IDENTIFICAÇÃO DOS SUBPRODUTOS FORMADOS NA OZONIZAÇÃO DO 17β-ESTRADIOL.................................................... 180

IV.5. DESAPARECIMENTO DAS BANDAS DE ABSORBÂNCIAS DO 17β-ESTRADIOL APÓS A OZONIZAÇÃO........................................... 186

IV.6. REMOÇÃO DA ATIVIDADE ESTROGÊNICA DO 17β-ESTRADIOL NA OZONIZAÇÃO........................................................... 190

IV.6.1. Ensaio YES........................................................................................ 190 IV.6.2 Atividade Estrogênica da Água Destilada.......................................... 192 IV.6.3. Atividade Estrogênica das Amostras Aquosas de 17β-Estradiol

Ozonizadas.......................................................................................... 194 IV.6.4. Atividade Estrogênica de Possíveis Subprodutos Formados na

Ozonização do 17β-Estradiol............................................................. 206 IV.7. TOXICIDADE CRÔNICA DO 17β-ESTRADIOL............................. 208

V. CONCLUSÕES................................................................................................. 210 VI. REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICA............................................................. 213 ANEXO 1: Sumário das Concentrações Médias ou Faixas de Concentrações de

Desreguladores Endócrinos Detectados no Meio Ambiente.................... 239 ANEXO 2: Sumário das Concentrações Médias ou Faixas Concentrações de

Fármacos Detectados no Meio Ambiente............................................... 246

ix

ANEXO 3: Sumário de Condições de Tratamentos e Resultados Descritos na Literatura.................................................................................................. 253

ANEXO 4: Cromatogramas das Amostras Submetidas à Espectrometria de Massas....................................................................................................... 264

ANEXO 5: Alguns Subprodutos Formados na Ozonização do 17β-Estradiol Identificados na Espectrometria de Massa................................................ 270

ANEXO 6: Espectros de absorbância das amostras aquosas de 17β-estradiol ozonizadas (C17β-estradiol inicial = 50 µg.L-1), com diferentes dosagem de ozônio consumido e valores de pH 3, 7 e 11............................................ 272

ANEXO 7: Atividade estrogênica das amostras aquosas de 17β-estradiol ozonizadas, usadas sem preparo prévio no ensaio YES........................... 275

ANEXO 8: Cromatogramas obtido por CG das amostras aquosas de 17β-estradiol (C17β-estradiol inicial = 10µg.L-1) ozonizadas, preparadas com água ultrapura apirogênica....................................................................... 277

x

ÍNDICE DE TABELAS

Tabela II.1. Seminários, comitês e relatórios de avaliação sobre os DE............... 12 Tabela II.2. Substâncias químicas classificadas como DE.................................... 18 Tabela II.3. Principais funções dos hormônios no corpo humano e as doenças

resultantes da superprodução ou escassez dessas substâncias............... 25 Tabela II.4. Diferentes mecanismos de ação dos DE............................................. 33 Tabela II.5. Efeitos e anomalias atribuídos aos DE............................................... 39 Tabela II.6. Efeitos e anomalias em peixes atribuídos aos DE.............................. 40 Tabela II.7. Potências relativas de algumas substâncias estrogênicas

comparadas com o 17β-estradiol (GAIDO et al., 1997)...................... 48 Tabela II.8. Estrutura química e algumas características dos estrogênios

naturais e sintéticos.............................................................................. 50 Tabela II.9. Propriedades físico-químicas dos estrogênios.................................... 51 Tabela II.10. Excreção diária (µg) per capita de estrogênios por humanos

(JOHNSON et al., 2000)....................................................................... 52 Tabela II.11. Remoções estrogênios monitoradas na ETE da Penha/RJ por

TERNES et al. (1999)........................................................................... 54 Tabela II.12. Sumário de ensaios in vivo e in vitro usados para identificar

substâncias com atividade estrogênica.................................................. 73 Tabela II.13. Algumas vantagens e desvantagens dos ensaios in vitro e in vivo... 74 Tabela II.14. Fármacos e metabólitos monitorados no Brasil por Stumpf et al.

(1999).................................................................................................... 82 Tabela II.15. Remoções de fármacos residuais monitoradas na ETE da

Penha/RJ por Stumpf et al. (1999)........................................................ 83 Tabela II.16. Métodos utilizados na determinação de fármacos em matrizes

aquosas.................................................................................................. 95 Tabela II.17. Métodos usados na determinação de estrogênios em amostras

ambientais.............................................................................................. 96 Tabela II.18. Potenciais de oxi-redução de alguns agentes oxidantes................... 98 Tabela II.19. Constantes das taxas de reação de compostos orgânicos com o

ozônio compiladas HOIGNÉ e BADER (1983a)………....………… 116 Tabela II.20. Constantes das taxas de reação de compostos orgânicos com o

ozônio compiladas de HOIGNÉ e BADER (1983b)………………… 117 Tabela II.21. Constantes das taxas de reação de compostos orgânicos com o

radical HO• compiladas de GLAZE e KANG (1989)……………… 117 Tabela II.22. Constantes das taxas de reação da oxidação de compostos

orgânicos com radicais HO• compiladas de estudos da literatura......... 120 Tabela II.23. Constantes das taxas reação da oxidação de compostos orgânicos

com ozônio compiladas de estudos da literatura................................... 121 Tabela II.24. Intermediários identificados ou propostos para a oxidação do 17β-

estradiol copilados da literatura............................................................ 141 Tabela III.1. Estruturas químicas de algumas substâncias usadas nos ensaios..... 146 Tabela III.2. Características e condições de análise do sistema CG empregado... 155 Tabela III.3. Características e condições de análise do sistema CG/EM

empregado............................................................................................. 155

xi

Tabela IV.1. Porcentagem de recuperação do 17β-estradiol após o processo de EFS........................................................................................................ 170

Tabela IV.2. Parâmetros da composição do efluente de ETE da Ilha do Governador............................................................................................ 178

Tabela IV.3. Possíveis subprodutos formados na ozonização do 17β-estradiol de acordo com as análises de CG/EM................................................... 183

Tabela IV.4. Subprodutos propostos na ozonização do 17β-estradiol em água destilada e em efluente de ETE nos diferentes valores de pH investigados........................................................................................... 186

Tabela IV.5. Valores de EQ-E2 dos extratos das amostras aquosas de 17β-estradiol ozonizadas.............................................................................. 201

Tabela IV.6. Valores de EC50 e PR para os possíveis subprodutos formados na ozonização do 17β-estradiol..................................................................

xii

ÍNDICE DE FIGURAS

Figura II.1. Mecanismo global de ação dos estrogênios. Estrogênio, tal como o 17β-estradiol, regula os processos celulares pela ligação no RE no núcleo celular. O receptor ativado dimeriza e se acopla ao ERE no promotor nos genes alvo iniciando a transcrição genética................. 28

Figura II.2. Representação da estrutura tridimensional do DLH do RE-α com o 17β-estradiol acoplado. (a) monômero com a visualização das α-hélices em vermelho e do 17β-estradiol em azul. (b) Dímero. (Figura retirada de BRZOZOWSKI et al. (1997))............................. 29

Figura II.3. Mecanismos de atuação dos DE (imagem copiada e modificada (http://acpo94.sites.uol.com.br/interferentes_hormonais.htm, acessado em 12/09/2003)................................................................... 31

Figura II.4. Estrutura química do 17β-estradiol.................................................... 48 Figura II.5. Representação esquemática da biosíntese dos estrogênios naturais... 49 Figura II.6. Possíveis rotas de fármacos e estrogênios no meio ambiente (BILA

e DEZOTTI, 2003)............................................................................. 85 Figura II.7. Geração de Ozônio............................................................................. 100 Figura II.8. Esquema de reações do ozônio em solução aquosa. Onde, M =

composto, Moxid = composto oxidado, Si = capturador de radical livre, P = produtos que não catalisam a decomposição do ozônio, R• = radicais livres que catalisam a decomposição do ozônio (figura copiada de HOGNÉ e BADER, 1983)................................... 103

Figura II.9. Mecanismo da reação do ozônio e radicais HO• com solutos (M) em meio aquoso.................................................................................. 112

Figura II.10. Sistema de reator biocatalítico de degradação do 17α-etinilestradiol no qual o MnO2 opera como uma superfície catalítica e os microrganismos oxidantes de Mn2+, re-oxidam e redepositam o Mn2+ no MnO2............................................................ 131

Figura II.11. Mecanismos de reação para a ozonização do fenol proposto por HUANG e SHU (1995)...................................................................... 134

Figura II.12. Mecanismo de degradação do 17β-estradiol pela fotocatálise proposto por OHKO et al. (2002)...................................................... 136

Figura II.13. Estruturas químicas dos compostos ADO e TS................................ 136 Figura II.14. Estruturas químicas do 5,6,7,8-tetrahidro-2-naftol (THN) e 1

etinil-1-ciclohexanol (ECH)............................................................... 137 Figura II.15. Mecanismo de reação proposto por HUBER et al., 2004 para a

ozonização do composto modelo THN.............................................. 138 Figura II.16. Mecanismo de reação proposto por HUBER et al., 2004 para a

ozonização do composto modelo ECH.............................................. 139 Figura II.17. Mecanismo de reação proposto por HUBER et al. (2004) para a

ozonização 17β-estradiol e estrona.................................................... 140 Figura II.18. Lugares da oxidação metabólica do 17β-estradiol pelas enzimas

citocromo P450 NADPH-dependente. Os principais caminhos metabólicos (2-hidroxilação, 16α-hidroxilação e a formação da estrona) são indicados pelas setas pretas............................................ 142

Figura II.19. Os metabólicos 2-hidroxiestradiol e 16α-hidroxiestradiol (estriol). 142 Figura III.1. Esquema da unidade de ozonização................................................. 148

xiii

http://acpo94.sites.uol.com.br/interferentes_hormonais.htm

Figura III.2. Foto das colunas de contato. (A) coluna de acrílico e (B) coluna de vidro................................................................................................... 149

Figura III.3. Foto da unidade de ozonização......................................................... 149 Figura III.4. Esquema da metodologia analítica utilizada..................................... 151 Figura III.5. Foto do sistema de EFS.................................................................... 152 Figura III.6. Esquemas das metodologias analíticas usadas para avaliar a

eficiência do processo de extração..................................................... 154 Figura III.7. Esquemas das metodologias analíticas usadas para avaliar a

eficiência do processo de extração..................................................... 156 Figura III.8. Esquema detalhado da metodologia analítica utilizada na

espectrometria de UV......................................................................... 157 Figura III.9. Esquema do sistema de expressão do estrogênio induzível na

levedura Saccharomyces cerevisiae................................................... 159 Figura III.10. Microfotografia da Saccharomyces cerevisiae............................... 160 Figura III.11. Esquema detalhado da metodologia analítica usada no ensaio

YES.................................................................................................... 164 Figura III.12. Foto da microplaca de 96 poços no início dos ensaios de

atividade estrogênica.......................................................................... 166 Figura IV.1. Cromatograma de uma amostra aquosa com 50µg.L-1 de 17β-

estradiol.............................................................................................. 170 Figura IV.2. Estrutura química do 17β-estradiol................................................... 172 Figura IV.3. Remoções do 17β-estradiol após a ozonização nos valores de pH

3, 7, 11. Concentração inicial de 17β-estradiol de 10 e 50 µg.L-1..... 173 Figura IV.4. Dosagem de ozônio com o tempo em todos os pH

investigado.............. 175 Figura IV.5. Quantidade de 17β-estradiol (C17β-estradiol inicial = 50 µg.L-1)

removida por dosagem de ozônio consumido.................................... 175 Figura IV.6. Remoção do 17β-estradiol (C17β-estradiol inicial = 50 µg.L-1) em

solução aquosa e efluente de ETE pela ozonização........................... 179 Figura IV.7. Estrutura do produto formado da derivatização com BSTFA do

17β-estradiol....................................................................................... 180 Figura IV.8. (A) Espectro de massa (CG/EM) do 17β-estradiol, e (B) o espectro

de massa do Bis-TMS estradiol obtido da biblioteca da NIST.......... 181 Figura IV.9. Representação da atuação do ozônio molecular sobre o anel

fenólico do 17β-estradiol................................................................... 182 Figura IV.10. Espectro de absorbância do 17β-estradiol em metanol (C17β-estradiol

= 50µg.L-1)......................................................................................... 187 Figura IV.11. Espectros de absorbância das amostras aquosas de 17β-estradiol

ozonizadas em diferentes valores de pH............................................ 189 Figura IV.12. Redução das absorbâncias a λ = 203 nm nos diferentes valores de

pH em função das dosagens de ozônio consumido........................... 190 Figura IV.13. Microplacas do ensaio YES com a curva padrão do 17β-estradiol

(Fileiras E e G), branco (Fileiras F e H)............................................ 191 Figura IV.14. Curva dose-resposta padrão do controle positivo 17β-estradiol no

ensaio YES realizado por WANG et al. (2003)................................. 191 Figura IV.15. Curva dose-resposta padrão do controle positivo 17β-estradiol no

ensaio YES. Curva de calibração do estrogênio foi produzida pela análise de 17β-estradiol na faixa de 54,4 µg.L-1 a 26,61 ng.L-1........ 192

xiv

Figura IV.16. Curvas dose-resposta do 17β-estradiol e do extrato de água destilada no ensaio YES..................................................................... 193

Figura IV.17. Microplacas de 96 poços com a resposta no ensaio YES dos extratos das amostras de 17β-estradiol ozonizadas serialmente diluídos. Amostras com 10µg.L-1 de 17β-estradiol e: 1mg.L-1 de O3 e pH 3 (fileiras A e C da placa A); 5mg.L-1 de O3 e pH 3 (fileiras E e G da placa A); 1mg.L-1 de O3 e pH 7 (fileiras A e C da placa B); 5mg.L-1 de O3 e pH 7 (fileiras E e G da placa B); As fileiras B, D, F, H são os brancos............................................................................ 195

Figura IV.18. Microplacas de 96 poços com a resposta no ensaio YES dos extratos das amostras de 17β-estradiol ozonizadas serialmente diluídos. Amostras com 10µg.L-1 de 17β-estradiol e: 10mg.L-1 de O3 e pH 7 (fileiras A e C da placa A); curva padrão do 17β-estradiol (fileiras E e G da placa A); 10 mg.L-1 de O3 e pH 3 (fileiras A e C da placa B); Amostras com 50µg.L-1 de 17β-estradiol 10 mg.L-1 de O3 e pH 11 (fileiras E e G da placa B); As fileiras B, D, F, H são os brancos....................................................... 195

Figura IV.19. Microplacas de 96 poços com a resposta no ensaio YES dos extratos das amostras de 17β-estradiol ozonizadas serialmente diluídas. Amostras com 50µg.L-1 de 17β-estradiol e: 5 mg.L-1 de O3 e pH 7 (fileiras A e C da placa A). Amostras com 10µg.L-1 de 17β-estradiol e: 10 mg.L-1 de O3 e pH 11 (fileiras E e G da placa A); Amostras com 50µg.L-1 de 17β-estradiol e: 1 mg.L-1 de O3 e pH 7 (fileiras A e C da placa B); curva padrão do 17β-estradiol (fileiras E e G da placa B); As fileiras B, D, F, H são os brancos..... 195

Figura IV.20. Curva dose-resposta dos extratos das amostras aquosas de 10µg.L-1 de 17β-estradiol ozonizadas em diferentes valores de pH.. 197

Figura IV.21. Comparação das curvas dose- respostas do 17β-estradiol e dos extratos das amostras aquosas de 17β-estradiol ozonizadas.............. 198

Figura IV.22. (A) Curva dose-resposta dos extratos das amostras ozonizadas de 50µg.L-1 de 17β-estradiol e pH 7 e (B) comparação das curvas dose- respostas do 17β-estradiol e dos extratos das amostras aquosas de 17β-estradiol ozonizadas................................................. 199

Figura IV.23. EQ-E2 dos extratos das amostras aquosa de 17β-estradiol ozonizadas com 10 µg.L-1 e 50 µg.L-1............................................... 200

Figura IV.24. EQ-E2 dos extratos das amostras aquosas de 17β-estradiol ozonizadas.......................................................................................... 201

Figura IV.25. Quantidade de 17β-estradiol presente nas amostras aquosas ozonizadas em água ultrapura apirogênica......................................... 202

Figura IV.26. Remoção do EQ-E2 dos extratos das amostras ozonizadas............. 204 Figura IV.27. Curva dose-resposta do 17β-estradiol, 2-hidroxiestradiol e

testosterona......................................................................................... 207

xv

LISTA DE ABREVIATURAS

Acorrigida Absorbância Corrigida ABNT Associação Brasileira de Normas Técnicas ACSH American Council on Science and Health ADO Androsta 4,16–dien–3–ona AP Surfactantes Alquilfenóis APEO Etoxilados dos Alquilfenóis ARCEM Austrian Research Cooperation on Endocrine Modulators B Bases não-Protonadas B- Ácidos deprotonados BBP Butilbenzil Ftalato BDE 47 2,2’,4,4’-tetrabromodifenil éter BDE 99 2,2’,4,4’,5-pentabromodifenil éter BDE 100 2,2’,4,4’,6-pentabromodifenil éter BDE 153 2,2’,4,4’,5,5’-hexabromodifenil éter BDE 154 2,2’,4,4’,5,6’-hexabromodifenil éter BDE octa Octabromodifenil éter BDE 209 Decabromodifenil éter BFR Retardadores de Chama Bromados Br- Brometo BSTFA N,O-bistrimetilsililtrifluoroacetamida C17β-estradiol Concentração de 17β-estradiol C17β-estradiol inicial Concentração inicial de 17β-estradiol CAG Carvão Ativado Granular CAP Carvão Ativado Em Pó CBF Bifenilos CBZ Carbamazepina CDD Dioxinas Cloradas CDF Benzofuranos CENO Concentração de efeito não observado CEO Concentração de efeito observado CG Cromatografia Gasosa CLAE Cromatografia Líquida CLAE/EM Cromatografia líquida de alta eficiência acoplada a espectrometria de

massas CLAE/EM/EM Cromatografia líquida de alta eficiência acoplada a dois

espectrômetros de massas em série CG/EM Cromatografia gasosa acoplada a espectrometria de massas CG-EM/EM Cromatografia gasosa acoplada a dois espectrômetros de massas em série CL2 Cloro CLO2 Dióxido de Cloro COD Carbono Orgânico Dissolvido COMPREHEND Community Programme of Research on Endocrine Disrupters and

Environmental Hormones COT Carbono Orgânico Total CPRG Clorofenol vermelho-β-D-galactopiranosida CSTEE Scientific Committee on Toxicity, Ecotoxicity and the Environment DBO5 Demanda Bioquímica de Oxigênio

xvi

DBP Di-n-Butil Ftalato DCHP Diciclohexilo ftalato DDT 2,2 bis-p-clorofenil-1,1,1-tricloroetano DDE 2,2 bis-p-clorofenil-1,1-dicloroetileno DE Desregulador Endócrino DEO 10∈ - 17 β-dihidroxi–1,4–estradieno–3–ona DEHP Di-2-(etil-exil) ftalato DEP Dietil ftalato DES Dietilestilbestrol DIC Ionização em chama DIBP Di-iso-butil ftalato DIDP Di-iso-decil ftalato DINP Di-iso-nonil ftalato DIOP Di-isooctil ftalato DLH Domínio de ligação hormonal DMP Dimetil ftalato DQO Demanda Química de oxigênio DOP Di-n-octil ftalato E1 Estrona E2 17β-estradiol EC50 Concentração que elucida uma atividade igual a 50% do controle positivo

17β-estradiol ECH 1 etinil-1-ciclohexanol EDCs Endocrine Disrupting Chemicals EDTA Endocrine Disrupters Testing and Assessment Task Force EDSP Environmental Disruptor Screening Program EDSTAC Endocrine Disruptor Screening and Testing Advisory Committee EE2 17α-etinilestradiol EFS Extração por Fase Sólida ERE Elementos de respostas de estrogênios ELISA Ensaios de imunoadsorção enzimática EPA State Environmental Protection Agency ENV Resina de copolímero poliestireno EQ-E2 Equivalentes de estradiol ER-CALUX Estrogen Receptor – Chemically Activated LUciferase eXpression ETE Estações de Tratamento de Esgoto ETIG Estações de Tratamento de Esgoto da Ilha do Governador HAP Hidrocarbonetos Aromáticos Policíclicos HBCD Hexabromociclododecano HOBr Ácido hipobromoso HO• Radical Hidroxila H2O2 Peróxido de hidrogênio I- Iodeto IEH Institute for Enviroment and Health IPCS International Programme on Chemical Safety Kow Coeficiente de partição octanol-água KO3 Constantes das taxas de reação de compostos orgânicos com o ozônio KOH Constantes das taxas de reação de compostos orgânicos com o radical HO• Koc Coeficiente de sorção ktot Constante da taxa de reação total

xvii

M Composto orgânico MnO2 Óxido de manganês MON Material orgânico natural Moxid Composto orgânico oxidado MSTFA/TMSI/DTE N-metil-N-(trimetilsilil)- trifluoacetamida / trimetilsililimidazola/

ditioeritrol MTBFA N-metil-Ntert-butildimetilsilil-trifluoroacetamida MTBSTFA N-metil-N-(tert- butildimetil trifluoacetamida) NP Nonilfenol NF Nanofiltração NO2

- Nitrato O2 Oxigênio O3 Ozônio OBr - Íons hipobrometo OCDE Organização para a Cooperação e Desenvolvimento Econômico OCl- Íon hipoclorito OECD Organisation for Economic Co-operation and Development OH Hidroxila OMS Organização Mundial de Saúde OP Octilfenol OR Osmose reversa P Produtos que não catalisam a decomposição do ozônio PR Potência Relativa estrogênica PFBBR-TMS Pentafluorbenzil bromado-trimetilsilil PBB Polibromobifenila PBDE Difenil-éteres polibromados PC Policarbonato PCB Bifenilas policloradas PCDD Policlorodibenzo-p-dioxinas PCDF Policlorodibenzofuranos POA Processos Oxidativos Avançados POP Poluentes orgânicos persistentes PVC Poli (cloreto de vinila) QSAR Quantitative Structure-Activity Relationship R• Radicais livres que catalisam a decomposição do ozônio RA Receptor de Andrógeno RE Receptor de Estrogênio REh Receptor de Estrogênio Humano RIE Radioimunoensaio RP Receptor de progesterona RYA Recombinant yeast assay rO3 Taxa de decomposição do ozônio SETAC Society of Environmental Toxicology and Chemistry S2- Íons sulfeto Si Capturador de radical livre SO3

2- Sulfito T3 Triiodotironina T4 Tiroxina TBBA Tetrabromobisfenol A TBT Tributilestanho

xviii

TCDD 2,3,7,8-tetraclorodibenzeno-p-dioxina TCDF 2,3,7,8-tetraclorodibenzofurano THM Trihalometanos THN 5,6,7,8-tetrahidro-2-naftol TiO2 Dióxido de Titânio TPT Trifenilestanho TS Testosterona UE União Européia US EPA United State Environmental Protection Agency UV Radiação Ultravioleta VOC Compostos Orgânicos Voláteis VTG Vitelogenina WHO World Health Organisation YES Yeast estrogen-inducible expression system ou recobinant yeast estrogenic

system

xix

I – INTRODUÇÃO E OBJETIVOS

Atualmente, um dos tópicos mais relevantes na química ambiental é a qualidade

da água. A preocupação com micropoluentes – poluentes que estão presentes no meio

ambiente em concentrações da ordem de µg.L-1 e ng.L-1 – tem aumentado

expressivamente nos últimos anos. Fármacos, desreguladores endócrinos e poluentes

orgânicos persistentes (POP) são classes de substâncias muito investigadas devido aos

seus efeitos ao meio ambiente. Os riscos podem estar associados com efeitos específicos

dessas substâncias, como por exemplo, os desreguladores endócrinos que são suspeitos

de causarem efeitos adversos no sistema reprodutivo de humanos e animais. Ou, no caso

dos fármacos o efeito mais discutido é o desenvolvimento da resistência bacteriana aos

antibióticos. Os POP são substâncias químicas tóxicas, cuja resistência à biodegradação

favorece a sua permanência por longos períodos de tempo no meio ambiente, sendo

assim, responsáveis por fenômenos como a biomagnificação na cadeia alimentar.

Aparentemente, essas três classes de substâncias parecem ser distintas, porém

avaliando-se mais de perto os seus efeitos e as estruturas dessas substâncias químicas

observa-se que se entrelaçam. Por exemplo, o 17α-etinilestradiol e o DES

(dietilestilbestrol) são substâncias farmacêuticas, porém são classificadas como

desreguladores endócrinos, pois causam efeitos adversos no sistema endócrino.

Conhecidos desreguladores endócrinos fazem parte das classes de pesticidas, PCB e

HAP, contudo, essas substâncias são persistentes no meio ambiente e, por isso, também

são considerados como POP.

Por essa razão, a problemática dos fármacos, dos desreguladores endócrinos e dos

POP muitas vezes é tratada em conjunto. Uma grande preocupação relacionada a essas

classes de substâncias é que podem produzir efeitos tóxicos aos organismos expostos

em concentrações realmente muito baixas.

Em seres humanos e animais a desregulação endócrina é um mecanismo de efeito

relacionado ao funcionamento do sistema endócrino, o qual influência no

desenvolvimento, crescimento, reprodução e comportamento. Os desreguladores

endócrinos podem (EC(2001)):

1

• Danificar diretamente um órgão endócrino;

• Alterar diretamente a função de um órgão endócrino;

• Interagir com um receptor de hormônios;

• Ou alterar o metabolismo de um hormônio em um órgão endócrino (por

exemplo inibindo a esteroidogénesis) ou de forma periférica (por exemplo

um aumento no metabolismo hepático).

Atualmente, este assunto está gerando controvérsias. Há pesquisadores que

acreditam que a exposição aos desreguladores endócrinos pode estar ligada a efeitos

como: anomalias na reprodução de pássaros, peixes e outros animais, redução na

quantidade de esperma e aumento na incidência de alguns tipos de câncer em humanos.

No entanto, um grupo de pesquisadores tem questionado a significância dos dados que

relacionam a exposição aos desreguladores endócrinos, nos níveis encontrados no meio

ambiente, e o aumento da incidência de algumas doenças, argumentando que, tais

efeitos não passam de hipóteses e que não há dados convincentes que sustentem essa

relação.

Contudo, a respeito dos efeitos observados nos animais, vários pesquisadores

concluíram que existem fortes provas obtidas em estudos laboratoriais, que mostram o

potencial de várias substâncias presentes no meio ambiente em causar desregulação

endócrina nos níveis existentes de exposição ambiental.

A origem da hipótese da ação dos desreguladores endócrinos deve-se a

acontecimentos na história, como o aparecimento de câncer no sistema reprodutivo de

filhas de mulheres que usaram DES na gravidez, entre os anos de 1940 a 1970

(BIRKETT E LESTER, 2003); anomalias reprodutivas observadas em jacarés que

habitavam um lago na Flórida contaminado com o pesticida DDT e seu metabólito DDE

(GUILLETTE et al., 1996) e um estudo na Dinamarca que reporta o declínio da

qualidade do sêmen de homens durante os últimos 50 anos (CARLSEN et al., 1992).

Em relação à exposição de humanos e animais aos desreguladores endócrinos, as

maiores preocupações são: 1) se essas substâncias podem produzir efeitos tóxicos em

baixas concentrações; 2) quais substâncias estão associadas aos efeitos tóxicos a baixas

2

concentrações; 3) se essas substâncias estão presentes em concentrações

ambientalmente relevantes que possam ser uma ameaça à saúde de animais e humanos;

4) se existe uma concentração limiar abaixo da qual as substâncias químicas podem ser

consideradas como seguras; 5) se os novos tipos de ensaios, usados para prever os

efeitos causados em organismos expostos, podem realmente fornecer ferramentas para o

entendimento do mecanismo de ação dos desreguladores endócrinos; e 6) se esses

ensaios podem ser facilmente usados em larga escala para monitorar os efeitos no meio

ambiente.

Várias são as substâncias que possuem a capacidade de afetar o sistema endócrino

dos animais expostos, tais como substâncias sintéticas (alquilfenóis, pesticidas, ftalatos,

policlorados de bifenilas (PCD), o bisfenol A, 17α-etinilestradiol, entre outros) e

substâncias naturais (os estrogênios 17β-estradiol e a estrona, e fitoestrogênios).

Os estrogênios, sejam naturais (17β-estradiol, estrona), ou sintéticos (17α-

etinilestradiol), vêm recebendo atenção especial da comunidade científica. Estudos

demonstram que essas substâncias são as maiores responsáveis pela atividade

estrogênica observada nos efluentes de estações de tratamento de esgoto (ETE)

(JOBLING et al., 1998, DESBROW et al., 1998). Sua presença no meio aquático é

atribuída à sua incompleta remoção nos processos de tratamento de esgoto (TERNES et

al., 1999a). Além disso, essas substâncias estrogênicas têm mostrado induzir uma

resposta estrogênica em peixes, em concentrações na água (0,1-1,0 ng.L-1) muitas vezes

mais baixas do que as comumente detectadas no meio ambiente (DESBROW et al.,

1998, ROUTLEDGE et al., 1998), enquanto em humanos suas conseqüências ainda

estão sendo investigadas.

Devido à dificuldade de identificação desses micropoluentes, muitos métodos

analíticos foram desenvolvidos para detectar e quantificar essas substâncias em matrizes

ambientais complexas, tais como águas superficiais e subterrâneas, esgoto doméstico,

efluentes de ETE, sedimentos marinhos, solo e lodo biológico. Adicionalmente, a

necessidade de se conhecer os efeitos potenciais dos desreguladores endócrinos tem

conduzido a uma demanda por métodos de ensaios in vitro e in vivo para identificar os

efeitos biológicos de uma grande faixa de substâncias naturais e sintéticas presentes no

meio ambiente.

3

Uma vantagem significativa dos ensaios in vitro e in vivo sobre as análises

químicas é que a atividade biológica das substâncias, com suas naturezas químicas

desconhecidas, são também determinadas nesses ensaios, o que já não ocorre no caso

das análises químicas. Contudo, as análises químicas são importantes para identificar e

quantificar as substâncias químicas. A combinação de ensaios in vitro, e com menos

extensão in vivo, e técnicas de análises químicas, tem sido usada para analisar amostras

ambientais, tanto para confirmar a atividade biológica como para identificar os

compostos responsáveis.

O comportamento desses micropoluentes nas ETE, solo e sedimentos marinhos

tem sido investigado, bem como seu transporte e destino no meio ambiente. O

conhecimento do destino e dos processos de transporte desses poluentes no meio

ambiente é essencial para avaliar seus impactos potenciais no solo e águas naturais.

Vários consórcios têm sido montados em todo o mundo com o objetivo de avaliar

a complexa situação dos desreguladores endócrinos, e são exemplos da crescente

preocupação mundial com essas substâncias. Vários assuntos são abordados e

investigados, tais como: (1) o monitoramento de substâncias estrogênicas em amostras

de águas naturais (ARCEM - Austrian Research Cooperation on Endocrine

Modulators), (2) a validação dos métodos de ensaios que determinam as substâncias

com potencial de desregulação endócrina (EDSTAC - Endocrine Disruptor Screening

and Testing Advisory Committee, EDTA - Endocrine Disrupter Testing and Assessment

Task Force), (3) a identificação e caracterização de todos os efeitos relatados (EDSP –

Environmental Disruptor Screening Program e programa COMPREHEND –

Community Programme of Research on Endocrine Disrupters and Environmental

Hormones; CSTEE - Committee on Toxicity, Ecotoxicity and the Environment), (4)

organização do conhecimento científico disponível sobre os desreguladores endócrinos

(SPEED’98/JEA - Exogenous Endocrine Disrupting Chemical Task Force e COM

(1999 e 2001) - Community Strategy for Endocrine Disrupters), entre outros.

A presença de fármacos e desreguladores endócrinos em estações de tratamento

de esgoto e em fontes de água potável demonstra que é necessária uma avaliação dos

processos de tratamento envolvidos com respeito à eficiência de remoção dessas

substâncias. Os processos oxidativos avançados e a ozonização são tecnologias bastante

4

promissoras para a oxidação de fármacos e estrogênios no tratamento de água e esgoto

doméstico (TERNES et al., 2003, HUBER et al., 2003).

No entanto, na ozonização, doses de ozônio economicamente viáveis nem sempre

alcançam a mineralização completa dos micropoluentes, portanto o conhecimento dos

subprodutos formados na oxidação desses compostos, bem como a avaliação dos seus

efeitos são extremamente importantes. O foco principal da eliminação dos

desreguladores endócrinos do meio ambiente deve levar em conta a remoção de sua

atividade biológica.

Os objetivos deste estudo foram estudar a degradação e a remoção da atividade

estrogênica do 17β-estradiol pelo processo de ozonização. Foi investigando a influência

do pH, da dosagem de ozônio e da matriz na remoção do 17β-estradiol e na formação de

seus subprodutos da ozonização, além de avaliar a atividade estrogênica dos

subprodutos formados.

Para investigar a ação dos oxidantes a ozonização foi conduzida em três

valores de pH (3, 7 e 11). Duas matrizes diferentes, água destilada e efluente de ETE,

foram estudadas, que serviu para avaliar se o ozônio pode efetivamente degradar esse

estrogênio presente em uma matriz ambiental complexa. Diferentes dosagens de ozônio

foram aplicadas para avaliar a remoção do 17β-estradiol e seus subprodutos formados.

Estas condições também serviram para investigar a remoção da atividade estrogênica do

17β-estradiol pelo processo de ozonização.

No presente estudo, a quantificação do 17β-estradiol e a identificação dos

subprodutos formados na ozonização por CG e CG/EM foi combinado com a

determinação da atividade estrogênica pelo ensaio in vitro YES.

5

II – REVISÃO BIBLIOGRÁFICA

II.1. DESREGULADORES ENDÓCRINOS

As substâncias denominadas desreguladores endócrinos são uma recente categoria

de contaminantes ambientais que interferem nas funções do sistema endócrino. Essas

substâncias são encontradas no meio ambiente em concentrações da ordem de µg.L-1 e

ng.L-1, e são suspeitas de causarem efeitos negativos à saúde humana e animal.

Os desreguladores endócrinos podem interferir com o funcionamento do sistema

endócrino pelo menos de três formas: (1) mimetizam a ação de um hormônio endógeno,

como o estrogênio ou a testosterona, afetando as funções que esses hormônios

controlam; (2) bloqueiam os receptores hormonais nas células, impedindo assim a ação

dos hormônios naturais; (3) afetam a síntese, o transporte, o metabolismo e a excreção

dos hormônios, alterando dessa forma as concentrações dos hormônios naturais no

corpo. Alterações nas funções do sistema endócrino podem prejudicar a saúde do

organismo, da sua descendência ou de uma (sub) população.

Efeitos tais como diminuição na eclosão de ovos de pássaros, peixes e tartarugas;

feminização de peixes machos; deformidade em peixes; problemas no sistema

reprodutivo em répteis, pássaros e mamíferos; e alteração no sistema imunológico de

mamíferos marinhos têm sido associados à exposição de espécies de animais aos

desreguladores endócrinos. Em alguns casos esses efeitos podem conduzir ao declínio

da população. Em seres humanos esses efeitos incluem a redução da quantidade de

esperma, o aumento da incidência de câncer de mama, de testículo e próstata, e a

endometriose.

Algumas vezes, os desreguladores endócrinos são chamados de estrogênios

ambientais ou xenoestrogênios, que não necessariamente apresentam uma estrutura

similar aos estrogênios naturais. Podem abranger uma grande faixa de classe de

substâncias com estruturas distintas, incluindo hormônios sintéticos e naturais,

substâncias naturais e uma grande quantidade de substâncias sintéticas.

6

II.1.1 Definição - O que é um Desregulador Endócrino?

Algumas definições são propostas para essas substâncias, denominadas em inglês

“Endocrine Disrupting Chemicals” (EDCs). Alguns autores entendem que são

considerados “endocrine disrupting chemicals” somente as substâncias que interagem

com sítios receptores de hormônios, enquanto outros entendem como qualquer

substância que cause um desequilíbrio, interferência ou alteração no sistema endócrino,

independentemente se atua diretamente no sítio receptor ou não.

De acordo com a Environmental Protection Agency (U.S. EPA, 1997), um

desregulador endócrino é definido como um “agente exógeno que interfere com a

síntese, secreção, transporte, ligação, ação ou eliminação de hormônio natural no

corpo que são responsáveis pela manutenção, reprodução, desenvolvimento e ou

comportamento dos organismos”.

O Programa Internacional de Segurança Química (IPCS) em conjunto com o

Japão, os EUA, o Canadá, a OECD e a União Européia, adotaram as seguintes

definições: “Um desregulador endócrino é uma substância ou um composto exógeno

que altera uma ou várias funções do sistema endócrino e tem, conseqüentemente,

efeitos adversos sobre a saúde num organismo intacto, sua descendência, ou (sub)

populações” (COM(1999)706).

A tradução do termo “endocrine disrupting chemicals” também não é simples,

sendo que existem cinco possíveis traduções: perturbadores endócrinos, interferentes

endócrinos, desreguladores endócrinos, disruptores endócrinos e interferentes

hormonais. Os termos mais usados são perturbadores endócrinos e desreguladores

endócrinos.

Mesmos os termos em inglês geram dúvidas em relação aos seus efeitos, a

existência de vários termos confirmam isso. Na literatura podem ser encontrados

“endocrine disrupting”, “endocrine modulator”, “environmental estrogen”, sendo o

primeiro termo o mais usado. Segundo o ACSH (1999), o termo “endocrine disrupting”

sugestiona que os efeitos de tais substâncias são negativos, mas é também concebível

que a exposição a essas substâncias hormonalmente ativas pode conduzir a resultados

benéficos. Segundo o ACHS, as substâncias “endocrine modulator” focam nas

substâncias químicas industriais, tais como, policlorados de bifenilas e pesticidas.

7

Existem ainda outras definições para as substâncias estrogênicas presentes no

meio ambiente. Freqüentemente, são referidos como estrogênios ambientais, estrogênios

exógenos ou exoestrogênios. Exoestrogênios são diversos grupos de substâncias que

não necessariamente apresentam alguma semelhança com a estrutura química do 17β-

estradiol, mas causa respostas antagônicas e agônicas possivelmente através de

mecanismos de ação via receptores hormonais. Entende-se por atividade agonista a

capacidade de uma substância acoplar-se ao receptor de hormônios esteróides e elucidar

uma resposta. Em contrapartida, a atividade antagonista é a habilidade de uma

substância acoplar-se ao receptor de esteróide e bloquear a ação do ligante natural

(esteróide) e assim sua resposta não será elucidada. Assim, essas substâncias podem ser

identificadas por sua capacidade de ligar-se ao receptor de estrogênios (RE) e induzir ou

atenuar uma resposta hormonal (ZACHAREWSKI, 1997).

Os estrogênios endógenos são os estrogênios produzidos naturalmente pelo corpo

humano, como por exemplo, o 17β-estradiol e a estrona. Substâncias sintéticas com

atividade estrogênica também são denominadas de xenoestrogênios (estrogênios

estranhos) por alguns autores (DESBROW et al., 1998, NOGUEIRA, 2003, SAFE,

2004, SOTO et al., 1995). Os termos estrogênios ambientais ou eco-estrogênios também

geram controvérsias no meio científico, pois omitem a possibilidade de substâncias que

não sejam estrogênicas, como por exemplo, andrógenos (hormônios masculinos), anti –

andrógenos e anti- estrogênicas, poderem afetar o sistema endócrino. Outros autores

usam o termo substância estrogênica para quaisquer substâncias que interagem com

receptores de hormônios esteróides, sendo ele receptor de estrogênio ou não.

Outras definições também geram confusões, que alguns autores tentam esclarecer

(GRAY et al., 1997). Substância estrogênica refere-se à substância cujo efeito se dá

através do receptor de estrogênio, iniciando uma cascata de efeitos específicos no

tecido/célula similar aos iniciados pelo 17β-estradiol. O termo anti-andrógeno e anti-

estrogênico não são especificamente limitados às interações através RA e RE

respectivamente. Anti-hormônios podem atuar via: 1) receptor de hormônios esteróides,

2) inibição da síntese dos hormônios esteróides, 3) diminuição da biodisponibilidade

pela redução da quantidade de hormônios livres no sangue, 4) aumento do metabolismo

dos hormônios que conduz a uma redução dos níveis de hormônios no sangue, entre

outros mecanismos (GRAY et al., 1997).

8

Os chamados “endocrine disrupting chemicals” originalmente foram relacionados

com substâncias que mimetizam a ação dos estrogênios naturais. Porém, com a

descoberta de outros mecanismos de ação, gerou-se uma confusão na nomenclatura.

Com isso, o que se percebe é que a comunidade científica ainda não entrou em consenso

sobre qual a nomenclatura correta que deve ser empregada para essa classe de

substâncias, no que se referem a todos os seus efeitos causados.

Neste trabalho, será usado o termo “Desregulador Endócrino (DE)”, sendo esta a

nomenclatura usada pela União Européia nos textos em português.

II.1.2. Histórico e Estado Atual do Conhecimento

A hipótese de que substâncias químicas presentes no meio ambiente podem causar

uma resposta biológica aos organismos expostos não é nova. Os efeitos causados ao

sistema endócrino de animais de laboratório por substâncias estrogênicas foram

primeiramente evidenciados nos anos 1900 por alguns pesquisadores (ALLEN e

DOISY, 1923 e DODDS et al., 1938). Porém, recentemente este assunto emergiu com

um maior interesse na comunidade científica, devido ao aumento da detecção de

anomalias na saúde humana e de animais, que podem estar relacionadas à ação dos

desreguladores endócrinos.

O caso mais famoso sobre os desreguladores endócrinos é o DDT e seus

subprodutos, um pesticida muito utilizado em todo mundo durante as décadas de 1950 e

1960, e que ainda hoje é usado em alguns países. Estudos mostram que o DDT é

persistente no meio ambiente, apresenta atividade estrogênica e pode afetar o sistema

reprodutor de mamíferos e pássaros (US. EPA 1997). Exemplo disso são as anomalias

detectadas no sistema reprodutivo de jacarés em vários lagos da Flórida contaminados

com DDT (GUILLETTE et al., 1996). Segundo SAFE (2000), em 1962, Rachel Carson

publicou “Silent Spring” que foi um dos primeiros relatos sobre a ligação da presença

do pesticida DDT no meio ambiente e o declínio na população de algumas espécies de

animais.

Uma fase bastante crítica à exposição de desreguladores endócrinos é o

desenvolvimento fetal, o exemplo mais claro dos efeitos causados no feto foi o uso do

9

potente estrogênio sintético DES em mulheres grávidas entre os anos de 1948 a 1970.

Este fármaco era prescrito por médicos para evitar abortos e promover o crescimento

fetal. Mais tarde descobriu-se que as crianças nascidas de mulheres que fizeram uso de

DES, quando atingiam a puberdade apresentaram disfunção no sistema reprodutivo,

gravidez anormal, redução na fertilidade, desordem no sistema imunológico e muitas

desenvolveram câncer vaginal (BIRKETT e LESTER, 2003, COLBORN, et al., 1993).

Recentes estudos sugerem que substâncias estrogênicas, como o DES, podem apresentar

efeitos duradouros no sistema reprodutor em humanos expostos in utero (US. EPA

1997). Os efeitos relatados a curto, médio e longo prazo do DES têm servido como

exemplo e de padrão comparativo para os efeitos da exposição de seres humanos aos

desreguladores endócrinos. É o primeiro exemplo documentado de uma substância

química que, quando administrada à mãe, pode causar câncer na filha.

Em 1993, COLBORN et al. (1993) publicou uma revisão sobre anomalias em

pássaros e peixes associadas à exposição de subprodutos industriais (dioxinas e bifenilas

policloradas) e pesticidas (DDT) em áreas, tais como, os Grandes Lagos na América do

Norte. Também relatou que a exposição humana ao DES ocorrida no passado serve

como um modelo para a exposição a substâncias estrogênicas durante o estágio

prematuro da vida, incluindo contaminantes no meio ambiente que são estrogênios

agonistas.

Em 1996, Colborn e colaboradores publicaram o livro “Our Stolen” que também

relatou a possibilidade de efeitos no sistema endócrino de humanos e animais serem

causados por algumas substâncias presentes no meio ambiente. Este livro faz um

levantamento detalhado de problemas ambientais causados por substâncias químicas,

que mesmo em baixas concentrações, podem causar efeitos adversos ao sistema

reprodutivo de animais.

Vários estudos têm demonstrado que efluentes de ETE apresentam substâncias

químicas classificadas como desreguladores endócrinos. Feminização de peixes machos,

entre outras alterações no sistema reprodutivo de animais que habitam ambientes

aquáticos que recebem descarte de efluentes de ETE, têm sido associados à presença de

substâncias estrogênicas nesses efluentes, tais como, estrogênios naturais e sintéticos.

Esses estrogênios são excretados diariamente pela população humana (GAGNÉ et al.,

2001, RODGER-GRAY et al., 2001).

10

No Brasil, recentemente foram relatados alguns efeitos relacionados à exposição

de desreguladores endócrinos no meio ambiente. FERNANDEZ et al. (2002) relataram

a exposição de organismos marinhos a compostos orgânicos contendo estanho, o

tributilestanho (TBT) e o trifenilestanho (TPT), no litoral do Brasil (Rio de Janeiro,

Fortaleza) e o desenvolvimento de caracteres sexuais masculinos em fêmeas de

moluscos, fenômeno conhecido como imposex. O estudo de KOIFMAN et al., 2002

apresenta os resultados de um estudo epidemiológico, que relaciona a exposição a

pesticidas durante os anos 80 e distúrbios reprodutivos observados nos anos 90 em

estados brasileiros. TORRES et al., 2002 investigaram a concentração e destino de

pesticidas, PCB e HAP na bacia hidrográfica Paraíba do Sul/Guandu, importantes

reservatórios de água usados no abastecimento da população. Os resultados indicaram

que contaminantes industriais, principalmente os HAP, foram encontrados na água e

sedimentos marinhos.

II.1.3. Estratégias Internacionais para Avaliar o Problema dos DE

Nas últimas duas décadas, houve um aumento da preocupação na comunidade

científica, debate público, e atenção da mídia em relação aos possíveis efeitos danosos

causados nos humanos e animais pela exposição a substâncias químicas, presentes no

meio ambiente que têm o potencial de interferir com o sistema endócrino.

Para esclarecer, desenvolver estratégias e solucionar o problema dos

desreguladores endócrinos, várias organizações governamentais e não governamentais,

tais como, União Européia (UE), Agência de Proteção Ambiental dos Estados Unidos

(EPA), Organização Mundial de Saúde (OMS), Programa Internacional de Segurança

Química (IPCS) e a Organização para a Cooperação e Desenvolvimento Econômico

(OCDE) investigam a questão dos desreguladores endócrinos. Assim, e alguns relatórios

estão disponíveis, tais como, o monitoramento e avaliação de metodologias de ensaios

disponíveis para detectar os DE; estudos de efeitos ao meio ambiente; identificação das

substâncias com potencial estrogênico, entre outros. Alguns estudos são apresentados na

Tabela II.1.

11

Tabela II.1. Seminários, comitês e relatórios de avaliação sobre os DE. Ano Organização Objetivos dos estudos Referência

1995 Agência Ambiental Federal Alemã

Discussão sobre a ocorrência e impacto dos DE e os riscos potenciais que podem causar aos humanos e animais UBA, 1996

1995 US EPA Seminário para a Avaliação de Risco da saúde e efeitos ambientais dos DE KAVLOCK et al., 1996

1995 Ministério do meio ambiente e energia da Dinamarca

Avaliação dos efeitos de substâncias estrogênicas no desenvolvimento e nas funções do sistema reprodutivo masculino

TOPPARI et al., 1996

1996 US EPA Seminário para o desenvolvimento de uma estratégia para avaliar o risco ao meio ambiente dos DE

ANKLEY et al., 1997

1996 US EPA Desenvolvimento de um programa de testes e análise (screening) para avaliar a ação dos DE

EDSTAC, 1996

1997 US EPA Relatório especial sobre os DE presentes no ambiental US EPA,1997

1998 US EPA Revisão e discussão das informações científica disponível sobre os DE EDSTAC,1998

1998 OECD Desenvolvimento de métodos de ensaio para os DE OECD, 2000

1999 CSTEE Revisão da literatura existente e opinião científica na evidência dos DE, em particular, avaliação dos riscos ecológicos e diretrizes de teste toxicológicas. CSTEE, 1999

1999 Comissão das Comunidades Européias

Identificação do problema dos DE, suas causas e conseqüências e a definição das medidas políticas adequadas a fim de dar uma resposta ao problema.

COM, 1999 (706)


Primeiro relatório sobre o progresso dos trabalhos, da comunidade européia, sobre os DE.

COM, 2001 (262)


Programa COMPREHEND: Avaliação das evidências dos DE no ambiente aquático na Europa

COMPREHEND, 2002

2002 OECD Avaliação dos métodos de ensaios para as substâncias estrogênicas OECD,2002 2002 WHO Avaliação global do estado da arte da ciência dos DE IPCS, 2002 2003 IEH Relatório de avaliação do progresso internacional da pesquisa dos DE IEH, 2003

2004 Comissão das Comunidades Européias Segundo relatório sobre o progresso dos trabalhos, sobre os DE SEC (2004)

1372

12

0

II.1.4. Substâncias Classificadas como Desreguladores Endócrinos

Com base em informações disponíveis na literatura foram elaboradas, por várias

organizações mundiais, listas de substâncias químicas suspeitas de causar desregulação

do sistema endócrino (COM(1999)706, COM(2001) 262, BIRKETT e LESTER, 2003,

PETROVÍC et al., 2001). Contudo, mais dados científicos são necessários para realizar

uma investigação mais profunda a fim de identificar os critérios de seleção utilizados

para agrupar as substâncias nestas listas. Para tal, a União Européia lançou um estudo

que é o primeiro passo para o estabelecimento de uma lista de substâncias para a futura

avaliação do seu papel na desregulação endócrina.

Uma ação a curto prazo da Comissão Estratégica Comunitária em Matéria os

Desreguladores Endócrinos estabelecida pela Comissão das Comunidades Européias foi

o estabelecimento de uma lista prioritária de substâncias para uma futura avaliação do

seu papel na desregulação endócrina. Assim, em 2000 foi proposta uma lista com 553

substâncias sintéticas e 9 hormônios naturais e sintéticos (COM(2001) 262). Dessas 553

substâncias, existem evidências de perturbação endócrina ou potencial de perturbação

endócrina para 118 substâncias. Para as outras 435 substâncias dados insuficientes

foram apresentados nesse relatório. Baseados nisso, dois novos estudos foram iniciados,

no primeiro avaliaram 9 substâncias sintéticas e de 3 estrogênios das 118 substâncias,

apresentadas no relatório de 2000, que não tinham seus usos restringidos pela UE

(WRc-NSF, 2002). O segundo estudo abrange as 435 substâncias para as quais os dados

foram insuficientes no relatório de 2000. Esta lista foi dividida em três grupos separados

de substâncias que dependem do volume de produção, da persistência no ambiente, das

provas de desregulação endócrina encontradas em bibliografias científicas e nas

considerações relativas à exposição (Anexo 1 de SEC (2004) 1372). Fora da lista de 435

substâncias, outras 147 substâncias foram avaliadas, desse último grupo de substâncias,

129 substâncias eram restringidas pela UE por motivos distintos da perturbação

endócrina.

As substâncias classificadas como DE, incluindo substâncias naturais e sintéticas,

usadas ou produzidas para uma infinidade de finalidades, podem ser agrupadas em

quatro classes:

13

1. Substâncias sintéticas utilizadas na agricultura e seus subprodutos, como

pesticidas, herbicidas, fungicidas e moluscicidas;

2. Substâncias sintéticas utilizadas nas indústrias e seus subprodutos, dioxinas,

PCB, alquilfenóis e seus subprodutos, HAP, ftalatos, bisfenol A, entre outros;

3. Substâncias naturais, como fitoestrogênios, tais como, genisteína e

metaresinol e os estrogênios naturais 17β-estradiol, estrona e estriol;

4. Compostos farmacêuticos, como o DES e o 17α-etinilestradiol.

Resíduos de vários pesticidas vêm sendo encontrados em alimentos, água potável

e em corpos hídricos. Os pesticidas foram largamente utilizados no mundo por vários

anos, sendo o maior grupo de substâncias classificadas como desreguladores

endócrinos. Na classe dos pesticidas, estão inclusos os inseticidas, herbicidas e

fungicidas, que são utilizados na agricultura, na aqüicultura e no uso domiciliar.

Os hidrocarbonetos aromáticos policíclicos (HAP) são substâncias que

apresentam potencial de bioacumulação e atividade estrogênica (SANTODONATO,

1997). E podem ser encontrados na indústria petroquímica e na queima de gasolina e

óleo diesel.

Alguns subprodutos de processos de combustão são suspeitos de serem

desreguladores endócrinos, como os PCDD (policlorodibenzo-p-dioxinas) e PCDF

(policlorodibenzofuranos), conhecidos como dioxinas. Esses organoclorados podem ser

produzidos durante a incineração de hidrocarbonetos clorados e do papel, na produção

de PVC e na produção de compostos aromáticos clorados, como o 2,4,5-triclorofenol.

Pesquisas demonstram que essas substâncias persistem e bioacumulam no meio

ambiente (LOUIE e SIN, 2003). Já foram identificadas 75 moléculas diferentes na

família das dioxinas cloradas (CDD), 135 na dos benzofuranos (CDF) e 209 na dos

bifenilos (CBF) (REYS, 2001).

Outros organoclorados, como as bifenilas policloradas (PCB) também apresentam

atividade estrogênica. No passado, eram utilizados em várias aplicações, como fluidos

de transferência de calor em transformadores e como fluidos dielétricos em capacitores.

14

Ainda que não estejam mais sendo usados, eles estão presentes em algumas instalações

antigas (BIRKETT e LESTER, 2003).

Desreguladores endócrinos também são encontrados na indústria química, como

detergentes, resinas, alguns aditivos e monômeros utilizados na produção de plásticos.

Os ftalatos são usados como aditivos (plastificantes) em alguns plásticos,

principalmente na produção de PVC. Podem ser encontrados ainda em brinquedos

infantis, embalagens de produtos alimentícios e equipamentos médicos. Devido a sua

persistência no meio ambiente, os ftalatos, tais como, butilbenzil ftalato (BBP), di-n-

butil ftalato (DBP), e di-2-(etil-exil) ftalato (DEHP), são comumente encontrados em

águas superficiais e de subsolo (HUTCHINS e WARD, 1984, FROMME et al., 2002).

Os surfactantes alquilfenóis (AP) e seus etoxilados (APEO), particularmente o

nonilfenol (NP), apresentam uma variedade de aplicações, incluindo detergentes

industriais e domésticos, lubrificantes, emulsificantes e em formulações de pesticidas,

de tintas e de produtos de uso pessoal (maquiagem, cremes de pele, produtos de cabelo

e produtos de banho) (BIRKETT e LESTER, 2003). Assim, as possíveis rotas de

entrada dessas substâncias no meio ambiente são durante sua produção, uso e

disposição. Nas ETE, os alquilfenóis polietoxilatos são inicialmente biodegradados,

derivando em metabólitos persistentes e altamente lipofílicos, incluindo alquilfenóis

etoxilatos, e finalmente nos alquilfenóis, tais como nonilfenol (NP) e octilfenol (OP)

(ROUTLEDGE e SUMPTER, 1996). Estes metabólitos são largamente detectados nos

efluentes de ETE e águas superficiais (SOLÉ et al., 2000 e KUCH e BALLSCHMITER,

2001), sendo também relatado os efeitos causados em organismos expostos a essas

substâncias estrogênicas (JOBLING e SUMPTER, 1993).

O bisfenol A é extensamente usado na produção de plásticos, em particular os

policarbonatos e resinas epóxi (BILES et al., 1997, FÜRHACKER et al., 2000). Pode

ainda ser encontrado em adesivos, papéis para fax, tubulações, painéis de carros e

produtos eletrônicos, também estão presentes em revestimentos de latas de conservas e

frascos de alimentos para bebês; pode ser liberado destes causando graves problemas

para a saúde humana. Alguns polímeros usados no tratamento dentário também contêm

bisfenol A. A exposição humana a esse composto é considerável (BILES et al., 1997,

FROMME et al., 2002) e sua atividade estrogênica tem sido muito relatada

(BERESFORD et al., 2000, DE BOEVER et al., 2001, GAIDO et al., 1997).

15

Os retardadores de chama bromados (BFR), os chamados Difenil-éteres

polibromados (PBDE), são um grupo de substâncias químicas adicionadas em alguns

produtos, como computadores, TV e tecidos domésticos para atrasar a combustão.

Como por exemplo, o polibromobifenila (PBB), tetrabromobisfenol A (TBBA) e

hexabromociclododecano (HBCD). Essas substâncias são persistentes, lipofílicas e

bioacumulativas (BIRKETT e LESTER, 2003).

Os parabenos são ésteres de alquil de ácido para-hidrobenzóico, são compostos

utilizados como conservantes em cosméticos e em algumas pastas usadas por dentistas.

Vários compostos deste grupo mimetizam hormônios endógenos, apresentando assim

atividade estrogênica (REYS, 2001).

Uma variedade de hormônios naturais é encontrada em plantas e são chamados de

fitoestrogênios. Uma grande quantidade dessas substâncias é absorvida através da dieta

alimentar. Alimentos como grãos integrais, ervilhas, feijão, alguns vegetais e frutas

contêm fitoestrogênios. A soja e alimentos baseados em soja, como tofu, são alguns dos

alimentos que possuem essas substâncias. Os fitoestrogênios mais estudados são da

classe dos lignanos e das isoflavonas. Algumas dessas substâncias podem atuar sobre

hormônios naturais em animais. Os fitoestrogênios são compostos naturais mais fracos

do que os estrogênios endógenos, estudos indicam que essas substâncias podem se

acoplar aos RE e podem funcionar como agonistas ou antagonistas no sistema

endócrinos (BIRKETT e LESTER, 2003).

Pesquisadores têm chegado a conclusões dúbias quanto aos benefícios e/ou

toxicidade desses fitoestrogênios e quanto aos seus efeitos hormonais. Segundo a

comissão das comunidades européias (COM (1999)706), os fitoestrogênios apresentam

alguns efeitos benéficos comprovados para a saúde humana, tais como, na prevenção

das doenças cardiovasculares, da osteoporose e de algumas formas de câncer. Acredita-

se que o corpo humano consiga decompor facilmente e excretar rapidamente essas

substâncias, significando que elas passam pouquíssimo tempo no organismo e não se

acumulam gradualmente nos tecidos, como acontece com algumas substâncias

artificiais. Todavia, podem existir alguns riscos associados às alterações de estilo de

vida e à mudança dos hábitos alimentares e de consumo, que levem a um maior

consumo de alimentos que contenham estas substâncias.

16

Estrogênios naturais também pertencem à classe dos desreguladores endócrinos.

Pesquisas demonstram a presença da estrona, 17β-estradiol como fonte de atividade

estrogênica em muitos efluentes (SOLÉ et al., 2003). Estrogênios naturais são

encontrados em efluentes de ETE e águas superficiais em várias partes do mundo

(TERNES et al., 1999a, BELFROID et al., 1999, LOPÉZ e BARCELO, 2001). Esses

estrogênios são naturalmente e diariamente excretados na urina humana e assim

descartados no esgoto doméstico.

Alguns agentes terapêuticos e farmacêuticos também estão na lista das substâncias

classificadas como desreguladores endócrinos. São hormônios sintéticos usados como

contraceptivos orais, na reposição terapêutica na menopausa ou na prevenção do aborto,

tais como, DES e o 17α-etinilestradiol. A maior aplicação médica do 17α-etinilestradiol

tem sido no desenvolvimento de pílulas contraceptivas, os contraceptivos contém de 30

a 50 µg de 17α-etinilestradiol por pílula (BEAUSSE, 2004). O DES foi muito usado nos

anos 1970 na prevenção do aborto (BIRKETT e LESTER, 2003).

Os compostos orgânicos contendo estanho são substâncias sintéticas que também

causam efeitos no sistema endócrino de animais. Esses compostos apresentam uma

infinidade de aplicações, sendo seu maior uso em tintas usadas no casco de embarcações

para protegê-las da ação de organismos incrustantes (antiincrustantes), além de também

serem usados como estabilizantes em plásticos e pesticidas (LINTELMAN et al., 2003).

Podem ser detectados em águas naturais e sedimentos marinhos, impondo um grande

risco aos organismos aquáticos. Estudos demonstraram o desenvolvimento de anomalias

no sistema reprodutivo relacionado à exposição de animais a essas substâncias

(FERNANDEZ et al., 2002, UBA, 1996).

Algumas dessas substâncias tiveram seus usos proibidos ou não são mais

produzidas, porém ainda podem ser encontradas no meio ambiente. A Tabela II. 2

apresenta algumas substâncias conhecidas ou suspeitas de serem desreguladores

endócrinos.

Para identificar se uma determinada substância possui o potencial de causar algum

efeito aos organismos, testes in vitro (cultura de células) e in vivo (animais de

laboratórios) são usados.

17

Tabela II.2. Substâncias químicas classificadas como DE. Ftalatos Pesticidas

Dimetil ftalato (DMP) dietil ftalato (DEP) di-iso-butil ftalato (DIBP) di-n-butil ftalato (DBP) butilbenzil ftalato (BBP) diciclohexilo ftalato (DCHP) di-(2-etil-exil) ftalato (DEHP) di-n-octil ftalato (DOP) di-isooctil ftalato (DIOP) di-iso-nonil ftalato (DINP) di-iso-decil ftalato (DIDP)

Inseticidas: DDT (2,2 bis-p-clorofenil-1,1,1-

tricloroetano) DDE (2,2 bis-p-clorofenil-1,1-

dicloroetileno Deltametrin Carbofurano Herbicidas: Atrazina Linuron

Fungicidas: Vinclozolina Carbendazime Penconazol Procloraz Propiconazol Epoxiconazol Procimidona Tridemorfos

Alquilfenóis Pesticidas organoclorados: Lindane (1,2,3,4,5,6-hexaclorohexano)

Compostos orgânicos de estanho Nonilfenol Nonilfenol etoxilado Octilfenol Octilfenoletoxilado

Tributilestanho (TBT) e trifenilestanho (TPT)

Organoclorados Policlorados de bifenilas Dibenzo-p-dioxina 2,4,4’-triclorobifenil TCDD (2,3,7,8-tetraclorodibenzeno-p-dioxina)

2,2’,5,5’-tetraclorobifenil

TCDF (2,3,7,8-tetraclorodibenzofurano) 2,2’,4,5,5’-pentaclorobifenil Bisfenol 2,3’,4,4’,5-pentaclorobifenil

Bisfenol A 2,2’,3,4,4’,5’-hexaclorobifenil Parabenos 2,2’,4,4’,5,5’-hexaclorobifenil

Benzilparabeno 2,2’,3,4,4’,5,5’-heptaclorobifenil Isobutilparabeno Retardante de chama bromado Butilparabeno Polibromobifenila (PBB) n-propilparabeno 2,2’,4,4’-tetrabromodifenil éter (BDE 47) etilparabeno 2,2’,4,4’,5-pentabromodifenil éter (BDE 99) metilparabeno 2,2’,4,4’,6-pentabromodifenil éter (BDE 100)

Hidrocarbonetos aromáticos policíclicos

2,2’,4,4’,5,5’-hexabromodifenil éter (BDE 153) 2,2’,4,4’,5,6’-hexabromodifenil éter (BDE 154)

Naftalina Benzo[a]antraceno 2,2’,3,4,4’,5’,6-heptabromodifenil éter Acenaftileno Criseno Octabromodifenil éter (BDE octa) Acenafteno Benzo[b]fluoranteno Decabromodifenil éter (BDE 209) Fluoreno Benzo[k]fluoranteno Hexabromociclododecano (HBCD) Fenantreno Benzo[a]pireno Tetrabromobisfenol A (TBBA) Antraceno Indeno[123-cd]pireno Fitoestrogênios Fluoranteno Dibenzo[ah]antraceno Isoflavona: daidzeína e genisteína. Pireno Benzo[ghi]perileno Liganas: metaresinol, enterodiol,

enterolactona Agentes terapêuticos e farmacêuticos Estrogênios naturais

Dietilestilbestrol (DES) 17α-etinilestradiol (EE2)

Estrona (E1) 17β-estradiol (E2)

18

II.1.5. Meios de Exposição aos Desreguladores Endócrinos

Toneladas de substâncias sintéticas e naturais são lançadas anualmente no meio

ambiente, das quais, um número considerável é de desreguladores endócrinos. Além de

serem associados a vários efeitos, alguns são também persistentes, lipofílicos,

bioacumulativos e têm baixa pressão de vapor, o que facilita a dispersão e difusão no

meio ambiente.

A exposição aos desreguladores endócrinos pode ocorrer sob diversas formas,

como através do contato direto no local de trabalho ou em casa, ou indireto através da

ingestão de água, ar ou alimentos contaminados e ao contato com o solo.

Uma das maiores exposições da população aos desreguladores endócrinos é

através da ingestão de alimentos contaminados. No caso dos seres humanos estima-se

que mais de 90% dos tóxicos ambientais são absorvidos por via digestiva, através de

alimentos contaminados (REYS, 2001).

Alguns desreguladores endócrinos são solúveis em gordura, assim, altos níveis

podem estar presentes na carne, peixe, ovos e derivados do leite. HARTMANN et al.

(1998) relataram à ocorrência de hormônios sexuais (17β-estradiol, estrona, testosterona

e progesterona) em carnes (gado, porco, aves, peixe), leite e seus derivados, ovos e

plantas (gramíneas, leguminosas). A contaminação de alimentos também pode vir do

fato de que alguns hormônios são aplicados na criação de animais e que são usados na

alimentação humana. Contudo, em alguns países essa prática foram proibidas.

A exposição pode também vir de pesticidas residuais que contaminam frutas,

vegetais e em baixas concentrações a água potável. Junto com alguns pesticidas também

podem estar presentes o nonilfenol e seus etoxilados usados na formulação de alguns

pesticidas. Outras fontes de exposição direta dos alquilfenóis são através do uso de

produtos pessoais como, maquiagem, cremes de pele, produtos de cabelo e produtos de

banho (BIRKETT e LESTER, 2003).

O bisfenol A é usado em revestimento de algumas latas de alimentos, e os ftalatos

são encontrados em outras embalagens de comida e em brinquedos infantis

(WILKINSON e LAMB, 1999). Estudos demonstram que resíduos de bisfenol A

residual podem ser encontrados em alguns alimentos humanos devido a sua migração

19

das embalagens (BILES et al., 1997, KUO e DING, 2004). Por ter uso doméstico e

industrial, o bisfenol A também pode ser encontrado no esgoto, efluente e lodo

biológico de ETE (FÜRHACKER et al., 2000). Ambos, Bisfenol A e ftalatos, podem

ser lançados no meio ambiente durante o processo de produção e pela lixiviação dos

produtos finais.

A variedade de produtos de PVC com aditivos tóxicos, os chamados ftalatos,

presente nas residências podem expor diariamente as famílias a múltiplas fontes de

contaminação. Estudos científicos sobre a exposição humana aos componentes tóxicos

começam a serem apresentados em todo o mundo, alguns investigam a hipótese de que

alguns plásticos como o PVC pode afetar a saúde se colocado na boca por crianças

muito pequenas (EARLS, et al., 2003). Entretanto, para outros autores os riscos tóxicos

associados com a exposição oral de alguns ftalatos em produtos de crianças não foram

confirmados (BABICH et al., 2004). De qualquer forma, organizações de alguns países

determinaram a remoção de ftalatos presentes em produtos para crianças (BABICH et

al., 2004).

Recentemente, ftalatos, HAP, PCD, alquilfenóis e seus metabólitos, pesticidas e

retardadores de queima bromados foram encontrados no ar e poeira de residências

(RUDEL et al., 2003).

Os desreguladores endócrinos também podem ser encontrados nas cinzas dos

produtos incinerados, no lodo biológico de estações de tratamento de efluentes e em

chorumes de aterros sanitários. Uma quantidade considerável de vários produtos

industrializados potencialmente tóxicos é disposta diretamente no solo ou em aterros

sanitários. Alguns desreguladores endócrinos, tais como PCDD, PCDF, bisfenol A,

nonilfenol, octilfenol e 17α-etinilestradiol e alguns ftalatos e pesticidas são encontrados

no chorume de aterros sanitários (BEHNISCH et al., 2001).

A água potável é outra significativa fonte de exposição à desreguladores

endócrinos. As águas superficiais e de subsolo, principais fontes de água potável,

podem ser contaminadas pela infiltração de substâncias químicas através do solo, na

agricultura ou mesmo em áreas urbanas, ou no descarte de efluentes industrial e

doméstico e sendo que, muitas dessas substâncias não são removidas pelos processos

convencionais de tratamento de água. Muitos desses DE são encontrados em ambientes

20

aquáticos, como as dioxinas e os furanos, que podem ser descartados nas águas

superficiais através de alguns efluentes industriais (BIRKETT e LESTER, 2003).

Estudos demonstram que a aplicação de esterco animal afeta a qualidade das

águas superficiais e de subsolo. PETERSON et al. (2000) reportaram a presença de

17β-estradiol em águas subterrâneas próxima a áreas com alta densidade de criação de

animais (6 a 66 ng.L-1). Os estrogênios são naturalmente excretados pelos animais, ou

são administrados como promotores de crescimento nas criações de animais

(PETERSON et al., 2000, CASEY et al., 2003).

Os efeitos dos desreguladores endócrinos no meio ambiente não dependem

somente das suas concentrações no meio ambiente, mas também de outros fatores, tais

como, a lipofilicidade, persistência, bioacumulação, tempo de exposição, seus

mecanismos de biotransformação e de excreção, etc. Algumas substâncias presentes no

meio ambiente sofrem biotransformação, resultando em metabólitos ou subprodutos

igualmente ou até mais danosos que os compostos originais. Geralmente, os

desreguladores endócrinos persistem no meio ambiente e podem bioacumular, ou

podem ser degradados, tornando-se, porém “persistentes” porque são continuamente

introduzidos no meio ambiente por serem muito usados (MCGOVERN e

MCDONALD, 2003).

A exposição a baixos níveis de desreguladores endócrinos, que bioacumulam com

o tempo pode levar aos seus altos níveis no corpo de animais. Por isso, em uma cadeia

alimentar, os animais que se encontram no topo da cadeia apresentam concentrações

mais altas dessas substâncias no corpo do que os organismos do início da cadeia

alimentar. Pesquisas demonstram que altas concentrações de substâncias químicas são

encontradas no tecido adiposo ou no leite (HARTMANN et al., 1998).

Outros importantes fatores relacionados à exposição de uma substância são

potência e dose. Potência pode ser entendida como a capacidade da substância em

causar uma resposta, neste caso uma resposta hormonal. A dose é a quantidade da

substância que é recebida. Estes fatores são distintos, contudo estão relacionados. Uma

alta dose de uma substância fraca “A”, por exemplo, pode causar o mesmo nível de

resposta, se danoso ou benigno, do que uma baixa dose de uma substância mais potente

“B”. Recebendo doses iguais, essas duas substâncias podem apresentar níveis de

21

respostas diferentes, assim, a diferença das substâncias “A” e “B” é a potência (ACSH,

1999).

Uma fonte de exposição bastante crítica é a presença dessas substâncias químicas

presentes nos organismos das fêmeas que podem ser transferidas aos seus embriões,

fetos ou filhotes através dos ovos, placenta ou leite materno; e assim, afetar o

desenvolvimento fetal. Os hormônios desempenham um papel muito importante no

desenvolvimento embrionário e fetal. Segundo REYS (2001), nos mamíferos alguns

desreguladores endócrinos atravessam a barreira placentária afetando o

desenvolvimento fetal e podem igualmente ultrapassar a barreira hemato-encefálica e

exercer seus efeitos no sistema nervoso. Nos animais aquáticos, a exposição aos

poluentes é inevitável, pois grande parte do ciclo reprodutivo ocorre fora do corpo das

fêmeas, proporcionando um contato direto durante a fase gestacional.

II. 1.6. Ocorrência de Desreguladores Endócrinos no Meio Ambiente

O monitoramento da presença de desreguladores endócrinos no meio ambiente

tem sido realizado em uma grande variedade de estudos em todo mundo. No ambiente

aquático, essas substâncias são encontradas nas águas superficiais e de subsolo,

sedimentos marinhos, solo, efluentes de ETE, lodo biológico das ETE e água potável.

São continuamente introduzidos no meio ambiente em concentrações detectáveis, os

quais podem afetar a qualidade da água, a saúde dos ecossistemas e potencialmente

impactar o suprimento de água potável.

É intensivamente relatado que efluentes de ETE contêm concentrações

consideráveis de estrogênios naturais e sintéticos devido a sua incompleta remoção nos

processos de tratamento de esgoto (DESBROW et al., 1998, TERNES et al., 1999a).

Estudos mostram que outros desreguladores endócrinos, tais como, nonilfenóis

etoxilados, nonilfenol, octilfenol, HAP e bisfenol A, pesticidas também são

identificados em efluentes de ETE e águas superficiais e subterrâneas (BOYD et al.,

2003, HOHENBLUM et al., 2004, KOLPIN et al., 2002, KÖGER et al., 2000).

O bisfenol A e o nonilfenol são fracamente estrogênicos e freqüentemente com

potenciais três ou mais ordens de magnitude menores do que os estrogênios estrona,

22

17β-estradiol e 17α-etinilestradiol. Várias pesquisas sugerem que essas três últimas

substâncias são os maiores responsáveis pela estrogenicidade dos efluentes de ETE

(DESBROW et al., 1998 e JOBLING et al., 1998).

KÖRNER et al. (2000), investigaram a remoção da atividade estrogênica em uma

planta de tratamento de efluente doméstico na Alemanha, determinaram que 90% da

atividade estrogênica foi removida, e somente 2,8% da atividade estrogênica foi

encontrada no lodo biológico, concluindo que a maior parte das substâncias

responsáveis pela estrogenicidade do esgoto doméstico foi de fato biodegradada e não

ficaram adsorvidas nas partículas sólidas ou lodo biológico. Porém, as taxas de

eliminação individuais das substâncias foram diferentes, algumas foram totalmente

removidas enquanto que outras foram ainda detectadas no efluente da ETE, tais como,

bisfenol A, octilfenol e nonilfenol. Outros estudos demonstram uma variação da taxa de

adsorção dessas substâncias no lodo biológico (JOHNSON e SUMPTER, 2001,

TERNES et al., 2001b). A adsorção dessas substâncias no lodo biológico é um

importante caminho para a sua remoção, o que justifica a quantificação da sua adsorção

no lodo biológico de ETE (CLARA et al., 2004, JOHNSON e SUMPTER, 2001,

YAMAMOTO e LILJESTRAND, 2003).

O 4-nonilfenol e o bisfenol A foram detectados em águas superficiais em Portugal

na faixa de 0,03 a 30µg.L-1 e 0,07 a 4,0µg.L-1, respectivamente (AZEVEDO et al.,

2001). O Bisfenol A e ftalatos foram encontrados águas superficiais, sedimentos

marinhos, efluentes de ETE, lodo biológico (FROMME et al., 2002, FÜRHACKER et

al., 2000).

A qualidade da água é fortemente dependente da qualidade dos sedimentos

marinhos, assim, esses últimos podem se tornar fonte em potencial para contaminação

das águas superficiais. Estudos demonstram que os sedimentos marinhos estão

contaminados com vários desreguladores endócrinos, tais como, alquilfenóis, ftalatos,

estrogênios, organoclorados, componentes polibrominados (LEGLER et al., 2002,

PETROVIC et al., 2001). Porém, mais estudos devem ser realizados para se determinar

quais os fatores influenciam na disponibilidade e lançamento dessas substâncias nas

águas.

23

Compostos orgânicos contendo estanho (TBT e TPT) também foram detectados

em águas superficiais e sedimentos marinhos no litoral do Brasil. O TBT se acumula

nos sedimentos em concentrações em média três mil vezes maiores que as detectadas na

água (FERNANDEZ et al., 2002).

O Anexo 1 apresenta uma compilação das concentrações médias ou faixas de

concentração de alguns desreguladores endócrinos detectados no meio ambiente, em

trabalhos conduzidos por diversos autores.

II.1.7. Mecanismos de Ação dos Desreguladores Endócrinos

II.1.7.1. Sistema Endócrino

O sistema endócrino é um dos mais complexos sistemas do corpo humano,

consiste de várias glândulas em diferentes áreas do corpo, incluindo o pâncreas, a

tireóide, os órgãos reprodutores (ovários e testículos), o hipotálamo, a pituitária

(hipófise), a paratireóide, a supra-renal, que produzem hormônios com diferentes

funções. Essas glândulas secretam hormônios que são ativos em receptores de tecidos e

órgãos ao longo do corpo. A Tabela II.3 apresenta as principais funções dos hormônios

nos seres humanos e algumas doenças que podem resultar da superprodução ou escassez

dessas substâncias no corpo.

Os humanos e outros animais vertebrados (mamíferos, pássaros, répteis, anfíbios e

peixes) apresentam muitas semelhanças nas suas glândulas endócrinas e na composição

de seus hormônios, em particular dos hormônios esteróides.

24

Tabela II.3. Principais funções dos hormônios no corpo humano e as doenças resultantes da superprodução ou escassez dessas substâncias.

Principais doenças

Hormônios Lugar de produção

Principais funções que controlam superprodução

Escassez de hormônios /

anormalidades no receptor

Hormônio do crescimento

Glândula pituitária

Aceleração do crescimento

Acromegalia e gigantismo Dwarfismo

Triiodotironina (T3) e tiroxina (T4)

Tireóide

Estimulo do metabolismo

celular, controle da

inteligência e crescimento

Hipertireodismo Hipotireoidismo

Insulina Pâncreas Decréscimo de

açúcar no sangue

Hipoglicemia Hiperglicemia

Hormônios: glicocorticóides, os mineralocorticóides

e os androgênios

Adrenais ou supra-

renais

Controle do metabolismo, imunológico,

etc

Síndrome de Cushing Doença de Addison

Estrogênios (hormônios sexuais

femininos) Ovários

Feminização (menstruação,

glândula mamária),

desenvolvimento dos óvulos e

ovulação

Endometriose, câncer vaginal e

de mama

Desenvolvimento de anomalias na

genitália feminina e desordem menstrual

Andrógenos (hormônios sexuais

masculinos) Testículos

Virilização, desenvolvimen

to de testículos,

espermatogêneses

Prematuro desenvolvimento de características

sexuais secundárias

Desenvolvimento de anomalias na

genitália masculina, e síndrome da feminização

testicular

O sistema endócrino usa os hormônios como carreadores de informações.

Hormônios são poderosas moléculas mensageiras que controlam funções essenciais do

corpo e após serem sintetizados, são transportados pela corrente sangüínea, no estado

livre ou ligados a proteínas, e agem em locais específicos regulando ou alterando

determinados órgãos ou funções, estabelecendo um modo de comunicação entre

diferentes partes do corpo. Estrogênios, progesteronas e testosterona são alguns dos

hormônios chave no sistema endócrino humano.

A insulina regula os níveis de glicose no sangue, outros hormônios afetam

processos bioquímicos como a produção de espermas no homem e o ciclo menstrual na

25

mulher. Os hormônios desempenham um papel fundamental no crescimento e

desenvolvimento, na reprodução e na diferenciação sexual e ainda na formação dos

sistemas nervoso e imunológico.

Os hormônios possuem características únicas e interagem com as células alvo por

diversos meios. Algumas características dos hormônios são citadas a seguir

(http://e.hormone.tulane.edu/learning/targetcells.html, acessado em 22/10/2003):

• Os hormônios naturais são potentes, ou seja, pequenas quantidades são

suficientes para causar uma resposta;

• Um mesmo hormônio pode ser produzido por diferentes glândulas. Por

exemplo, ambos, ovários e glândulas supra-renais, podem liberar os mesmos

estrogênios, ao mesmo tempo.

• Um hormônio pode apresentar diferentes efeitos dependendo da

localização da célula alvo, gênero do indivíduo e a espécie. Por exemplo, o

estrogênio liberado pelo ovário da mulher prepara o útero para o ciclo menstrual,

enquanto o mesmo hormônio se liga a células dos ossos fortalecendo a massa

óssea.

• Os hormônios influenciam a expressão de gene ligando-se ao DNA no

núcleo de uma célula. Ou seja, hormônios ligam-se em certos genes que são pré-

programados para produzir proteínas específicas. Estas proteínas promovem

uma resposta da célula em um novo estímulo (crescer, secretar, metabolizar,

etc.).

• A concentração de hormônios esteróides livres que estão disponíveis

para interagir com seus receptores é regulada por proteínas ligantes

extracelulares (ARNOLD et al., 1996).

Os hormônios não estão presentes somente nos seres humanos, eles também são

encontrados na natureza, como em outros animais e vegetais. O mecanismo pelo qual

eles atuam é semelhante, uma substância pode interferir no mecanismo de ação

hormonal alterando o desenvolvimento, a reprodução e as funções dos seres vivos de

diversas espécies.

26

http://e.hormone.tulane.edu/learning/targetcells.html

II.1.7.2. Os diferentes mecanismos de ação dos DE

O sistema endócrino é complexo e há uma variedade de mecanismos de ações

diferentes pelo quais os desreguladores endócrinos podem interferir com este sistema,

incluindo: (1) mimetização dos efeitos dos hormônios naturais pela ligação nos

receptores hormonais; (2) efeitos antagônicos de hormônios naturais pelo bloqueio do

domínio de ligação hormonal (DLH); (3) pela interferência na síntese de hormônios; (4)

pela alteração dos níveis de receptores e pela interferência com o transporte e

eliminação dos hormônios, (5) outros mecanismos que não são via receptores

hormonais.

A possibilidade de haver ações simultâneas por parte de alguns desreguladores

endócrinos dificulta a investigação dos mecanismos de ação dessas substâncias. Isso

ocorre com as amostras ambientais que apresentam uma complexa mistura de

substâncias, que podem ter o mesmo mecanismo de ação biológica, como diferentes

mecanismos de ações.

Dentre os mecanismos de ação dos desreguladores endócrinos, os mais relatados

são mecanismos de ação via receptores dos hormônios esteróides, outros mecanismos

independentes dos receptores hormonais são pouquíssimos relatados.

II.1.7.2.a. Via receptores de hormônios esteróides.

Um grande número de desreguladores endócrinos interage com os receptores

hormonais e causam uma resposta biológica, e assim, atuam como agonistas ou

antagonistas. Receptores hormonais são moléculas protéicas onde os hormônios se

acoplam formando um complexo ativo hormônio-receptor, que por sua vez, se acoplam

a elementos reguladores do DNA (promotores) iniciando e influenciando a transcrição

genética. Os receptores são suscetíveis à ação das substâncias estrogênicas. Domínio de

ligação hormonal (DLH) é o local da ligação hormonal tanto dos hormônios quanto dos

anti-hormônios.

27

Os efeitos fisiológicos dos hormônios esteróides são relacionados à ativação dos

receptores de estrogênios REα e REβ (um membro da superfamília de receptores

encontrado no núcleo das células) por seus ligantes hormonais, incluindo o 17β-

estradiol. O hormônio acopla-se ao DLH do receptor; por sua vez, o complexo

hormônio-receptor, ativado pela alteração conformacional, acopla-se a regiões controle

(promotores) de genes específicos. Assim, por este meio controlam a transcrição dos

genes alvos e inicia uma série de eventos moleculares que culmina com a ativação ou

repressão do gene alvo (BROSENS e PAKER, 2003, BRZOZOWSKI et al., 1997), um

mecanismo simplificado é apresentado na Figura II.1.

Em outras palavras, a ligação de um esteróide no seu receptor causa uma mudança

conformacional no receptor permitindo ao complexo hormônio-receptor se acoplar a

específicas seqüências de DNA, chamadas de elementos de respostas de estrogênios

(ERE). Uma vez acoplado ao DNA, o complexo hormônio-receptor altera expressões de

genes de respostas. E é através dessa mudança na expressão do gene que os hormônios

esteróides exercem seus efeitos (GAIDO et al., 1997, ZACHAREWSKI, 1997).

17β-estradiol

RE

Transcrição

ERE

Proteínas

Efeitos Extracelular

Efeitos Intracelular

Figura II.1. Mecanismo global de ação dos estrogênios. Estrogênio, tal como o 17β-

estradiol, regula os processos celulares pela ligação no RE no núcleo celular. O receptor

ativado dimeriza e se acopla ao ERE no promotor nos genes alvo iniciando a transcrição

genética.

28

Fato bastante interessante é que o receptor de estrogênio possui uma característica

que o diferencia dos receptores dos demais esteróides. O seu DLH é dobrado em sua

forma helicoidal produzindo uma concavidade tipo dobra de sanduíche, para receber a

molécula do estrogênio. Apesar do arranjo em forma de pinça em volta do anel A dos

esteróides (anel fenólico) impor um pré-requisito aos ligantes de conter um anel

fenólico em sua molécula, o restante da cavidade pode aceitar um número variado de

compostos esteróides e não esteróides, contendo diferentes grupos hidrofílicos. Isto

pode ser atribuído ao tamanho da concavidade do receptor (quase o dobro da molécula

do 17β-estradiol), que poderá ser ocupado por outros compostos de tamanhos espaciais

menores ou maiores que a molécula do 17β-estradiol, desde que possuam um anel

fenólico (www.lucasmachado.com.br/docs/fitoestrogenios_na_menopausa.pdf).

Assim, a conformação do DLH no receptor de estrogênios, possibilita que outras

moléculas diferentes se acoplem e interajam com o RE. A estrutura cristalina do DHL

do receptor de estrogênios humano α (REhα) foi determinada por BRZOZOWSKI et

al., 1997, e é apresentada na Figura II.2. Substâncias agonistas e antagonistas acoplam-

se no mesmo DLH no receptor, porém, apresentam modos de ligação diferentes, bem

como, cada ligante induz a conformações distintas (BRZOZOWSKI et al., 1997).

Figura II.2. Representação da estrutura tridimensional do DLH do RE-α com o 17β-

estradiol acoplado. (a) monômero com a visualização das α-hélices em vermelho e do

17β-estradiol em azul. (b) Dímero. (Figura retirada de BRZOZOWSKI et al. (1997)).

29

Além do mecanismo de ação que uma substância pode interagir diretamente com

os receptores hormonais, e então mimetizar ou bloquear a ação de um hormônio

endógeno há outros mecanismos pelos quais uma substância química pode alterar o

processo mediante receptores hormonais, tais como, a alteração do nível de hormônios

endógenos pela alteração em sua síntese, metabolismo, distribuição ou clivagem. Pode

ainda, alterar a resposta dos hormônios pela alteração dos níveis de receptores ou por

outros caminhos secundários que afetam as funções dos receptores (GAIDO et al.,

1997).

Além disso, as substâncias químicas podem apresentar múltiplas atividades

hormonais, ou seja, uma substância que mimetiza estrogênios pode ter outros

mecanismos de ação, como apresentar uma atividade anti-andrógena. Por exemplo, o

DDT o qual foi originalmente determinado como uma substância estrogênica, também

possui atividade anti-andrógeno (SOHONI e SUMPTER, 1998).

Os desreguladores endócrinos quando interferem no mecanismo de ação dos

hormônios esteróides pela interação com seus receptores hormonais, acoplam-se aos

receptores e mimetizam a ação de um hormônio. Ativando uma resposta mais fraca ou

mais forte do que o hormônio natural, exerce uma ação agonista. Podem acoplar-se a

um receptor e ocupar o ERE impedindo que o hormônio acople-se, bloqueando assim

seus sinais normais, e impedindo que exerça sua função, funcionando assim como

antagonistas, que possivelmente não elucidam uma resposta biológica porque são

incapazes de estabilizar a mudança conformacional ou a interação molecular requeridos

para a ativação. Algumas vezes essas substâncias podem amplificar ou reduzir as

respostas dos hormônios endógenos (BIRKETT e LESTER, 2003). Esses mecanismos

de ação são apresentados na Figura II. 3.

30

Hormônio Desregulador Endócrino

Os hormônios acoplam-se perfeitamente nos receptores e transmitem sinais

indispensáveis às células

Os desreguladores endócrinos ocupam o lugar dos hormônios endógenos enviam

sinais diferentes e fora de tempo às células

E por fim, os mesmos desreguladores hormonais atuam como bloqueadores dos sinais normais dos hormônios que

seriam enviados às células.

Receptor específico

Figura II.3. Mecanismos de atuação dos DE (imagem copiada e modificada de

http://acpo94.sites.uol.com.br/interferentes_hormonais.htm, acessado em 12/09/2003).

Dentre os mecanismos de ação dos desreguladores endócrinos, tem sido muito

investigado a interação direta com os receptores dos hormônios esteróides que é

suspeito de alterar as funções endócrinas, causando alterações na capacidade

reprodutiva, infertilidade, endometriose e diversos tipos de câncer (GAIDO et al.,

1997). Essa capacidade de acoplar-se ao receptor do hormônio esteróide é denominada,

por alguns autores, de atividade biológica. Dos mecanismos de ação, a atividade

estrogênica, que é a capacidade de uma substância se ligar ao receptor de estrogênios e

elucidar uma resposta, é atualmente o mais largamente estudado.

Uma variedade de produtos sintéticos é capaz de interagir com o receptor de

estrogênio. Os pesticidas, como o DDT e componentes de plásticos como o nonilfenol,

mimetizaram a ação de estrogênios endógenos em testes com animais de laboratório

(COLBORN, et al., 1993).

31

http://acpo94.sites.uol.com.br/interferentes_hormonais.htm

Estudos evidenciam que algumas anomalias no sistema reprodutivo de machos

podem ser relacionadas com mecanismos via receptor de andrógeno (SOHONI e

SUMPTER, 1998). Pelo bloqueio da ação do andrógeno, a exposição aos chamados

anti-andrógenos pode causar mudanças similares às associadas com a exposição a

substâncias estrogênios.

Certos desreguladores endócrinos ligam-se às proteínas, reduzindo a

disponibilidade destas para o transporte de hormônios através do sangue. Outros alteram

os níveis de hormônios endógenos acelerando sua ruptura e eliminação, ou desativando

as enzimas que facilitam sua ruptura; alguns reagem diretamente com os hormônios

alterando suas estruturas, afetando sua síntese ou sua eliminação natural.

Os vários mecanismos de ação que os desreguladores endócrinos podem

apresentar são descritos na Tabela II.4. Como são vários os mecanismos de ação dos

desreguladores endócrinos, algumas vezes, é difícil determinar como essas substâncias

afetam o funcionamento de alguns hormônios endógenos no corpo. Contudo, no meio

ambiente podem ainda apresentar outros efeitos que explicam como essas substâncias

podem atuar e assim apresentar os efeitos biológicos, tais como os efeitos citados abaixo

(http://archive.greenpeace.org/toxics/reports/ptf/ptf.html, acessado em 30/10/2003):

• Persistência e bioacumulação: Alguns desreguladores endócrinos

bioacumulam no tecido adiposo dos animais e humanos, alcançando níveis que

podem ser mais altos do que os níveis encontrados no meio ambiente. Alguns são

também persistentes, e levam longos tempos para degradar e assim, permanecem no

corpo por vários anos. Como resultados disso, algumas substâncias com essas

propriedades alcançam níveis no corpo de animais e humanos muitas vezes maiores

do que os níveis dos hormônios naturais no corpo.

• Misturas de substâncias: No meio ambiente, humanos e animais são expostos,

não a desreguladores endócrinos individuais, mas a misturas complexas de diferentes

desreguladores endócrinos. Conseqüentemente é possível que a ação dessas

substâncias juntas se adicione e cause efeitos cumulativos, ou sinérgicos.

32

http://archive.greenpeace.org/toxics/reports/ptf/ptf.html

Tabela II.4. Diferentes mecanismos de ação dos DE. Mecanismo de

ação Definição Efeito

Mimetização (Agonista)

Mimetizando um hormônio natural, um DE pode acoplar-se ao receptor de hormônio.

Pela ocupação do sítio receptor, podem ser enviadas mensagens aos genes receptores, que enviadas no momento errado, ou superprodução de mensagens tem efeitos adversos nas funções biológicas. Agem com esse mecanismo as substâncias estrogênicas pela interação com o RE.

Bloqueio (Antagonista)

Pela ocupação do receptor hormonal, alguns DE são capazes de bloquear a ligação do hormônio natural.

Impedem que o hormônio exerça sua função. Pode ainda, ter um aumento ou decréscimo no efeito, dependendo se o bloqueador é mais ou menos potente do que o hormônio bloqueado. Agem assim, substâncias que interferem na ação do hormônio masculino, impedindo a ação androgênica do mesmo. Ex. DDT. São conhecidos como “substância anti-androgênica”.

Depleção de hormônios

Acelerando a clivagem de um hormônio e sua eliminação, que conduz a depleção da concentração desse hormônio no corpo

Ex. a dioxina e alguns PCB atuam desta forma, resultando em baixas concentrações dos hormônios da tiróides, insulina e andrógenos.

Estimular Estimulam a formação de mais receptores

de hormônios dentro da célula, gerando múltiplos sinais.

Esse efeito conduz a uma amplificação, tanto do hormônio natural, como do DE.

Inibição de enzimas

Interferência com as enzimas que são responsáveis pela ruptura de hormônios no corpo.

Pela desativação de enzimas necessárias para eliminação de hormônios, mais hormônios do que os necessários permanecem ativos. Sua contínua presença no corpo envia mais sinais do que o normal ou sinais em momentos impróprios. Hiperestimulação dos receptores pelos hormônios naturais que não são metabolizados e permanecem no corpo.

Destruição

Destruição do hormônio ou da capacidade do hormônio de executar a sua função, alterando sua estrutura direta ou indiretamente, faz com que o hormônio não se encaixe no sítio receptor. Adicionalmente, podem ocorrer alterações nos padrões de síntese dos hormônios.

Com a destruição de determinados hormônios há um desbalanceamento hormonal e resultando em maiores concentrações de um determinado hormônio e diminuição da atividade dos hormônios naturais afetados.

Por exemplo, pode haver a redução do nível de testosterona e conseqüentemente o nível de estrogênio ficará acima. Exemplo disso é a feminização de peixes machos.

33

0

• Associação com proteínas: Cerca de 90% dos estrogênios naturais circulam no

sangue ligados a proteínas. Os estrogênios que permanecem livres são capazes de se

difundir nas células e exercer efeitos biológicos. Alguns desreguladores endócrinos

não se ligam as proteínas, permanecendo 100% dessas substâncias circulando

livremente no sangue para se difundir nas células e exercer efeitos.

• Múltiplos caminhos de ação: Alguns desreguladores endócrinos podem não

somente exercer seus efeitos por um único mecanismo, tal como, mimetizar, mas

podem causar efeitos através de dois ou mais mecanismos, amplificando seu

potencial.

Quando os efeitos acima são considerados, fica claro que, ainda que essas

substâncias sejam muito menos potentes do que os hormônios endógenos e estejam

presentes em baixas concentrações no meio ambiente, os desreguladores endócrinos

podem apresentar ameaça à saúde de animais e humanos.

Para muitas substâncias, um aumento na concentração acarreta um aumenta dos

efeitos tóxicos. Entretanto, para os desreguladores endócrinos, os maiores efeitos podem

ocorrer em baixas concentrações. Isto porque os hormônios normalmente são efetivos

em baixas concentrações, pois os receptores têm uma afinidade muito grande para um

hormônio específico, de forma que baixas concentrações são necessárias para se obter

uma resposta. Apesar da sua alta afinidade por hormônios, esse receptor pode se ligar a

outras substâncias químicas. Assim, desreguladores endócrinos presentes em baixas

concentrações podem causar um efeito e elucidar uma resposta (BIRKETT e LESTER,

2003).

III.1.7.2.b. Mecanismos independentes dos receptores hormonais

Outros mecanismos de ação independente da interação com os receptores dos

hormônios esteróides são pouquíssimos relatados. FISHER (2004) relata dois

mecanismos de ação associados à exposição aos desreguladores endócrinos, que não são

via receptor de estrogênio, são eles, a supressão de síntese de testosterona fetal em

roedores expostos in utero por ftalatos e a capacidade de várias substâncias químicas

34

interferirem com o metabolismo de esteróides pela inibição da enzima sulfotransferase

(enzima envolvida no metabolismo dos hormônios esteróides).

II.1.7.3. Atividade estrogênica

Vários são os mecanismos de ação pelo qual um desregulador endócrino pode

causar alterações no sistema endócrino. A capacidade de uma substância acoplar-se ao

RE e em elucidar uma resposta estrogênica é um deles, conhecida como atividade

estrogênica.

Muitas vezes, faz-se uma comparação entre a estrutura química do 17β-estradiol

com as substâncias que também apresentam atividade estrogênica. A posição relativa do

grupo hidroxila fenólico (OH) no anel A é considerada crucial para a alta afinidade da

ligação com o receptor de estrogênio e a estrogenicidade in vivo (BIRKETT e LESTER,

2003).

Nos ensaios de atividade estrogênica, a potência estrogênica relativa de uma

substância é comparada com o estrogênio padrão humano 17β-estradiol, que representa

o padrão pelo qual a atividade estrogênica é medida.

A afinidade de ligação de uma substância no RE tem sido investigada para

inúmeras substâncias suspeitas de causar alguma perturbação no sistema endócrino.

Esta afinidade tem sido avaliada, em ensaios in vitro e in vitro, para substâncias como

fitoestrogênios, estrogênios sintéticos e substâncias sintéticas. Há uma significativa

diferença na afinidade das diferentes substâncias químicas pelo RE, com isso, há

substâncias que apresentam estrogenicidade fraca ou forte. O 17β-estradiol é usado

como controle positivo em ensaio in vitro, para avaliar a atividade estrogênica das

substâncias químicas simples ou amostras complexas.

II.1.7.4. Relação estrutura-atividade biológica

Resultados de vários ensaios in vitro e in vivo demonstram que diferentes tipos de

estruturas de substâncias naturais e sintéticas agem como desreguladores endócrinos.

35

Essas substâncias atuam por diferentes mecanismos de ação, sendo o mais estudado a

atividade estrogênica.

O RE pode ser acoplado por uma variedade de compostos não-esteróides, os quais

são estruturalmente análogos ao fenol do 17β-estradiol. Assim, a atividade biológica de

uma substância pode estar associada com sua estrutura química. A característica

estrutural mais proeminente identificada para a atividade estrogênica é um grupamento

polar capaz de fazer ponte de hidrogênio (isto é a hidroxila) em um sistema aromático

(HAMBLEN et al., 2003). Estudos de relação estrutura-atividade sugerem que quando o

17β-estradiol é acoplado ao receptor de estrogênio, há somente um encaixe perfeito ao

final do anel fenólico do esteróide.

Devido à estrutura similar com o anel fenólico do 17β-estradiol, algumas

substâncias químicas estão sendo relacionadas com a atividade estrogênica, tais como

PCB, alquilfenóis (nonilfenol e octilfenol), bisfenol A, fitoestrogênios (HU e AIZAWA,

2003, ROUTLEDGE e SUMPTER, 1997, SCHULTZ, 2002) entre outras. O número e a

posição do grupo hidroxila na estrutura molecular são importantes fatores que

contribuem para uma forte ligação no RE e na resultante atividade estrogênica (WANG

e LOU, 2004). Segundo ROUTLEDGE e SUMPTER (1997), a posição e a ramificação

do substituinte dos compostos fenólicos alquil-substituídos afetam a sua

estrogenicidade.

Alguns estudos investigam a estrutura química característica de uma substância

que será responsável por sua atividade estrogênica (ROUTLEDGE e SUMPTER, 1997,

SCHULTZ, 2002). Este tipo de análise correlaciona uma estrutura química

característica com uma atividade biológica e os modelos derivados dessas relações

podem ser usados para predizer a atividade não testada de um contaminante ambiental

(BLAIR et al., 2000). Em inglês é denominada de QSAR. Essa ferramenta investiga a

estrutura característica responsável pela atividade estrogênica de uma substância

química baseada em ensaios in vitro e in vivo.

O QSAR (Quantitative Structure-Activity Relationship) tem sido utilizado por

alguns pesquisadores, como uma ferramenta de análise inicial a priori aos ensaios in

vivo e in vitro para estimar a atividade estrogênica de substâncias químicas presentes no

meio ambiente. Esta técnica pode ainda fornecer informações sobre o mecanismo da

36

ação dessas substâncias. O QSAR é o estudo das relações entre estrutura e atividade

biológica dos compostos químicos

II.1.7.5. Efeitos de combinação aditivos

Provavelmente, o efeito potencial de uma substância em uma mistura é diferente

do efeito de uma substância simples. SUMPTER e JOBLING (1995) concluíram que a

combinação de substâncias estrogênicas é consideravelmente mais potente do que cada

substância estrogênica sozinha.

Alguns autores (RAJAPAKSE et al., 2001, SILVA et al., 2002) tentam

desenvolver metodologias para estimar os efeitos esperados de uma mistura. Essa

avaliação pode depender de alguns fatores, tais como, potência dos componentes da

mistura e a relação resposta-concentração (razão de mistura) de uma substância em uma

mistura, como também de efeitos como sinergismo e antagonismo que podem desviar os

efeitos esperados. Misturas sinérgicas mostram-se maior, e misturas antagônicas menor,

do que os efeitos esperados.

RAJAPAKSE et al (2001) avaliaram se substâncias estrogênicas fracas (bisfenol

A e DDT) quando combinadas com o 17β-estradiol contribuem para o efeito de mistura

global, ou seja, investigaram se essas substâncias estrogênicas fracas podem fazer

alterações na intensidade dos efeitos do 17β-estradiol. Nesse estudo foi demonstrado

que o efeito de combinação da mistura dessas três substâncias é aditivo. Substanciais

alterações na intensidade (aumento) dos efeitos do 17β-estradiol, quando combinado

com o DDT e o bisfenol A, foram observadas. Concluíram ainda que o impacto das

substâncias estrogênicas na ação dos hormônios esteróides depende da razão de mistura

e de sua potência relativa ao 17β-estradiol.

II.1.8. Efeitos Causados pela Exposição aos Desreguladores Endócrinos

Recentemente, muitos efeitos causados pelos desreguladores endócrinos presentes

no meio ambiente têm sido relatados, incluindo: 1) anomalias no sistema reprodutivo de

animais (peixes, répteis e pássaros); 2) indução da síntese de vitelogenina (VTG) no

37

plasma de peixes, que tem sido usado como um biomarcador em águas com

contaminação por efluentes de ETE e 3) efeitos na saúde de humanos, tais como,

redução na produção de esperma e aumento da incidência de câncer.

Os riscos em potencial dos desreguladores endócrinos têm sido o tema de vários

debates internacionais e pesquisas científicas (ACSH, 1999, CSTEE, 1999, COLBORN

et al., 1993, GOLDMAN et al., 2000, UBA, 1996, US EPA, 1997). O ponto principal

desta questão é se há evidências significativas de que essas substâncias possam causar

efeitos danosos em animais e humanos e se há níveis suficientes de desreguladores

endócrinos no meio ambiente para exercer esses efeitos.

II.1.8.1. Efeitos relatados em animais silvestres e de laboratório

Vários estudos relacionam a contaminação ambiental de rios e lagos com algumas

anomalias no sistema reprodutivo e no desenvolvimento de espécies de animais. A

exposição aos desreguladores endócrinos pode ser responsável por alterações

fisiológicas e histológicas em animais silvestres e de laboratórios, incluindo: (1)

alterações nos níveis de VTG (vitelogenina) no plasma sangüíneo, (2) feminização de

peixes machos, (3) indução ao hermafroditismo, (4) inibição no desenvolvimento das

gônadas e (5) declínio na reprodução. Essas e outras anomalias reportadas em várias

espécies de animais são apresentadas na Tabela II. 5 e II.6.

Vários estudos demonstram que organismos aquáticos respondem com a indução

da síntese de VTG à exposição a determinadas concentrações de estrogênios (FOLMAR

et al. 2000, GAGNÉ et al., 2001, THOMPSON et al. 2000). No estudo de THOMPSON

et al. (2000) três espécies de peixes (Oryzia latipes, Morone saxatalis x Morone

chrysops e Ictalurus punctatus) foram expostas a concentrações de 17β-estradiol de 10 a

100 ng.L-1 por 21 dias, resultando na indução de VTG no plasma para todas as espécies.

38

Tabela II.5. Efeitos e anomalias atribuídos aos DE. Espécie Contaminante Efeitos Referência

Bisfenol A Deformidades no sistema reprodutivo de ratos MARKEY et al., 2003

PCB Alta mortalidade de golfinho AGUILAR e BORREL, 1994 Mamífero

DDT Anomalias no sistema reprodutivo de ratos BITMAN et al., 1968

Réptil DDE e DDT

Concentrações anormais de hormônios sexuais no plasma

(baixa concentração de testosterona), anomalias

morfológicas nas gônadas (redução no tamanho do pênis)

em jacarés.

GUILLETTE et al., 1996 e 1999, MILNES

et al., 2002

Mexilhão Efluente de ETE

Indução a síntese de VTG no sangue e anomalias no

crescimento da concha dos mexilhões

GAGNÉ et al., 2001

Moluscos TBT e TPT Surgimento de órgãos sexuais

masculinos em fêmeas - imposex e esterilização

FERNANDEZ et al., 2002

Tartaruga 17β-estradiol Indução a síntese de VTG no

sangue e alterações na produção de ovos.

IRWIN et al., 2001

Pesticidas Decréscimo da fertilidade FRY, 1995

DDT Feminização gaivotas machos FRY e TOONE, 1981 Pássaro

DDT Anomalias no sistema reprodutivo BITMAN et al., 1968

Herbicida (atrazina)

Anomalias no sistema reprodutivo e declínio na

população DALTON, 2002

Anfíbio Efluente de

ETE Indução a síntese de VTG no sangue e hermafroditismo. BOGI et al., 2003

39

Tabela II.6. Efeitos e anomalias em peixes atribuídos aos DE. Espécie Contaminante Efeitos Referência

Feminização de peixes ALLEN et al.,1999 Declínio na reprodução ROBINSON et al.,2002

Efluente de ETE

Indução a síntese de VTG

LARSSON et al., 1999, RODGER-GRAY et al., 2000,

SOLE et al., 2000, 2001 e 2003, ALLEN et al.,1999,

PANTER et al., 1998

Feminização de peixes RODGER-GRAY et al., 2001,

KÖGER et al., 2000, KNÖRR e BRAUNBECK, 2002

Alteração nas gônadas PANTER et al., 2000

Hermafroditismo HARTLEY et al., 1998, KÖGER et al., 2000

Incidência de testículo-óvulos nas gônadas KANG et al., 2002

Declínio na reprodução SHIODA e WAKABAYASHI., 2000, KÖGER et al., 2000

Inibição do crescimento testicular PANTER et al., 1998

Mortalidade elevada dos descendentes

KNÖRR e BRAUNBECK, 2002

17β-estradiol

Indução a síntese de VTG

PANTER et al., 2000, MONCAUT et al., 2003,

ROUTLEDGE et al., 1998, ROSE et al., 2002

Indução a síntese de VTG PANTER et al., 1998, ROUTLEDGE et al., 1998 Estrona Inibição do crescimento

testicular PANTER et al., 1998

Indução a síntese de VTG SCHMID et al., 2002, ROSE et al., 2002, FOLMAR et al.,2000

Mortalidade da espécie SCHMID et al., 2002 17α-

etinilestradiol Declínio na reprodução ROBINSON et al.,2002

bisfenol A e DEHP (ftalato) Declínio na reprodução SHIODA e WAKABAYASHI.,

2000

Declínio na reprodução SHIODA e WAKABAYASHI, 2000

Indução a síntese de VTG JOBLING e SUMPTER, 1993, ROUTLEDGE et al., 1998 Nonilfenol,

octilfenol e butilfenol Mortalidade elevada dos

descendentes e feminização de peixes

machos

KNÖRR e BRAUNBECK, 2002

DES Indução a síntese de VTG no sangue FOLMAR et al., 2000

Peixe

4-tert-pentilfenol

Feminização de peixes machos GIMENO et al., 1998

40

Segundo SCHMID et al. (2002) altos níveis de VTG no plasma podem causar a

mortalidade de peixes. Em seu estudo, peixes da espécie Pimephales promelas foram

expostos a 50 ng/L de 17α-etinilestradiol por 35 dias, seguidos por igual período de

depuração. Foi observado que a mortalidade de peixes ocorreu entre o 20o e o 36o dia de

exposição, que coincidiu com o período no qual foram observados os maiores níveis de

VTG no plasma.

No estudo de ROUTLEDGE et al. (1998), duas espécies de peixes, Oncorhynchus

mykiss e Rutilus rutilus, foram expostas por 21 dias a concentrações de 17β-estradiol e

estrona ambientalmente relevantes (1, 10, 100 ng.L-1). De acordo com esses e outros

pesquisadores, os resultados confirmaram que os estrogênios identificados em efluentes

domésticos estão presentes em quantidades suficientes para induzir a síntese de VTG

nas espécies de peixes (DESBROW et al., 1998).

A indução da síntese de VTG não ocorre só em espécies de peixes, mas também

em outras espécies de animais. Concentrações ambientalmente relevantes de 17β-

estradiol são suficientes para induzir a síntese de VTG em tartarugas (IRWIN et al.,

2001). Em outro estudo, GAGNÉ et al. (2001) concluíram que efluentes de ETE contêm

estrogênios em níveis suficientes para elucidar efeitos, dentre estes a indução da síntese

do VTG em mexilhões (Elliptio complanata).

Pesquisas têm demonstrado que essas concentrações presentes no meio ambiente,

embora muito baixas, são suficientes para elucidar uma resposta hormonal em uma

variedade de espécies de animais, tais como peixes machos expostos a baixíssimos

níveis de estrogênios (1,0 ng.L-1), seja intermitente ou continuamente, exibem respostas

estrogênicas, tal como a indução à síntese da proteína vitelogenina (VTG) (RODGER-

GRAY et al., 2001, HANSEN et al., 1998).

Anomalias no sistema reprodutivo de jacarés jovens que vivem em lagos da

Flórida contaminados, tais como, concentrações anormais de hormônios sexuais no

plasma (baixa concentração de testosterona) e anomalias morfológicas nas gônadas

(redução no tamanho do pênis), têm sido bastante relatadas (MILNES et al., 2002,

GUILLETTE et al., 1996 e 1999). A causa dessas anomalias pode estar relacionada com

a presença de substâncias estrogênicas e anti-andrógenas. O principal contaminante

41

encontrado nesses jacarés é o DDE, o mais persistente metabólito do DDT

(GUILLETTE et al., 1999).

Outros organismos aquáticos também têm efeitos no sistema endócrino resultante

da exposição de TBT, como por exemplo, os moluscos (caramujos e lesmas) que vivem

no litoral brasileiro. Compostos orgânicos contendo estanho, TBT e TPT, oriundos da

tinta dos cascos das embarcações estão provocando o surgimento de órgãos masculinos

em fêmeas, o fenômeno conhecido como imposex – imposição sexual – é irreversível e

provoca a esterilização da população dos animais, podendo causar declínio considerável

nas populações de espécies mais sensíveis. Esses compostos orgânicos contendo

estanho interferem na síntese da testosterona (hormônio masculino), causando um

aumento na sua produção nas fêmeas. Essa alteração hormonal faz surgir estruturas

sexuais masculinas não funcionais, mantendo-se, porém a anatomia interna do

organismo (FERNANDEZ et al., , 2002).

São relatados também efeitos adversos no sistema reprodutivo de pássaros

expostos aos desreguladores endócrinos como, pesticidas (DDT, dicofol) e PCB,

resultando em anomalias em embriões machos e fêmeas como, por exemplo, a

feminização dos machos (FRY, 1995).

Os peixes têm sido usados como um modelo para detectar os efeitos de

desreguladores endócrinos no desenvolvimento de anomalias no sistema reprodutivo.

Peixes de espécies Oryzias latipes, são excelentes organismos para estudos de

reprodução, pois apresentam a diferenciação sexual antes da eclosão dos ovos, podem

reproduzir todos os dias sob apropriadas condições e levam poucos meses para atingir a

maturidade (KANG et al.,2002, SHIODA e WAKABAYASHI., 2000). Além disso, a

exposição a substâncias estrogênicas pode causar a feminização de peixes se a

exposição ocorrer durante o período crítico da diferenciação sexual. Isso foi observado

em espécies de peixes, como Cyprinus carpio (GIMENO et al., 1998a) e Rutilus rutilus

(JOBLING et al., 1998).

Efluentes de ETE vêm sendo apontados como a maior causa de efeitos

estrogênicos em peixes. RODGRES-GRAY et al. (2000) observaram um aumento nos

níveis de VTG no plasma de peixes da espécie Rutilus rutilus quando expostos ao

efluente de ETE do Reino Unido. Neste efluente foi detectada a presença dos

42

estrogênios 17·-estradiol, estrona e 17α-etinilestradiol nas concentrações de 4, 50 e 1,7-

3,4 ng.L-1 respectivamente.

De acordo com estudos de PANTER et al (1998) e PANTER et al. (2000),

concentrações baixas de 17β-estradiol e estrona, similares às concentrações encontradas

em efluentes, causaram efeitos em peixes machos (Pimephales promelas). Os efeitos

relatados foram à indução da síntese de VTG e o desenvolvimento das gônadas

(inibição testicular) quando expostos a concentrações na faixa de ng/L.

HARTLEY et al. (1998) utilizaram o desenvolvimento das gônadas de peixes

Oryzias latipes para avaliar os efeitos das substâncias com atividade estrogênica

baseados na indução do hermafroditismo. Os peixes foram expostos a concentrações de

17β-estradiol de 4,0; 29,4 e 115,6 µg.L-1 por 48 horas. Os resultados mostraram que em

concentrações de 4,0 e 29,4 µg.L-1 ocorreu 53% de desenvolvimento de

hermafroditismo, e que com a maior concentração de estradiol houve uma mortalidade

de 90%, sendo que dos três peixes sobreviventes, dois eram fêmeas e um hermafrodita.

Pouco é conhecido sobre a exposição de organismos em ambientes aquáticos a

substâncias com atividade estrogênica presentes em sedimentos marinhos. LEGLER et

al. (2002) demonstraram que as substâncias com atividade estrogênica não só são

importantes na fase aquosa, mas também pode acumular-se em sedimentos marinhos.

No estudo de JANSSEN et al. (1997), peixes da espécie Platichthys flesus foram

expostos a sedimentos contaminados, resultando em um prematuro aumento dos níveis

de VTG no plasma dos peixes fêmeas.

Embora as concentrações dessas substâncias nos efluentes sejam baixas (da ordem

de ng.L-1 e µg.L-1), estas são suficientemente elevadas para induzir a síntese de VTG em

peixes machos e outros tipos de anomalias no sistema reprodutivo de organismos

terrestres e aquáticos. E ainda, os efeitos causados no sistema reprodutivo de espécies

de animais podem conduzir a uma diminuição do tamanho da população a um nível

crítico, o qual pode eventualmente causar a extinção da população.

Como reportado, peixes machos expostos a efluente de ETE ou que vivem em rios

com despejos de efluentes de ETE tiveram um aumento dos níveis de VTG no plasma e

hermafroditismo. Isso confirma que efluentes de ETE são rotas importantes de

43

lançamento de substâncias estrogênicas no meio ambiente (JOBLING et al., 1998,

RODGERS-GRAY et al., 2000 e 2001, DESBROW et al., 1998). Segundo JOBLING et

al. (1998) há indícios fortes de que a incidência do hermafroditismo é devida a

feminização de peixes geneticamente machos e não pela androgenização de fêmeas

genéticas.

Estudos que investigam os efeitos causados no sistema reprodutivo de peixes e em

outras espécies de animais são de grande importância para determinar o potencial de

risco de um desregulador endócrino, avaliando as anomalias na reprodução

propriamente dita dos animais. Já, os ensaios in vitro e alguns in vivo são usados para

determinar somente a resposta estrogênica de uma substâncias ou amostra ambiental,

porém, não indicam adequadamente se a substâncias irá causar efeitos adversos nos

animais expostos. Por exemplo, a relação entre os ensaios que se baseiam na interação

com os RE e na subseqüente ativação de uma resposta estrogênica ou no aumento dos

níveis de VTG no sangue de peixes machos, e as anomalias causadas no sistema

reprodutivo de peixes ainda não está claro.

II.1.8.2. Efeitos relatados em humanos

Uma variedade de substâncias é suspeita de causar efeitos adversos na saúde

humana, resultando em alterações no sistema endócrino, incluindo efeitos no sistema

reprodutivo feminino (diferenciação sexual, função dos ovários, aumento no risco de

câncer de mama e vagina, ovários policísticos e endometriose) e no sistema reprodutivo

masculino (redução na produção de esperma, aumento do risco de câncer testicular e de

próstata, infertilidade e alterações nos níveis hormonais da tireóide). Esses e outros

efeitos foram revisados em alguns estudos (DASTON et al., 1997, HARRISON et al.,

1997, US. EPA, 1997, WEBER et al., 2002).

O desenvolvimento e as funções do sistema reprodutivo feminino dependem do

balanço e concentrações dos hormônios (estrogênios, andrógenos e tireoidianos), assim,

uma disfunção no sistema endócrino pode resultar em algumas anomalias, tais como,

irregularidades no ciclo menstrual, prejuízos na fertilidade, endometriose e ovários

policísticos (para revisão veja NICOLOPOULOU-STAMATI e PITSOS, 2001).

44

Os esteróides podem, em alguns casos, estar envolvido na iniciação de um tumor,

e induzirem eventos críticos na “progressão” maligna destes cânceres (DICKSON e

LIPPMAN, 1986). Alguns tipos de câncer podem estar ligados à exposição inadequada

e/ou prolongada a hormônios endógenos ou substâncias estrogênicas, pois a proliferação

celular, devido aos estrogênios aumenta o que leva ao aumento da probabilidade de

mutações ocorrerem durante a síntese de DNA.

Sabe-se que os desreguladores endócrinos têm a capacidade de modular, alterar a

intensidade desses hormônios, no entanto resta saber se essas substâncias podem

realmente afetar as funções do sistema reprodutivo feminino. O uso de DES em

mulheres grávidas na década de 1970s, e no então desenvolvimento de várias anomalias

no sistema reprodutivo feminino de meninas nascidas de mães que fizeram uso desse

medicamento (tais como câncer vaginal, gravidez anormal e redução na fertilidade) é

sem dúvida uma evidência dos efeitos à exposição de estrogênios.

Vários grupos de pesquisas sugerem que grande parte da população sofre com o

decréscimo na qualidade do sêmen nas últimas décadas. Contudo, as evidências desse

declínio ainda não estão bem claras. De 1973 a 1992, AUGER et al. (1995) analisaram a

qualidade do sêmen de um grupo de homens férteis saudáveis, levando em conta o

volume do fluido seminal, a concentração de espermas e a mobilidade e morfologia do

espermatozóide. Os autores observaram um declínio na concentração e mobilidade do

esperma nos homens estudados em um período de 20 anos, e esse decréscimo da

qualidade do sêmen coincide um aumento na incidência de anomalias no sistema

reprodutivo masculino, incluindo câncer testicular. O aumento da incidência de câncer

testicular também tem sido relatado por outros autores (WEBER et al., 2002).

Apesar de alguns pesquisadores sugerirem que não há relação entre a exposição

aos desreguladores endócrinos e alguns efeitos danosos em humanos, tal como a

incidência de câncer de mama (SAFE, 1995 e 2004), revisões indicam que há claras

evidências experimentais e epidemiológicas do papel dessas substâncias na disfunção no

sistema reprodutivo humano (DAVIS et al., 1993, DICKSON e LIPPMAN, 1986,

NICOLOPOULOU-STAMATI e PITSOS, 2001, WEBER et al., 2002).

No que diz respeito aos efeitos sobre a saúde humana, o Comitê Científico da

Toxicidade, Ecotoxicidade e Ambiente (CSTEE, 1999) concluiu que há associações

45

entre algumas substâncias causadoras de desregulação endócrina e alterações na saúde

humana, tais como, o câncer de testículo, de mama e de próstata, o declínio das taxas de

espermatozóides, deformidades dos órgãos reprodutivos, a disfunção da tiróide.

II.1.8.3. Efeitos em fetos ou espécies jovens

Durante os estágios prematuros da vida, na fase fetal e no desenvolvimento

jovem, os hormônios são os principais responsáveis pelo controle e desenvolvimento de

alguns tecidos e órgãos, incluindo os sistemas reprodutivo, imunológico e nervoso. As

crianças e animais jovens são as espécies que talvez apresentem os maiores riscos

quando expostos aos desreguladores endócrinos, pois, durante este estágio crítico de

desenvolvimento, podem causar desequilíbrios hormonais, acarretando problemas que

podem ser pronunciados mais tarde (SOLOMON e SCHETTLER, 2000, WEBER et al.,

2002).

Como o desenvolvimento dos sistemas reprodutivos feminino e masculino ocorre

na fase fetal, anomalias podem estar relacionadas ao aumento da exposição de

substâncias estrogênicas in utero (WEBER et al., 2002). A exposição a essas

substâncias pode, por exemplo, comprometer a produção dos hormônios responsáveis

pelo sistema reprodutivo.

Durante o seu desenvolvimento, o feto é particularmente vulnerável a flutuações

hormonais. A exposição a baixas concentrações de hormônios endógenos pode resultar

em mudanças fisiológicas permanentes, que não são observadas em adultos quando

expostos aos mesmos níveis (SOLOMON e SCHETTLER, 2000). A exposição a essas

substâncias durante o desenvolvimento embrionário pode induzir, tanto a efeitos

catastróficos (mortalidade e câncer) quanto a efeitos sutis (mudança nas funções das

enzimas), que são capazes de desorganizar a diferenciação das células e órgãos

(GUILLETTE et al., 1996).

Algumas disfunções sexuais são verificadas em recém nascidos cujas mães

tiveram contado com substâncias suspeitas de serem desreguladores endócrinos. Alguns

efeitos relatados dessas substâncias podem afetar não só os indivíduos expostos, como

46

também a população ou sub-população a que pertencem, pelos efeitos propagados na

sua descendência.

Alguns pesquisadores afirmam que as evidências da relação dos desreguladores

endócrinos são ainda pequenas ou não existem. Entretanto, para outros as implicações

potenciais para a saúde humana e para outras numerosas espécies de animais é um fato.

Dentre elas, podemos citar a exposição ao DDT e DDE que fizeram com que jacarés na

Flórida desenvolvessem anomalias no sistema reprodutivo (GUILLETTE et al., 1996); e

o desenvolvimento de anomalias no sistema reprodutivo de mulheres que foram

expostas in utero ao DES (BIRKETT e LESTER, 2003).

II.1.9. Estrogênios Naturais e Sintéticos

II.1.9.1. Hormônios sexuais

Os hormônios esteróides são produzidos nas glândulas endócrinas e são

excretados diretamente na corrente sangüínea, estimulando ou inibindo a atividade

metabólica em outros tecidos ou órgãos. Os hormônios sexuais, que controlam a

maturação e a reprodução, podem ser classificados em três grupos principais: (1) os

hormônios sexuais femininos, tais como, estrogênios e progesteronas, (2) os hormônios

sexuais masculinos, tais como, androgênios e (3) corticosteróides, que são divididos em

glicocorticóides e mineralocorticóides.

Todos os hormônios esteróides exercem sua ação pela passagem através da

membrana plasmática e acoplam-se a receptores intracelulares. (YING et al., 2002). Os

hormônios esteróides são um grupo de substâncias ativas biologicamente que são

sintetizadas a partir do colesterol, e tem em comum uma estrutura de anel básica,

constituída de três anéis hexagonais (A, B, C) e um anel pentagonal (D), como

apresentado na Figura II.4. Os estrogênios são caracterizados por seu anel A fenólico, o

qual tem o grupamento hidroxila no carbono 3 e é o que lhe confere à atividade

biológica, neste caso a atividade estrogênica, e uma cetona ou um grupamento hidroxila

no carbono 17. São também referidos como esteróides C18, por apresentar 18 carbonos

em sua estrutura. A biosíntese dos estrogênios naturais é apresentada na Figura II.5.

47

OH

HO

CH3

A B

C D12

34

56

7

8910

1112

1314

15

16

17

18

Figura II.4. Estrutura química do 17β-estradiol

Os estrogênios naturais são secretados pelos ovários e promovem o

desenvolvimento das características femininas secundárias que aparecem no início da

puberdade, também estimulam o desenvolvimento das glândulas mamárias durante a

gravidez e induzem o cio dos animais. Dentre os estrogênios naturais, o 17β-estradiol é

mais ativo do que a estrona e o estriol, sendo que estes dois últimos são derivados do

primeiro. Estriol é o principal estrogênio encontrado na urina de mulheres grávidas e

também na placenta. A estrona está em equilíbrio metabólico com o 17β-estradiol. Os

estrogênios sintéticos são geralmente usados como anticoncepcionais orais.

A grande maioria das substâncias estrogênicas presentes no meio ambiente são

consideravelmente menos potentes do que os estrogênios endógenos e estão presentes

em baixas concentrações no tecido humano (RAJAPAKSE et al., 2001). Por outro lado,

os estrogênios sintéticos geralmente são mais estáveis na água dos que os estrogênios

naturais e são mais potentes (SNYDER et al., 1999).

O 17β-estradiol é o estrogênio humano primário, ele representa o maior potencial

estrogênico e o padrão pelo qual a atividade estrogênica é medida. A potência relativa

de algumas substâncias em relação ao 17β-estradiol é apresentada na Tabela II.7, esses

dados foram copilados do estudo de GAIDO et al. (1997).

Tabela II.7. Potências relativas de algumas substâncias estrogênicas comparadas com o 17β-estradiol (GAIDO et al., 1997).

Substância química Razão de potência estrogênica (em relação ao 17β-estradiol)

17β-estradiol 1 DES 0,64 (1/1,57)

Nonilfenol 0,0002 (1/5.000) DDT 0,0000001 (1/8.000.000)

Bisfenol A 0,00007 (1/15.000)

48

Deidroepiandrosterona

ColesterolHO

O

HO

Pregnenolona

O

O

OH

17-OH Pregnenolona

O

O

Progesterona

HO

OH

17β-Estradiol

O

HO

OH

OTestosterona

O

O

Androstenediona

17-OH Progesterona

O

HO

OH

HO Androstenediol

O

O

OH

OH

OH

HO

Estrona

Estriol

Figura II.5. Representação esquemática da biosíntese dos estrogênios naturais.

II.1.9.2. Propriedades físico-químicas dos estrogênios

Os estrogênios naturais estrona, 17β-estradiol e estriol têm solubilidade em água

de aproximadamente 13 mg.L-1, o estrogênio sintético 17α-etinilestradiol tem

49

solubilidade mais baixa, 4,8 mg.L-1 (YING et al., 2002). A Tabela II.8 apresenta as

estruturas químicas desses estrogênios e algumas características. Todos esses

estrogênios têm pressão de vapor na faixa de 2,3 x 10-10 a 6,7 x 10-15 mmg Hg indicando

baixa volatilidade, essas e outras propriedades estão apresentadas na Tabela II.9.

Tabela II.8. Estrutura química e algumas características dos estrogênios naturais e sintéticos.

Estrogênio Estrutura Química Características

Estrona

HO

O

Estriol

OH

HO

OH

17 β-estradiol

HO

OH

Principal e mais potente estrogênio natural

17 α-etinilestradiol

OH

HO

C CHÉ mais potente do que o 17β-estradiol

50

Tabela II.9. Propriedades físico-químicas dos estrogênios. Estrogênios Propriedades

Estrona Estriol 17 β-estradiol 17 α-etinilestradiol Peso Molecular 270,37 288,40 272,39 296,40 Solubilidade na

água (m./L-1 a 20°C)a

13 13 13 4,8

Pressão de Vapor

(mm Hg)a2,3 x 10-10 6,7 x 10-15 2,3 x 10-10 4,5 x 10-11

Log Kowb 3,43 2,81 3,94 4,15

Kocc,d 4882 1944 3300 4770

Constante de Henry

(Pa m3mol-1) 6,2 x 10-7 2,0 x 10-11 6,3 x 10-7 3,8 x 10-7

aLAI et al., 2000 bcoeficiente de partição octanol-água cYING et al., 2002 dcoeficiente de sorção

Dessas propriedades físico-químicas, observa-se que esses estrogênios são

compostos orgânicos hidrofóbicos, em baixa volatilidade, moderadamente solúveis em

água e adsorvem em sedimentos/partículas sólidas. É de se esperar que a sorção no solo,

ou sedimento ou lodo biológico seja um significativo fator na redução de concentrações

na fase aquosa (LAI et al., 2000). Durante o tratamento biológico, provavelmente, parte

desses estrogênios fica retida no lodo biológico (na camada lipolítica das células),

devido à sua hidrofobicidade, e conseqüentemente pode ocorrer bioacumulação.

II.1.9.3. Uso e produção

Além de serem excretados naturalmente por humanos e animais, os estrogênios

naturais também são usados na medicina humana na terapia de substituição hormonal,

no tratamento de outros distúrbios ginecológicos e no tratamento de câncer de próstata e

mama. Na medicina veterinária são usados como promotor de crescimento.

51

II.1.9.4. Ocorrência e destino no meio ambiente

II.1.9.4.a. Excreção de estrogênios natural e sintético e seus metabólitos

Os estrogênios naturais (estrona, 17β-estradiol e estriol) são excretados

diariamente na urina por mulheres, animais fêmeas e em menor quantidade por homens

na forma de conjugados polares inativos, predominantemente como glucuronides e

sulfatos. Porém estudos demonstram que esses estrogênios são encontrados nas ETE na

forma livre, sugerindo que ocorrem reações de transformação dessas substâncias

durante o processo na ETE (JOHNSON e SUMPTER, 2001, TERNES et al., 1999a).

JOHNSON et al. (2000) revisaram as quantidades diárias excretadas dos

estrogênios naturais 17β-estradiol, estrona, estriol e da quantidade de 17α-etinilestradiol

nas pílulas orais contraceptivas e estimaram as excreções diárias de estrogênios por

humanos. Essa estimativa está apresentada na Tabela II. 10

Tabela II.10. Excreção diária (µg) per capita de estrogênios por humanos (JOHNSON et al., 2000).

Categoria Estrona 17 β-Estradiol Estriol 17 α-Etinilestradiol

Homens 3,9 1,6 1,5 - Mulheres menstruando 8 3,5 4,8 -

Mulheres na menopausa 4 2,3 1 - Mulheres grávidas 600 259 6.000 -

Mulheres - - - 35

II.1.9.4.b. Estrogênios no esgoto doméstico e efluente de ETE: Destino e remoção

dos estrogênios nas ETE.

Os estrogênios estrona, 17β-estradiol e 17α-etinilestradiol recebem uma atenção

especial, pois são continuamente e diariamente excretados no esgoto e não são

completamente removidos nas ETE (TERNES et al., 1999a,b). Com isso, são lançados

continuamente no sistema aquático e podem ser encontrados na água superficial, muitas

vezes usada como suprimento de água potável. Como os processos convencionais de

tratamento de água não removem totalmente esses micropoluentes (JOBLING et al.,

1998), um risco constante é imposto aos humanos e espécies de animais.

52

Os efluentes de ETE são importantes fontes de lançamento de substâncias

estrogênicas no ambiente aquático. DESBROW et al., (1998) e JOBLING et al. (1998)

demonstraram que os estrogênios naturais (17β-estradiol e estrona) e sintético (17α-

etinilestradiol) são responsáveis pela maior parte da atividade estrogênica detectada em

efluentes de ETE no Reino Unido. A atividade estrogênica também foi detectada em

efluentes de ETE da Alemanha (PAWLOWSKI et al., 2003, PAWLOWSKI et al.,

2004) Suécia (SVENSON et al., 2003) e Reino Unido (ROUTLEDGE et al., 1998

RODGERS-GRAY et al., 2001).

Grande parte dos estrogênios excretados por humanos e lançados no esgoto

doméstico está em uma forma conjugada que é menos ativa biologicamente

(glucuronides). Entretanto, a ocorrência de estrogênios livres em efluentes de ETE e

águas naturais (TERNES et al., 1999a, BARONTI et al., 2000, BELFROID et al., 1999)

indica que essas formas conjugadas são convertidas em formas ativas em alguma parte

entre a entrada e a saída do esgoto doméstico das ETE. Estudos concluíram que a

desconjugação ocorre durante o processo de tratamento da ETE, por microrganismos

presentes no lodo biológico (ANDERSEN et al., 2003, TERNES et al., 1999b,

DESBROW et al., 1998). Escherichia coli, a qual é eliminada em largas quantidades

nas fezes e são capazes de sintetizar grandes quantidades da enzima β-glucuronidase,

podem ser responsáveis por esta transformação (BELFROID et al., 1999, JOHNSON e

SUMPTER, 2001).

Os estrogênios foram detectados no esgoto doméstico e efluente de ETE na

Alemanha, Brasil, Canadá, Espanha, Holanda, Itália, Inglaterra, Reino Unido, Suécia,

EUA e França na faixa de 0,2 ng.L-1 a 0,07 µg. .L-1 (BARONTI et al., 2000,

BELFROID et al., 1999, CARGOUËT et al., 2004, DESBROW et al., 1998,

JOHNSON et al., 2000, KOLPIN et al., 2002, LOPÉZ e BARCELÓ, 2001, SVENSON

et al., 2003, TERNES et al., 1999a, XIAO et al., 2001).

No Brasil em 1997, TERNES et al. (1999a) realizaram o monitoramento de

estrogênios naturais e contraceptivo sintético na ETE da Penha/RJ. No esgoto

doméstico, os estrogênios 17β-estradiol e estrona foram detectados em concentrações de

0,021 µg.L-1 e 0,04 µg.L-1, respectivamente. As taxas de remoção de estrona observadas

foram de 67% para o efluente tratado em filtro biológico e 83% para o efluente tratado

pelo processo de lodos ativados. Para o 17β-estradiol, estas taxas foram de 92% e

53

99,9% para o efluente tratado em filtro biológico e para o efluente tratado pelo processo

de lodos ativados, respectivamente. Para o estrogênio contraceptivo 17α-etinilestradiol,

as taxas de remoção na ETE foram de 64% e 78% para o efluente do filtro biológico e

para o efluente do tanque de lodos ativados. A Tabela II. 11 apresentam as remoções de

estrogênios monitoradas por TERNES et al. (1999a) na ETE da Penha/RJ.

Tabela II.11. Remoções de estrogênios monitoradas na ETE da Penha/RJ por TERNES et al. (1999a).

Remoção (%)

Substância Carga de estrogênios no esgoto Doméstico

(g.dia-1) Efluente

tratado/filtro biológico

Efluente tratado/processo de

lodos ativados Estrona 5,0 67 83

17 β-estradiol 2,5 92 99,9 17 α-

etinilestradiol 0,6 64 78

Muitos estudos foram realizados para investigar o comportamento dos estrogênios

nas ETE e demonstram que essas substâncias não são completamente removidas nestes

processos de tratamento (ANDERSEN et al., 2003, BARONTI et al., 2000,

D’ASCENZO et al., 2003, KÖNER et al., 2000, TERNES et al., 1999ab). BARONTI et

al., 2000 demonstraram que um processo de lodos ativados de uma ETE na Itália

removeu 95% de estriol, 87% de 17β-estradiol, 85 % de 17α-etinilestradiol e apenas

61% de estrona. Já segundo JOHNSON e SUMPTER (2001) os processos de lodos

ativados removem em torno de 85% do 17β-estradiol, estriol e 17α-etinilestradiol e em

menor porcentagem a estrona. No caso da estrona essa baixa remoção pode ser atribuída

a sua formação nos processos de tratamento nas ETE pela oxidação do 17β-estradiol.

Com respeito à remoção dessas substâncias nas ETE e ambientes aquáticos, ainda não

está claro qual o processo que comanda sua eliminação, se os processos de sorção ou de

biodegradação.

CARBALLA et al., 2004, investigaram a remoção de algumas substâncias nas

ETE na Espanha, dentre elas o 17β-estradiol e a estrona. No tratamento primário, o 17β-

estradiol foi parcialmente removido (20%), indicando que a adsorção nas partículas

54

sólidas é o mecanismo envolvido na sua remoção. Por outro lado, no tratamento

biológico (processo de lodos ativados) o 17β-estradiol foi removido 47%, alcançando

uma remoção global na ETE em torno de 65%. Foi detectado que as concentrações de

estrona aumentaram durante o tratamento, indicando que sob condições oxidativas, o

17β-estradiol foi convertido em estrona, o qual é mais lentamente degradado.

SVENSON et al. (2003) demonstraram em seu estudo que a remoção da atividade

estrogênica do esgoto doméstico nas ETE é fortemente dependente do tipo de processo

usado, o tratamento biológico aparentemente é essencial para a remoção da

estrogenicidade dos efluentes municipais. Porém, mesmo entre os processos de

tratamento biológico, diferenças de remoções também foram observadas. O processo de

lodos ativados resultou numa remoção na faixa de 69 a 94%, já os métodos baseados em

biomassa imobilizada, tais como filtros biológicos (trickling filters), baixas remoções

foram alcançadas (em média de 28%). O uso de somente processos de precipitação

química com sais de ferro e alumínio não reduziu a atividade estrogênica. Outros

estudos também demonstram essas diferenças de remoção de substâncias estrogênicas

pelos processos biológicos (TERNES et al., 1999a, KÖRNER et al., 2001).

Uma vez no meio aquático, os estrogênios sofrem uma série de processos, tais

como diluição, fotólise, biodegradação e sorção em sedimentos, em partículas orgânicas

e no lodo biológico, os quais podem contribuir para sua remoção da fase aquosa. O

processo de adsorção no lobo biológico é de grande importância, pois é o primeiro

estágio de biodegradação que contribui para sua remoção do meio ambiente (CLARA et

al., 2004).

Os processos de tratamentos convencionais em uma ETE consistem em:

tratamento preliminar (gradeamento e caixa de areia), tratamento primário

(sedimentação primária) e tratamento secundário (tratamento biológico). No tratamento

preliminar os sólidos grosseiros são retirados e muito pouca remoção de micropoluentes

é observada. No tratamento primário, há a adsorção dessas substâncias sobre os sólidos

do lodo primário. Substâncias hidrofóbicas, como muitos desreguladores endócrinos,

são removidas da fase líquida junto com o lodo primário. O grau de remoção de

compostos orgânicos é bastante dependente da remoção de sólidos suspensos pelo

processo de sedimentação. A remoção de poluentes orgânicos durante o tratamento

biológico inclui a adsorção nos flocos microbianos e posterior remoção no lodo

55

biológico, degradação química e biológica, e transformação e volatilização durante a

aeração.

A fim de se investigar a degradação de estrogênios no meio ambiente, testes em

laboratório com processo de lodos ativados de ETE (TERNES et al., 1999b), águas

naturais e sedimentos marinhos (LAI et al., 2000) foram realizados. TERNES et al.

(1999b) avaliaram o comportamento de estrogênios naturais e contraceptivos em ETE,

para isso, realizaram experimentos em batelada com lodo biológico aeróbio de uma

ETE na Alemanha. Os resultados mostraram que depois de um período de 1-3 h, 95%

do 17β-estradiol foi oxidado a estrona, esta última foi degradada 50% após 24 h.

Aproximadamente 20% do 17α-etinilestradiol foi degradado nos experimentos em

batelada após 24h com uma concentração inicial de 1 ng.L-1 e depois de 48h com uma

concentração inicial de 1µg.L-1, indicando uma relativa persistência deste estrogênio. O

comportamento e remoção dessas substâncias nas ETE dependem de suas propriedades

físico-químicas, bem como, a configuração e operação das ETE.

Segundo JOHNSON e SUMPTER (2001), nas ETE o principal mecanismo de

remoção dos estrogênios naturais é a sorção. Contudo, na literatura poucos dados são

disponíveis sobre o potencial de sorção dessas substâncias no processo de lodos

ativados. Estudos indicam a presença de estrogênios nos lodos biológicos das ETE,

mostrando que essas substâncias podem ser persistentes durante a digestão do lodo. Em

um processo de lodos ativados de uma ETE da Alemanha, estrona e 17β-estradiol foram

detectados em concentrações de 37 ng.g-1 e 49 ng.g-1, respectivamente, enquanto que o

17α-etinilestradiol foi detectado a 17 ng.g-1 (TERNES et al., 2001b).

A natureza hidrofóbica dos estrogênios possibilita sua adsorção em partículas

sólidas. Essa propriedade sugere que técnicas de separação que envolve a adsorção, tais

como a sedimentação, poderão resultar em uma significativa remoção desse poluente da

fase aquosa de lodos primários e secundários (BIRKETT e LESTER, 2003). Algumas

pesquisas têm relatado que a eliminação de estrogênios como o 17β-estradiol é atribuída

à adsorção ou outros fatores independentes da degradação microbiana. Porém, estudos

demonstram que não há acumulo de 17β-estradiol nos lodos biológicos, indicando a

remoção desses estrogênios nas ETE é devido principalmente aos processos de

biodegradação (BARONTI et al., 2000).

56

No estudo de KÖRNER et al. (2000), uma investigação no balanço de massa de

estrogênios em uma ETE na Alemanha demonstrou que 90% da atividade estrogênica

do esgoto bruto foi removida no tratamento, porém somente 3 % da atividade biológica

foi encontrada no lodo biológico, constatando que a maior parte da atividade

estrogênica foi biodegradada durante o tratamento e menor parte ficou adsorvida nos

sólidos suspensos.

II.1.9.4.c. Estrogênios em águas naturais

Devido ao efeito potencial dos estrogênios em espécies de animais e humanos,

fica claro que a ocorrência dessas substâncias no esgoto doméstico e águas naturais são

muito importantes. Estudos demonstram que esses micropoluentes e seus metabólitos

estão presentes em ambientes aquáticos, em faixas de concentrações de µg.L-1 e ng.L-1,

em várias partes do mundo, tais como, Alemanha (HARTIG et al., 1999, HIRSCH et

al., 1998, PUTSCHEW et al., 2001, SACHER et al., 2001, TERNES et al., 1999a),

Áustria (AHRER et al., 2001), Brasil (STUMPF et al., 1999, TERNES et al., 1999a),

Canadá (TERNES et al., 1999a, WINKLER et al., 2001), Espanha (FARRÉ et al.,

2001, RODRÍGUEZ et al., 2003), Holanda (BELFROID et al., 1999, JOHNSON et al.,

2000), Inglaterra (DESBROW et al., 1998), Itália (BARONTI et al., 2000, JOHNSON

et al., 2000), Japão (BEHNISCH et al., 2001, NAKAMURA et al., 2001), Suíça

(BUSER et al., 1998a, BUSER et al., 1998b, BUSER et al., 1999), Estados Unidos

(KOLPIN et al., 2002, LINDSEY et al., 2001, SNYDER et al., 1999), Reino Unido

(XIAO et al., 2001) e França (CARGOUËT et al., 2004).

O Anexo 1 apresenta uma compilação das concentrações médias ou faixas de

concentrações de estrogênios naturais e sintéticos detectadas no meio ambiente, em

trabalhos conduzidos por diversos autores.

II.1.9.4.d. Estrogênios em detritos de animais

Outra grande fonte de hormônios esteróides é o esterco proveniente de criações de

animais, tais como, gado, porcos, ovelha e aves. Estrogênios são naturalmente

produzidos e excretados por animais, como também são administrados como

57

promotores de crescimento (CASEY et al., 2003). Os hormônios e outros fármacos são

intensivamente na criação de animais (REFSDAL, 2000). Detritos de animais algumas

vezes são usados como adubo ou podem contaminar o solo de regiões com grandes

criações de animais (PETERSON et al., 2000, TASHIRO et al., 2003) e podem

potencialmente contaminar as águas superficiais e subterrâneas e os sedimentos

marinhos. FINLAY-MOORE et al. (2000) determinaram as concentrações de 17β-

estradiol e testosterona do solo e do percolado dos pastos onde foram usados detritos de

aves como fertilizantes, demonstrando que esses hormônios apresentam potencial de

contaminação.

Outros estudos relatam o impacto dos detritos de criações de animais como uma

fonte de hormônios esteróides em ambientes aquáticos de áreas rurais (PETERSON et

al., 2000, TASHIRO et al., 2003). TASHIRO et al. (2003) detectaram atividade

estrogênica, proveniente da presença de estrogênios, em águas superficiais e sedimentos

marinhos de regiões próximas à criação de porcos ao sul da Ilha de Okinawa (Japão).

PETERSON et al. (2000) detectaram 17β-estradiol, na faixa de 6 a 66 ng.L-1, em fontes

de águas próximas a regiões que usam detrito de criação de aves como fertilizantes.

Em vista disso, o uso de detritos de animais na agricultura é uma considerável

fonte de contaminação por estrogênios ao meio ambiente. Outros estudos investigam a

persistência e a degradação dos estrogênios naturais e sintéticos no solo (COLUCCI et

al., 2001, COLUCCI e TOPP, 2001). Em um solo agrícola, o 17β-estradiol alcançou

remoções de 90,7% em 3 dias, em condições controladas, a determinação da atividade

estrogênica no extrato de solo indicou que outras substâncias estrogênicas não foram

formadas durante a degradação do 17β-estradiol (COLUCCI et al., 2001).

II.1.9.5 Estudos relevantes da avaliação dos efeitos de potencial do 17β-estradiol

Uma das ações da Comissão Estratégica Comunitária em Matéria dos

Desreguladores Endócrinos estabelecida pela Comissão das Comunidades Européias foi

o estabelecimento de uma lista prioritária com 553 substâncias sintéticas e 9 hormônios

naturais e sintéticos, para uma futura avaliação do seu papel na desregulação endócrina

(COM(2001) 262). Uma ação prioritária foi o início de uma avaliação detalhada de um

58

grupo de 12 substâncias candidatas a desreguladores endócrinos, dentre elas, o 17β-

estradiol. (WRc-NSF, 2002).

A conclusão obtida pelo relatório WRc-NSF (2002) em relação ao 17β-estradiol é

que há evidências de que este estrogênio causa efeitos na reprodução e desenvolvimento

de peixes, e estes efeitos acontecem em concentrações ambientalmente relevantes, ou

seja, concentrações detectadas no meio ambiente. Dados globais indicam que o nível

mínimo sobre o qual são observados efeitos em peixes está na faixa 5 - 25 ng.L-1

baseado em respostas de diferentes ensaios. Sendo assim, o 17β-estradiol pode

representar um risco para os animais aquáticos. Esta observação seria consistente com

os resultados de pesquisas realizadas por outros países, como por exemplo o Programa

COMPREHEND.

O dados de toxicidade crônica para peixe indicam que os níveis de 17β-estradiol

que causar efeitos gerais ocorrem em níveis > 100 ng.L-1 (WRc-NSF, 2002).

II. 2. MÉTODOS DE ENSAIOS USADOS PARA AVALIAR OS DE

Em muitos casos a relação entre a exposição ambiental a uma substância

específica e os efeitos adversos na saúde de humanos e animais ainda não foi bem

estabelecida. Mais pesquisas são necessárias para a completa caracterização dos efeitos

adversos resultante dessa exposição e para o entendimento dos mecanismos básicos de

ação desses efeitos.

Várias substâncias com potencial de causar efeitos em seres vivos estão presentes

em efluentes de ETE, chorume de aterros sanitários e águas naturais, e são

continuamente lançados no meio ambiente. São de grande importância o

desenvolvimento de metodologias analíticas e técnicas de monitoramento para

quantificar e analisar os efeitos endócrinos dos desreguladores endócrinos causados em

humanos e animais expostos. Análises rápidas e confiáveis de um grande número de

substâncias químicas e amostras ambientais requerem ensaios simples, sensíveis e

algumas vezes específicos. Com isso, muitos ensaios in vitro e in vivo têm sido

desenvolvidos para este fim.

59

Vários ensaios in vivo e in vitro são desenvolvidos para analisar os efeitos

causados por substâncias presentes no meio ambiente suspeitas ou confirmadas como

desreguladores endócrinos. Contudo há ainda a necessidade de validar os ensaios in vivo

e in vitro para avaliar, com uma melhor precisão, esses efeitos. Organizações mundiais

renomadas, tais como, OECD e US EPA, elaboram diretrizes internacionais de métodos

de ensaios para investigar os efeitos dos desreguladores endócrinos (EDSTAC, 1998 e

OECD, 2002). O OECD produz diretrizes reconhecidas internacionalmente em métodos

de teste por investigar e os efeitos ambientais de substâncias químicas.

Os ensaios in vivo utilizam vários parâmetros, como peso de órgãos sexuais,

diferenciação celular, expressão de proteínas e atividades enzimáticas (GRAY et al.,

1997, BAKER, 2001). Os ensaios in vitro que estão sendo usados para analisar a

atividade estrogênica de substâncias químicas, são baseados em mecanismos de ação

que elucidam respostas e utilizam pontos mais definidos do que os ensaios in vivo, tais

como a interação com receptores hormonais, proliferação de células, entre outros.

Contudo, ensaios in vitro em conjunto com ensaios in vivo são requeridos para uma

completa análise dos potenciais de riscos dos desreguladores endócrinos presentes no

meio ambiente.

Pesquisadores relatam a existência de ensaios in vivo, in vitro e ex-vivo (ensaio in

vivo medido por funções de análise in vitro) para avaliar os efeitos dos desreguladores

endócrinos. Algumas medições finais, chamadas de “endopoint” dos ensaios in vivo

incluem pesagem e histologia de órgãos reprodutivos, níveis de hormônios no sangue,

ativação de gene in vivo, síntese de proteínas, comportamento, crescimento,

desenvolvimento, manutenção da gravidez e anatomia/morfologia. Os métodos dos

ensaios in vitro incluem proliferação de células animais, ligação nos RE e RA, síntese

de hormônios/enzima esteróides, ensaio de gene repórter recombinante usando células

transfectadas estáveis ou transientes (expressão de um gene transferido nas células) e

análises bioquímicas. Os métodos ex vivo podem ser medidos pela síntese de esteróides

do ovário/testículos (GRAY et al., 1997).

Como o mecanismo de ação mais investigado é o de mimetizar a ação de

estrogênio endógeno pela ligação no RE, vários bioensaios exploram esse mecanismo

de ação para identificar e analisar substâncias estrogênicas.

60

Os ensaios in vivo e in vitro apresentam vantagens e desvantagens (GRAY et al.,

1997, ZACHAREWSKI, 1997). Os ensaios in vitro têm algumas vantagens tais como

sensibilidade a baixas concentrações, respostas específicas, custo baixo, requer pouca

quantidade de amostra, pode ser usado para misturas complexas (águas naturais, lodos

biológicos, etc). Porém, resultados inconsistentes entre diferentes ensaios in vitro

também têm sido relatados, que podem ser devidos à capacidade metabólica diferente

dos diversos testes usados (BERESFORD et al., 2000).

Em contrapartida, os ensaios in vivo apresentam vantagens como explicações para

os mecanismos de absorção, distribuição, metabolismo e excreção. São ensaios bem

definidos usados por décadas para testes toxicológicos e análise de riscos, incorpora

uma larga faixa de mecanismos, fornece a compreensão e avaliação do sistema

endócrino como uma unidade (GRAY et al., 1997, ZACHAREWSKI, 1997). Porém, a

falta de especificidade é outra limitação dos ensaios in vivo, quando o objetivo do

estudo é analisar mecanismos de ação específicos, tais como via RE, RA ou síntese de

um hormônio esteróide, além do problema da utilização de animais nos ensaios (GRAY

et al., 1997). Estudos demonstram que, normalmente, a potência relativa de substâncias

estrogênicas em ensaios in vitro não refletem a potência em ensaios in vivo, ou seja, as

substâncias estrogênicas são mais potentes in vivo do que in vitro (FOLMAR et al.,

2002).

Assim, os dois tipos de ensaios se deparam com algumas limitações devido a

custos, sensibilidade, respostas, utilização em largas escalas, entre outros

(ZACHAREWSKI, 1997).

Alguns dos ensaios in vitro e in vivo desenvolvidos e mais utilizados, de acordo

com a literatura, são apresentados a seguir.

II.2.1. Ensaios in vivo

II.2.1.1. Ensaio em roedores

Dois ensaios clássicos para a identificação de substâncias estrogênicas são ensaio

uterotrófico (alteração do peso uterino) e ensaio de cornificação da mucosa vaginal

61

(ensaio para detectar mudanças histológicas nas células epiteliais da mucosa vaginal)

em roedores (BAKER, 2001).

Em 1923, ALLEN e DOISY (1923) desenvolveram um ensaio com ratos e

camundongos para determinar a atividade estrogênica de substâncias químicas através

da avaliação da alteração do peso uterino, cornificação vaginal, receptividade sexual

feminina e idade da puberdade/abertura vaginal após a exposição às substâncias

testadas. Este é um dos primeiros ensaios desenvolvidos para detectar atividade

estrogênica, e se apresentou como um ensaio útil e sensível na determinação de

substâncias estrogênicas.

Há uma variedade de protocolos descritos para esses ensaios, incluindo o uso de

ratos ou camundongos em vários estágios da vida e o uso de rotas orais ou subcutâneas

de administração das substâncias químicas (ODUM et al., 1997).

As vantagens desse ensaio é que há a incorporação de todos os aspectos do

sistema endócrino, permitindo um estudo da absorção, metabolismo, distribuição e

excreção da substância, como também de caminhos alternativos para avaliar os efeitos

dos desreguladores endócrinos. Entretanto, já foram relatados resultados inconsistentes,

além de ser um ensaio com custo e tempo alto e sendo ainda necessário ser usado em

conjunto com outros ensaios in vitro, somado ao problema de utilização de animais nos

ensaios (BERESFORD, et al., 2000).

Além disso, bioensaios com roedores não são adequados para analisar substâncias

em larga escala lançadas no meio ambiente, devido ao custo, complexidade e problemas

éticos com animais (SOTO et al., 1995).

II.2.1.2. Ensaio da indução da síntese de vitelogenina (VTG)

Numerosos testes com biomarcadores têm sido desenvolvidos para detectar a

atividade estrogênica de substâncias (HANSEN et al., 1998, ZACHAREWSKI, 1997).

Um marcador bastante usado com este fim é a determinação de níveis de Vitelogenina

(VTG) no plasma sangüíneo de um organismo (PANTER et al., 1998, SCHMID et al.,

2002). VTG é uma proteína que desempenha um importante papel no sistema

reprodutivo de vertebrados ovíparos fêmeas. É sintetizada no fígado, regulada por

62

estrogênio e transportada através do sangue para os ovários, onde será incorporada no

desenvolvimento dos óvulos (IRWIN et al., 2001, PANTER et al., 1998).

De um modo geral, o gene do VTG também está presente em organismos machos,

mas sob condições normais não é expresso, ou seja, a síntese de VTG nos machos é

muito baixa ou não detectada, possivelmente, pela baixa concentração de estrogênio no

sangue (SCHMID et al., 2002). Entretanto, quando peixes machos são expostos a

substâncias estrogênicas são capazes de produzir uma grande quantidade de VTG,

similar às fêmeas. O aumento de VTG no plasma de um organismo é considerado uma

evidência da exposição a substâncias com atividade estrogênica (HANSEN et al., 1998,

JOHNSON et al., 2000).

O ensaio de indução da síntese de VTG é um ensaio in vivo muito usado para

avaliar a exposição estrogênica em ambientes aquáticos, e se apresenta como uma

ferramenta apropriada para determinar os efeitos endócrinos em peixes. Este bioensaio é

realizado em curto prazo, relativamente de baixo custo, mostra uma resposta direta e

pode ser facilmente medido. Os níveis de VTG no plasma dos animais são medidos

através dos ensaios de imunoadsorção enzimática (ELISA) ou radioimunoensaio (RIE).

A indução da síntese de VTG no plasma de peixes machos tem sido usada como

um biomarcador específico para detectar substâncias estrogênicas em ambientes

aquáticos, em efluente de ETE, esgoto doméstico e sedimentos marinhos (DESBROW

et al., 1998, GAGNÉ et al., 2001, JOBLING et al., 1998, SOLÉ et al., 2003).

Outros organismos também são usados para avaliar a atividade estrogênica através

da indução da síntese da proteína VTG, tais como, pássaros, anfíbios e répteis (OEDC,

2002).

Outros ensaios in vivo usados para avaliar o efeito estrogênico de uma substância

podem ser encontrados na revisão realizada por GRAY et al. (1997). Estes ensaios

levam em consideração os efeitos das substâncias estrogênicas no sistema reprodutivo,

alterações no desenvolvimento da puberdade, alteração da diferenciação sexual e

desenvolvimento de animais machos e fêmeas.

63

II. 2.2. Ensaios in vitro

Os ensaios in vitro se baseiam em mecanismos de ação específicos dos

desreguladores endócrinos e se apresentam como ferramentas úteis para a determinação

do efeito potencial de substâncias individuais, bem como, misturas de substâncias e

amostras ambientais.

Os ensaios in vitro mais usados para avaliar o potencial de substâncias em afetar o

sistema endócrino incluem: (1) ensaios de interação com receptores hormonais

(determinam a capacidade de uma substância acoplar-se aos receptores hormonais), (2)

ensaios de proliferação de células (análise da capacidade de uma substância estimular o

crescimento de células sensíveis a estrogênios), (3) ensaios de gene repórter em células

de mamíferos ou leveduras (analises da capacidade de uma substância estimular a

transcrição do gene repórter inseridos nas células) (BAKER, 2001).

Muitos outros ensaios in vitro são usados na determinação da atividade

estrogênica de substâncias químicas ou amostras complexas. Uma grande variedade de

linhagens de células humanas e animais (ratos, camundongos, boi), como também

outros endpoint são empregados. Uma revisão detalhada desses ensaios pode ser

encontrada em OECD (2002).

Os ensaios in vitro medem a atividade estrogênica total de uma amostra

negligenciando quais compostos são responsáveis por essa atividade. A atividade

estrogênica total na amostra é então comparada com a atividade do estrogênio endógeno

17β-estradiol, e pode ser expressa como equivalentes de estradiol (EQ-E2).

Os ensaios de ligação nos receptores hormonais sozinhos são suficientes para

determinar a atividade estrogênica de uma substância química, uma vez que a

estrogenicidade é dependente da afinidade do ligante pelo RE e de sua capacidade de

manter ocupado o RE que irá iniciar eventos em cascata que culminem em respostas

adversas. Estudos sugerem que respostas complexas tais como, a modulação do sistema

endócrino e/ou o comprometimento da saúde reprodutiva podem requerer não somente

eventos que envolvam ligação com receptores, mas também a ação acumulativa

continuada da ocupação do complexo ligante-RE (ZACHAREWSKI, 1997).

64

Numerosos estudos empregaram ensaios in vitro para avaliar a atividade

estrogênica de efluentes de ETE, esgoto doméstico e águas naturais em vários países.

II.2.2.1. Ensaio de ligação competitiva nos receptores dos hormônios esteróides

Muitos ensaios que determinam à atividade estrogênica de substâncias químicas

são baseados no modo de ação das substâncias estrogênicas de acoplar-se ao RE e

resultar em um subseqüente efeito na atividade biológica. Os ensaios de ligação

competitiva nos receptores dos hormônios esteróides são métodos que investigam a

capacidade de uma substância de competir com estrogênios pela ligação no RE, para

isso utilizam estrogênios radiomarcados, no caso do RE o hormônio usado é o [3H]17β-

estradiol (BIRKETT e LESTER, 2003, GRAY et al., 1997).

Nos ensaios de ligação competitiva o RE é extraído de uma cultura de células, tal

como as MCF-7 (células cancerígenas mamarias humanas) e incubado com [3H]17β-

estradiol e a substância testada, podendo também ser usado o estrogênio sintético DES

como controle. Os [3H]17β-estradiol acoplados aos RE são extraídos e quantificados em

um cintilador líquido. Quanto menos [3H]17β-estradiol estiver ligado aos RE indica que

as substâncias testadas têm a capacidade de competir pela ligação no domínio de ligação

hormonal (DLH) nos RE (BIRKETT e LESTER, 2003).

Os ensaios que investigam a interação direta do RE com um ligante têm sido

extensivamente utilizados para analisar a atividade estrogênica de substâncias químicas.

Porém, só podem ser usados para substâncias estrogênicas que possuem a capacidade de

se ligar ao RE e elucidar uma resposta. No caso dos ensaios de ligação competitiva, as

substâncias testadas competem com o estrogênio natural pelo RE. A maior limitação

deste ensaio é que não podem distinguir entre efeitos agonista e antagônico (BIRKETT

and LESTER, 2003, ZACHAREWSKI, 1997).

Os ensaios de ligação competitiva nos receptores dos hormônios esteróides são

relativamente rápidos. Entretanto, são significativamente menos sensíveis do que outros

ensaios in vitro, além de não serem facilmente disponíveis para a automatização e sendo

necessário à utilização de substâncias radiomarcadas, limitando seu uso para sua

utilização como uma ferramenta de análise (screening).

65

Embora os ensaios de ligação de receptor tenham sido desenvolvidos e utilizem

receptores de estrogênios humanos (REα), receptores de estrogênio de outras espécies

também têm sido utilizados, tais como, de répteis e peixes , para substâncias que exibem

maior afinidade por estes receptores (BIRKETT e LESTER, 2003). Além disso, também

tem sido desenvolvido ensaio de ligação com receptor de andrógeno (RA) e receptor de

progesterona (RP) (GRAY et al., 1997).

II.2.2.2. Ensaios de proliferação celular

Estes ensaios se baseiam na proliferação de culturas de células cancerígenas

mamarias humanas induzidas pela exposição à substância estrogênica. Comumente, são

usadas culturas de células cancerígenas mamárias humanas MCF-7 ou T47-D receptor-

positivo de estrogênio.

O bioensaio com cultura de células, o qual avalia a proliferação de células

cancerígenas mamárias humanas MCF-7 em resposta a exposição a substâncias

estrogênicas, é conhecido como ensaio de E-screen. A cultura de células MCF-7 foi

derivada de uma efusão pleural de uma paciente com câncer de mama nos anos 70s

(DICKSON e LIPPMAN, 1986). Neste bioensaio, as células MCF-7 são incubadas (seis

dias) com e sem controle de 17β-estradiol e na presença e ausência de substância ou

amostra ambiental a ser testada. A proliferação das células é determinada através da

contagem do número de células ou núcleos (SOTO et al., 1995), contudo algumas

modificações e simplificações têm sido realizadas que permite a determinação da

proliferação das células por um método colorimétrico (KÖNER et al., 1999 e 1998),

além de outras técnicas de medidas também têm sido utilizadas (GRAY et al., 1997).

O ensaio E-screen é baseado em três premissas: (1) fatores presentes no soro

adicionado no meio inibem a proliferação das MCF-7, (2) os estrogênios induzem a

proliferação das células pela anulação deste efeito inibitório, e (3) substâncias não

estrogênicas não neutralizam o sinal inibitório presente no soro (WORKING REPORT

No. 43, 2003).

O potencial estrogênico de muitas substâncias químicas simples e misturas de

substâncias têm sido avaliados usando o ensaio E-screen, que também tem sido eficiente

66

para avaliar a atividade estrogênica em efluentes de ETE (KÖNER et al., 1999 e 2000),

esgoto sanitário (KÖRNER et al., 1999 e 2000), águas naturais (OH et al., 2000),

sedimentos aquáticos (OH et al., 2000) e chorume de aterros sanitários (BEHNICSH et

al., 2001). KÖRNER et al. (1999) investigaram a importância do lançamento de

substâncias estrogênicas, via esgoto sanitário, nos rios da Alemanha, aplicando o ensaio

E-screen. Este estudo determinou que em todas as nove amostras de efluente de cinco

diferentes ETE da Alemanha, significativos níveis de atividade estrogênica entre 2,5 e

25 ng de equivalente estradiol (EQ-E2)/L, constatando que os efluentes de ETE são as

maiores fontes de lançamento de substâncias estrogênicas nos rios e lagos.

O ensaio E-screen é considerado um ensaio muito sensível, confiável e

relativamente simples, com o qual podem ser analisadas substâncias simples ou

múltiplas substâncias químicas ao mesmo tempo (KÖRNER et al., 1999, OH et al.,

2000). Porém, alguns fatores afetam a determinação do potencial estrogênico de uma

substância, tais como, diferenças entre células da cultura, condições da cultura,

diferentes níveis dos receptores, densidade das células, que podem complicar a

padronização do ensaio que asseguram sua reprodutividade (BIRKETT e LESTER,

2003, ZACHAREWSKI, 1997).

Além da medida da indução de proliferação das células MCF-7, outros endpoint

também tem sido usados para avaliar a resposta dessas células a substâncias

estrogênicas, tais como, níveis do receptor de progesterona ou seu mRNA, exo-

proteinas específicas (por exemplo pS2) ou atividade da enzima luciferase (OECD,

2002).

II.2.2.3. Ensaios de gene repórter recombinante

Ensaios de gene repórter são baseados na capacidade de um componente de

estimular uma atividade transcricional dependente RE (ER-dependent transcriptional

activity). Assim, a expressão do gene repórter é um resultado de uma cascata molecular

de eventos implicada pela ativação do receptor, e como tal promove uma integral

indicação da atividade estrogênica de um componente. Esses ensaios in vitro são

conduzidos com culturas de células mamíferas (câncer humano) ou culturas de

leveduras geneticamente modificadas. São disponíveis para uso nesse ensaio culturas de

67

células com um RE endógeno (células T47D ou MCF-7) ou culturas de células sem um

RE endógeno (células de leveduras ou Hela).

Nos ensaios de gene repórter baseado em células de mamíferos (ER-Calux e

ensaio com células MVLN) o gene repórter codifica para luciferase. No ensaio de gene

repórter baseado em levedura (YES), o gene repórter codifica para β-galactosidase.

Nos ensaios de gene repórter, a amostra é adicionada às células transfectadas, as

substâncias estrogênicas entram nas células e ligam-se aos RE, o quais se tornam

ativados pela mudança na conformação e se ligam aos ERE. Esta ligação inicia a

expressão do gene repórter e assim ocorre a síntese de uma enzima. Um substrato

presente no meio é metabolizado pela enzima sintetizada, o subproduto formado pode

ser então detectado.

A escolha de qual ensaio de gene repórter empregar, baseado em levedura ou

baseado em células de mamíferos, depende de alguns fatores como baixos custos, fácil

uso e baixo limite de detecção. Diferenças entre ensaio YES e baseado em células de

mamíferos existem, como por exemplo, na sensibilidade da resposta do ensaio com

células de mamíferos que podem detectar baixas concentrações quando comparado com

o ensaio com levedura e na presença de substâncias tóxicas que podem inibir o

crescimento das células animais, mas não as células de levedura.

II.2.2.3.a. Ensaios gene repórter baseado em células de mamíferos

Os ensaios gene repórter baseados em células de mamíferos incluem: (a) ensaio de

expressão do gene da luciferase quimicamente ativada mediante RE (ER-mediated

chemical activated luciferase gene expression) denominado de ER-CALUX (Estrogen

Receptor – Chemically Activated LUciferase eXpression), (b) ensaio com células

MVLN, entre outros (OECD, 2002, WORKING REPORT No. 43, 2003)

O ensaio ER-CALUX utiliza células T47D de adenocarcinoma de mama humano

com RE endógeno, o qual são estavelmente transfectadas com um gene repórter de

luciferase (Luc) estrogênio-responsivo que contém três EREs. No ensaio, no interior das

células, a substâncias estrogênicas se ligam aos RE endógenos ativando-os. Com isso, o

complexo ligante-receptor se liga aos EREs presentes na região do promotor do gene da

68

luciferase, conduzindo a expressão do gene da luciferase. A enzima luciferase é liberada

através do lise das células, que metaboliza o substrato luciferina e a luz produzida pode

ser medida em um luminômetro (LEGLER et al., 2002, WORKING REPORT No. 43,

2003).

Os princípios do ensaio de células MVLN são semelhantes aos do ensaio de ER-

CALUX. Entretanto, o ensaio com células MVLN utiliza uma linhagem de células

derivadas das células MCF-7 que expressam o RE endógeno e estavelmente

transfectadas com um gene repórter da luciferase estrogênio-responsivo (o plasmídeo de

vitellogenin-A2-promotor / repórter de luciferase - p-Vit-tk-Luc). Como no ensaio ER-

CALUX, a atividade estrogênica da substância química testada é diretamente

relacionada à atividade da luciferase medida após o lise das células MVLN (WORKING

REPORT No. 43, 2003).

II.2.2.3.b. Ensaios gene repórter baseado em células de levedura

As células de leveduras são transformadas pela introdução de vetores contendo

seqüências de DNA para receptores humanos ou de animais, junto com o gene repórter

contendo elementos de respostas (BIRKETT e LESTER, 2003, GRAY et al., 1997). A

ativação do receptor pela substância testada resulta na estimulação da expressão do gene

repórter seguida pela ativação de um elemento resposta. Estes ensaios são bastante

usados para avaliar substâncias químicas suspeitas de causar atividade estrogênica

através da interação com receptores de estrogênio.

Os ensaios baseados no uso de levedura geneticamente modificada são

promissores devido a sua simplicidade molecular e biológica, fácil manipulação e baixo

custo (WU et al., 2002). As culturas recombinantes de levedura é uma ferramenta muito

útil para investigar a função do receptor hormonal de mamíferos isoladamente (GAIDO,

et al., 1997). Esses ensaios com leveduras podem ser utilizados para analisar a interação

de substâncias químicas com múltiplos receptores de hormônios esteróides, como o

receptor de estrogênio (ROUTLEDGE e SUMPTER, 1996), receptor de andrógino

(GAIDO, et al., 1997, SOHONI e SUMPTER, 1998) e receptor de progesterona

(GAIDO, et al., 1997).

69

Um grande número de pesquisadores tem usado os ensaios com leveduras gene

repórter para analisar a atividade estrogênica de uma variedade de substâncias químicas.

ROUTLEDGE e SUMPTER (1996) desenvolveram um ensaio com a levedura

Saccharomyces cerevisiae na qual foi inseridos um gene receptor de estrogênio humano

(REh) e a expressão do plasmídeo com um elemento de resposta de estrogênio (ERE) e

um gene repórter lacZ, o qual codifica a enzima galactosidase. Um ligante ativo (o qual

tenha a capacidade de acoplar-se ao RE) induz a expressão da β-galactosidase. A

medida é determinada pela produção da enzima galactosidase que metaboliza o

substrato cromogênico clorofenol vermelho-β-D-galactopiranosida (CPRG) presente no

meio, que é um produto amarelo para vermelho o qual é medido pela absorbância a

540nm. A produção de β-galactosidase no meio depende da quantidade de substância

estrogênica. A medida da absorbância pela espectrofotometria pode estimar a

quantidade de substância estrogênica no meio de análise.

Outros ensaios com leveduras recombinantes, com culturas de células e

metodologia diferentes do ensaio desenvolvido por ROUTLEDGE e SUMPTER (1996)

também têm sido usados para avaliar a atividade estrogênica de substâncias químicas

(ARNOLD, et al., 1996, GAIDO et al., 1997, REHMANN et al., 1999).

Os ensaios in vitro que utilizam gene repórter também têm sido adaptados para

outros receptores tais como receptores RA e RP, possibilitando assim a avaliação de

substâncias que interagem com esses outros receptores hormonais esteróides (GAIDO et

al., 1997, GRAY et al., 1997, SOHONI e SUMPTER, 1998).

Os ensaios que utilizam a levedura contendo REh para identificar substâncias

estrogênicas pela interação com o receptor de estrogênio humano, é comumente referido

como ensaio YES (yeast estrogen-inducible expression system ou recobinant yeast

estrogenic system) ou RYA (recombinant yeast assay).

Com algumas modificações em sua metodologia, os ensaios YES podem ser

usados para investigar, tanto a atividade hormonal agonista como antagonista de

substâncias químicas. No ensaio YES, para determinar se uma substância possui

atividade antagônica, um ligante natural (17β-estradiol) deve ser adicionado ao meio de

análise numa concentração que produza uma resposta sub-máxima (65%); a capacidade

70

da substância testada em inibir a mudança de cor pelo ligante natural será determinada

(SOHONI e SUMPTER, 1998).

A atividade estrogênica tem sido o mecanismo de ação dos desreguladores

endócrinos mais investigado. Porém, os desreguladores endócrinos possuem outros

mecanismos de ação, como a capacidade de se ligar a outros receptores ou múltiplos

receptores resultando também na deterioração do sistema endócrino. Por isso, os ensaios

YES também são usados para avaliar atividades anti-estrogênicas, androgênicas e anti-

androgênicas de várias substâncias químicas (SOHONI e SUMPTER, 1998, COLLINS

et al., 1997, MOFFAT et al., 2001). SOHONI e SUMPTER (1998) mostraram que

algumas substâncias conhecidas como estrogênicas também possuem atividade anti-

androgêna, tais como o DDT e seu metabólito DDE, o bisfenol A e ftalatos. Esses

resultados demonstram que substâncias químicas que mimetizam estrogênios podem ter

atividades hormonais múltiplas, isso pode fazer com que a interpretação dos

mecanismos de ação in vitro de uma substância seja dificultada.

O ensaio de YES também tem sido usado com sucesso na identificação de

substâncias estrogênicas em efluentes de ETE, esgoto sanitário, águas naturais e extrato

de solo (COLUCCI et al., 2001, COLUCCI e TOPP, 2001, PAWLOWSKI et al., 2003,

PAWLOWSKI et al., 2004, SVENSON et al., 2003, TANAKA et al., 2001). E além de

ser um ensaio muito utilizado para se avaliar a atividade estrogênica de uma substância,

mistura de substâncias e amostras em geral, também tem sido usado para estabelecer a

relação atividade - estrutura estrogênica (ROUTLEDGE e SUMPTER, 1997,

SCHULTZ e SEWARD, 2000, SCHULTZ, 2002), no entanto, essa relação ainda não

esta completamente entendida.

Os ensaios com leveduras recombinantes também têm sido usados para avaliar os

efeitos sinérgicos de uma mistura de substâncias estrogênicas (ARNOLD et al., 1997,

RAJAPAKSE et al., 2001). O ensaio YES é ideal para ser usado para avaliar efeitos

combinados, pois é rápido e mostra-se ser altamente reprodutivo e sensível

(BERESFORD et al., 200). Estudos demonstram que o REh contém múltiplos DLH e a

interação com duas diferentes substâncias pode produzir atividade estrogênica

sinergística (ARNOLD et al., 1997). ARNOLD et al. (1997) demonstraram que a

combinação de duas substâncias estrogênicas, o 17β-estradiol e a estrona, produziram

um aumento sinérgico na atividade estrogênica esperada, outras combinações de

71

estrogênios também provocaram efeitos sinérgicos. O autor constatou ainda, que a

atividade sinérgica na levedura e a combinação de substâncias estrogênicas foram

correlacionados com a ligação das duas substâncias no REh simultaneamente.

Os ensaios gene repórter in vitro é uma importante ferramenta, pois é capaz de

indicar um mecanismo potencial de ação de uma substância, bem como também

considera os efeitos sinergisticos, antagonisticos e interações aditivas que podem

ocorrer com misturas complexas (WU et al., 2002).

As vantagens dos ensaios YES são suas especificidade, sensibilidade, capacidade

de realizar análise de grande quantidade de amostras com processo de fácil manuseio

(por que as células não precisam ser continuamente transformadas) e econômico, não

necessita o uso de substâncias radiomarcadas. Porém, algumas amostras ambientais

podem conter interferentes tóxicos as células de leveduras e podem apresentar cor o

qual pode interferir na medida do ensaio com leveduras. Entretanto, as amostras podem

ser fracionadas e os interferentes removidos (clean-up) antes desses ensaios.

Segundo a União Européia (COMPREHEND, 2002), os ensaios baseados em

leveduras geneticamente modificadas (ensaio de YES) são suficientemente robustos e

seguros para analisar a atividade estrogênica de amostras simples e efluentes

complexos. Os ensaios YES têm o potencial de padronização para testes rotineiros em

efluentes, mas duas fontes de interferência foram identificadas: a toxicidade de alguns

efluentes para as células de levedura que pode ser superada pela diluição e os acetatos

de alquilfenóis que suprimem a atividade estrogênica de esteróides e de alquilfenóis.

Alguns ensaios in vivo e in vitro usados para identificar e classificar substâncias

naturais e sintéticas com efeitos endócrinos são apresentados na Tabela II.12. Algumas

vantagens e desvantagens dos ensaios in vitro e in vivo são apresentadas na Tabela II.13.

72

Tabela II.12. Sumário de ensaios in vivo e in vitro usados para identificar substâncias com atividade estrogênica.

Ensaios Substâncias testadas Referências

Ensaio in vivo

Ensaio de síntese de

VTG

17β-estradiol, estrona, 17α-etinilestradiol, nonilfenol, dietilestilbestrol.

VAN DEN BELT et al., 2004, FOLMAR

et al., 2000, PANTER et al.,

2000, ROSE et al., 2002

Ensaio in vitro

YES

Fitoestrogênios, Fitoestrogênios (coumestrol e genisteína), DDT, 17β-estradiol, estrona, 17α-

etinilestradiol, bisfenol A, testosterona, dietilestilbestrol, nonilfenol, metoxicloro, DDE,

dihidrotestosterona e progesterona.

COLLINS et al., 1997, ARNOLD et

al., 1996, GAIDO et al., 1997

YES (Metodologia ROUTLEGDE e SUMPTER,

1996)

Octilfenol e nonilfenol, Fitoestrogênios (genisteína e coumestrol), 17β-estradiol, estrona,

cetotestosterona, dihidrotestosterona, testosterona, 17α-etinilestradiol, 2-

hidroxiestradiol, mestranol, bisfenol A, metoxicloro (pesticida), nonilfenol, Bisfenol A, dietilestilbestrol, butilbenzilftalato DDE, DDT,

estradiol 3-sulfato, 4-tert-octilfenol e 4-tert-butilfenol

MOFFAT et al., 2001,

MATSUMOTO et al., 2004, ELSBY et

al., 2001, DE BOEVER et al., 2001, VAN DEN

BELT et al., 2004, LI et al., 2004, SCHULTIS e

METZGER, 2004, SOHONI E

SUMPTER, 1998 e BERESFORD et

al., 2000

E-screen

Bisfenol A, PCD, dioxinas, octilfenol, butilbenzilfatalato (BBP)

17β-estradiol, estrona, 17α-etinilestradiol, dietilestilbestrol, octilfenol e nonilfenol

BEHNICSH et al., 2001, SCHULTIS e METZGER, 2004,

KÖNER et al., 1999

73

Tabela II.13. Algumas vantagens e desvantagens dos ensaios in vitro e in vivo. Ensaio Vantagens Desvantagens

Ensaio in vitro

Ensaio de Ligação

Competitiva nos RE

• Ensaios rápidos.

• São significativamente menos sensíveis do que outros ensaios in vitro

• Não é um ensaio de fácil automatização, limitando assim sua utilização como ferramenta screening

• Requer uso de aparatos especiais de laboratórios por causa das substâncias radioativas.

Ensaio E-screen • Ensaio bastante sensível.

• Algumas substâncias não-estrogênicas têm influenciado a proliferação em algumas linhagens das células MCF-7;

• Variabilidade inter-laboratórios têm sido observada nestes ensaios

• Consumo maior de tempo; • Cultivo mais difícil dos que as

células de leveduras; • Mais vulneráveis a riscos de

contaminação.

Ensaio YES

• Simplicidade; • Produto do gene reporter é

excretado no meio não sendo necessário o lise celular;

• Células de leveduras são mais resistentes em condições adversas;

• Cultivo e manutenção fáceis; • Rápido crescimento celular.

• É menos sensível do que os ensaios com células de mamíferos e o E-screen;

• Endpoint colorimétricos (β-galactosidase) tendem a ser menos sensíveis do que para os baseados na luciferase (luminômetro).

Ensaio in vivo

Ensaio com Roedores

• Incorpora todos os aspectos do sistema endócrino, permitindo um estudo da absorção, metabolismo, distribuição e excreção da substância, como também de caminhos alternativos.

• Não são adequados para analisar substâncias em larga escala;

• Custo e complexidade altos; • Alto tempo de ensaio; • Problemas éticos com o uso de

animais.

Ensaio com biomarcadores

(VTG)

• Realizado em curto prazo e baixo custo;

• Resposta direta e facilmente medida.

74

II.2.3. Sistemas de análises

Os ensaios in vitro nem sempre predizem com confiança os resultados in vivo

devido a diferenças no metabolismo dos sistemas usados e os diversos mecanismos pelo

qual um desregulador endócrino pode atuar (BAKER, 2001). A escolha de um sistema

de ensaios apropriado para caracterizar quais substâncias podem afetar o sistema

endócrino é complexa por vários fatores, entre eles o fato de que os desreguladores

endócrinos podem atuar por diversos mecanismos de ação diferentes que podem

produzir uma grande faixa de repostas, e sabemos que muitas substâncias o fazem em

concentrações muito baixas.

Um conjunto de ensaios in vivo e in vitro é essencial para detectar, caracterizar e

avaliar o efeito potencial de uma substância ou uma mistura de substâncias. Uma gama

de ensaios o quais compreendam vários mecanismos de ação dos desreguladores

endócrinos pode ser usada. Um exemplo dado por BAKER, 2001 inclui: 1) ensaio de

ligação nos receptores hormonais; 2) ensaio gene repórter e 3) ensaio in vivo (ex. ensaio

uterotrófico).

Enfim, a caracterização de uma substância como um desregulador endócrino vai

depender de um sistema de ensaios com a confirmação positiva utilizando outros

ensaios. Métodos de ensaios confiáveis e adequados existem, são necessárias a

validação e padronização dos sistemas de ensaios in vivo e in vitro desenvolvidos para

identificar e classificar substâncias com efeitos endócrinos.

Organizações mundiais estão se empenhando no desenvolvimento e

implementação de estratégias de ensaios para avaliar os riscos associados com

substâncias caracterizadas como desreguladores endócrinos, que devem abranger

substâncias estrogênicas, andrógenas e substâncias ativas–tiróide e ainda que

substâncias ativas nestes ensaios devam ser testadas em estudos em animais (BLAIR et

al., 2000). Com isso, comitês têm sido criados para desenvolver um programa de

ensaios e testes para avaliar o potencial dos desreguladores endócrinos em humanos e

animais, incluindo o EDSTAC formado pela EPA.

Recentemente, um conjunto de ensaio in vivo e in vitro está sendo desenvolvido e

aplicado para a avaliação dos potenciais efeitos dos desreguladores endócrinos de

75

substâncias simples ou amostras ambientais (PAWLOWSKI et al., 2003, VAN DEN

BELT et al., 2004).

A maior preocupação com relação aos ensaios que caracterizam os efeitos

potenciais dos desreguladores endócrinos é se as novas tecnologias podem realmente

servir como ferramentas para o entendimento do mecanismo de ação dos desreguladores

endócrino e se essas tecnologias podem ser usadas para o monitoramento dos efeitos

provocados em animais e humanos por essas substâncias.

76

II.3. FÁRMACOS RESIDUAIS

Outra classe de micropoluentes orgânicos, presentes em ambientes aquáticos,

bastante investigada atualmente na química ambiental, são os fármacos. Toneladas de

medicamentos são produzidas anualmente e aplicadas na medicina humana e

veterinária, sendo que a quantidade exata produzida não é publicada na literatura. Após

a administração, uma parte significativa dos fármacos é excretada e seu maior destino é

o esgoto doméstico. Estudos demonstram que vários fármacos podem ser persistentes no

meio ambiente e não são completamente removidas nas ETE (STUMPF et al., 1999,

TERNES, 1998, TERNES et al., 1999a). Além disso, muitos fármacos resistem aos

processos convencionais de tratamento de água (TERNES, 1998).

Como veremos nesta seção, fármacos, tais como, antibióticos, estrogênio

sintético, anestésicos, agentes reguladores de lipídeos, meio de contraste de Raios-X,

antiinflamatórios, droga antiepilética, entre outros, foram detectados no esgoto

doméstico, em águas superficiais e de subsolo em vários países (BILA e DEZOTTI,

2003).

Na Alemanha, 18 antibióticos foram identificados em efluentes de ETE e águas

superficiais por HIRSCH et al. (1999); TERNES et al. (1999a) detectaram estrogênios

em concentrações da ordem de µg.L-1 em efluentes de ETE. O ácido clofíbrico, um

metabólito de três agentes reguladores de lipídeos, foi identificado em rios, águas de

subsolo e água potável em concentrações na faixa de µg.L-1 por TERNES (1998) e

SACHER et al. (2001).

Dois problemas ambientais relacionados à presença de fármacos no meio

ambiente são amplamente discutidos O primeiro é devido ao uso desenfreado de

antibióticos; as bactérias podem fazer, e freqüentemente o fazem, mudanças no seu

material genético, adquirindo resistência aos antibióticos. Assim, uma bactéria presente

em um corpo hídrico que contenha traços de antibióticos, pode adquirir resistência a

essas substâncias (BOWER e DAESCHEL, 1999). O segundo é o 17α-etinilestradiol,

um fármaco muito usado como contraceptivo oral que causa efeitos danosos ao sistema

endócrino dos animais, sendo classificado como desregulador endócrino.

77

Os fármacos são desenvolvidos para estimular uma resposta em animais e

humanos, muitas vezes em baixas doses e com um objetivo específico, sendo assim, as

implicações para a saúde humana devido a sua presença no meio ambiente devem ser

avaliadas. O contraceptivo oral 17α-etinilestradiol tem elevada potência e causa efeitos

biológicos mesmo em baixas concentrações. Antibióticos presentes na água, solo e

sedimentos podem causar alterações na comunidade microbiana e afetar organismos de

uma cadeia alimentar.

Métodos para avaliar os riscos ambientais para os fármacos têm sido investigados

e desenvolvidos, bem como programas de monitoramento de fármacos no meio

ambiente em vários países do mundo têm sido criados. Porém, o levantamento de um

maior número de dados ainda é necessário.

II.3.1. Ocorrência de Fármacos no Meio Ambiente

A ocorrência de fármacos no esgoto doméstico e águas naturais é um importante

tópico internacional. Estudos demonstram que esses micropoluentes e seus metabólitos

estão presentes em ambientes aquáticos em várias partes do mundo, como Alemanha,

Áustria, Brasil, Canadá, Espanha, Holanda, Inglaterra, Itália, Japão, Suíça, Estados

Unidos e Reino Unido, (AHRER, et al., 2001, BARONTI et al., 2000, BEHNISCH et

al., 2001, BELFROID et al., 1999, BUSER et al., 1998a, BUSER et al., 1998b, BUSER

et al., 1999, DESBROW et al., 1998, FARRÉ et al., 2001, HARTIG et al., 1999,

HIRSCH et al., 1998, JOHNSON, et al., 2000, KOLPIN et al., 2002, LINDSEY et al.,

2001, NAKAMURA et al., 2001, RODRÍGUEZ et al., 2003, SACHER et al., 2001,

STUMPF , et al., 1999, TERNES et al., 1999a, TERNES e HIRSCH, 2000, WINKLER

et al., 2001, XIAO et al., 2001).

Na investigação de WINKLER et al. (2001), em rios do Canadá foram detectadas

concentrações de 0,087 µg.L-1 para o ibuprofeno e 0,049 µg.L-1 para o ácido clofíbrico.

O ácido clofíbrico e o ibuprofeno também foram detectados em águas superficiais na

Alemanha (TERNES, 1998, WEIGEL et al., 2002), Áustria (AHRER, et al., 2001),

Brasil (STUMPF et al., 1999) e Espanha (FARRÉ et al., 2001) na faixa de 0,01 a 3,0

µg.L-1.

78

Na Alemanha, TERNES e HIRSCH (2000) investigaram a presença de meios de

contraste de Raios-X em efluentes de ETE. As concentrações máximas foram detectadas

para o iopamidol e iopromida que foram de 15 µg.L-1 e 11 µg.L-1, respectivamente,

indicando que esses fármacos estão em grandes concentrações nos efluentes de ETE.

A ocorrência de meios de contraste de Raios-X tais como, iopamidol, ioprimida e

iomeprol foram investigadas em águas superficiais na Alemanha por PUTSCHEW et al.

(2001) e TERNES e HIRSCH (2000). As concentrações médias detectadas foram 0,49

µg.L-1 para iopramidol e 1,6 µg.L-1 para iopromida. Os meios de contraste de Raios-X

são aplicados em altas doses quando utilizados na radiologia e, segundo STEGER-

HARTMANN et al. (2002), são excretados quase completamente sem metabolização e

assim lançados em concentrações consideráveis no meio ambiente.

TERNES e HIRSCH (2000) investigaram a ocorrência de meios de contrastes de

Raios-X em águas de subsolo da Alemanha e detectaram uma concentração máxima de

2,4 µg.L-1. O iopamidol e diatrizoato foram detectados com valores médios de

0,16µg.L-1 e 0,03 µg.L-1, respectivamente. A contaminação de fármacos em águas de

subsolo é uma prova de que muitos desses compostos infiltram no aqüífero e podem

persistir por vários anos.

A ocorrência de 32 fármacos residuais de diferentes classes medicinais como

agentes reguladores de lipídeos, drogas psiquiátricas, droga antiepilética, β-

bloqueadores e 5 metabólitos foram detectados em águas superficiais na Alemanha por

TERNES (1998). Entre os fármacos detectados pode-se citar a carbamazepina um

antiepiléptico e o ácido acetilsalicílico com concentrações médias de 2,1 µg.L-1 e 0,22

µg.L-1, respectivamente.

Uma investigação no Brasil (STUMPF et al., 1999) detectou diferentes tipos de

fármacos na faixa de µg.L-1, no esgoto doméstico do estado do Rio de Janeiro. As

concentrações máximas foram determinadas para o agente regulador de lipídeo

bezafibrato (1,2 µg.L-1), para o antiinflamatório indometacina (0,95 µg.L-1) e para o

metabólito ácido clofíbrico (1,0 µg.L-1). Outros fármacos foram detectados em

concentrações de 0,1 a 1,0 µg.L-1, devido à incompleta eliminação de fármacos durante

sua passagem nas ETE. Outros antiinflamatórios como diclofenaco e ibuprofeno foram

79

detectados no esgoto doméstico e efluentes de ETE na Suíça (BUSER et al., 1998b,

BUSER et al., 1999) na faixa de 2 ng.L-1 a 3,3 µg.L-1.

Os rios que recebem os efluentes de ETE são assim contaminados devido às altas

concentrações de fármacos presentes nestes efluentes. Em rios do estado do Rio de

Janeiro, o ácido clofíbrico (metabólito de três agentes reguladores de lipídeos) e os

antiinflamatórios diclofenaco e naproxeno foram freqüentemente detectado no

monitoramento realizado por STUMPF et al. (1999). As concentrações máximas foram

encontradas em águas superficiais em áreas urbanas da cidade do Rio de Janeiro e

Niterói, e freqüentemente excederam a concentração de 0,1 µg.L-1.

TERNES (1998) investigou a ocorrência de fármacos de diferentes classes

medicinais no esgoto doméstico e efluente de ETE na Alemanha, concluindo que

aproximadamente 80% dos fármacos estudados foram encontrados em efluentes de ETE

devido à incompleta remoção de fármacos durante sua passagem na ETE, como a

carbamazepina que foi detectada com uma concentração máxima de 6,3 µg.L-1,

resultando na contaminação de rios e lagos.

Os antibióticos são fármacos freqüentemente investigados no meio ambiente

devido ao seu potencial de desenvolver bactérias multi-resistentes. Penicilinas,

fluoroquinolonas, tetraciclinas, sulfonamidas e macrolídeos têm sido amplamente

detectados em vários ambientes aquáticos. Ciprofloxacina e norfloxacina foram

detectados no esgoto doméstico e efluente de ETE na Suíça (GOLET et al., 2002) na

faixa de 45 a 568 ng/L e 36 a 367 ng/L, respectivamente. A eficiência de remoção

desses fármacos nas ETE esteve na faixa de 79 a 87% (GOLET et al., 2001 e GOLET et

al., 2002). De acordo com GOLET et al. (2002) e KÜMERER et al. (2000), as

propriedades de forte adsorção e a resistência à biodegradabilidade observadas nas

fluoroquinolonas, sugerem que a sua adsorção no processo de lodos ativados é o

principal caminho da remoção desses antibióticos durante o tratamento nas ETE.

Os antibióticos foram freqüentemente detectados em águas superficiais em todo o

mundo. No monitoramento realizado por LINDSEY et al (2001) nos EUA foram

detectados vários antibióticos, entre eles, a tetraciclina, o sulfametoxazol, a

oxitetraciclina e a clorotetraciclina na faixa de 0,07 a 15 µg.L-1, esses dois últimos

antibióticos são muito usados na aqüicultura. HIRSCH et al. (1999) investigaram a

80

ocorrência de 18 antibióticos em águas superficiais na Alemanha, a eritromicina e o

sulfametoxazol foram freqüentemente detectados na faixa de 0,03 a 1,70 µg.L-1, outros

antibióticos foram esporadicamente detectados. Outros autores também reportaram a

ocorrência de antibióticos em ambientes aquáticos em outros países (SACHER et al.,

2001, HIRSCH et al., 1999, HARTIG et al., 1999).

As águas de subsolo podem ser contaminadas com fármacos através da infiltração

de águas superficiais contendo fármacos, bem como pelo chorume proveniente de

aterros sanitários. Pelo fato de alguns fármacos serem solúveis em água e terem uma

baixa afinidade como o solo, muitas dessas substâncias migram rapidamente para águas

de subsolo.

Analgésicos foram freqüentemente detectados em amostras de água de subsolo em

Berlim (REDDERSEN et al., 2002). Fenazona, propifenazona e dimetilaminofenazona

foram detectados em concentrações médias de 3 µg.L-1, 1 µg.L-1 e 0,4 µg.L-1,

respectivamente. Nesta região, a contaminação das águas de subsolo está sob a

influência das águas superficiais de rios. Fenazona também foi detectada com máxima

concentração de 25 ng/L, no monitoramento das águas de subsolo na Alemanha,

realizado por SANCHER et al. (2001), no qual ainda foram detectados fármacos como

diclofenaco (analgésico), carbamazepina (antiepiléptico), iopamidol (meio de contraste

de Raios-X) e sulfametoxazol (antibiótico) em concentrações máximas na faixa de 300 a

900 ng/L.

Investigações sobre a contaminação de diferentes ambientes aquáticos por

fármacos residuais revelam que esses contaminantes estão presentes em faixas de

concentrações de µg.L-1e ng.L-1. O Anexo 2 apresenta uma compilação das

concentrações médias de fármacos detectados no meio ambiente, em trabalhos

conduzidos por diversos autores.

II.3.1.1. Fármacos monitorados no Brasil

Em 1996 e 1997, agentes reguladores de lipídeos, antiinflamatórios, e alguns

metabólitos foram detectados em esgoto, em efluente de ETE e em águas de rios no

estado do Rio de Janeiro por STUMPF et al. (1999). Estes resultados são apresentados

81

na Tabela II. 14. Neste estudo, foram investigados os efluentes de 10 ETE na cidade do

Rio de Janeiro e 17 águas superficiais no estado do Rio de Janeiro, dentre estes, o rio

Paraíba do Sul, Lagoa de Jurtunaíba na Região dos Lagos, a Baía de Guanabara e

amostras de águas potáveis de algumas das maiores cidades do estado do Rio de Janeiro

(Rio de Janeiro, Niterói, Três Rios, Campos e Resende).

Tabela II.14. Fármacos e metabólitos monitorados no Brasil por STUMPF et al. (1999).

Substância Classe das Substâncias Concentração

no meio ambiente

Condições

1,0 µg.L-1 Esgoto doméstico/RJ Ácido Clofíbrico

Maior metabólito de três agentes reguladores de

lipídeos 0,2-0,3 µg.L-1 Correntes do rio Paraíba do Sul/RJ

Ácido Fenofíbrico

Maior metabólito do fenofibrato 0,4 µg.L-1 Esgoto doméstico/RJ

Bezafibrato Agente regulador de lipídeos 1,2 µg.L-1 Esgoto doméstico/RJ

Genfibrozila Agente regulador de lipídeos ≈ 0,3 µg.L-1 Esgoto doméstico/RJ

Ibuprofeno Antiinflamatório ≈ 0,35 µg.L-1 Esgoto doméstico/RJ ≈ 0,8 µg.L-1 Esgoto doméstico/RJ

Diclofenaco Antiinflamatório 0,02–0,06 µg.L-1

Correntes do rio Paraíba do Sul/RJ

Cetoprofeno Antiinflamatório ≈ 0,55 µg.L-1 Esgoto doméstico/RJ Indometacina Antiinflamatório 0,95 µg.L-1 Esgoto doméstico/RJ

≈ 0,55 µg.L-1 Esgoto doméstico/RJ Naproxeno Antiinflamatório 0,02 – 0,05

µg.L-1Correntes do rio Paraíba do Sul/RJ

Segundo STUMPF et al. (1999), a concentração média nos efluentes de ETE, da

maioria dos fármacos investigados foi faixa de 0,1 a 1,0 µg.L-1. Nos rios, as

concentrações médias ficaram entre 0,02 e 0,04 µg.L-1, como conseqüência da

incompleta remoção dos fármacos durante sua passagem pela ETE e pelo descarte de

esgoto in natura. A taxa de remoção de fármacos individuais durante a passagem pela

ETE variou de 12 a 90%, como apresentado na Tabela II. 15. Os fármacos mais

freqüentemente detectados foram o ácido clofíbrico, ibuprofeno, diclofenaco,

bezafibrato e naproxeno. Nas ETE a maior concentração média determinada foi para o

bezafibrato (1,0 µg.L-1). O ácido clofíbrico, o diclofenaco e o naproxeno foram

82

detectados na faixa de 0,06 a 0,1 µg.L-1no Paraíba do Sul, rio mais importante para a

produção de água potável do estado do Rio de Janeiro. Na Baía de Guanabara o ácido

clofíbrico, o diclofenaco e o naproxeno foram novamente os fármacos mais

freqüentemente detectados, contudo, na faixa de 10 a 100 ng.L-1.

Tabela II.15. Remoções de fármacos na ETE da Penha/RJ por STUMPF et al. (1999).Remoção (%)

Fármaco Efluente tratado pelo filtro biológico

Efluente tratado pelo processo de lodos ativados

Ácido Clofíbrico 15 34 Ácido Fenofíbrico 6 45

Bezafibrato 27 50 Genfibrozila 16 46 Ibuprofeno 22 75 Diclofenaco 9 75 Cetoprofeno 48 69 Indometacina 71 83

Naproxeno 15 78

Em outro estudo na Brasil, TERNES et al. (1999a) detectaram o contraceptivo

oral 17α-etinilestradiol na ETE da Penha/RJ. O 17α-etinilestradiol foi detectado em

uma concentração de 0,005 µg.L-1, as taxas de remoção na ETE foram de 64% e 78%

para o efluente do filtro biológico e para o efluente do processo de lodos ativados.

II.3.2. Aplicação e Destino dos Fármacos no Meio Ambiente

Os Fármacos são largamente utilizados na medicina humana e veterinária, e em

geral, são desenvolvidos para serem persistentes para servir a um propósito terapêutico.

Os fármacos são absorvidos pelo organismo e estão sujeitos a reações metabólicas, tais

como, hidroxilação, clivagem ou glucuronação. Entretanto, segundo MULROY (2001)

cerca de 50 a 90 % dessas substâncias originais e seus metabólitos são excretados na

urina, fezes ou esterco animal. Os fármacos freqüentemente são excretados não

metabolizados ou como moléculas polares conjugadas, tal como glucuronides. Durante

os processos de tratamento das ETE, essa forma conjugada é facilmente transformada

nos fármacos original e assim são lançadas em ambiente aquático (REDDERSEN et al.,

2002).

83

A excreção é o maior e principal meio pelo qual os fármacos de uso humano e

veterinário são introduzidos no meio ambiente. Uma vez no esgoto doméstico, os

fármacos entram nas ETE, onde não são completamente removidos (STUMPF et al.,

1999) e são descartados no meio ambiente com os efluentes das ETE. Uma grande

quantidade de fármacos também é encontrada nos efluentes hospitalares (KÜMERER et

al., 1997).

Pouco se conhece sobre o comportamento e o destino dos fármacos no meio

ambiente, que dependem de suas propriedades físico-químicas e concentrações médias

presentes no meio ambiente. A Figura II. 6 apresenta um esquema que sugere possíveis

caminhos para os fármacos e estrogênios, quando descartados no meio ambiente (BILA

e DEZOTTI, 2003).

Alguns fármacos também são identificados no lodo biológico das ETE

(BEAUSSE, 2004). Fármacos de uso veterinário e humano podem ser lançados no meio

ambiente através do lodo produzidos nas ETE e do esterco que, algumas vezes, são

aplicados no solo, contaminando um solo que poderá ser usado na agricultura

(JJEMBA, 2002), esse processo pode causar um impacto ambiental, bem como

prejudicar a saúde humana (JORGENSEN e HALLING-SORENSEN, 2000). Outras

pesquisas mostram a ocorrência de fármacos no solo e lodo biológico (BEAUSSE,

2004, RABOLLE e SPLIID, 2000).

Medicamentos que não foram totalmente utilizados ou com a data de validade

vencida, são dispostos nos aterros sanitários ou no esgoto doméstico. Uma prática

comum antigamente em alguns países era o de dispor os resíduos de indústrias

farmacêuticas em aterros sanitários. Assim, uma outra forma de contaminação das águas

superficiais e de subsolo é através do chorume proveniente dos aterros sanitários

(HOLM et al., 1995).

84

Aplicação Produção

Excreção

MedicinaVeterinária

MedicinaHumana

Aquicultura

Esterco Esgoto Sedimento

Águas Superficiais

Estação de Tratamento de Água Água Potável

AterroSanitário

Água de Subsolo

ETE

Indústria

Solo Estação detratamentode efluentesindustriais

Figura II.6. Possíveis rotas de fármacos e estrogênios no meio ambiente (BILA e

DEZOTTI, 2003).

Na medicina veterinária, os antibióticos são usados como promotores de

crescimento, na prevenção e controle de doenças na criação de gado, aves, ovelhas e

cavalos, como também, são intensivamente usados como aditivos de alimento de peixe

na aqüicultura e criação de porcos (INGERSLEV et al., 2001, LOKE et al., 2000,

RABOLLE e SPLIID, 2000). Na produção animal, restos de alimentos que contêm

aditivos podem ser dispostos como lixo ou permanecem nas pastagens. Sendo assim,

podem contaminar o solo, águas de subsolo e superficiais. Devido ao uso na cultura de

peixes, alguns antibióticos como o cloranfenicol e o oxitetraciclina são detectados em

sedimentos de origem marinha (CHIEN et al., 1999, SMITH e SAMUELSEN, 1996).

Os sedimentos marinhos pode ser o último estágio para muitas dessas substâncias

lançadas no sistema aquático, como o agente farmacêutico 17α-etinilestradiol

identificados LAI et al. (2000). Os sedimentos marinhos atuam como uma fonte

secundária de fármacos como o 17α-etinilestradiol e o DES impactando o sistema

aquático (PETROVIC et al., 2001).

85

No solo, a sorção e mobilidade dos fármacos dependem de algumas características

do solo e da estrutura química do fármaco. RABOLLE e SPLIID (2000) investigaram a

sorção e a mobilidade de antibióticos, usados na medicina veterinária, em diferentes

solos agrícolas, concluindo que o metronidazol e olaquindox apresentam uma alta

mobilidade, enquanto que a oxitetraciclina e tilosina são fortemente adsorvidos

independentemente do tipo de solo, e apresentam uma fraca mobilidade.

II.3.2.1 Degradação de fármacos no meio ambiente

De acordo com RICHARDSON and BROWRON (1985), há três destinos

possíveis para qualquer fármaco individual nas ETE:

1. Pode ser biodegradável, ou seja, mineralizado a gás carbônico e água,

como por exemplo, o ácido acetilsalicílico;

2. Pode passar por algum processo metabólico ou ser degradado

parcialmente, como as penicilinas;

3. Pode ser persistente, como o clofibrato, um agente regulador de lipídeos.

Fármacos normalmente são lipofílicos, freqüentemente apresentam baixas

biodegradabilidades (CHRISTENSEN, 1998), conseqüentemente, possuem um

potencial para bioacumulação e persistência no meio ambiente. A persistência de

fármacos em águas superficiais e de subsolo, em ETE, em solos e em sedimentos

marinhos tem sido relatada em alguns estudos (TERNES, 1998, RICHARDSON e

BROWRON, 1985). Transformações naturais bióticas e abióticas dessas substâncias

nesses ambientes, tal como a fotodegradação solar influenciam sua degradação no meio

ambiente e necessitam ser mais bem estudada. A persistência à fotodegradação solar de

alguns fármacos em ambientes aquáticos tem sido investigada (ANDREOZZI et al.,

2002, ANDREOZZI et al., 2003b, ANDREOZZI et al., 2003c).

TIXIER et al. (2003) investigaram os processos responsáveis pela remoção de

fármacos em rios de Suíça. A fotodegradação foi identificada como o principal processo

de eliminação do diclofenaco em águas naturais. Com um relativamente alto coeficiente

de sorção em partículas, o ibuprofeno pode ser eliminado pela sedimentação. No caso

86

do cetoprofeno e do naproxeno, a biodegradação e a fotodegradação podem ser

mecanismos de remoção de ambientes aquáticos.

ANDREOZZI et al. (2002) observaram somente uma leve remoção da

carbamazepina de ambientes aquáticos através dos mecanismos de fotodegradação

solar. Para o diclofenaco, ensaios em laboratórios com águas naturais resultaram em

uma rápida eliminação desse fármaco pela fotodegradação (BUSER et al., 1998b).

A fim de se investigar a degradação de fármacos no meio ambiente, testes em

laboratórios com lodo biológico de ETE (KALSCH, 1999, STEGER-HARTMANN et

al., 1997, TERNES et al., 1999b), águas naturais e sedimentos marinhos (INGERSLEV

et al., 2001, KALSCH, 1999) vêm sendo executados. TERNES et al. (1999b)

analisaram o comportamento do fármaco contraceptivo 17α-etinilestradiol em ETE.

Para isso, experimentos em batelada foram realizados com lodo biológico aeróbio de

uma ETE na Alemanha. Os resultados mostraram aproximadamente 20% do 17α-

etinilestradiol foi degradado nos experimentos em batelada após 24h com uma

concentração inicial de 1 ng.L-1 e depois de 48h com uma concentração inicial de

1µg.L-1, indicando uma relativa persistência deste estrogênio.

Geralmente, os fármacos persistem no meio ambiente e podem bioacumular, ou

podem ser degradados, tornando-se, porém “persistentes” porque são continuamente

introduzidos no meio ambiente por serem muito utilizados (MCGOVERN e

MCDONALD, 2003).

CARBALLA et al. (2004), investigaram a eficiência de remoção de fármacos

(carbamazepina, diazepan, diclofenaco, ibuprofeno, naproxeno, roxitromicina,

sulfametoxazol e iopromida) em uma ETE na Espanha. De acordo com este estudo, as

remoções alcançadas foram de 40-70% para os antiinflamatórios (ibuprofeno e

naproxeno), 67% para o sulfametoxazol, a iopromida não foi significativamente

removida.

STEGER-HARTMMAN et al. (2002) investigaram a degradação do meio de

contraste de Raios-X, iopromida, através de testes que simulam condições nas ETE.

Concluíram que esse fármaco é lentamente degradado, pois cerca de 80% da iopromida

foi removida após 31 dias. Estes estudos mostram que alguns fármacos não são

removidos no tratamento convencional de esgoto ou não podem ser adsorvidos no lodo

87

biológico. RICHARDSON e BROWRON (1985) investigaram a biodegradação de

fármacos durante o tratamento de esgoto doméstico e concluíram que alguns

analgésicos, antibióticos e antiinflamatórios não são biodegradáveis.

Segundo KÜMMERER et al. (1997), a ifosfamida, um fármaco usado no

tratamento de tumores, não foi biodegradada nos testes com processo de lodos ativados

de uma ETE, sendo considerado persistente ao meio ambiente. Em outro estudo,

KÜMMERER et al. (2000) investigaram a biodegradação de alguns antibióticos de uso

veterinário (ciprofloxacina, ofloxacina e metronidazol). Os resultados indicaram que

estes antibióticos não foram biodegradados nos testes, sugerindo que esses fármacos

podem não ser removidos nas ETE e assim serem lançados no ambiente aquático.

INGRERLEV et al. (2001) estudaram a biodegradação de antibióticos de uso

veterinário em águas superficiais e sedimentos marinhos. Os antibióticos metronidazol,

tilosina, e oxitetraciclina foram considerados moderadamente persistentes no meio

ambiente, já o olaquinox foi biodegradável nos experimentos realizados. HENSCHEL et

al. (1997) observaram que o ácido salicílico pode ser facilmente biodegradado, ao

contrário do ácido clofíbrico e do metotrexato que foram considerados persistentes.

A remoção dos analgésicos fenazona e propifenazona (remoções de 90% foram

alcançadas para os dois fármacos) durante o tratamento de água potável foi investigada

por REDDERSEN et al.(2002). O lodo dos filtros foi analisado para se avaliar se a

redução da concentração desse as substâncias foi causada pela adsorção nas partículas

ou pelos processos microbiológicos, como resíduos desses analgésicos não foram

detectados no lodo biológico, assumiu-se que a fenazona e a propifenazona foram

biodegradas durante o tratamento por processos microbiológicos.

II.3.3. Possíveis Efeitos da Presença de Fármacos ao Meio Ambiente

A ocorrência de fármacos e estrogênios no meio ambiente pode apresentar efeitos

adversos em organismos aquáticos e terrestres. O efeito pode ser em qualquer nível da

hierarquia biológica: célula - órgãos - organismo - população - ecossistema. De acordo

com JORGENSEN e HALLING-SORENSEN (2000) alguns desses efeitos podem ser

observados em concentrações da ordem de ng/L. Pouco é conhecido sobre o destino e o

88

comportamento dessas substâncias no ambiente aquático, assim como não está claro

quais organismos são afetados e em que grau.

Atualmente, os tópicos mais discutidos sobre o efeito de fármacos no meio

ambiente são o desenvolvimento de resistência bacteriana aos antibióticos

(GUARDABASSI et al., 2002, MIRANDA e CASTILLO, 1998) e os efeitos no sistema

endócrino causados por fármacos como o DES e 17α-etinilestradiol, conhecidos

desreguladores endócrinos já discutido no capítulo II.2. Até agora, outros efeitos

adversos específicos na saúde humana não foram apresentados e discutidos.

Um inevitável efeito do uso indiscriminado de antibióticos é a contribuição no

desenvolvimento de bactérias resistentes, assunto que tem sido largamente discutido

(GUARDABASSI et al., 2002, MIRANDA e CASTILLO, 1998, GUILLEMOT, 1999,

MCKEON et al., 1995). A resistência bacteriana aos antibióticos tem aumentado

substancialmente nos últimos anos, e vem se tornando um problema de saúde pública.

Segundo JORGENSEN e HALLING-SORENSEN (2000), há indícios de que o

desenvolvimento de resistência a antibióticos é favorecido por baixas concentrações. As

bactérias podem adquirir resistência através da mutação ou processos de transferência

genética, tal como, transformação, transducção e conjugação. Esses mecanismos têm

sido discutidos por alguns pesquisadores (ANDERSEN et al., 2001, BOWER e

DAESCHEL, 1999).

MIRANDA e CASTILLO (1998) investigaram a incidência de resistência

microbiana em uma espécie de Aeromonas isolada de fontes de águas naturais do Chile,

constatando que a resistência ocorreu com vários antibióticos testados, dentre esses, o

cloranfenicol, trimetropim, sulfametoxazol e tetraciclina.

Os hospitais são poderosos focos de desenvolvimento de bactérias resistentes

(KÜMMERER, 2001). Alguns autores relatam um aumento na incidência de infecções

em hospitais devido à resistência de bactérias aos antibióticos, como é o caso de

bactérias Gram-positivas em um hospital nos EUA relatada por GINZBURG et al.

(2001). KOLÁR et al. (2001) avaliaram o desenvolvimento da resistência em bactéria

Gram-negativa a antibióticos usados em um hospital na República Tcheca. Os

resultados mostraram que a resistência bacteriana depende do tipo de antibiótico e que

89

em muitos casos, um aumento nas bactérias resistentes é induzido pelo aumento no uso

de um determinado antibiótico.

Os antibióticos são amplamente aplicados na medicina veterinária, portanto o uso

de esterco como fertilizante na agricultura pode acarretar outros efeitos tóxicos ao meio

ambiente. MIGLIORE et al. (1995) avaliaram o efeito tóxico da sulfonamida em três

tipos de plantas e observaram alterações no desenvolvimento das plantas e em seus

mecanismos naturais, bem como a bioacumulação, acarretando risco de contaminação

na cadeia alimentar, além de causarem modificações da comunidade microbiana no

solo, incluindo o desenvolvimento de bactérias resistentes.

Estudos sobre os efeitos causados ao meio ambiente com o uso de antibióticos na

aqüicultura foram desenvolvidos por vários pesquisadores (CHIEN et al., 1999, SMITH

e SAMUELSEN, 1996, WU, 1995). Um desses efeitos, descrito por WU (1995), foi o

desenvolvimento de uma população de bactérias resistentes em sedimentos marinhos.

Esse estudo mostrou que o maior impacto é no sedimento marinho, e em menor

extensão na qualidade da água.

Algumas possíveis rotas de transmissão de resistência ao antibiótico têm sido

estudadas. WITTE (2000) descreveu os possíveis meios de transferência de resistência

aos antibióticos entre diferentes ecossistemas, dentre estes, ambientes aquáticos, tais

como, ETE, águas naturais e ambientes terrestre. CHEE-SANFORD et al. (2001)

demonstraram que genes de resistência aos antibióticos estão presentes em bactérias de

águas de subsolo e superficiais, como um resultado direto do uso de esterco na

agricultura, assim as águas de subsolo podem ser uma fonte em potencial de bactérias

com resistência aos antibióticos. A transferência de bactérias resistentes de animais para

humanos também tem sido relatada. Humanos podem ser infectados com a bactéria

Salmonella spp. pelo contato direto com animais infectados ou suas fezes, porém a mais

importante fonte de infecções humana é o consumo de produtos de origem animal

infectado (carne, ovos e etc.) (VAN DEN BOGAARD e STOBBERINGH, 2000).

Outros estudos também têm relatado a presença de bactérias resistentes no meio

ambiente, tal como, solo (SENGELOV et al., 2003), sedimentos marinhos (WU, 1995),

ETE (GRABOW et al., 1976, GUARDABASSI et al., 2002), águas superficiais

(MIRANDA e CASTILLO, 1998), águas de subsolo (MCKEON et al., 1995).

90

II.3.4. Avaliação do Impacto Ambiental de Fármacos em Ambientes

Aquáticos

No momento, um ponto crítico neste tema é saber se existem níveis elevados

desses fármacos no meio ambiente, que sejam suficientes para exercer efeitos adversos

em organismos aquáticos e terrestres. Esta questão estimula o desenvolvimento de

estudos de impacto ambiental, causado por diferentes fármacos presentes no meio

ambiente. Dados ecotoxicológicos têm sido levantados por alguns pesquisadores,

identificando assim, fármacos que são potencialmente perigosos ao meio ambiente,

porém, os dados disponíveis na literatura são insuficientes. A ocorrência desses

fármacos residuais em águas superficiais e de subsolo demonstra a necessidade de mais

estudos que determinem os efeitos tóxicos dessas substâncias ao meio ambiente.

Neste contexto, alguns pesquisadores (HENSCHEL et al., 1997, HALLING-

SORENSEN, 2000, LANZKY e HALLING-SORENSEN, 1997, MIGLIORE et al.,

1997, STEGER-HARTMANN et al., 1999, WOLLENBERGER et al., 2000) vêm

avaliando os possíveis riscos ambientais causados por diferentes fármacos. HENSCHEL

et al. (1997) analisaram dois fármacos, o paracetamol (analgésico) e o metotrexato

(fármaco usado na quimioterapia), e dois metabólitos, o ácido salicílico e o ácido

clofíbrico, com relação às suas biodegradabilidades e testes de toxicidade (valores de

EC50 com algas, microcrustáceo (Daphnia magna), embriões de peixe e bactérias

luminescentes). Os autores concluíram que os fármacos investigados se mostraram

potencialmente perigosos ao meio ambiente.

LANZKY e HALLING-SORENSEN (1997) utilizaram os organismos marinhos

Selenastrum capricormutum e Acatia tonsa para estudar os efeitos tóxicos agudos do

metronidazol (antibiótico). MIGLIORE et al. (1997) avaliaram a toxicidade de

antibióticos usados na medicina veterinária, determinando dados ecotoxicológicos como

CE50 utilizando Artemia cysts. HALLING-SORENSE (2000) usaram duas espécies de

micro algas (Microcystis aeruginosa e Selenastrum capricornutum) para estudar os

efeitos tóxicos agudos de oito antibióticos, dentre eles, a penicilina, a clorotetraciclina, o

olaquindox, a tetraciclina e o tilosina, usados na terapia e como promotores de

crescimento na medicina veterinária. WOLLENBERGER et al. (2000) avaliaram a

91

toxicidade crônica e aguda com o microcrustáceo Daphnia magna para 9 antibióticos de

uso veterinário, dentre esses, oxitetraciclina, sulfadiazina, tetraciclina e tilosina. Estes

estudos demonstraram que os fármacos estudados apresentam um potencial de causar

efeitos adversos no ambiente aquático.

STUER-LAURIDSEN et al. (2000), realizaram estudo de análise de risco

ambiental dos 20 fármacos mais usados na Dinamarca, dentre esses, analgésicos,

estrogênios e antiinflamatórios. No estudo de JONES et al. (2002) foi apresentada a

análise de risco ambiental para os 25 fármacos mais usados na Inglaterra (analgésicos,

antibióticos, antiinflamatórios, drogas antiepiléticas e β-bloqueadores).

Os efeitos tóxicos de fármacos residuais têm sido avaliados utilizando biota

aquática, no entanto, poucos dados experimentais têm sido obtidos para comunidades

terrestres. O estudo desenvolvido por MIGLIORE et al. (1995) avaliou os efeitos do

antibiótico sulfonamida na contaminação de um sistema terrestre com três espécies de

plantas. Observaram bioacumulação deste antibiótico, apresentando um significativo

impacto ambiental na comunidade microbiana e risco de contaminação da cadeia

alimentar.

Atualmente, uma avaliação de risco ambiental devido à contaminação por

fármacos tem sido requerida em vários países. Com isso, vários pesquisadores vêm

desenvolvendo metodologias de testes ecotoxicológicos e modelos para avaliação de

risco ambiental (HENSCHEL et al., 1997, JORGENSEN et al., 1998,

KOSCHORRECK et al., 2002).

92

II.4. MÉTODOS ANALÍTICOS UTILIZADOS NA DETERMINAÇÃO DE

FÁRMACOS E ESTROGÊNIOS EM MATRIZES AMBIENTAIS

O uso de técnicas analíticas no monitoramento e identificação de micropoluentes

no meio ambiente é importante tópico da química analítica. Métodos que determinam

com acurácia essas substâncias em concentrações na faixa de µg.L-1 e ng.L-1 em

matrizes ambientais complexas, tais como, águas naturais, solo, sedimento marinho,

lodo biológico e efluente de ETE, são um desafio para muitos pesquisadores.

Para a determinação de fármacos e estrogênios, diferentes métodos analíticos são

reportados na literatura, os quais primeiramente foram válidos para matrizes biológicas

como sangue, tecido e urina (HEDENMO e ERIKSSON, 1995, VREE et al., 1994,

WHITLAM e VINE, 1980,), sendo que algumas modificações nestes métodos podem

ser suficientes para amostras ambientais. No entanto, as análises de fármacos e

estrogênios em efluentes de ETE, em águas superficiais, de subsolos, água potável,

sedimento marinho, solo e lodo biológico requerem ainda o desenvolvimento de

metodologias analíticas mais sensíveis para a detecção de concentrações na faixa de

µg.L-1e ng.L-1 em matrizes ambientais muitas vezes complexas.

Nos últimos anos, muitos métodos para a análise desses micropoluentes em

amostras ambientais foram publicados, tais como para agentes reguladores de lipídeos,

β-bloqueadores e antiinflamatórios e alguns para a determinação de antibióticos,

estrogênios e drogas psiquiátricas. TERNES (2001) em seu estudo fez uma revisão de

todos os métodos analíticos utilizados na determinação de vários fármacos e

estrogênios, a níveis de ng.L-1, em diferentes matrizes ambientais aquosas. No estudo de

PETROVIC et al. (2002) foi apresentada uma revisão de métodos analíticos usados na

detecção de desreguladores endócrinos (alquilfenóis, PCDD, PCDF, bisfenol A, ftalatos,

PBDE e estrogênios) em amostras ambientais, tais como, águas superficiais e

subterrâneas, sedimento marinhos, solo e lodo biológico.

Para detecção de fármacos e estrogênios em ambiente aquático na faixa de µg.L-1e

ng.L-1, os métodos descritos na literatura, na maioria das vezes, são baseados na

extração e preparo das amostras que podem incluir a purificação da amostra,

concentração e/ou derivatização e finalmente a quantificação das substâncias. Os

93

métodos predominantes de quantificação são a cromatografias gasosa (CG) e a líquida

(CLAE), dependendo das substâncias a ser detectada. Em conjunto com a

cromatografia, a espectrometria de massa é bastante usada, freqüentemente conferem à

técnica uma maior sensibilidade e especificidade. A Tabela II.16 apresenta os diferentes

métodos utilizados na detecção de fármacos e estrogênios em amostras de ambientes

aquáticos.

Na determinação de estrogênios, em amostras aquosas, os métodos analíticos

publicados são freqüentemente baseados na extração por fase sólida (EFS),

derivatização e detecção por CG/EM, CG/EM/EM ou CLAE/EM. A EFS é uma técnica

de extração simples, rápida e que requer poucas quantidades de solventes.

Freqüentemente são usados cartuchos ou discos de extração, comercialmente

disponíveis, com uma variedade de adsorventes tais como, C18, resina de copolímero

poliestireno (ENV), sílica, alumina B, CN. A EFS não é só uma técnica de extração,

mas também de concentração dos componentes.

Para facilitar a determinação dos estrogênios pela CG, técnicas de derivatização

são usadas. Para isso, diferentes agentes são empregados, predominantemente derivados

sililanizados, tais como, MTBFA (N-metil-Ntert-butildimetilsilil-trifluoroacetamida),

MSTFA/TMSI/DTE(N-metil-N-(trimetilsilil)- trifluoacetamida / trimetilsililimidazola/

ditioeritrol), BSTFA (N, O – bistrimetilsililtrifluoracetamida), PFB-TMS

(pentafluorobenzil-trimetilsilil), MTBSTFA (N-metil-N-(tert- butildimetil

trifluoacetamida), PFPA (ácido pentafluorpropionico), PFBBR-TMS(pentafluorbenzil

bromado-trimetilsilil)). Na determinação de estrogênios pela cromatografia líquida não

há a necessidade de derivatização dos componentes das amostras. A Tabela II. 17

apresenta os métodos usados na determinação de estrogênios em amostras ambientais.

94

Tabela II.16. Métodos utilizados na determinação de fármacos em matrizes aquosas. Método Substâncias Referência

Estrogênios JOHNSON et al. 2000,

LÓPEZ de ALDA e BARCELÓ, 2001

Meios de contraste de Raios-X TERNES e HIRSCH, 2000 Ácido Clofíbrico, antibióticos, agentes

reguladores de lipídeos, antiinflamatórios, drogas epiléticas

AHRER et al., 2001

Ácido salicílico, antiinflamatórios e agentes reguladores de lipídeos FARRÉ et al., 2001

CLAE/ EMa

Antibióticos LINDSEY et al., 2001

Antibióticos GOLET, et al., 2001, HARTIG et al., 1999, HIRSCH et al., 1998

Antiinflamatórios, antiepiléptico e antidiabéticos. TERNES et al., 2001a

Estrogênios BARONTI et al., 2000 Analgésicos, β-bloqueadores, agentes reguladores de lipídeos, antibióticos SACHER et al, 2001

CLAE/EM/EMb

β-bloqueadores, antibióticos TERNES, 2001 Analgésicos, agentes reguladores de

lipídeos e metabólitos, antiinflamatórios STUMPF et al., 1999

Analgésicos, antipiréticos, antiinflamatórios, agentes reguladores de

lipídeos, drogas epiléticas, drogas psiquiátricas

SACHER et al, 2001

Estrogênios

CARGOUËT et al., 2004, DESBROW et al., 1998,

MOL, et al., 2000, NAKAMURA, et al., 2001,

TERNES et al., 2001b, XIAO et al., 2001

CG/EMc

Ácido Clofíbrico, antiinflamatórios, drogas epiléticas ÖLLERS et al., 2001

Estrogênios

BELFROID et al., 1999, FINE et al., 2003, KELLY,

2000, TERNES et al., 1999a,b CG/EM/

EMd

Antiinflamatórios, drogas antiepilépticas, agentes reguladores de lipídeos, β-bloqueadores, drogas psiquiátricas,

estrogênios

TERNES, 2001

aCLAE/EM – cromatografia líquida de alta eficiência acoplada a espectrometria de massas bCLAE/EM/EM – cromatografia líquida de alta eficiência acoplada a dois espectrômetros de massas

em série cCG/EM -cromatografia gasosa acoplada a espectrometria de massas dCG-EM/EM - cromatografia gasosa acoplada a dois espectrômetros de massas em série

95

Tabela II.17. Métodos usados na determinação de estrogênios em amostras ambientais.

Amostra Extração (EFS)

Derivatização Método

Limite de

detecção(ng.L-1)

Rec.a

(%) Ref.b

Águas naturais e efluentes de ETE

C18

Derivados de tert-butil-

dimetilsilil

CG-EM/EM 1 90 KELLY, 2000

Águas superficiais ENV/124 PFB-TMS CG-EM 0,10-0,28 86-

127 NAKAMURA,

et al., 2001

Água subterrânea

HLB – balanço

hidrofílico lipofílico

PFBBR-TMSI

CG-EM/EM 0,2-0,6 103 FINE et al.,

2003

Afluente e efluente de ETE, águas superficiais

divinilbenzeno e C18

PFPA CG-EM - - CARGOUËT et al., 2004

Águas naturais e potável e efluentes de ETE

C18, sílica, alumina B,

CN - CLAE-

EM 0,2-5 96-112

LÓPEZ DE ALDA e

BARCELÒ, 2001

Águas superficiais e efluentes

de ETE

C18, NH2Reagente

SIL-A CG-

EM/EM 0,1-2,4 88-98 BELFROID et al., 1999

Rec.a: Recuperação Ref.b: Referências

A presença desses micropoluentes em outros tipos de amostras ambientais, tais

como, lodo biológico e sedimentos marinhos, ditam a necessidade do desenvolvimento

de tecnologias que também façam a detecção nessas amostras, que muitas vezes

necessitam de etapas de extração com solvente, purificação (normalmente com sílica

gel), cromatografia de permeação em gel e/ou EFS dos componentes antes de serem

analisados em técnicas cromatográficas como a CG/EM, CG/EM-EM ou CLAE/EM

(KUSTER et al., 2004, PETROVIC et al., 2001, TERNES et al., 2001b).

A literatura também reporta o uso de técnicas biológicas na identificação e

quantificação de estrogênios naturais e ambientais tais como, ensaios de imunoadsorção

enzimática (ELISA) e radioimunoensaio (RIE) (BIRKETT e LESTER, 2003, IRWIN et

al., 2001, LI et al., 2004). O ensaio ELISA, que é baseado no uso de antígenos, tem sido

descrito como um método altamente sensível e seletivo para analisa de estrogênio e

96

outros desreguladores endócrinos em ambientes aquáticos. O ensaio ELISA é usado em

conjunto com técnicas de extração, tal como EPS para aumentar seu limite de detecção.

Recentemente, estão sendo desenvolvidos outros métodos analíticos baseados em

imunoensaios para monitorar fármacos, estrogênios, e pesticidas em amostras de água,

tal como um biosensor óptico (TSCHAMELAK et al., 2005).

97

II.5. A OZONIZAÇÃO E OS PROCESSOS OXIDATIVOS AVANÇADOS

II.5.1. Introdução

Segundo GLAZE (1987) o ozônio vem sendo usado no tratamento de água desde

1906, onde foi primeiramente empregado para desinfecção em uma planta de tratamento

de água potável na cidade de Nice na França. Na Europa, a ozonização é largamente

usada em plantas de tratamento de água para a oxidação de micropoluentes orgânicos,

para a desinfecção, no controle da flora, odor e cor. Atualmente, devido ao seu alto

poder de oxidação, o ozônio vem sendo utilizado em plantas de tratamento de água e

efluentes em várias partes do mundo (CAMEL e BERMOND, 1998, VON GUNTEN,

2003a, RICE, 1997, TERNES et al., 2002). No tratamento de efluentes é aplicado na

indústria têxtil, refinarias de petróleo, indústria de papel, entre outros.

O ozônio é um oxidante muito poderoso, somente os radicais HO• e o flúor

apresentam o poder de oxidação maior do que ozônio, como demonstrado pelos

potenciais de oxi-redução apresentados na Tabela II. 18.

Tabela II.18. Potenciais de oxi-redução de alguns agentes oxidantes.

Reação Potenciais de oxi-redução (Volts)

F2 + 2e- ↔ 2F- 2,870 HO• + H+ + e- ↔ H2O 2,760

O3+ 2H+ + 2e- ↔ O2 + H2O 2,076 OH• + e- ↔ HO- 2,020

H2O2 + 2H+ + 2e- ↔ 2H2O 1,776 MnO4

- + 4H+ + 3e- ↔ MnO2 + 2H2O 1,679 HOCl + H+ + 2e- ↔ Cl- + H2O 1,482 HOBr + H+ + 2e- ↔ Br- + H2O 1,331

O2+ 4H+ + 4e- ↔ 2H2O 1,229 HOI + H+ + 2e- ↔ I- + H2O 0,987 Cl2(aq) + 2e- ↔ ClO2

- + H2O 0,954 OCl- + H2O + 2e- ↔ Cl- + 2OH- 0,810 OBr- + H2O + 2e- ↔ Br- + 2OH- 0,761

OI- + H2O + 2e- ↔ I- + 2OH- 0,485

98

A ozonização pode ser combinada com outros processos, tais como, radiação UV

e peróxido de hidrogênio (H2O2), resultando em processos de tratamentos que podem

ser mais poderosos que apenas o ozônio. Com isso, o ozônio pode se decompor por

mecanismos que envolvem a geração de radicais HO•, os quais são espécies mais

reativas. Os processos caracterizados pela geração de radicais HO• são conhecidos

como Processos Oxidativos Avançados (POA) (ANDREOZZI et al., 1999, GLAZE,

1987, GLAZE e KANG, 1989). Os POA que incluem o ozônio são: O3/H2O2, O3/UV e

ozônio em altos valores de pH.

Os POA geralmente usam uma combinação de agentes oxidantes (H2O2 ou O3),

irradiação (UV ou ultrasom) e catalisadores (íons metálicos ou fotocatalisadores) com o

objetivo de gerar radicais HO•.Esses processos são de grande interesse devido ao seu

alto poder de oxidação. Os POA são relatados por vários autores para a degradação de

uma variedade de poluentes orgânicos (GLAZE e KANG, 1987). Os radicais HO• são

espécies muito reativas e com baixa seletividade, que reagem com a maior parte das

moléculas orgânicas com constantes de reação na ordem de 106-109M-1s-1 (GLAZE,

1987, ANDREOZZI et al., 1999).

Os POA apresentam grande potencial na remoção de poluentes com altas ou

baixas concentrações em diversas aplicações, entre elas, tratamento de águas

subterrâneas, redução do excesso de lodo biológico de ETE e compostos orgânicos

voláteis (VOC) (PARSONS, 2004)

Segundo PARSONS (2004), o número de publicações com os POA no tratamento

de água tem aumentado nos últimos anos, e apresenta três principais áreas de

oportunidade dessas aplicações, que são: (1) remoção dos precursores dos subprodutos

da desinfecção (DBP); (2) remoção de micropoluentes, incluindo, fármacos,

desreguladores endócrinos e biotoxinas e (3) inativação de microrganismos patogênicos

resistentes (ex. Crytosporidium).

Apesar do radical HO• ser o agente oxidante mais forte, o ozônio, por ser um

oxidante muito seletivo, é bastante usado no tratamento de água e efluentes. Sua

seletividade pode proporcionar que o tratamento seja realizado com baixas dosagens de

ozônio, ao passo que os oxidantes mais reativos (radicais HO•) podem ser largamente

consumidos nos processos oxidativos.

99

Os tratamentos baseados na destruição química, como o caso dos POA e a

ozonização, quando bem desenvolvidos, podem ser a solução para o tratamento de

efluentes com características particulares. Os processos de oxidação química permitem

a mineralização de poluentes em dióxido de carbono, água e inorgânicos ou sua

transformação em produtos menos complexos. Em geral, esses processos são acoplados

a outros, sejam biológicos ou físico-químicos, de forma a obter o melhor desempenho

possível no processo global de tratamento. Os processos oxidativos são particularmente

interessantes pelo fato de que levam a uma redução na produção de resíduos. Essas

tecnologias podem destruir efetivamente os poluentes orgânicos e não simplesmente

transferi-los de fase.

II.5.2. Geração do Ozônio e Propriedades Químicas e Físicas

O ozônio é um gás instável, sob as condições normais de tratamento de água e

efluentes, o qual deve ser gerado “in sito” para imediato uso, podendo ser produzido

comercialmente pelas técnicas: (1) exposição do oxigênio à radiação UV e (2) descarga

elétrica no gás oxigênio, que é a técnica mais usada na geração de ozônio e a qual

produz ozônio de acordo com a reação apresentada na Equação II.1 (GLAZE, 1987,

BALAKRISHNAN et al., 2002, HARRISON, 2000). O sistema de geração de ozônio

por descarga corona está apresentado na Figura II.7.

3O2 Descarga elétrica 2O3

II.1

O2 O2 + O3 Descarga de corona Alta

Voltagem AC

Remoção de calor

Eletrodo

Eletrodo Dielétrico

Figura II.7. Geração de Ozônio.

100

O ozônio é gerado pela passagem de um gás contendo oxigênio (ar sintético,

oxigênio puro, ou outras misturas com oxigênio) através da alta energia na descarga

elétrica (descarga corona) ou através da fonte de radiação UV. O ozônio quando gerado

do ar, têm uma cor azulada na célula do gerador, mas misturas de ar/ozônio são

invisíveis até mesmo nas altas concentrações que saem do gerador de ozônio.

Para grandes instalações, os geradores de descarga corona são requeridos, pois são

capazes de gerar altas concentrações de ozônio, necessárias para a suficiente

solubilização do ozônio para satisfazer as demandas de ozônio no tratamento.

O ozônio é parcialmente solúvel em água, de 10-20 vezes mais solúvel do que o

oxigênio. Como outros gases parcialmente solúveis, ozônio segue a lei de Henry que

formula que no equilíbrio, a concentração de um gás na água é diretamente proporcional

as suas pressões parciais na fase vapor sobre o líquido. A constante de

proporcionalidade de Henry varia com a temperatura, e ainda a solubilidade do ozônio

diminui com o aumento da temperatura.

Além de ser muito instável e por isso dever ser imediatamente usado após sua

produção, o ozônio tem uma adicional complicação que é a sua parcial solubilidade em

água. Como resultado disso, a efetividade do processo de ozonização depende da

introdução do ozônio na água ou efluente, ou seja, do contato líquido/gás e da

transferência de massa do ozônio da fase gás para a fase aquosa, que está relacionada

com a concentração de ozônio na fase gás produzido pelo gerador.

Os fatores que afetam a solubilidade do ozônio na água são: a concentração de

ozônio que entra no difusor; temperatura da água, pressão absoluta da água em contato

com o gás de ozônio; a demanda de ozônio na água e a eficiência do difusor de ozônio

empregado.

II 5.3. Instabilidade do Ozônio na Água

O ozônio é uma molécula instável, que se decompõe novamente em oxigênio. O

tempo de meia-vida para a decomposição do ozônio no ar é de 4 a 12 horas dependendo

da temperatura e umidade do ar. O tempo de meia-vida do ozônio na água depende da

temperatura, pH e da qualidade da água que afeta a demanda de ozônio, este valor está

101

na faixa de segundos a horas. O máximo valor de tempo de meia-vida em água muito

limpa é da ordem de poucas horas. No tratamento de água potável, o tempo de meia-

vida do ozônio pode variar de 1 a 30 minutos.

A decomposição do ozônio na água aumenta com o aumento do pH. Em pH 6, o

tempo de meia-vida do ozônio residual é de 20 minutos, nos pH 7 e 8 esse valor cai para

15 e 5 minutos respectivamente. O ozônio é mais estável em águas altamente puras

quando o pH é menor do que 6. Com o aumento do pH, maior do que 7, oxidantes

secundários são formados, tais como os radicais HO•, como apresentado na Equação

II.2. A taxa de decomposição do ozônio em radicais HO• aumenta com o aumento do

pH e é instantânea em pH acima de 10 (HARRISON, 2000). Os radicais HO• são

agentes oxidantes mais fortes do que o ozônio, entretanto, esses radicais que são

também instáveis e reativos, são rapidamente consumidos (milésimos de segundos) por

muitos compostos oxidáveis, tais como, íons bicarbonato/carbonato e compostos

orgânicos presentes na água. Outros radicais livres menos importantes, também são

formados na decomposição do ozônio, como por exemplo, os radicais HO•2. O aumento

da temperatura também irá promover a formação de radicais HO• pela decomposição do

ozônio molecular.

O3 + H2O → O2 + HO• + HO- II.2

Os radicais HO• podem também são formados pela combinação da ozonização

com a radiação UV e/ou H2O2. Alguns compostos orgânicos refratários, os quais não

são oxidados ou são lentamente oxidados pelo ozônio, podem ser oxidados pelos

radicais HO•.

Na ozonização em água, somente parte do ozônio reage diretamente com solutos

dissolvidos, outra parte é decomposta antes da reação. Tal decomposição é catalisada

pelos íons hidróxidos e outras espécies presentes no meio, promovendo a formação dos

radicais HO• (HOIGNÉ e BADER, 1983a, STAEHELIN e HOIGNÉ, 1985). Esses

radicais e seus produtos de reação podem adicionalmente acelerar a decomposição do

ozônio, através de reações radicalares em cadeia. A Figura II.8 apresenta um esquema

simplificado de reações do ozônio em solução aquosa. Em alguns sistemas aquosos,

102

águas naturais e potáveis, dependendo do pH e de outros fatores (temperatura e

constituintes presentes na água) esses dois caminhos de reação podem ser significativos.

Figura II.8. Esquema de reações do ozônio em solução aquosa. Onde, M = composto,

Moxid = composto oxidado, Si = capturador de radical livre, P = produtos que não

catalisam a decomposição do ozônio, R• = radicais livres que catalisam a decomposição

do ozônio (figura copiada de HOGNÉ e BADER, 1983a).

De acordo com a Figura II.8, os efeitos do ozônio em sistemas aquosos são

resultado de: (1) reação direta do ozônio com compostos dissolvidos; (2) sua

decomposição em radicais secundários (radicais livres HO• e HO•2) e (3) as

subseqüentes reações dos oxidantes secundários com os compostos dissolvidos na água.

Todas as reações podem ocorrer simultaneamente, as reações predominantes dependem

das condições reacionais (temperatura e pH) e da composição química do meio

(alcalinidade natural – carbonato e bicarbonato que são capturadores e consomem

rapidamente os radicais HO•). O aumento da alcalinidade diminui a concentração dos

radicais HO•, pelo consumo dessas espécies e assim, o mecanismo via ozônio molecular

predomina no sistema (RICE, 1997).

A presença de espécies capturadoras, tais como carbonato e em menor extensão o

bicarbonato, diminui as taxas de reações dos radicais OH• com os solutos. No caso dos

íons carbonatos, este efeito é devido à reação de transferência do elétron do íon CO3 2-

para os radicais OH•, como apresentado na Equação II.3 (HOIGNÉ e BADER, 1976).

103

HO•

+

+

CO3 • - + HO- k = 20 x 10-7 L. mol-1.s-1

Produtos

II.3

Como na ozonização o ozônio se decompõe em oxidantes secundários, a avaliação

do processo de ozonização sempre envolve, principalmente, duas espécies de oxidantes,

o ozônio e os radicais HO•. Enquanto que o processo de desinfecção ocorre

predominantemente através do ozônio molecular.

Os caminhos de reação que ocorrem durante a ozonização são regulados por

diferentes parâmetros que geralmente conduzem a diferentes produtos de oxidação, por

isso, a importância do conhecimento dos mecanismos de oxidação desde a reação direta

com o ozônio até as reações com outros oxidantes secundários formados pela

decomposição do ozônio, essas reações podem e são estudas separadamente.

O conhecimento da cinética de decomposição do ozônio em meio aquoso é de

suma importância devido à larga aplicação da ozonização no tratamento de água e em

outros sistemas aquosos. Na literatura vários mecanismos de decomposição de ozônio

na água são relatados. As cinéticas de decomposição do ozônio em solução aquosa têm

sido bastante investigadas (FORNI et al., 1982, PELEG, 1976, STAEHELIN e

HOIGNÉ, 1982, STAEHELIN e HOIGNÉ, 1985, SOTELO et al., 1987), uma vez que

envolve um grande número de reações químicas.

Com base em observações experimentais, WEISS (1935) propôs como uma

primeira etapa da reação de decomposição do ozônio em água a Equação II.4.

O3 + HO- → O2- • + HO2

• II.4

Seguida pelas reações em cadeia representadas pelas Equações II.5 a II.8.

O3 + HO2• → 2O2

• + HO• II.5

O3 + HO• → O2• + HO2

• II.6

104

HO2• + HO2

• → O3 + H2O II.7

HO2• + HO• → O2 + H2O II.8

ADLER e HILL (1950) através de seus estudos cinéticos propuseram o seguinte

mecanismo de reações apresentado pelas Equações II.9 a II.12:

O3 + H2O → HO3+ + HO- II.9

HO3+ + HO- → 2HO•

2 II.10

O3 + HO2• → HO• + 2O2 II.11

HO2• + HO• → H2O + O2 II.12

Segundo FORNI et al. (1982), a decomposição do ozônio em solução aquosa

alcalina não é um processo de etapa simples, mas, envolve reações em cadeia, que

podem ser iniciadas pela Equação II.13:

O3 + HO- → O3- • + HO• II.13

Entretanto, os radicais HO• podem ser produzidos de acordo com as reações

apresentadas nas Equações II.14 a II.17. Porém, os radicais O3- • podem ser formados

pela Equação II.18.

O3 + HO- → HO2 • + O2 II.14

HO2- • + O3 → HO2

• + O3- • II.15

O3- • ↔ O- • + O2 II.16

O- • + H2O ↔ HO• + HO- II.17

105

O2- • + O3 → O3

- • + O2 II.18

Segundo uma revisão de VON GUNTEN (2003a), a decomposição do ozônio em

água envolve as seguintes reações apresentadas pelas Equações II.19 a II.26:

O3 + HO- → HO2- + O2 k = 70 M-1.s-1 II.19

O3 + HO2- → HO• + O2

-• + O2 k = 2,8 x 106 M-1.s-1 II.20

O3 + O2-• → O3

-• + O2 k = 1,6 x 109 M-1.s-1 II.21

Em pH< ≈ 8: O3-• + H+ ↔ HO3

• k+ = 5 x 1010 M-1.s-1

k - = 3,3 x 102 s-1II.22

HO3• → HO• + O2 k = 1,4 x 105 s-1 II.23

Em pH> ≈ 8: O3-• ↔ O-• + O2 k+ = 2,1 x 103 M-1.s-1

k - = 3,3 x 109 s-1II.24

O-• → HO• + HO- k = 1 x 108 s-1 II.25

HO• + O3 → HO2• + O2 k = 1 x 108 – 2 x 109 M-1.s-1 II.26

De acordo com as Equações II.19 e II.20 o início da decomposição do ozônio pode

ser artificialmente acelerada pelo aumento do pH ou adição de H2O2. A reação

apresentada pela Equação II.26 é um processo rápido e é importante nas águas com

baixa concentração de espécies capturadores, podendo conduzir ao consumo de radicais

HO• e ozônio, e a baixa capacidade de oxidação no sistema.

Como se pode observar, a decomposição do ozônio na água é um tópico bastante

complexo, dependente de vários parâmetros. Além disso, todas as espécies

intermediárias formadas são muito reativas e possuem tempo de meia-vida muito curto

que dificultam sua identificação.

106

A eficiência do processo de ozonização é significativamente afetada pela

eficiência da transferência de massa gás-líquido, pela reação do ozônio e cinética de

decomposição das substâncias químicas. Altos custos associados com a aplicação do

ozônio podem ser reduzidos pelo aumento na taxa de transferência de massa, na

dissolução do ozônio gás, e pela reação do ozônio, assim que é produzido, com os

poluentes em solução pelo uso do gerador de ozônio in situ. Um aumento na taxa de

transferência de massa está relacionado com a entrada do ozônio no sistema aquoso, ou

seja, no uso de difusores capazes de desenvolverem microbolhas de ozônio que

aumentem a área interfacial para a transferência de massa (PANDA et al., 2004).

II.5.4. Aplicações do Ozônio nas Plantas de Tratamento de Água e Efluentes

O aumento do uso do ozônio nas estações de tratamento de água potável e esgoto

municipal tem sido estimulado pela necessidade de alcançar um efluente com alta

qualidade que atenda aos padrões de descarte ou potabilidade cada vez mais exigentes.

Nas plantas de tratamento de água ou efluentes, o ozônio pode ser adicionado em

vários pontos ao longo do tratamento: pré-ozonização, ozonização intermediária,

desinfecção final ou como polimento para oxidação de poluentes remanescentes. No

tratamento de água, por exemplo, o ozônio pode ser usado na remoção de inorgânicos,

como auxiliar no processo de coagulação/floculação, na remoção de manganês, na

degradação de material orgânico, na remoção de odor e gosto, na remoção de

micropoluentes e na desinfecção (GLAZE, 1987).

O ozônio é um excelente desinfectante, é capaz de inativar uma grande variedade

de microrganismos patogênicos, como protozoários que são muito resistentes aos

desinfectantes convencionais (Cl2 e ClO2). O ozônio conduz a uma adequada inativação

aplicando baixas doses de ozônio e pequenos tempos de contatos (VON GUNTEN,

2003a).

No tratamento de água potável, a desinfecção e a oxidação podem ocorrer

simultaneamente quando o ozônio é o responsável pelas reações de oxidação.

Entretanto, se compostos resistentes à oxidação pelo ozônio devem ser oxidados, e a

107

oxidação pelos radicais HO• sendo a opção, neste caso há um decréscimo na eficiência

de desinfecção.

Uma aplicação importante da ozonização no processo de tratamento de água

potável é a remoção de material orgânico, podendo conter substâncias húmicas,

compostos orgânicos e micropoluentes como os pesticidas. Podem remover compostos

que conferem cor e odor, subprodutos da desinfecção com compostos de cloro, tais

como os trihalometanos (THM), e inibir o crescimento microbiano no sistema de

distribuição de água.

O ozônio começou a ser largamente aplicado no tratamento de água potável nos

anos 1990, hoje está se expandindo no tratamento de uma variedade de efluentes.

Segundo RICE (1997), a ozonização tem sido usada em plantas de tratamento da água

reciclada de aquários marinhos (para a remoção de DBO5 e NH3 e desinfecção); na

remoção de cianetos em efluentes de indústrias de acabamento de metais (ex. pinturas

de carros e aviões); no reuso da água de lavagem na produção de circuitos eletrônicos

que necessitam de águas com alta pureza (para remoção de microrganismos, de traços

de compostos orgânicos e amônia); na redução da cor e de concentração de surfactantes

em efluentes de plantas de tratamento da indústria de têxtil; na eliminação de fenóis ou

hidrocarbonetos de efluentes de refinarias de petróleo; na remoção de DQO e COD de

chorume proveniente de aterros sanitários e efluentes da indústria química; no

tratamento de efluentes de indústrias de polpa e papel.

Assim, o ozônio no tratamento de efluentes é aplicado na remoção de DQO, COD

e DBO5, compostos orgânicos recalcitrantes (fenóis, compostos organoclorados,

compostos aromáticos, detergentes, pesticidas), compostos inorgânicos (amônia, cianeto

e outros metais), cor, turbidez, no aumento da biodegradabilidade e na redução da

toxicidade (PARASKEVA e GRAHAM, 2002).

Várias substâncias químicas podem ser oxidadas pelo ozônio nas plantas de

tratamento de efluentes. O processo de tratamento com ozônio pode ter custos

altíssimos quando desenvolvidos para alcançar altas eficiências de mineralização

completa de poluentes orgânicos. Entretanto, baixas doses de ozônio podem ser

suficientes para transformar compostos biorefratários e melhorar sua

biodegradabilidade, permitindo um apropriado seqüênciamento do processo de

108

ozonização seguido por um processo de tratamento biológico, diminuindo

consideravelmente os custos do processo (BAIG e LIECHTI, 2001). A ozonização

também pode ser combinada com outros tratamentos, como por exemplo, a adsorção em

carvão ativado pode aumentar a eficiência na remoção de cor e compostos orgânicos se

este processo for usado após a ozonização (CAMEL e BERMOND, 1998, RICE, 1997).

BAIG e LIECHTI (2001) demonstraram que a combinação de processos

oxidativos químicos e biológicos no tratamento de efluentes pode alcançar uma alta

eficiência de remoção de DQO junto com uma redução na dosagem necessária de

ozônio, quando aplicados no tratamento de chorume de aterros sanitários e efluentes de

indústrias de papel.

II.5.5. Reações de Oxidação Durante a Ozonização

Devido à instabilidade do ozônio, uma reação de oxidação ocorre com a colisão

entre uma molécula de ozônio e a molécula dos compostos oxidáveis. Em uma reação

de oxidação a energia usualmente é transferida da molécula de ozônio que deixa uma

molécula de oxigênio estável (O2) e um altamente instável átomo de oxigênio (O), a

reação de dissociação do ozônio está apresentada na Equação II.27. A molécula que é

oxidada liga-se então ao átomo de oxigênio (O) livre criando um produto oxidado ou

derivado da substância (HARRISON, 2000). Assim, o ozônio pode oxidar compostos

inorgânicos, orgânicos e inativar microrganismos.

O3 → O2 + O II.27

Na ozonização, a estrutura da molécula orgânica é modificada pela oxidação o que

freqüentemente causa a quebra da molécula original. Quando os metais oxidados são

dissolvidos na água, eles são freqüentemente hidrolisados e se tornam insolúveis. Além

de ter um alto potencial de oxidação, o ozônio possui a capacidade de difundir através

das membranas biológicas, assim, as células das bactérias e vírus são rompidas ou

inativadas através da oxidação das cadeias de DNA e RNA (HARRISON, 2000).

O ozônio reage melhor quando atua como um aceptor de transferência de elétrons

(para a oxidação de íons metálicos), como uma espécie eletrofílica (para oxidação de

109

aromáticos ativados, como o fenol) e como um reagente de adição dipolo (pela adição

em ligações carbono-carbono) (GLAZE, 1987).

O ozônio molecular é um oxidante muito seletivo, usualmente reage com as

ligações C=C, C=C−O−R ou C=C−X, e com átomos tais como, N, P, O, S. O ozônio

reage mais rapidamente com compostos orgânicos, os quais tenham substituintes orto e

para dirigidos, ex.: -OH, -CH3, -OCH3 (LEDAKOWICZ et al., 2001). Entretanto,

grupos retiradores de elétrons sempre conduzem a uma diminuição das taxas de reação

(VON GUNTEN, 2003a). O ozônio molecular ataca o anel aromático por reações

eletrofílicas diretas, ocasionando a abertura do anel e gerando compostos oxidados

menores. Um sumário das reações de oxidação pelo ozônio é apresentado a seguir

(HARRISSON, 2000):

1) Hidrocarbonetos alifáticos saturados (ex. propano) não reagem rapidamente

com o ozônio;

2) Compostos olefínicos (ex. etileno) reagem com o ozônio rapidamente, em

segundos. Porém, alguns compostos clorados (tais como etilenos clorados),

podem reagir mais lentamente com o ozônio;

3) Benzeno reage lentamente com o ozônio (dias). Porém, alguns

hidrocarbonetos poliaromáticos reagem rapidamente (segundos), mas a taxa

de reação pode ser dependente do pH;

4) Fenóis reagem rapidamente com o ozônio (segundos), mas a taxa de reação

é dependente do pH;

5) As espécies inorgânicas, os íons sulfeto (S2-), sulfito (SO32-), nitrato (NO2

-),

brometo (Br-) e iodeto (I-) reagem imediatamente com o ozônio;

6) Em pH menor do que 9, amônia livre reage lentamente com o ozônio

(horas);

7) O íon hipoclorito (OCl-) reage moderadamente com o ozônio para produzir

77% de íon cloreto e 23% de íon clorato.

8) Ácidos hipocloroso e hipobromoso não reagem com o ozônio;

110

9) A monocloroamina é degradada pelo ozônio mais lentamente do que o íon

hipocloreto;

10) O ozônio reage rapidamente com os íons brometo para produzir íons

hipobrometo (OBr-) o qual equilibra rapidamente com a água para produzir

ácido hipobromoso (HOBr);

11) Íon hipobrometo (OBr-) reage moderadamente com o ozônio para produzir

77% de íon brometo e 23% de íon bromato.

As reações de ozonização em baixo pH são predominantemente via ozônio

molecular, o aumento de pH favorece a decomposição do ozônio em radicais livres,

principalmente os radicais HO•, que irão oxidar os compostos. A oxidação pelos

radicais HO• é menos seletiva e geralmente mais rápida. Os radicais HO• reagem

rapidamente com hidrocarbonetos aromáticos, compostos insaturados, álcoois alifáticos

e ácido fórmico.

Os radicais HO• atacam os compostos orgânicos pela adição da hidroxila,

abstração de um átomo de hidrogênio ou pela transferência de elétrons (HUANG et al.,

1993). Compostos orgânicos contendo sistemas aromáticos ou ligações múltiplas

carbono-carbono sofrem reação de adição de hidroxila devido à nuvem de elétrons π

dos anéis aromáticos, como apresentado na Equação II.28:

HO• + C6H6 → •C6H6OH II.28

As reações com compostos orgânicos insaturados são via abstração de hidrogênio

(Equação II.29):

HO• + CH3COH3 → CH2COCH3 + H2O II.29

A transferência de elétrons ocorre em reações do radical HO• com íons

inorgânicos, como apresentado pela Equação II.30.

Fe2+ + HO• → HO- + H2O II.30

111

II.5.6. Oxidação de Compostos Orgânicos Durante a Ozonização

A oxidação de compostos orgânicos e inorgânicos durante a ozonização pode

ocorrer via ozônio molecular (O3), ou radicais HO• ou ainda uma combinação desses

dois oxidantes. O caminho da oxidação é determinado pela razão das concentrações de

ozônio e radicais HO• e as correspondentes cinéticas de reação. O ozônio é um oxidante

muito seletivo e de natureza eletrofílica. Os radicais HO• são espécies muito reativas e

com baixa seletividade.

A Figura II.9 apresenta os prováveis mecanismos da reação do ozônio e o radical

HO• com solutos. Esses diferentes caminhos de reação conduzem a diferentes produtos

de oxidação, que são controlados por diferentes cinéticas de reação.

Figura II.9. Mecanismo da reação do ozônio e radicais HO• com solutos (M) em meio

aquoso.

Na ozonização, tanto as reações de oxidação direta dos poluentes pelo ozônio,

quanto à decomposição do ozônio em sistemas aquosos são afetadas pela temperatura e

pelo pH. Estudos com o tempo de meia-vida do ozônio em solução aquosa indicam que

a decomposição do ozônio é acelerada pelo aumento do pH, que favorece a formação de

radicais HO• (GLAZE et al., 1987, STAEHELIN e HOIGNÉ, 1982, STAEHELIN e

HOIGNÉ, 1985). A decomposição do ozônio em um dado pH é também freqüentemente

Oxidação direta do O3 alta seletividade

Decomposição do O3

O3

+ M

+ OH– ou + R•OH• + •O2

– HO2•

Baixa seletividade

+ M

R• ou M’oxid

O2 + •O3–

O3

+ O2ROO•

M’’oxid

Moxid

112

acelerada por reações radicalares em cadeia, as quais podem ser iniciadas, promovidas

ou inibidas por vários solutos (STAEHELIN e HOIGNÉ, 1985).

A eficiência da degradação de compostos orgânicos em meio aquoso pelo

processo de oxidação depende da natureza dos compostos, bem como da qualidade da

água, isto é, na presença de material orgânico natural (MON) ou carbonatos que atuam

como espécies capturadoras e consomem os oxidantes (CAMEL e BERMOND, 1998).

Na ozonização de compostos orgânicos vários subprodutos são formados,

geralmente, são compostos orgânicos parcialmente oxidados que são mais

biodegradáveis do que seus compostos de origem. Por isso, em alguns casos, um

tratamento biológico pode ser usado com sucesso na mineralização dos subprodutos da

ozonização. A ozonização conduz a compostos de baixa massa molar, aldeídos e ácidos

carboxílicos, os quais podem ser melhor adsorvidos em processos com carvão ativado,

quando esse acoplamento for interessante (CAMEL e BERMOND, 1998).

II.5.6.1. Cinética das reações de oxidação durante a ozonização

Dados cinéticos são importantes para avaliar quais substâncias químicas serão

oxidadas, em quais velocidades e em alguns casos, podem predizer os subprodutos

formados durante a ozonização. O conhecimento da cinética de reação de ozonização é

necessário ainda para predizer o comportamento dos oxidantes responsáveis pela

ozonização quando aplicados em sistemas complexos, tais como águas naturais e

efluentes. Para as reações com ozônio as constantes das taxas de reação para vários

compostos orgânicos e inorgânicos foram medidas e estão descritas na literatura

(HOIGNÉ e BADER, 1983a,b, HOIGNÉ et al., 1985).

Segundo HOIGNÉ e BADER (1983a), a cinética de reação do ozônio com

compostos inorgânicos e orgânicos é tipicamente de segunda ordem, isto é, primeira

ordem em relação ao ozônio e primeira ordem aos compostos. A taxa de reação pode ser

formulada como a Equação II.31. Como no processo de ozonização, a oxidação de um

composto é caracterizada pela ação de dois oxidantes (ozônio e radicais HO•), essa

oxidação pode ser descrita pela cinética apresentada na Equação II.32.

113

M + O3 → produtos

[ ] [ ][ 3OMkdtMd

=− ] II.31

[ ] [ ][ ] [ ][ ].33HOMkOMk

dtMd

OHO +=− II.32

Para se determinar as constantes das taxas de reações independentes (ozônio ou

radical HO•) para uma variedade de compostos, pesquisadores realizam experimentos

com o processo de ozonização em condições controladas. Diferentes métodos

experimentais (HOIGNÉ e BADER, 1983a, GLAZE e KANG, 1989) foram

desenvolvidos para este fim. Nestes estudos, interferente entre a reação direta do ozônio

e reações devido a sua decomposição em oxidantes secundários (radicais HO•) podem

ser eliminadas pela ação de espécies capturadoras de radicais HO• (HOIGNÉ e BADER,

1983a,b, HOIGNÉ et al., 1985).

Os compostos orgânicos podem ser divididos entre não dissociáveis, tais como

álcoois alifáticos, olefinas, etilenos cloro substituídos, carboidratos e benzenos

substituídos; e compostos orgânicos os quais podem dissociar e formar espécies iônicas,

tais como, aminas, ácidos aminos, ácidos carboxílicos e fenóis (HOIGNÉ e BADER,

1983a,b). As constantes de taxas de reação com os radicais HO• também foram

determinadas por alguns autores (GLAZE e KANG, 1989).

HOIGNÉ e BADER (1983b) formularam um esquema cinético para solutos

orgânicos que se dissociam, que será apresentado a seguir:

Caso I (Caso Geral):

No caso dos solutos que consistem de ácidos (HB) ou bases (B), a taxa de reação

do ozônio também depende do grau de dissociação ou protonação dessas espécies, como

apresentado pelas Equações II.33 e II.34:

HB + H2O H3O+ + B– II.33

ou

114

B + H3O+ HB+ + H2O II.34

Para a Equação II.34, a dependência da taxa de desaparecimento de ozônio, ,

pode ser formulada como mostra a Equação II.35:

3Or

][][

][tottot

3

3O B

OO

3k

dtd

r =⋅

−=

][[ +++= HBB] HBB kk

( ) ][][ totHBtotB B1B +α−+α= kk II.35

Onde ktot é a constante da taxa de reação aparente baseada na concentração total de

base presente, [Btot]; kB e são as constantes de taxa de reação individuais para a

espécies não-protonada B e a protonada HB

+HBk+, respectivamente. A quantidade relativa de

B ou HB+ presentes em solução pode ser calculada a partir de α, o grau de ionização, de

acordo com a Equação II.36. O grau de ionização pode ser determinado a partir do pH

da solução e da constante de ionização da base protonada como mostra a Equação II.37:

][[

++=α

HB[B]B]

II.36

+

+

+=α

HB

H1

1

K][

II.37

Formulações correspondentes podem ser usadas para as equações de taxa para

ácidos.

Caso II:

As bases não-protonadas (B) ou ácidos deprotonados (B–) freqüentemente reagem

numa ampla faixa de valores de pH, muitas ordens de magnitude mais rápida do que os

115

compostos protonados HB+ ou HB. Nesta região de pH a taxa de reação é determinada

somente pela taxa na qual B (ou B–) reage, conforme a Equação II.38:

Bkα >> ( ) +α− HB1 k II.38

A Equação II.35 se reduz a:

ktot = αkB. II.39

Quando α é expresso pela Equação II.37 e se [H+] >> , a Equação II.38 pode

ser reescrita pelas Equações II.40 e II.41:

+HBK

][ +

+⋅=

HHBB

tot

Kkk

II.40

ou

+−+= HBBtot ppHlog)log( Kkk

II.41

A Equação II.41 demonstra que nesse caso, o logaritmo da constante da taxa de

reação total, ktot, aumenta linearmente com o pH, com um coeficiente angular igual a

1,0.

As Tabelas II.19 a II.21 apresentam as constantes de taxa de reação para a

oxidação de alguns compostos orgânicos com o ozônio e o radical HO•.

Tabela II.19. Constantes das taxas de reação de compostos orgânicos com o ozônio compiladas HOIGNÉ e BADER (1983a).

Composto 3Ok (M-1s-1)

Benzeno 2±0,4 Tolueno 14±3

Cloro benzeno 0,75±0,2 Tricloroetileno 17±4

Tetracloroetileno <0,1 n-Butanol 0,58±0,06 Acetona 0,032±0,006

tert- Butanol ≈0,003 Etanol 0,37±0,04

Metanol ≈0,024

116

Tabela II.20. Constantes das taxas de reação de compostos orgânicos com o ozônio compiladas de HOIGNÉ e BADER (1983b).

Compostos orgânicos dissociáveis Composto HBk (M-1s-1) −Bk (M-1s-1)

Fenol (1,3±0,2)x103 (1,4±0,4)x109

2-Clorofenol (1,1±0,3)x103 (0,2±0,1)x109

Ácido fórmico 5±5 100±20 Ácido glioxílico 0,17±0,4 1,9±0,2 Ácido malônico <4 7±2 Ácido oxálico - <0,04 Ácido acético <3x10-5 -

Tabela II.21. Constantes das taxas de reação de compostos orgânicos com o radical HO• compiladas de GLAZE e KANG (1989).

Composto OHk (M-1s-1)

Benzeno 7,8x109

Tolueno 6,8x109

Clorobenzeno 4,5x109

Tricloroetileno 4,0x109

Tetracloroetileno 2,3x109

Ácido fórmico 0,2x109

As constantes de taxa de reação nas quais compostos orgânicos dissociáveis

reagem com o ozônio aumentam consideravelmente com o aumento do pH, o que é

diretamente correspondente ao aumento do grau de dissociação de suas espécies

protonadas. Para os compostos fenólicos, as constantes de taxas de reação aumentam

largamente com os valores de pH pelo fator de 10 por unidade de pH (HOGNÉ e

BADER, 1983b). No caso dos compostos fenólicos essas constantes de taxas são de 103

a 109 M-1s-1, para o ácido fórmico de 1 para 100 M-1s-1.

Os dados apresentados nas Tabelas II.19 a II.21 explicam porque os ácidos

fórmico, glioxílico e malônico (formato, glioxilato e malonato) são freqüentemente

observados como intermediários da ozonização de compostos orgânicos. As baixas

constantes das taxas de reação indicam que esses compostos são lentamente oxidados

pelo ozônio quando o tempo de ozonização é estendido e porque as oxidações são mais

rápidas quando o pH é maior do que 3 (HOGNÉ e BADER, 1983b). Como é também o

117

caso dos ácidos acético e oxálico e seus ânions que sempre se acumulam como produtos

finais quando alguns compostos orgânicos são ozonizados em solução aquosa. Porém,

os compostos com baixas constantes das taxas de reação com o ozônio podem ser

oxidados por oxidantes secundários, tais como os radicais HO• durante a ozonização.

II.5.7. Formação de Subprodutos Indesejáveis na Ozonização

Durante a ozonização, principalmente em águas naturais, uma variedade de

subprodutos orgânicos são formados da oxidação da MON. Compostos como aldeídos,

cetonas, ceto-aldeídos, ácidos carboxílicos, ácidos acéticos, álcoois e ésteres podem ser

formados. Muitos desses subprodutos orgânicos são biodegradáveis. Devido às

características biodegradáveis desses produtos formados, filtros biológicos são muito

usados depois da ozonização em plantas de tratamento de água potável através do

mundo.

Contudo, até o momento, o único subproduto regulado na ozonização de águas

natural é o bromato, formado através dos íons brometo presentes em águas naturais

(VON GUNTEN, 2003b). Recentemente, devido ao conhecimento da formação desses

subprodutos formados durante a ozonização de águas naturais, o seu monitoramento

durante a ozonização é desejável. O NaCl normalmente contém pequenas quantidades

de íon brometo. Essas espécies de bromo oxidadas são substâncias tóxicas e

cancerígenas. A União européia e a US.EPA estabeleceram um máximo nível de

contaminação de 10 µg.L-1 para o bromato na água potável (VON GUNTEN, 2003b).

II.5. 8. Oxidação de Micropoluentes Orgânicos

Os compostos orgânicos são oxidados com o ozônio seletivamente em certos

grupamentos funcionais. O ozônio reage principalmente com ligações duplas, sistemas

aromáticos e aminas não protonadas. Em geral, grupos doadores de elétrons melhoram a

oxidação pelo ozônio, enquanto que grupos retiradores de elétrons reduzem as taxas de

reação (VON GUNTEN, 2003a).

118

Recentemente, a ozonização tem sido um processo muito eficiente na oxidação de

vários micropoluentes presente em águas naturais e efluentes de ETE. Outro grupo de

processos oxidativos que também estão sendo avaliados na remoção desses

micropoluentes orgânicos em ambientes aquáticos são os POA.

II.5.8.1. Oxidação de desreguladores endócrinos e fármacos

Para avaliar a eficiência de remoção de fármacos e desreguladores endócrinos em

águas naturais ou efluentes de ETE, podem-se determinar as constantes das taxas de

reação para a oxidação desses compostos com o ozônio e radicais HO•.

As constantes das taxas de reação para a oxidação de alguns pesticidas pelo ozônio

foram determinadas (YAO e HAAG, 1991). Com base nas estruturas e na Tabela II.22,

observa-se que as maiores constantes das taxas de reação são para os compostos que

apresentam grupamentos amino ou fenólicos como o carbofurano e o metoxicloro

respectivamente.

Recentemente, estudos investigam a oxidação de fármacos presentes em fontes de

água usadas no tratamento de água potável. As constantes das taxas de reação para a

oxidação dessas substâncias são apresentadas na literatura (HUBER et al., 2003). A

cinética de oxidação de fármacos apresentadas nas Tabelas II.22 e II.23 mostram que

compostos com grupamento amino e fenólico e duplas ligações mostraram ser altamente

reativos com o ozônio, como é o caso do diclofenaco, a carbamazepina, o

sulfametoxazol e o 17α-etinilestradiol. A oxidação de todos os fármacos da Tabela II.22

com radicais HO• é muito rápida com as constantes de taxa de reação maiores. As

Tabelas II.22 e II.23 apresentam as constantes de taxas de reação de segunda ordem

para a oxidação de alguns compostos orgânicos com ozônio e radicais HO•.

As bifenilas policloradas (PCB) exibem uma baixa constantes de taxa de reação

com o ozônio ( < 0,9M3Ok

k

-1s-1), segundo YAO e HAANG (1991), essa baixa

reatividade é devido à ozonização do anel aromático com substituintes clorados. Porém,

esses compostos são mais reativos com os radicais HO• ( = 4,3 – 8x10OH9 M-1s-1).

119

A oxidação de alguns hidrocarbonetos aromáticos policíclicos (HAP) também foi

investigada, esses compostos foram degradados eficientemente pelo ozônio com as

constantes de taxas de reação na faixa de 4,2x103 a 5,3x104 M-1s-1 (TRAPIDO et al.,

1995).

HUBER et al. (2003) investigaram as cinéticas de reação de alguns fármacos com

o ozônio e radicais HO•, apresentadas nas Tabelas II.22 e II.23. Segundo este estudo,

espécies desprotonadas reagem mais rapidamente com o ozônio eletrofílico, porque eles

são nucleofílicos fortes. As constantes das taxas de reação para o 17α-etinilestradiol e a

roxitromicina são fortemente dependentes do pH devido aos seus valores de pka serem

maiores do que 8 e o grupo fenólico desprotonado do 17α-etinilestradiol e a amina não

protonada da roxitromicina reagirem com algumas ordens de magnitude mais rápidas do

que suas formas protonadas. Para outros fármacos (ibuprofeno, iopromida e diazepan)

as baixas constantes das taxas de reação podem ser explicadas pela ausência de grupos

reativos. Assim, durante a ozonização desses compostos, as reações diretas com ozônio

são menos importantes do que a oxidação pelos radicais HO•.

Tabela II.22. Constantes das taxas de reação da oxidação de compostos orgânicos com radicais HO• compiladas de estudos da literatura.

Composto OHk (M-1s-1) Referência Pesticidas

(2,6±0,4)x109 HAAG e YAO, 1992 Atrazina

2,4 x109 HUBER et al., 2003 Carbofurano 7x109 HAAG e YAO, 1992 Endrin 4x109 HAAG e YAO, 1992 Metoxicloro 2x1010 HAAG e YAO, 1992 Fármacos Carbamazepina (8,8±1,2)x109 HUBER et al., 2003 Diclofenaco (7,5±1,5)x109 HUBER et al., 2003 Sulfametoxazol (5,5±0,7) x109 HUBER et al., 2003 17α-etinilestradiol (9,8±1,2) x109 HUBER et al., 2003 Diazepan (7,2±1,0) x109 HUBER et al., 2003 Ibuprofeno (7,4±1,5) x109 HUBER et al., 2003 Iopromida (3,3±0,6) x109 HUBER et al., 2003 Benzafibrato (7,4±1,2)x109 HUBER et al., 2003 Dioxina 2,3,7,8 – tetraclorobenzo-dioxina 4 x 109 HAAG E YAO, 1992

120

Tabela II.23. Constantes das taxas de reação da oxidação de compostos orgânicos com ozônio compiladas de estudos da literatura.

Composto 3Ok (M-1s-1) Referência Pesticidas

Atrazina 6 YAO e HAAG, 1991

Carbofurano 620±60 YAO e HAAG, 1991 Endrin <0,02 YAO e HAAG, 1991 Metoxicloro 270±80 YAO e HAAG, 1991 Fármacos Carbamazepina ≈ 3 x105 HUBER et al., 2003 Diclofenaco ≈ 1 x106 HUBER et al., 2003 Roxitromicina (4,5±0,5)x106 HUBER et al., 2003 Sulfametoxazol ≈ 2,5 x106 HUBER et al., 2003 17α-etinilestradiol ≈ 7 x109 HUBER et al., 2003 Diazepan 0,75±0,15 HUBER et al., 2003 Ibuprofeno ≈9,6±1 HUBER et al., 2003 Iopromida <0,8 HUBER et al., 2003 Benzafibrato 590±50 HUBER et al., 2003 PCB 2,2’,4,4’,5,5’-hexaclorobifenil <0,9 YAO e HAAG,1991

HAP Benzo[a]pireno 5,3x104 TRAPIDO et al.,1995 pireno 3,6x104 TRAPIDO et al., 1995 antraceno 2,7x104 TRAPIDO et al., 1995 fenantreno 1,0x104 TRAPIDO et al., 1995 fluoranteno 9,5x103 TRAPIDO et al., 1995 Benzo[ghi]perileno 8,4x103 TRAPIDO et al., 1995 fluoreno 4,2x103 TRAPIDO et al., 1995 Ftalatos dimetil ftalato (DMP) 0,20±0,10 YAO e HAAG, 1991 dietil ftalato (DEP) 0,14±0,05 YAO e HAAG, 1991 Metabólito do clofibrato, um agente regulador de lipídeos. Ácido clofíbrico 842,1 ANDREOZZI et al., 2003c

121

Dos dados apresentados nas Tabelas II.22 e II.23 conclui-se que a oxidação desses

micropoluentes orgânicos pelo ozônio é somente um processo eficiente para

componentes que contém grupamentos amino, sistemas aromáticos ativados (ex.

fenólicos) ou duplas ligações. As altas constantes das taxas de reação para a oxidação

com radicais HO• mostram que a remoção desses compostos orgânicos com radicais

HO• é muito mais rápida e mostram a natureza não seletiva dos radicais HO• nas reações

em solução aquosa.

A Tabela II.23 mostra que o ozônio pode oxidar todas as substâncias orgânicas

apresentadas, porém é mais eficiente com alguns compostos, ou seja, que apresentam

grupos funcionais específicos. Contudo, na ozonização, os compostos orgânicos que não

reagem diretamente com o ozônio, podem ser removidos através das reações com os

radicais HO•.

HUBER et al. (2003) determinaram as constantes das taxas de reação de segunda

ordem para vários fármacos em água pura e investigaram a cinética de oxidação desses

compostos em um sistema de ozonização em águas naturais. Os autores concluíram que

as constantes das taxas de reação determinadas em água pura podem ser aplicadas para

predizer o comportamento dos fármacos em água natural.

II.6. TRATAMENTOS APLICADOS NA REMOÇÃO DE

MICROPOLUENTES (FÁRMACOS E DESREGULADORES ENDÓCRINOS)

EM SISTEMAS AQUOSOS

Atualmente, a presença de micropoluentes que podem causar danos à saúde

humana e de animais é uma preocupação mundial. Tecnologias de tratamentos que

podem eficientemente remover esses poluentes de ambientes aquáticos têm sido

bastante investigadas. No entanto, não só a eliminação desses micropoluentes, mas

também a destruição do seu efeito potencial deve ser alcançada.

Devido à presença de fármacos e desreguladores endócrinos em ambientes

aquáticos torna-se necessária uma avaliação da eficiência de remoção dos processos de

tratamento empregados nas plantas de tratamento de água potável e de esgoto

122

doméstico. Estudos demonstram que esses micropoluentes não são completamente

removidos pelos processos convencionais de tratamento empregados nas estações de

tratamento de água potável e de esgoto doméstico. Com isso, diferentes outros

processos de tratamento estão sendo investigados para a remoção desses compostos de

sistemas aquosos.

Estes estudos claramente demonstram que os processos oxidativos, tais como,

ozonização e os POA são tecnologias promissoras na remoção de micropoluentes (ex.

fármacos, estrogênios, pesticidas, PCB entre outros) no tratamento de água potável ou

outros sistemas aquosos.

II.6.1. Ozonização de Fármacos

Vários estudos têm demonstrado que a ozonização e os POA são tecnologias

muito eficientes na oxidação de vários fármacos e estrogênios em ambientes aquáticos

(ZWIENER e FRINMEL, 2000, ANDREOZZI et al., 2002, HUBER et al., 2003,

TERNES et al., 2002, TERNES et al., 2003). Particularmente, a ozonização tem-se

mostrado ser um processo eficiente na remoção de fármacos em ambientes aquáticos

nas condições usualmente utilizadas no tratamento de água potável (ANDREOZZI et

al., 2002, TERNES et al., 2002).

ZWIENER e FRINMEL (2000) investigaram a ozonização do ácido clofíbrico, do

ibuprofeno e do diclofenaco (em concentrações iniciais 2,0 µg.L-1). A ozonização, em

condições de ozônio aplicadas em plantas de tratamento de água (1,0 mg.L-1 de ozônio e

10 min), degradou facilmente o diclofenaco, alcançando 97% de remoção, enquanto que

o ácido clofíbrico e o ibuprofeno foram removidos em 8 e 12 % respectivamente. Com a

aplicação de O3/H2O2 a eficiência de remoção aumentou significativamente, alcançando

degradações superiores a 90% dos fármacos investigados.

ANDREOZZI et al. (2002) estudaram a remoção de carbamazepina em sistemas

aquosos pela ozonização e identificaram os intermediários formados durante a sua

oxidação. Os resultados mostraram que a completa remoção deste fármaco em água

potável, em concentrações encontradas no meio ambiente, pode ser facilmente

alcançada com a ozonização em condições adotadas em plantas de tratamento de água

123

(dosagem de ozônio de 1,0 mg.L-1 por 10 a 60 min), porém, um baixo grau de

mineralização foi alcançado com 60 minutos de ozonização. Os intermediários

identificados na ozonização da carbamazepina foram: os ácidos oxálico, glioxílico,

cetomalônico.

ADAMS et al. (2002) avaliaram a eficiência de remoção de antibióticos em vários

processos de tratamentos convencionais utilizados em plantas de tratamento de água

potável, dentre esses processos, a ozonização. Dosagens de ozônio tipicamente

utilizadas em plantas de tratamento de água foram altamente eficientes na remoção de

antibióticos como: carbadox, sulfaclorpiridazina, suladimetoxina, sulfamerazina,

sulfametazina, sulfatiazol e trimetropina, degradações maiores de 95% foram

alcançadas para cada antibiótico investigado, com 0,3 mg.L-1 de ozônio e 1,3 min de

tratamento.

Outro estudo sobre a ozonização de fármacos em sistemas aquosos foi realizado

por TERNES et al. (2002). Com uma pequena dosagem de 0,5 mg.L-1 de O3, mais de

97% da concentração de carbamazepina e do diclofenaco foram removidos, enquanto

que somente 50% da concentração de bezafibrato foi removida com uma dosagem de

1,0-1,5 mg.L-1 de O3, para remoções de 90% desse composto, uma concentração de 3,0

mg.L-1 de ozônio foi necessário. O ácido clofíbrico foi considerado muito estável frente

à ozonização, com uma dosagem de 3,0 mg.L-1 de O3 somente 40% desse fármaco foi

degradado.

A ozonização do paracetamol em solução aquosa foi estudada por ANDREOZZI

et al. (2003a). Os resultados mostraram que o ozônio foi capaz de remover totalmente o

paracetamol (concentração inicial = 5,0 x 10-3 mol.dm-3), alcançando um grau de

mineralização de 30% com altos tempos de reação. Em pH 2,0 e 7,0, cerca de 70% dos

subprodutos foram identificados como sendo, ácidos oxálico, glioxálico e fórmico, após

105 minutos de ozonização.

A ozonização do metabólito ácido clofíbrico também foi investigada por

ANDREOZZI et al. (2003c). A completa remoção do ácido clofíbrico (concentração

inicial = 1,5 x 10-3 a 2,0 x 10-3 M) foi alcançada com 20 min de ozonização com um

grau de mineralização de 34%. Uma mineralização de 49% só foi alcançada com 60 min

de um prolongado processo de ozonização (1,0 x 10-5 M de ozônio). Demonstrando

124

novamente a difícil degradação desses metabólito frente à ozonização. Os autores

também observaram que o conteúdo de cloreto no metabólito foi transformado em íons

cloreto, indicando que não foram formados intermediários clorados perigosos.

TERNES et al. (2003) investigaram a ozonização na remoção de fármacos (meios

de contraste de Raio-X, antibióticos, β-bloqueadores, metabólito de um regulador de

lipídio e um antiepiléptico) presentes em efluente de ETE. Para uma dosagem de 5 a

15mg.L-1 de ozônio (tempo de contato de 18 min), a estrona e quase todos os fármacos

foram totalmente removidos, somente os meios de contraste de Raio-X foram ainda

detectados no efluente. Esses fármacos, foram removidos numa faixa de 13 a 89% com

dosagens de ozônio de 10 e 15 mg.L-1.

No estudo de HUBER et al. (2003), a ozonização foi um processo muito eficiente

na remoção de fármacos (bezafibrato, carbamazepina, diazepan, diclofenaco, 17α-

etinilestradiol, ibuprofeno, iopromida, sulfametoxazol e roxitromicina) em

concentrações na faixa de ng.L-1 em águas naturais. Dosagens de 0,2 a 0,5mg.L-1 de O3

foram suficientes para remover mais de 97% de quase todos os fármacos estudados,

com exceção do bezafibrato, em diferentes amostras de águas naturais. A constante de

taxa de reação do benzafibato com o ozônio é no mínimo 100 vezes menor do que as

taxas de reação dos outros compostos investigados com o ozônio. As constantes das

taxas de reação estimadas desses compostos neste estudo estão apresentada

anteriormente nas Tabelas II.22 e II.23. Os autores concluíram que baixas doses de

ozônio são suficientes para alcançar uma completa remoção de fármacos com

constantes das taxas de reação > 105 M-1.s-1.

A ozonização também foi investigada no tratamento de efluentes de indústrias

farmacêuticas. BALCIOGLU e ÖTKER (2003) concluíram que a ozonização pode ser

usada com sucesso como um pré-tratamento, melhorando a biodegradabilidade de

efluentes de indústrias farmacêuticas contendo antibióticos (penicilina e quinolona).

VOGNA et al. (2004b) mostraram que a ozonização foi efetiva na degradação do

diclofenaco. Após 90 min de tratamento, uma completa conversão do cloro em íons

cloreto com um grau de mineralização de 32% foi alcançada. Os autores ainda

identificaram vários intermediários resultantes da oxidação desse fármaco (acridina,

ácido salicílico, catecol e ácido antranílico).

125

As condições e os resultados desses tratamentos são apresentados no Anexo 3.

II.6.2. Ozonização de Estrogênios

A ozonização tem sido considerada como uma tecnologia promissora na remoção

de estrogênios naturais e sintéticos de água potável e efluentes de ETE. Recentemente,

alguns estudos têm investigado a oxidação dessas substâncias durante a ozonização

(ALUM et al., 2004, HUBER et al., 2003, KIM et al., 2004, TERNES et al., 2003).

Esses estudos demonstram que os estrogênicos são rapidamente oxidados na

ozonização. Os compostos podem ser oxidados pelo ozônio ou pelos radicais HO•. As

duas espécies são oxidantes fortes e as constantes das taxas de reação dos estrogênios

com os dois oxidantes são extremamente altas.

HUBER et al. (2003) investigaram a oxidação do 17α-etinilestradiol

(concentração inicial = 0,5 µM) durante a ozonização aplicada no tratamento de água

potável. Doses na faixa de 0,1 – 0,2 ng.L-1 de ozônio foram capazes de alcançar uma

remoção >97% desse estrogênio em águas naturais.

TERNES et al., (2003) investigaram a remoção de estrona concentração inicial no

efluente de ETE de 0,015µg.L-1. Como uma dosagem de 5 mg.L-1 de ozônio, esse

estrogênio foi reduzido abaixo do limite de detecção.

No estudo de ALUM et al. (2004), o ozônio (dosagem de 1,5 mg de O3.L-1) oxidou

rapidamente o bisfenol A, 17β-estradiol e 17α-etinilestradiol, todos com concentração

inicial de 100 nM, em condições usadas no tratamento de água potável. Sendo que o

17β-estradiol e o 17α-etinilestradiol foram mais rapidamente oxidados do que o

bisfenol A. Segundo os autores, a atividade estrogênica dos três desreguladores

endócrinos diminuiu, porém uma estrogenicidade residual permaneceu devido aos

subprodutos de oxidação. A oxidação resultou em uma rápida transformação dos

compostos investigados.

Os resultados do estudo de KIM et al. (2004) mostraram que a ozonização removeu

99% do 17β-estradiol (concentração inicial de 5,2 µm). Com uma concentração de

ozônio de 5 mg de O3.L-1 após 15 min de tratamento. A mesma remoção de 17β-

126

estradiol foi alcançada com uma concentração de ozônio de 15,0 mg.L-1 por 4 min. Os

autores observaram que a concentração de ozônio dissolvido aumentou quando muito

do 17β-estradiol já havia sido degradado, concluindo que o 17β-estradiol é altamente

reativo com o ozônio.

II.6.3. Os POA na Remoção de Fármacos e Desreguladores Endócrinos

Sob condições de tratamento reais, atrazina e outros herbicidas foram oxidados

com O3/H2O2. Cerca de 80% da atrazina e >99% dos herbicidas fenil - substituídos

foram degradados em pH 7,8 e razão H2O2/O3 de 3,7 g.g-1. Outra possibilidade de

tratamento empregada na decomposição de pesticidas na água é o Reativo de Fenton

(Fe2+/H2O2). Porém só foi alcançada uma remoção de 75% de atrazina e 94% de

herbicidas fenil - substituídos em pH 5,5 e 10 mg.L-1 de H2O2 (IJPELAAR et al., 2000).

Com a fotocatálise com TiO2 imobilizado, COLEMAN et al. (2000) alcançaram

uma degradação de 50% do 17β-estradiol em 40 minutos. Uma remoção de 98% só foi

alcançada em 3,5 horas de tratamento. Enquanto que OHKO et al. (2002) alcançaram

mais de 99% de degradação do 17β-estradiol com a fotocatálise com o TiO2 em

suspensão em 30 minutos de tratamento.

Segundo OHKO et al. (2002) a degradação de mais de 99% do 17β-estradiol com

a fotocatálise ocorre após 30 minutos de radiação UV, enquanto que a mineralização

completa foi alcançada em 3 horas de tratamento. Neste estudo foram identificados,

alguns intermediários e proposto um mecanismo para a oxidação fotocatalítica do 17β-

estradiol, e concluiu-se que os intermediários produzidos durante a oxidação

fotocatalítica do 17β-estradiol não exibem atividade estrogênica.

A fotocatálise também têm sido avaliada como um processo de remoção para

outros desreguladores endócrinos. A degradação fotocatalítica do bisfenol A foi

investigada por OHKO et al. (2001). Neste estudo, o bisfenol A foi totalmente

mineralizado com 20h de tratamento. A atividade estrogênica do bisfenol A também foi

drasticamente removida com 6h de tratamento.

127

NAKASHIMA et al. (2002) utilizaram partículas de TiO2 imobilizado em tela de

politetrafluoroetileno (PTFE) e luz negra (15 W) na remoção de 17β-estradiol em

solução aquosa. Os resultados mostraram que 98% de remoção do estrogênio foi

alcançada com 1 hora de tratamento. Os autores investigaram também a degradação

fotocatalítica do bisfenol A em água. O bisfenol A mostrou comportamento similar ao

observado com o 17β-estradiol.

ANDREOZZI et al. (2003a) estudaram a oxidação do paracetamol com H2O2/UV.

Observaram que com uma concentração de 5,0 x 10-3 mol.dm-3 de H2O2, 21% do

paracetamol foi mineralizado em 4 min de tratamento. Com uma concentração maior de

H2O2 (2,0 x 10-2 mol.dm-3) há um incremento na mineralização de 40%. O processo de

H2O2/UV foi capaz de remover completamente o paracetamol. Entre os intermediários

identificados têm-se a hidroquinona, o 2 hidroxi-4-(N-acetil)-aminofenol e ácidos

dicarboxílicos.

O processo de H2O2/UV também foi investigado na remoção do metabólito ácido

clofíbrico em água (ANDREOZZI et al., 2003c). A quase completa remoção desse

metabólito foi alcançada com 60 min de tratamento, porém com uma baixa

mineralização neste tempo de reação.

Para aumentar a eficiência de degradação dos estrogênios pela fotocatálise,

NAKASHIMA et al. (2003) desenvolveram uma modificação no processo usado por

NAKASHIMA et al. (2002), que melhorou a transferência de massa do sistema.

Segundo os autores, 17β-estradiol e estrona em solução aquosa foram rapidamente

degradados. Em efluente de ETE, a estrona foi aproximadamente 90% degradada. Com

esta modificação no processo fotocatalítico, os autores esperam tratar efluentes de ETE

eficientemente com um relativo baixo custo de energia e custo espaço de tempo.

A degradação da carbamazepina pelo processo de H2O2/UV foi investigada por

VOGNA et al. (2004a). Uma alta remoção desse fármaco foi alcançada, com a completa

degradação em 4 min de tratamento e 35% de remoção de COT. Foram determinados

também alguns intermediários formados na oxidação do carbamazepina, indicando a

formação de substâncias mais tóxicas e perigosas do que o fármaco investigado.

Em outro estudo, VOGNA et al. (2004b) estudaram o processo de H2O2/UV na

degradação do antiinflamatório diclofenaco. Foi concluído que em 90 min de

128

tratamento, 39% do diclofenaco foi degradado e somente 52% de conversão de cloro em

íons cloretos foi alcançada. Alguns intermediários da oxidação do diclofenaco também

foram identificados.

Segundo COLEMAN et al. (2004), a fotocatálise e a fotólise são eficientes na

degradação de estrogênios (17β-estradiol, estrona e 17α-etinilestradiol) em água.

Porém, a degradação fotocatalítica dos estrogênios em meio aquoso é muito mais

eficiente do que somente pela luz UV. O 17β-estradiol foi degradado pela fotocatálise

cerca de duas vezes a sua taxa na fotólise.

Com a fotocatálise, diferentes taxas de reações e remoções de estrogênios foram

obtidas em vários estudos, isso é devido ao uso de diferentes lâmpadas, tipo de reatores

e formas de uso dos catalisadores de TiO2 (suspensão e imobilizados). Com base em

todos os estudos da literatura com a fotocatálise de estrogênios resta ainda determinar se

esse processo pode ser eficiente na degradação de estrogênios em concentrações

ambientais relevantes e em amostras ambientais reais (águas naturais e efluentes de

ETE).

II.6.4. Outros Tratamentos Empregados na Remoção de Fármacos e DE

Outros tratamentos também foram investigados na remoção de fármacos e

desreguladores endócrinos em sistemas aquosos, tais como, filtração,

coagulação/floculação, a adsorção em carvão ativado, osmose reversa, cloração, entre

outros.

MULROY (2001) investigou a eficiência de alguns meios de filtração na remoção

de antibióticos como: tetraciclina, penicilina e vancomicina em sistemas aquosos.

Foram estudadas três colunas: Coluna A recheada com areia; Coluna B com mistura de

areia e a levedura Saccharomycer cerevisiae; e a Coluna C com mistura de areia e

carvão ativado. Os resultados mostraram que a Coluna C alcançou as melhores

remoções dos antibióticos investigados, para a penicilina uma remoção de 77,1% foi

alcançada, para a tetraciclina 96% e para a vancomicina 93,3%.

129

A eliminação de alguns fármacos durante os processos de tratamento de água

potável foi investigada em escala de laboratório, em planta piloto e em estações de

tratamento de água por alguns pesquisadores. ADAMS et al. (2002) avaliaram os

processos empregados no tratamento convencional de água potável, comumente

utilizado na Europa e EUA, e determinaram as eficiências de remoções de antibióticos

usados na medicina humana (carbadox, sulfaclorpiridazina, suladimetoxina,

sulfamerazina, sulfametazina, sulfatiazol e trimetropina). Os processos, tais como,

adsorção em carvão ativado, osmose reversa, oxidação com cloro e ozônio, sob

condições tipicamente utilizadas em plantas de tratamento de água, foram efetivos na

remoção dos antibióticos investigados, alcançando remoções de 81-98%, 90,2-99,9%,

90%, 95%, respectivamente. Por outro lado, o processo de coagulação/floculação com

sais de alumínio e ferro não alcançou significativas remoções. Os processos de UV em

dosagens de desinfecção e troca iônica foram pouco eficientes na remoção desses

antibióticos, alcançando remoções de 50-80% e 21 a 58% respectivamente.

TERNES et al. (2002) investigaram a remoção de carbamazepina, bezafibrato,

ácido clofíbrico e diclofenaco em diferentes processos de tratamento, como floculação,

adsorção em carvão ativado e ozonização em planta piloto e estação de tratamento de

água real. O processo de floculação com FeCl3 não apresentou boa eficiência na

remoção dos fármacos investigados. Por outro lado, os quatro fármacos investigados

podem ser removidos eficientemente sob condições reais pela filtração em carvão

ativado. Já a ozonização se mostrou muito eficiente na remoção da carbamazepina,

bezafibrato e diclofenaco e moderadamente eficiente na degradação do ácido clofíbrico.

Foi observado ainda, que a capacidade de adsorção para os fármacos diminui no

processo de carvão ativado granular (CAG) se outros compostos, tais como, MON

competem pelos sítios de adsorção.

O poder de oxidação do cloro frente à desreguladores endócrinos (bisfenol A, 17β-

estradiol e 17α-etinilestradiol) foi avaliado por ALUM et al. (2004). Com exceção o

bisfenol A, o cloro (1 mg.L-1) foi capaz de oxidar em pouco tempo de tratamento os

compostos estudados. A oxidação do bisfenol A, abaixo do limite de detecção, só foi

atingida após 4h de cloração. A cloração também resultou em um aumento da atividade

estrogênica do bisfenol A e 17α-etinilestradiol em até 4h de tratamento. No caso do

130

17β-estradiol, baixos níveis de atividade estrogênica foram encontrados já durante a

primeira hora de tratamento.

Um novo processo foi investigado na remoção de micropoluentes em efluentes. O

sistema de filtro biológico em conjunto com o óxido de manganês (MnO2) foi

empregado na oxidação de desreguladores endócrinos. O MnO2 é um conhecido

oxidante em fase sólida e suas reações redox na superfície com compostos orgânicos

estão sendo estudadas (RUDDER et al., 2004). Neste sistema biocatalítico, o MnO2 e as

bactérias que oxidam o manganês são integrados. O MnO2 oxida os micropoluentes em

moléculas menores, que junto com o Mn2+ são degradados biologicamente e o

manganês reoxidado é redepositado no MnO2, este ciclo é apresentado na Figura II.10.

Com esse sistema de tratamento, RUDDER et al. (2004) alcançou a remoção de 81,7%

de atividade estrogênica do 17α-etinilestradiol em solução aquosa. A adsorção e a

destruição do 17α-etinilestradiol ocorrem no reator de MnO2. Neste estudo, foram

avaliados ainda a remoção da atividade estrogênica do 17α-etinilestradiol com areia e

carvão ativado granular (CAG), que foram de 17,3% e > 99,8% respectivamente.

Figura II.10. Sistema de reator biocatalítico de degradação do 17α-etinilestradiol no

qual o MnO2 opera como uma superfície catalítica e os microrganismos oxidantes de

Mn2+, re-oxidam e redepositam o Mn2+ no MnO2.

17α-etinilestradiol

Mn2+ e moléculas oxidadas menores

Biofilme na superfície do MnO2

Redisposição

CO2 + H2O

O2

MnO2 comercial

131

O carvão ativado é comumente usado no tratamento de água potável para a

remoção de micropoluentes. FÜERHACHER et al. (2001) investigaram a capacidade do

carvão ativado em remover estrogênios da água. Os resultados mostraram que o 17β-

estradiol (concentração de 0,5-100 ng.L-1) foi rapidamente adsorvido e o equilíbrio é

alcançado em 50-180 min de tratamento. Porém, mais estudos devem ser conduzidos

para reduzir a concentração de 17β-estradiol a níveis abaixo dos quais não causem

efeitos deletérios aos organismos expostos. Segundo YOON et al. (2003), o processo de

adsorção com carvão ativado em pó (CAP) pode ser uma tecnologia útil para a remoção

de três desreguladores endócrinos (bisfenol A, 17β-estradiol e 17α-etinilestradiol) de

águas naturais com remoções > 99% em baixíssimas concentrações iniciais (500 ng.L-1).

A US.EPA (2001) realizou um estudo para avaliar os processos usados no

tratamento de água que podem ser usados para a remoção de alguns desreguladores

endócrinos. Concluíram que a melhor tecnologia disponível no tratamento de água para

a remoção de pesticidas (ex. metoxicloro, endosulfano e DDT), ftalatos (ex. DEHP e

DEP), alquilfenóis e alquilfenóis etoxilados (Ex. nonilfenol) e PCB é o processo de

filtração em CAG.

Os pesticidas são tradicionalmente removidos no tratamento de água potável pelo

processo de filtração em carvão ativado. Porém, os custos desse processo aumentam

pela competição do MON com os pesticidas pelos sítios de adsorção no carvão ativado.

Segundo VAN DER BRUGGEN et al. (1998), a nanofiltração pode ser usada como

uma alternativa para a remoção de pesticidas de águas naturais, ou ainda pode ser usada

combinada com uma filtração em carvão ativado.

A aplicação de processos com membranas de nanofiltração (NF) e osmose reversa

(OR) em plantas de tratamento de água aumentou significativamente (VAN DER

BRUGGEN e VANDECASTEELE, 2003). Processos de NF e OR são particularmente

efetivos na remoção de micropoluentes inorgânicos (tais como, nitrato, arsênico e flúor)

e orgânicos (tais como, pesticidas entre outros) (NGHIEM et al., 2004, VAN Der

BRUGGEN et al., 1998, VAN DER BRUGGEN e VANDECASTEELE, 2003).

No estudo de VAN DER BRUGGEN et al. (1998), a nanofiltração alcançou

remoções de 95% de pesticidas em águas subterrâneas em concentrações na faixa de

100 a 500 µg.L-1. Recentemente, os processos de separação, usando membranas

132

comerciais de NF e OR, estão sendo investigados na remoção de estrogênios (NGHIEM

et al., 2004). NGHIEM et al. (2004) avaliaram os fatores que governam a retenção de

estrogênios naturais (17β-estradiol e estrona) em processos de tratamento com

membranas. Porém, mais estudos devem ser realizados.

Os resultados e as condições dos processos de tratamentos apresentados e

utilizados na remoção de fármacos e desreguladores endócrinos em ambientes aquáticos

são apresentados no Anexo 3.

II.7 SUBPRODUTOS FORMADOS DURANTE A OXIDAÇÃO DE

COMPOSTOS ORGÂNICOS

II.7.1. Introdução

A remoção de micropoluentes orgânicos de ambientes aquáticos, seja em efluentes

de ETE ou plantas de tratamento de água potável, visando o menor impacto na saúde

humana e de animais é de suma importância. Entretanto, como é o caso da ozonização, a

mineralização completa do poluente geralmente não é alcançada em condições

economicamente viáveis. Conseqüentemente, os subprodutos formados da oxidação

desses micropoluentes devem ser identificados e investigados se o seu efeito potencial

ainda permanece.

No caso da ozonização, dependendo do ataque do ozônio nos grupos funcionais da

estrutura molecular do poluente, os efeitos potenciais das substâncias podem ser

destruídos. Entretanto, há casos que os produtos de oxidação ainda produzam os

mesmos efeitos, ou são mais tóxicos do que os compostos originais.

Os subprodutos identificados na ozonização de MON são principalmente aldeídos

(formaldeído, acetaldeído, glioxal e metilglioxal) e ácidos carboxílicos (ácidos fórmico,

acético, glioxílico, pirúvico e cetomalônico) (CAMEL e BERMOND, 1998).

Os subprodutos formados da ozonização de compostos orgânicos em sistemas

aquosos foram somente estabelecidos para poucos compostos, tais como, olefinas,

133

compostos aminos e aromáticos simples, como por exemplo, o fenol. O mecanismo de

decomposição do fenol durante a ozonização foi descrito por alguns autores. Um

exemplo é o mecanismo proposto por HUANG e SHU (1995) apresentado na Figura

II.11. As reações do ozônio com compostos fenólicos resultam na abertura do anel

aromático.

OH OHOH

+ O3 +

OH

OH

OHOH OH

OH

O3+ Ácidos orgânico

Caminho de reação proposto para a decomposição do fenol pelo ozônio

OH

+ HO.O.

HO.+

OH OH

OH

+

OHOH

Ácidos orgânicos+

OH

OHOHOH

HO.

OH

+

O. OOH

+ Dímeros

Caminhos de reação proposta para a decomposição do fenol pelos radicais HO•

Figura II.11. Mecanismos de reação para a ozonização do fenol proposto por HUANG

e SHU (1995).

134

A maior parte das reações dos radicais HO• com fármacos acontecem no anel

benzeno, resultando na formação de compostos fenólicos ou a abertura do anel

(ANDREOZZI et al., 2003a).

Na ozonização do fenol em solução aquosa, catecol e hidroquinona são os maiores

subprodutos (MVULA et al., 2001). A formação desses intermediários é devida à

reação com os radicais HO•. Segundo MVULA et al. (2001), a formação dessas

substâncias pode ser suprimida quando álcool tert-butil é adicionado como espécies

capturadoras de radicais HO• em pH 2. O ozônio ataca as duplas ligações e conduzem à

clivagem das ligações e a formação de compostos carboxílicos.

A investigação e identificação dos subprodutos formados na ozonização de

compostos complexos como é o caso de fármacos e estrogênios tem sido um tópico à

parte na química analítica. Poucos são os estudos que conseguem identificar os vários

subprodutos formados na ozonização desses compostos (ANDREOZZI et al., 2002,

ANDREOZZI et al., 2003a).

II.7.2. Subprodutos Formados da Oxidação do 17β-Estradiol

OHKO et al. (2002) investigaram a oxidação do 17β-estradiol através da

fotocatálise e concluíram que essa reação é iniciada com a oxidação do anel fenólico da

molécula de 17β-estradiol, gerando uma molécula de 10∈ - 17 β-dihidroxi–1,4–

estradieno–3–ona (DEO), assim o anel aromático do estradiol pode ser reduzido

parcialmente gerando os intermediários androsta 4,16–dien–3–ona (ADO) e a

testosterona (TS) que também foram identificados no processo, porém, não estão no

mecanismo apresentado na Figura II.12, em que está apresentado o mecanismo de

oxidação fotocatalítica do 17β-estradiol proposto por OHKO et al. (2002). As estruturas

dos compostos ADO e TS estão apresentadas na Figura II.13. Contudo, nem todos os

intermediários citados no mecanismo proposto foram identificados em suas análises.

135

HO

Figura II.12. Mecanismo de degradação do 17β-estradiol pela fotocatálise proposto por

OHKO et al. (2002).

OH

E2

-e-+.

OH

.OHO1

-H+

OH

2

+O2.-

+H+

+ OH. HHO

H

HO.

OH

- H2O .O

OH

4 7

+O2

OH

H

HO

HO

OO.

5

-HO2.

HO

HO

OH

6

+ OH.

O

OH

HOO

3

+H2O-H2O2

DEO

OH

HO

O

Oxidação a CO 2

O O

OH

ADO TS

Figura II.13. Estruturas químicas dos compostos ADO e TS.

No mecanismo apresentado na Figura II.12, duas rotas foram propostas para a

fotocatálise do 17β-estradiol. Primeiro, os carbonos C10 e C3 do 17β-estradiol devem ser

os lugares no quais o 1º elétron é extraído, e conseqüentemente, as reações subseqüentes

irão formar o compostos DEO (E2 → 1 → 2 → 3 → 4). Em uma segunda rota, a reação

pode ser iniciada pela adição dos radicais HO• no 17β-estradiol (E2 → 4) especialmente

nos carbonos C2 e C5. Se a 1ª adição do radical HO• ocorrer no átomo C2, a

correspondente o-hidroquinona (6) pode ser formada pela subseqüente reação com O2,

(E2 → 4 → 5 → 6). Entretanto, tal intermediário não foi identificado neste estudo. Por

136

outro lado, o DEO pode ser produzido através das seguintes etapas: E2 → 4 → 2 → 3 →

DEO.

No estudo de HUBER et al. (2004), foram identificados alguns subprodutos

formados na ozonização do 17α-etinilestradiol. Duas porções da molécula podem ser

primeiramente oxidadas pelo ozônio, o anel fenólico do 17α-etinilestradiol é altamente

reativo com o ozônio (kO3 = 3 x 106 M-1s-1 em pH 7) e o grupamento etinil tem uma

significativa menor reatividade (kO3 = 200 M-1s-1). Para facilitar a identificação dos

subprodutos de oxidação, dois compostos modelos foram usados para representar a

oxidação dessas duas porções da molécula de 17α-etinilestradiol, esses compostos estão

apresentados na Figura II.14.

HO

HO

THN ECH

Figura II.14. Estruturas químicas do 5,6,7,8-tetrahidro-2-naftol (THN) e 1 etinil-1-

ciclohexanol (ECH).

A Figura II.14 apresenta um mecanismo de reação proposto para a ozonização do

composto modelo THN e a identificação dos intermediários. O primeiro subproduto

identificado foi o ácido adípico (6) usando um padrão na análise de CL-EM/EM. Outro

subproduto identificado foi o ácido 1-hidroxi-ciclopentanocarboxicílico (7) através da

fragmentação desse produto derivatizado no espectro da CG/EM. Um terceiro

subproduto foi identificado por seu espectro na CG/EM como sendo o ácido 2-

hidroxiheptanodióico, porém, este último não é apresentado na Figura II.14. Esse

mecanismo proposto sugere que o ozônio ataca na posição 3 do anel fenólico. Com base

em estudos da ozonização do fenol, os autores concluem que este primeiro passo da

oxidação conduz ao ácido mucônico (1), o 5,6,7,8-tetrahidro-2,3-naftoalenodiol (2) e a

2,3-naftalenodiona (3), como maiores intermediários. Esses subprodutos são reativos

com o ozônio, o que pode resultar na formação do hidroperoxido (4) e/ou 1,2 –

ciclohexanodiona (5a).

137

O3

O

HO

OHO

4

O

O 5a

HO

O 5b

H2O

OH

O

O

HO

O

HO

HO

6

5c

OH

HO

O

7

O

O

HO

HO1

T HM

O3

O3

O3HO

HOO3

HO

O

O

2

3

O3

Figura II.15. Mecanismo de reação proposto por HUBER et al., 2004 para a

ozonização do composto modelo THN.

Para a ozonização do composto modelo ECH, HUBER et al. (2004), propuseram o

mecanismo de reação apresentado na Figura II.16. O ataque do ozônio no grupamento

etinil do composto ECH resulta na formação do ozonideo primário (8), o qual

simplesmente se decompõe em hidroxihidroperoxido (9a) e/ou (9b). Em menos de 2

min de reação, esses compostos não são mais detectados, demonstrando que os

subprodutos (9a) e (9b) são intermediários de curta vida. Segundo o autor, o maior

subproduto formado nesta reação foi o ceto aldeído (10), porém, este composto não foi

detectado na análise de CL-EM/EM. Dois outros subprodutos foram identificados pelo

seu espectro de massa na CG/EM, o ácido hidroxiciclohexanocarboxilíco (11) e o

composto (12). O terceiro subproduto foi identificado como sendo a ciclohexanona (13),

usando um padrão na análise de CL-EM/EM.

138

HO

O3

ECH

OOO

8

H2O

HOHOH

ou

HOO O

HOH

OH

9a 9b

O

O

OH

H2O2 +

OOHO

H

10

H2O2

HOOH

O OH

11 12 13

O

H

O

+O O

OHH

+

OH

O

Figura II.16. Mecanismo de reação proposto por HUBER et al., 2004 para a

ozonização do composto modelo ECH.

HUBER et al. (2004), também investigaram os subprodutos formados na

ozonização do 17β-estradiol e estrona. A Figura II.17 apresenta o mecanismo proposto

neste estudo. Onde os subprodutos (14) e (17) foram identificado pela CL-EM/EM.

Segundo os autores, inexplicavelmente o grupo álcool do 17β-estradiol foi oxidado a

um grupo carboxílico sob as condições aplicadas de ozônio (10-15 mg.L-1) e rendeu os

mesmos produtos da oxidação da estrona (14 e 17). Os grupos carboxílicos e álcool, da

estrona e 17β-estradiol respectivamente, são muito menos reativos com o ozônio do que

o grupo etinil do 17α-etinilestradiol, assim, esperava-se que no caso da estrona e 17β-

estradiol as reações de oxidação ocorram principalmente no grupamento fenólico. Com

base no estudo de ozonização do composto modelo THN (Figura II.15), o subproduto

(17) pode ser decompostos no intermediário (22) e a porção ciclohexanedieno pode ser

hidratada e é em parte apresenta-se na forma enol (23).

139

OH

HO E2

O3

O

O

HO

O

HO

O3

O

HO E1

14

O3O3

O

O

HO HO

O

O

23 22

O

O

HO

HO

17

Figura II.17. Mecanismo de reação proposto por HUBER et al. (2004) para a

ozonização 17β-estradiol estrona.

A Tabela II.24 apresenta os intermediários identificados ou propostos para a

oxidação do 17β-estradiol compilados da literatura.

140

Tabela II.24. Intermediários identificados ou propostos para a oxidação do 17β-estradiol copilados da literatura.

Intermediário Estrutura química Situação Processo de

oxidação Referência

10ε-17β-dihidroxi-1, 4-

estradieno-3-one (DEO)

OH

O

OH

Identificados pela CG-EM/EM, sem

padrão. Fotocatálise OHKO et

al., 2002

2-hidroxiestradiol

OH

H O

H O

Proposto mecanisticamente* Fotocatálise OHKO et

al., 2002

Androsta-4, 16 – dieno-3-one

(ADO) O


padrão. Fotocatálise OHKO et

al., 2002

Testosterona (TS)

O

OH


padrão Fotocatálise OHKO et

al., 2002

-

O

O

HO

O

HO

Identificados pela CL-EM/EM, sem

padrão Ozonização HUBER et

al., 2004

- O

O

HO

HO

Identificados pela CL-EM/EM, sem

padrão Ozonização HUBER et

al., 2004

-

O

O

HO

Proposto mecanisticamente* Ozonização HUBER et

al., 2004

- O

HO

O

Proposto mecanisticamente* Ozonização HUBER et

al., 2004

*Proposto devido à identificação de outros subprodutos

141

II.7.3. Metabolismo do 17β-estradiol no corpo

No corpo, o metabolismo dos estrogênios endógenos inclui: (1) metabolismo

oxidativo, em grande parte hidroxilações e (2) metabolismo conjugativo pela

glucuronação, sulfonação e/ou O-metilação (ZHU e CONNEY, 1998). Os estrogênios

(17β-estradiol e estrona) podem ser hidroxilados em múltiplas posições por enzimas

presentes nos órgãos (Enzimas citocromo P450 NADPH-dependente). Os principais

caminhos metabólicos do 17β-estradiol, por essas enzimas, são apresentados na Figura

II.18. A 2-hidroxilação e 16α-hidroxilação do 17β-estradiol para um catecol e a

formação da estrona são os maiores caminhos metabólicos no fígado, um caminho

secundário neste órgão seria a 4-hidroxilação. Os metabólicos do estradiol 2-

hidroxiestradiol e 16α-hidroxiestradiol (estriol) são apresentados na Figura II.19. Outros

metabólicos ceto e hidroxilados do estradiol e da estrona são encontrados na revisão de

ZHU e CONNEY (1998).

OH

HO

CH3

A B

C D1

2

34

56

7

8910

11

12

13

14

15

16

17

18

Figura II.18. Lugares da oxidação metabólica do 17β-estradiol pelas enzimas citocromo P450 NADPH-dependente. Os principais caminhos metabólicos (2-

hidroxilação, 16α-hidroxilação e a formação da estrona) são indicados pelas setas pretas

OH

OH

HO

OH

HO

HO 16α-hidroxiestradiol (estriol) 2-hidroxiestradiol

Figura II.19. Os metabólitos 2-hidroxiestradiol e 16α-hidroxiestradiol (estriol).

142

II.8. REMOÇÃO DA ATIVIDADE ESTROGÊNICA POR PROCESSOS

OXIDATIVOS

É de suma importância avaliar se os tratamentos que removem efetivamente esses

micropoluentes da água potável ou efluente de ETE são capazes de eliminar totalmente

os efeitos deletérios que esses poluentes possam ter. Atualmente, alguns pesquisadores

começaram a avaliar esse outro parâmetro tão importante quanto à remoção dos

poluentes.

A atividade estrogênica do 17β-estradiol está relacionada com a porção fenólica

de sua estrutura. Assim, é de se esperar que processos que alterem o anel fenólico sejam

efetivos na remoção do potencial estrogênico do 17β-estradiol. O ozônio é muito reativo

com grupamentos fenólicos, bem como outros processos, tais como, os POA também

podem oxidar efetivamente esse grupamento.

O efeito potencial específico dos estrogênios é a atividade estrogênica, que está

intimamente ligada com a porção fenólica da estrutura química dos estrogênios. Como o

ozônio é altamente reativo com alguns grupos funcionais, como o caso do anel fenólico,

alguns pesquisadores acreditam que normalmente o processo predominante na

ozonização dessas substâncias é a oxidação via ozônio. Assim, alguns pesquisadores

investigam a atuação do ozônio molecular na ozonização, suprimindo as reações com os

radicais HO• pelo uso de compostos capturadores (HUBER et al., 2004). Contudo, as

reações com os radicais HO• não podem ser descartadas.

No estudo de OHKO et al. (2001), a fotocatálise reduziu consideravelmente a

atividade estrogênica do bisfenol A em água. Após 6h de tratamento, a atividade

estrogênica foi reduzida para menos de 10% da atividade estrogênica inicial do bisfenol

A, e 35% da concentração inicial do bisfenol A permaneceu em solução com alguns

subprodutos.

Em outro estudo de OHKO et al. (2002), concluíram que os intermediários

formados durante a fotocatálise do 17β-estradiol não exibiram atividade estrogênica.

Em 20 min de tratamento, onde foi observada a maior quantidade de intermediários

formados, a atividade estrogênica foi extremamente pequena, podendo assim, ser

negligenciada. Porém, esta conclusão não está totalmente clara em seus resultados.

143

A remoção da atividade estrogênica do 17α-etinilestradiol durante a ozonização

foi investigada por HUNBER et al. (2004). O efeito do ozônio na atividade estrogênica

desses compostos em solução aquosa foi avaliado usando o ensaio YES, que

demonstrou que doses de ozônio tipicamente usadas para desinfecção de água potável

foram suficientes para reduzir substancialmente a atividade estrogênica desse

estrogênio. Os autores concluíram que a redução da atividade estrogênica foi

proporcional ao decréscimo da concentração de 17α-etinilestradiol, indicando que a

estrogenicidade dos subprodutos são menores do que a desse estrogênio, a soma da

atividade estrogênica dos intermediários é pelo menos 200 vezes menor do à

estrogenicidade do 17α-etinilestradiol.

COLEMAN et al. (2005) investigaram a remoção da atividade estrogênica de três

estrogênios separadamente (17β-estradiol, estrona e 17α-etinilestradiol) com a

fotocatálise e a fotólise. Cerca de 50% da atividade estrogênica dos estrogênios foram

removidas com 10 min de fotocatálise. A total atividade estrogênica foi removida com

1h de tratamento, demonstrando que este é um processo eficiente na diminuição da

atividade estrogênica dos estrogênios investigados. A fotólise removeu mais lentamente

a atividade estrogênicas desses estrogênios do que a fotocatálise.

O ensaio E-Screen foi usado por ALUM et al. (2004) para avaliar a remoção da

atividade estrogênica dos desreguladores endócrinos (bisfenol A, 17β-estradiol e 17α-

etinilestradiol em concentrações iniciais = 10 nM), pela ozonização e cloração em

condições utilizadas em plantas de tratamento de água. Os resultados indicaram que a

oxidação pelo cloro do bisfenol A e do 17α-etinilestradiol aumentaram nas primeiras

horas de tratamento e o declínio foi observado após 12h de cloração. A cloração do 17β-

estradiol resultou em um relativo baixo nível de estrogenicidade. Com a ozonização, as

atividades estrogênica dos três compostos diminuíram. Contudo, em ambos os

tratamentos, observaram-se uma atividade estrogênica residual.

KIM et al. (2004), utilizaram um ensaio de Ligação Competitiva nos RE para

avaliar a atividade estrogênica do 17β-estradiol pela ozonização, na ausência e presença

de ácidos fúlvicos (MON). Os resultados mostraram que quando o 17β-estradiol foi

ozonizado sozinho, a atividade estrogênica não diminuiu consideravelmente com o

aumento da dosagem de ozônio, sugerindo que há a formação de subprodutos que

144

podem ter estrogenicidade similar ao 17β-estradiol, já que este foi rapidamente

removido no início da ozonização. Na presença de ácidos fúlvicos, não foi observada a

formação de subprodutos com estrogenicidade, pois a atividade estrogênica decresceu

com o aumento da dosagem de ozônio. Os autores concluíram que a decomposição do

ácido fúlvico tem um efeito positivo na decomposição dos subprodutos do 17β-

estradiol.

Processos de tratamento alternativos foram investigados na remoção da atividade

estrogênica de estrogênios. SUZUKI et al., 2003, avaliaram a remoção da atividade

estrogênica do 17β-estradiol e 17α-etinilestradiol após um tratamento com enzimas

ligninolíticas. Os resultados mostraram que a atividade estrogênica de uma mistura

desses estrogênios foi reduzida em 80% depois de 1 hora de tratamento, porém, a

completa remoção só foi alcançada após 8 h de tratamento. Os autores concluíram que o

fato de 20% da atividade estrogênica permanecer após 1 h de tratamento pode ser

devido a traços residuais de 17β-estradiol e 17α-etinilestradiol. Embora, detecções das

concentrações residuais dos estrogênios durante o tratamento enzimático mostraram que

essas substâncias foram quase completamente degradadas depois de 1 h de tratamento,

provavelmente próximo do limite de detecção do método analítico empregado.

145

III. MATERIAIS E MÉTODOS

III.1. REAGENTES

O 17β-estradiol (pureza 99%), BSTFA, 19-Nortestosterol, 2-hidroxiestradiol,

testosterona, KH2PO4, (NH4)2SO4, MgSO4, Fe2(SO4)3, L-leucina, L-histidina, adenina,

L-arginina-HCl, L-metionina, L-tirosina, L-isoleucina, L-lisina-HCl, L-fenilalanina, L-

ácido glutâmico, L-valina, L-serina, tiamina, piridoxina, pantetonato de cálcio, inositol,

D-glucose, ácido aspártico, L-treonina, sulfato de cobre (II) e KOH peletes foram

obtidos da Sigma-Aldrich. A biotina e o etanol absoluto foram adquiridos da Merck. Os

solventes hexano, metanol e a acetona da Tedia Brasil. O CPRG (clorofenol vermelho-

β-D-galactopiranosida) foi adquirido da Roche Diagnostics GmbH. As estruturas

químicas de algumas substâncias usadas nos ensaios são apresentadas na Tabela III.1.

Tabela III.1. Estruturas químicas de algumas substâncias usadas nos ensaios Nome da Substância CAS number Estrutura Química

17β-estradiol 50-28-2

OH

HO

19-nortestosterona 434-22-0

OH

O

2-hidroxiestradiol 362-05-0

OH

HO

HO

testosterona 58-22-0

O

OH

146

III.2. PREPARO DAS SOLUÇÕES DE 17β-ESTRADIOL

A solução estoque de 17β-estradiol utilizada nos experimentos de ozonização foi

preparada a uma concentração de 20 mg.L-1 em acetona e estocada a 4°C. As soluções

nas concentrações iniciais desejadas para cada experimento foram preparadas a partir da

solução estoque.

Nos experimentos de ozonização foram utilizadas duas matrizes: água destilada e

efluente de estação de tratamento de esgoto doméstico da Ilha do Governador/RJ

(ETIG), coletado e utilizado no mesmo dia. Porém, para os ensaios YES, as amostras

aquosas de 17β-estradiol, utilizadas na ozonização, foram preparadas com água

ultrapura apirogênica (< 0,001 endotoxicina / mL) obtida pelo sistema Mili-Q Biocell.

De acordo com os experimentos foram preparadas soluções aquosas com

concentrações iniciais de 1,0 mg.L-1, 10 e 50 µg.L-1 de 17β-estradiol, a partir da solução

estoque de 17β-estradiol. Nos experimentos com o efluente de ETE, o 17β-estradiol foi

adicionado nesta matriz alcançando uma concentração inicial de 50 µg.L-1.

III.3. EXPERIMENTOS DE OZONIZAÇÃO

Os experimentos de oxidação com ozônio foram realizados em uma unidade de

ozonização que consiste de três partes principais: o gerador de ozônio, o analisador de

ozônio e a coluna de contato. A Figura III.1 apresenta o esquema da unidade de

ozonização.

O gerador de ozônio, Unitek – modelo UTK-O-5B, que emprega a tecnologia de

descarga corona e gera até 5g de O3.L-1, foi alimentado com uma mistura de oxigênio e

nitrogênio de acordo com a faixa de dosagem de ozônio que se desejava obter.

Para medir concentração de ozônio (%p/p) na fase gás nas correntes de entrada e

de saída da coluna de contato utilizou-se um analisador de ozônio modelo IN USA,

ASX-Mod H1 sendo, a medida feita por absorção na região do ultravioleta.

147

O2

O2 + O3

ANALISADOR DE OZÔNIO

2

O2 + O3

GERADOR DE OZÔNIO

0, 50

Ozone Analizer Model H1

DE

Entrada de O2

Regulador de O3

COLUNA DE

CONTATO

O2

O2 + O3

ANALISADOR DE OZÔNIO

2

O2 + O3

GERADOR DE OZÔNIO

0, 50

Ozone Analizer Model H1

DE

Entrada de O2

Regulador de O3

COLUNA DE

CONTATO

Figura III.1. Esquema da unidade de ozonização.

Foram usadas duas colunas de contato diferentes, a primeira fabricada em acrílico

com 130 cm de altura, 16,5 cm de diâmetro e volume de trabalho de 1,5 L e outra em

vidro com 50 cm de altura, 7,0 cm de diâmetro e volume de trabalho de 1,0 L. As

colunas de contato são apresentadas na Figura III.2.

A corrente de ozônio foi continuamente introduzida na coluna de contato através

de um difusor de aço inox ou vidro sinterizado, que gera microbolhas, localizado na

parte inferior das colunas. A Figura III.3 apresenta uma foto da unidade de ozonização.

148

Figura III.2. Foto das colunas de contato. (A) coluna de acrílico e (B) coluna de vidro.

Gerador de ozônio

Analisador de ozônio

Coluna de contato Medidores

de vazão

A

B

Figura III.3. Foto da unidade de ozonização.

Nos experimentos de ozonização, uma corrente contendo ozônio na faixa de 0,40

a 0,55 % (p/p) em uma vazão de 1,46 L.min-1 era continuamente introduzida na coluna.

149

Pela variação do tempo de ozonização, dosagens diferentes de ozônio foram

introduzidas nas amostras.

A ozonização foi conduzida com diferentes dosagens de ozônio e pH de solução.

Ácido sulfúrico ou hidróxido de sódio foram utilizados para o ajuste do pH das

amostras. A faixa de concentração de ozônio consumido usado no experimento foi de

0,5 – 30 mg.L-1 de ozônio e foram investigados nos valores de pH 3, 7 e 11. A dosagem

de ozônio utilizada nos experimentos significa a quantidade de ozônio consumida pela

amostra, ou seja, a diferença de ozônio nas correntes gasosas de entrada e de saída da

coluna de contato no tempo de ozonização.

Após a ozonização, todas as amostras foram tratadas de acordo com uma

metodologia analítica desenvolvida para avaliar, tanto a degradação do 17β-estradiol,

quanto à formação e identificação dos intermediários formados na ozonização, além de

avaliar a atividade estrogênica dos intermediários formados.

III.4. METODOLOGIA ANALÍTICA

A metodologia analítica empregada para avaliar a remoção do 17β-estradiol

pela ozonização, consistiu de: extração por fase sólida (C18), derivatização e detecção

por CG ou CG/EM para a determinação da concentração de 17β-estradiol, e

identificação dos subprodutos formados na ozonização. A transformação do anel

fenólico do 17β-estradiol foi investigada através do desaparecimento das bandas de

absorbância na espectrometria de UV das amostras ozonizadas. A remoção da atividade

estrogênica foi avaliada pelo ensaio in vitro YES. Um esquema dos procedimentos

analíticos é apresentado na Figura III.4.

150

Amostra aquosa(pH 3,0 ajustado)

EFSCondicionamento do cartucho

Descarte do Eluato

Eluição4 mL de acetona

Secagem em N2

Derivatização com BSTFA

CG e CG/EM

Eluição4 mL de metanol

Espectrofotometria de UV


Secagem em N2

Reconstituição com 2 mLde etanol absoluto

AtividadeEstrogênica

Amostra aquosa(pH 3,0 ajustado)

EFSCondicionamento do cartucho

Descarte do Eluato


Secagem em N2

Derivatização com BSTFA

CG e CG/EM

Eluição4 mL de metanol



Secagem em N2

Reconstituição com 2 mLde etanol absoluto

AtividadeEstrogênica

Figura III.4. Esquema da metodologia analítica utilizada.

III.4.1. Extração Por Fase Sólida (EFS)

A EFS é uma ferramenta útil para extração e concentração de micropoluentes em

amostras aquosas. Na EFS foram utilizados cartuchos de extração em fase C18 de 500mg

e 3 mL obtidos da Varian. Antes de receber a amostra, os cartuchos foram

condicionados pela lavagem com 3 X 2 mL de hexano, seguido por 1 X 2 mL de

acetona e 3 X 2 mL de metanol, por último 5 X 2 mL de água (pH 3). Os baixos valores

de pH das amostras contribuem consideravelmente para a extração eficiente desses

estrogênios polares (FOTSIS et al., 1980). Em seguida, passou-se através dos cartuchos,

numa taxa de 20 mL.min-1, um litro de amostra com pH 3 previamente ajustado.

Subseqüentemente, os analitos foram eluídos com 4 X 1 mL de acetona. A acetona foi

151

totalmente evaporada por uma corrente de nitrogênio. O sistema de extração é

apresentado na Figura III.5.

Amostras

Manifold

Cartucho de C18

Bomba de vácuo

Figura III.5. Foto do sistema de EFS.

No caso dos ensaios realizados com efluente de ETE, antes de realizarem-se as

EFS, as amostras ozonizadas primeiramente foram filtradas em membrana de acetato de

celulose de 0,45 µm para a remoção do material particulado, como descrita na

metodologia analítica. Estudos demonstram que a adsorção dos componentes

estrogênicos no filtro pode ser negligenciada, ou seja, os componentes estrogênicos não

ficam retidos nos filtros ou no material particulado suspenso, mas permanecem em

solução (XIAO et al., 2001, DESBROW et al., 1998).

III.4.2. Derivatização

Após a acetona ser totalmente evaporada, as amostras foram deixadas no

dessecador por 30 min, em seguida, os componentes foram derivatizados pela adição de

50 µL de BSTFA por 30 min a 60°C. Depois da derivatização as amostras foram

152

novamente deixadas no dessecador por, pelo menos, 30 min antes de serem analisadas

por CG ou CG/EM

III.4.3. Aparatos e Condições da Cromatografia Gasosa (CG)

As análises cromatográficas foram realizadas em um cromatógrafo gasoso GC –

17A – Shimadzu com um detector por ionização em chama (DIC) nas condições de

operação descritas na Tabela III.2. O esquema da metodologia analítica utilizada para a

determinação do 17β-estradiol e seus subprodutos de ozonização estão apresentados na

Figura III.6.

III.4.4. Aparatos e Condições da Cromatografia Gasosa / Espectrometria de

Massa (CG/EM)

As análises por espectrometria de massas foram realizadas em um cromatógrafo

HP 5890 series II acoplado a Espectrômetro de Massas HP 5972, no modo de varredura,

entre 45 e 600 m/z, utilizando-se a mesma coluna DB–5 descrita no item anterior. A

Tabela III.3 apresenta as características e condições operacionais do sistema empregado.

As análises de espectrometria de massa nessas condições foram realizadas para as

amostras de 17β-estradiol em água e efluente de ETE ozonizadas e para amostras de

17β-estradiol, 19-nortestosterona, 2-hidroxiestradiol e testosterona.

153

Amostra aquosa

( pH 3,0 ajustado)

Extração em C18

Condicionamento:

- 3x2mL de hexano

- 1x2mL de acetona

- 3x2mL de metanol

- 5x2mL de água (pH3)

Descarte do eluato

50µ L de BSTFA

Eluição- 4mL de acetona

Derivatização 60°C / 30min

Secagem em N2

Analisado em CG ou CG / EM

Amostra -Efluente de

ETE

Filtração em membrana de

0,45 µm

Dessecador por 30 min


(pH 3,0 ajustado)

Amostra aquosa

( pH 3,0 ajustado)

Extração em C18

Condicionamento:

- 3x2mL de hexano

- 1x2mL de acetona

- 3x2mL de metanol


Descarte do eluato

50µ L de BSTFA


Derivatização 60°C / 30min

Secagem em N2

Analisado em CG ou CG / EM

Amostra -Efluente de

ETE

Filtração em membrana de

0,45 µm



(pH 3,0 ajustado)

Figura III.6. Esquema detalhado da metodologia analítica utilizada na determinação do

17β-estradiol e seus subprodutos formados na ozonização.

154

Tabela III.2. Características e condições de análise do sistema de CG empregado. Cromatógrafo Gasoso Modelo GC – 17A – Shimadzu Gás de arraste Hidrogênio

Coluna DB-5 (Agilent Technologies) com diâmetro interno de 0,25 mm, comprimento de 30 m e espessura de fase de 0,25 mm

Parâmetros Taxa (°C⋅min–1)

Temperatura (°C)

Tempo (min)

Tinjetor — 280 — Tdetector — 320 —

— 180 —

Programação de Temperatura

Tcoluna 10 300 1

Parâmetro Taxa (kPa⋅min–1)

Pressão (kPa)

Tempo (min)

— 118 — Programação de Pressão Pcoluna 3 155 1

Vazão do Gás de Arraste 2,0 mL⋅min–1

Velocidade Linear do gás de arraste

61 cm⋅s–1

Volume de Injeção 1,0 µL Modo de injeção split (1:150)

Tabela III.3. Características e condições de análise do sistema de CG/EM empregado. Espectrômetro de massa

Modelo HP 5890 series II acoplado a Espectrômetro de Massas HP 5972 no modo de varredura entre 45 e 600 m/z

Gás de arraste Hélio

Coluna DB-5 (Agilent Technologies) com diâmetro interno de 0,25 mm, comprimento de 30 m e espessura de fase de 0,25 mm

Parâmetros Taxa (°C⋅min–1)

Temperatura (°C)

Tempo (min)

Tinjetor — 290 — Tdetector — 300 —

— 50 — 30 150 —

Programação de Temperatura

Tcoluna10 300 5

Pressão na Coluna 65 kPa Vazão do Gás de Arraste 1,22 mL⋅min–1

Velocidade Linear do gás de arraste

40 cm⋅s–1

Volume de Injeção 1,0 µL Modo de injeção Splitless

155

III.4.5. Preparação da Curva de Calibração

A curva de calibração do 17β-estradiol, usada na CG, foi preparada com

concentrações na faixa de 0,2 a 10,0, µg.L-1 e foi obtida a partir da solução estoque, pela

diluição em água destilada, seguida pela mesma metodologia analítica utilizada para

todas as amostra ozonizadas, descrita no item III.4.3.

III.4.6. Avaliação da Eficiência do Processo de Extração

A avaliação da eficiência do processo de extração foi realizada através da análise

da recuperação do 17β-estradiol, que foi determinado pela comparação das áreas dos

picos das amostras da curva de calibração do 17β-estradiol (Caminho 1 da Figura III.7)

com amostras preparadas a partir da solução estoque de 17β-estradiol com diluições em

acetona (Caminho 2 da Figura III. 7), ambas em várias concentrações de 17β-estradiol e

posteriormente analisadas por CG. Todas as determinações foram realizadas em cinco

réplicas.

Caminho 1

17β-estradiol em acetona Secagem

em N2

Derivatização com

BSTFA

Análise em CG

17β-estradiol em água destilada

EFS Secagem em N2

Derivatização com

BSTFA

Análise em CG

Caminho 2

Figura III.7. Esquemas das metodologias analíticas usadas para avaliar a eficiência do

processo de extração.

156

III.4.7. Avaliação do Limite de Detecção da Metodologia Experimental

Os limites de detecção do 17β-estradiol são definidos como a quantidade mínima

de substância observada como uma razão sinal/ruído acima de 3.

III.4.8. Espectrofotometria de UV

As varreduras no UV foram realizadas em um espectrofotômetro UV Visível,

Shimadzu, modelo UV Mini-1240. Foram analisadas amostras ozonizadas de 17β-

estradiol em água destilada nas concentrações iniciais de 10 e 50µg.L-1.

Para a análise da espectrofotometria de UV das amostras ozonizadas, a

metodologia analítica foi modificada. Para isso, na EFS, os cartuchos foram

condicionados pela lavagem com 4 X 2 mL de metanol, seguido por 5 X 2 mL de água

(pH 3). Em seguida, passou-se através dos cartuchos, 1 L de amostra com pH 3

previamente ajustado, numa taxa de 20 mL.min-1. Subseqüentemente, os analitos foram

eluídos com 4 X 1 mL de metanol. Essa solução final foi analisada no

espectrofotômetro UV-Visível, como apresentado na Figura III.8.

Amostra aquosa

(pH 3,0 ajustado)

Extração em C18

Condicionamento:

- 4x2mL de metanol

- 5x2mL de água (pH3)Descarte do

eluato

Eluição- 4mL de metanol


Figura III.8. Esquema detalhado da metodologia analítica utilizada na espectrometria de UV.

157

III.4.9. Determinação da Atividade Estrogênica pelo Ensaio YES (YEAST

ESTROGEN SCREEN)

III.4.9.1. Ensaio YES

A atividade estrogênica das amostras foi determinada pelo ensaio in vitro YES,

realizado segundo metodologia desenvolvida por ROUTLEDGE E SUMPTER (1996).

Este ensaio permite a identificação de substâncias químicas que são capazes de

mimetizar a atividade do estrogênio pela interação com o REh. Em resumo, a levedura

Saccharomyces cerevisiae, na qual foi inserido um gene receptor de estrogênio humano

(REh), a expressão do plasmídeo com um elemento de resposta de estrogênio (ERE) e

um gene repórter lac-Z, o qual codifica a enzima β-galactosidase, é incubada com um

ligante ativo (substância capaz de acoplar-se ao RE) que induz a expressão da β-

galactosidase. A medida é determinada pela produção da enzima galactosidase que

metaboliza o substrato cromogênico clorofenol vermelho-β-D-galactopiranosida

(CPRG) presente no meio, que é um produto amarelo e muda para vermelho, e pode ser

medido por absorbância a 540nm. A produção de β-galactosidase no meio depende da

quantidade de substância estrogênica. A medida da absorbância pela espectrofotometria

permite estimar a quantidade de substância estrogênica no meio de análise. No ensaio

YES a levedura fica permanentemente transformada se o crescimento ocorrer sob

condições apropriadas. Um esquema do sistema de expressão do estrogênio induzível na

levedura Saccharomyces cerevisiae desenvolvida por ROUTLEDGE E SUMPTER

(1996) é apresentado na Figura III.9.

O ensaio de YES é prático e altamente sensível, pode detectar concentrações

baixas de 17β-estradiol na ordem de 2 ng.L-1 (ROUTLEDE E SUMPTER, 1996). Este

ensaio é realizado em microplacas de 96 poços, o que permite a análise de múltiplas

amostras em uma larga faixa de concentrações e o resultado pode ser obtido após três

dias. Os resultados podem ser visualizados a olho nu com uma mudança de coloração

do meio. Segundo os resultados obtidos por ROUTLEDGE E SUMPTER (1996), o

ensaio de YES mostrou-se ser altamente específico, reprodutivo e rápido, permitindo

seu uso como análise rotineira para avaliar a atividade estrogênica de substâncias

químicas e amostras ambientais.

158

Figura III.9. Esquema do sistema de expressão do estrogênio induzível na levedura

Saccharomyces cerevisiae. O gene receptor de estrogênio humano é integrado no

genoma principal e é expresso (1) na forma capaz de acoplar-se aos elementos de

respostas de estrogênios (ERE) dentro de um promotor híbrido na expressão do

plasmídeo (2). Ativação do receptor (3), pela ligação do ligante, causa expressão do

gene receptor da lac–Z (4) o qual produz a enzima β-galactosidase. Esta enzima é

excretada no meio (5) e metaboliza o substrato cromogênico CPRG (amarelo) em um

produto vermelho (6), que pode ser medido pela absorbância a 540 nm (Retirado de

ROUTLEDGE E SUMPTER (1996)).

Símbolos

Estrogênio

Receptor de estrogênio

Receptor ativado

β-Galactosidade

Citoplasma

REh

Núcleo

Meio

6

CPRG amarelo

CPRG vermelho

ERE

Lac - ZPGK

1

2

3

4

5

159

III.4.9.2. Cepa de Levedura (Saccharomyces cerevisiae) Recombinante

Uma cepa de levedura (Saccharomyces cerevisiae) modificada geneticamente foi

desenvolvida pelo Departamento de Genética da Glaxo para ser usada no teste para

identificar as substâncias que podem interagir com o REh. Essa levedura é apresentada

na Figura III.10.

Figura III.10. Microfotografia de células de Saccharomyces cerevisiae recombinante.

A cepa de Saccharomyces cerevisiae utilizada no ensaio YES foi doada pelo Prof.

J. P. Sumpter da Universidade de Brunel, Uxbrige, UK. No nosso laboratório uma

amostra dessa cepa foi obtida da Prof. Elisabetta Agradi do Instituto de Ciências

Farmacológicas, Universidade de Milão. A cepa de levedura foi acondicionada e trazida

no meio de crescimento fresco, foi mantida no laboratório em temperatura ambiente e

replicada para ser utilizada nos ensaios, além de amostras conservadas em glicerol a -

4°C por até quatro meses.

O cultivo da cepa de Saccharomyces cerevisiae foi realizado segundo a

metodologia desenvolvida por ROUTLEDE e SUMPTER (1996) descrita a seguir.

160

III.4.9.3. Preparação das Soluções do Meio de Cultivo

O problema de impurezas ou contaminação causa falsos positivos no ensaio YES.

Assim, os reagentes, a água e os recipientes usados no preparo das soluções que

compõem o meio de cultivo e análise devem apresentar alto grau de pureza. Os

reagentes foram comprados da Sigma-Aldrich, os recipientes de vidro foram rinsados

com etanol absoluto da Merck e foi utilizada água apirogênica (< 0.001 Endotoxicina /

mL) obtida pelo sistema Mili-Q Biocell.

O meio mínimo (pH 7,1) foi preparado pela adição de 13,61 g de KH2PO4, 1,98g

(NH4)2SO4, 4,2g de KOH peletes, 0,2g de MgSO4, 1 mL de solução de Fe2(SO4)3 (40

mg/50 mL H2O), 50 mg de L-leucina, 50 mg de L-histidina, 50 mg de adenina, 20 mg

de L-arginina-HCl, 20 mg de L-metionina, 30 mg de L-tirosina, 30 mg de L-isoleucina,

30 mg de L-lisina-HCl, 25 mg de L-fenilalanina, 100 mg de L-ácido glutâmico, 150 mg

de L-valina, e 375 mg L-serina para 1 L de água. A solução foi armazenada em frascos

de vidro, esterilizadas a 121°C por 10 min e estocadas em temperatura ambiente.

A solução de vitamina foi preparada pela adição de 8 mg de tiamina, 8 mg de

piridoxina, 8 mg de pantetonato de cálcio, 40 mg de inositol e 20 mL de solução de

biotina (2mg/100 mL H2O) em 180 mL de água. Essa solução foi filtrada e esterilizada

em membrana de 0,2 µm estéril, e estocada em alíquotas de 10 mL a 4°C em frascos de

vidro esterilizados.

Uma solução de 20% p/v de glucose foi esterilizada em alíquotas de 20 mL a

121°C por 10 min e estocada em temperatura ambiente.

Uma solução estoque de 4 mg.mL-1 de ácido aspártico foi esterilizada em

alíquotas de 20 mL a 121°C por 10 min e estocada a temperatura ambiente.

Foi preparada uma solução estoque de 24 mg.mL-1 de L-treonina e esterilizada em

alíquotas de 5 mL a 121°C por 10 min e estocada a 4°C.

Uma solução de 20 mM de sulfato de cobre (II) foi preparada, filtrada e

esterilizada em membrana de 0,2 µm esterilizada. A solução foi estocada a temperatura

ambiente em frascos de vidro esterilizados.

161

A solução estoque de 10 mg.mL-1 de CPRG foi preparada em água estéril e

estocada a 4°C em frascos de vidro esterilizados.

III.4.9.4. Cultivo da Cepa de Levedura de Saccharomyces cerevisiae

O meio de cultivo foi preparado pela adição de 5 mL de solução de glucose, 1,25

mL de solução de ácido L-aspartico, 0,5 mL de solução de vitamina, 0,4 mL de solução

de L-treonina, e 125µL de solução de sulfato de cobre (II) em 45 mL de meio mínimo.

O cultivo era realizado inoculando-se, com 100µL da solução estoque da

levedura, 10 mL de meio de cultivo e incubado a 28°C por aproximadamente 24 h a 100

rpm em um agitador orbital (Modelo No G 24, New Brunswick Scientific).

III.4.9.5. Preparação do Meio de Análise

O meio de análise foi preparado pela adição de 250 µL do substrato cromogênico

CPRG a 25 mL de meio de cultivo. O meio foi inoculado com 4 x 107 células de

levedura de uma cultura.

III.4.9.6. Preparação das Amostras para os Ensaios YES

Nos ensaios YES foram analisadas amostras ozonizadas em água ultrapura obtida

do sistema MiliQ Biocel com a concentração inicial de 17β-estradiol de 10 µg/L, com

dosagens de 1,0; 5,0 e 10 mg.L-1 de ozônio e nos três pHs investigados (pH 3, 7 e 11). E

para a concentração inicial de 17β-estradiol de 50 µg/L, com dosagens de 1,0; 5,0 e 10

mg.L-1 e pH 7. Os testes foram realizados utilizando-se diretamente essas amostras

segundo COLEMAN et al. (2004), e com as mesmas amostras preparadas segundo um

método descrito por PAWLOWSKI et al. (2003) modificado.

Para as amostras obtidas com preparo prévio, utilizou-se a extração por fase

sólida, onde 1 L da amostra acidificada com H2SO4 até pH 3,0 foi passada por um

162

cartucho de C18 (500 mg da Varian) previamente condicionado pela lavagem com 3 X 2

mL de hexano, seguido por 1 X 2 mL de acetona e 3 X 2 mL de metanol, por último 5 X

2 mL de água (pH 3). Subseqüentemente, os analitos foram eluidos com 4 X 1 mL de

acetona. A acetona foi totalmente evaporada por uma corrente de nitrogênio e os

analitos foram reconstituídos com 2,0 mL de etanol absoluto e essas amostras foram

estocadas a 4°C até serem usadas no ensaio YES. A Figura III.11 apresenta a

metodologia analítica utilizada para a extração e preparo das amostras para o teste de


Água ultrapura também foi preparada de acordo com o mesmo procedimento

realizado para as amostras (Figura III.11) e usada como controle no ensaio com preparo

prévio das amostras. Nos ensaios sem preparo das amostras, utilizou-se água, sem

preparo, como controle.

III.4.9.7. Procedimento de Análise do Ensaio YES

O procedimento de análise foi desenvolvido de acordo com a metodologia de

ROUTLEDGE e SUMPTER (1996), com algumas modificações. As análises foram

realizadas em microplacas de 96 poços (marca TPP) e preparadas em uma capela de

fluxo laminar. As amostras ozonizadas foram avaliadas em duplicata com um mínimo

de duas réplicas.

Como descrito no item III.4.9.5, foram usadas amostras sem e com preparo

prévio, assim, foram realizados dois procedimento de análise descritos a seguir:

163

Amostra aquosa

(pH 3,0 ajustado)

Extração em C18

Condicionamento:

- 3x2mL de hexano

- 1x2mL de acetona

- 3x2mL de metanol


Descarte do eluato

2,0 mL de etanol


Reconstituição da amostra

Secagem em N2

Teste de atividade estrogênica


Amostra aquosa

(pH 3,0 ajustado)

Extração em C18

Condicionamento:

- 3x2mL de hexano

- 1x2mL de acetona

- 3x2mL de metanol


Descarte do eluato

2,0 mL de etanol


Reconstituição da amostra

Secagem em N2

Teste de atividade estrogênica


Figura III.11. Esquema detalhado da metodologia analítica usada no ensaio YES.

164

III.4.9.7.a. Procedimento de análise do ensaio YES para amostras sem preparo

prévio

Uma alíquota de 10µL de cada amostra aquosa foi transferida para os poços da

microplaca de 96 poços. Um volume de 190µL de meio de análise (composto de meio

de crescimento fresco, levedura e CPRG) foi adicionado em cada poço. Após este

procedimento, as microplacas foram seladas com fita crepe, agitadas vigorosamente por

5 min em um agitador (modelo CERTOMAT II, B. Braun Biotech International), e

incubadas por 3 dias a 30°C em uma estufa (modelo 410, Nova Ética).

As microplacas para cada ensaio YES continham fileiras em duplicata das

amostras, fileira com água - controle negativo, e fileiras em duplicata com uma diluição

serial de 17β-estradiol em etanol absoluto (controle positivo), na faixa de 54,48 µg.L-1 a

26,61 ng.L-1, preparada a partir de uma solução de 54,48 µg.L-1 de 17β-estradiol em

etanol absoluto.

Após a incubação, as microplacas foram agitadas e permaneceram em repouso por

um período de 1 hora, depois do qual a absorbância foi lida a 540 nm, para a cor, e 650

nm, para a turbidez, (comprimento de onda mais próximo de 620 nm) usando um

Leitora de microplacas de 96 poços (THERMO Max, Molecular Devices).

III.4.9.7.b. Procedimento de análise YES para amostras com preparo prévio

Uma curva padrão de 17β-estradiol foi preparada através de uma diluição em série

de uma solução estoque de 17β-estradiol (54,48 µg.L-1) em etanol absoluto (faixa de

54,48 µg.L-1 a 26,61 ng.L-1). Alíquotas de 10 µL das amostras reconstituídas em etanol,

da curva padrão de 17β-estradiol e etanol absoluto foram adicionadas em cada poço da

microplaca de 96 poços, por fim, o etanol absoluto dos poços foi totalmente evaporado.

Um volume de 200 µL de meio de análise (composto de meio de crescimento fresco,

levedura e CPRG) foi adicionado em cada poço da microplaca de 96 poços. As

microplacas foram seladas com fita crepe, agitadas vigorosamente por 5 min em um

agitador (modelo CERTOMAT II, B. Braun Biotech International), e incubadas por 3

dias a 30°C em uma estufa (modelo 410, Nova Ética).

165

As microplacas continham fileiras em duplicata das amostras, duas fileiras

contendo etanol absoluto para cada amostra e duas fileiras com água preparada pela

mesma metodologia analítica das amostras ozonizadas, como controles negativos –

solventes, e fileiras em duplicata da curva padrão de 17β-estradiol em etanol absoluto

(controle positivo).

Após a incubação, as microplacas foram agitadas e permaneceram em repouso por

um período de 1 hora, depois do qual a absorbância foi medida a 540 nm (para a cor) e

650 nm (para a turbidez) usando uma Leitora microplacas de 96 poços (THERMO Max,

Molecular Devices).

III.4.9.8. Análise dos Dados

O crescimento da levedura é acompanhado por uma turbidez aparente, medida a

620 nm. A mudança da cor amarela (não apresenta atividade) para rosa (máxima

atividade), medida por absorbância a 540 nm, indica a atividade estrogênica da amostra.

A Figura III.12 apresenta uma foto da microplaca de 96 poços no início do ensaio YES.

Figura III.12. Foto da microplaca de 96 poços no início dos testes de atividade

estrogênica.

Nestes ensaios, para corrigir a reposta estrogênica de cada amostra analisada para

turbidez (Acorr), a seguinte correção foi aplicada para os dados de cada poço da

microplaca.

166

AcorrAmostra = A540Amostra – (A620 Amostra – A620 Branco)

Para cada amostra construiu-se uma curva dose-resposta com os resultados dos

valores experimentais das absorbâncias corrigidas. O 17β-estradiol representa o padrão

da atividade estrogênica (controle positivo) para o ensaio YES.

A concentração de equivalente de 17β-estradiol (EQ-E2) nas amostras foi

calculado a partir da curva dose-resposta do 17β-estradiol, usando os valores de

absorbância corrigidos de cada amostra em duplicata. O EQ-E2 é definido como a

concentração de 17β-estradiol requerida para elucidar a mesma resposta na amostra no

ensaio YES.

Os valores de EC50 (a concentração que elucida uma atividade igual a 50% do

controle positivo 17β-estradiol) foi determinada a partir da curva dose-resposta obtida

pelo ajuste dos dados experimentais na Equação III.1, que usa o método dos mínimos

quadrados.

2

0

21

1A

xx

AAy p +

⎟⎠⎞⎜

⎝⎛+

−=

III.1

Onde: y é o valor de AcorrAmostra, x é a concentração da substância estrogênica

no ensaio, A1 a máxima indução da atividade estrogênica, A2 é o limite de detecção, x0 é

o valor de EC50, p é a inclinação da região mediana da curva como estimado de um

regressão linear/log da parte linear da curva dose-resposta.

Para fazer uma comparação direta entre cada ensaio foi determinada a potência

relativa estrogênica (PR), calculada a partir da Equação III.2, para cada substância com

referência ao 17β-estradiol.

amostraEC

ECPR estradiol

50

5017 −= β III.2

167

III.5. TESTE DE TOXICIDADE COM Ceriodaphia dubia

A avaliação da toxicidade crônica do 17β-estradiol foi realizada nas

concentrações de 100, 10, 1, 0,5, 0,1, 0,02 µg.L-1. Os testes de toxicidade crônica a

Ceriodaphia dubia, um microcrustáceo de água doce, foram realizados segundo a

norma ABNT (1995) no BIOAGRI – Laboratório de Ecotoxicologia.

Este ensaio consiste na exposição de indivíduos jovens do gênero Ceriodaphnia

dubia, a várias concentrações da substância-ensaio, por um período de

aproximadamente sete dias, nas condições prescritas na Norma. No final do período de

exposição, determina-se o número médio de jovens produzidos por fêmea e o número de

fêmeas adultas sobreviventes. Com estes dados, calculam-se a CENO e a CEO do

agente tóxico em estudo.

CENO é a concentração de efeito não observado, ou seja, maior concentração

nominal da substância-ensaio, que não causa efeito deletério, estatisticamente

significativo, na sobrevivência e reprodução dos organismos, nas condições de ensaio.

CEO é a concentração de efeito observado, definida por: menor concentração

nominal da substância-ensaio, que causa efeito deletério, estatisticamente significativo,

na sobrevivência e reprodução dos organismos, nas condições de ensaio.

168

IV. RESULTADOS E DISCUSSÃO

A identificação dos subprodutos formados na ozonização do 17β-estradiol e a

investigação de sua atividade estrogênica são tópicos importantes para se avaliar se

além da remoção do 17β-estradiol, a ozonização também é eficiente para a remoção do

efeito potencial desse desregulador endócrino. Esses tópicos serão abordados a seguir.

IV.1. DETERMINAÇÃO DO 17β-ESTRADIOL

Para a detecção de estrogênios em amostras aquosas várias metodologias

experimentais são aplicadas. Para a extração e concentração desses micropoluentes a

extração por fase sólida (EFS) é bastante usada, devido a ser uma extração simples,

rápida e que requer o uso de pequenas quantidades de solventes. No caso do 17β-

estradiol, cartuchos com fase sólida apolar de C18 são bastante empregados.

Atualmente, o uso da cromatografia, líquida ou gasosa, confere aos métodos

de determinação de micropoluentes em amostras ambientais, normalmente complexas,

uma maior sensibilidade e confiabilidade. Para a quantificação de estrogênios a CG é

uma técnica que alcança excelentes resultados e o uso em conjunto da CG/EM na

identificação dos subprodutos formados na oxidação do 17β-estradiol confere à

metodologia experimental uma excelente confiabilidade.

A metodologia analítica desenvolvida para a determinação do 17β-estradiol

em amostras aquosas mostrou-se bastante adequada para a extração, concentração e

detecção desse estrogênio nas amostras investigadas (água destilada e efluente de ETE).

O cromatograma representativo do 17β-estradiol em água obtido a partir da

metodologia analítica empregada e análise em CG é apresentado na Figura IV.1.

169

Figura IV.1. Cromatograma de uma amostra aquosa de 17β-estradiol

(C17β-estradiol = 50µg.L-1) obtido por CG.

IV.2. AVALIAÇÃO DA METODOLOGIA ANALÍTICA UTILIZADA

IV.2.1. Avaliação da Eficiência do Processo de Extração e Detecção

A avaliação da eficiência do processo de extração e detecção foi realizada

através de um estudo de recuperação do 17β-estradiol segundo a metodologia

empregada. A Tabela IV.1 apresenta as porcentagens de recuperação do 17β-estradiol

em diferentes concentrações. Todas as determinações foram realizadas em cinco

réplicas.

Tabela IV.1. Porcentagem de recuperação do 17β-estradiol após o processo EFS e detecção por CG.

C17β-estradiol (µg.L-1) Recuperação (%) 1 96 ± 8,7 10 92 ± 8,2 20 101 ± 5,4 40 96 ± 8,7

17β-estradiol

170

Os resultados mostraram que tanto a adsorção do 17β-estradiol pelo cartucho

como sua posterior eluição foram eficientes. Portanto, a metodologia analítica

desenvolvida está adequada para a quantificação do 17β-estradiol em baixíssimas

concentrações em solução aquosa.

Esta verificação é de grande importância, pois é necessário determinar se a

substância química em questão, neste caso o 17β-estradiol, é retida na resina C18 e

principalmente se é extraída em sua totalidade, ou quase, do cartucho pelo solvente

orgânico empregado, neste caso a acetona.

Os valores obtidos de porcentagem de recuperação (%) do 17β-estradiol

podem ser considerados muito bons e validam, portanto, a metodologia.

IV.2.2. Limite de Detecção

A determinação do limite de detecção do 17β-estradiol em solução aquosa foi

baseada na razão sinal/ruído pelo menos três vezes maior que qualquer interferência no

branco do tempo de retenção do analito. O limite de detecção foi de 5,0 ±0,1ng.L-1.

IV.3. REMOÇÃO DO 17β-ESTRADIOL NAS MATRIZES INVESTIGADAS

IV.3.1. Remoção do 17β-Estradiol em Solução Aquosa

Na ozonização, dois oxidantes principais (O3 molecular e radicais HO•) podem

estar atuando de acordo com o pH de reação. O aumento do pH favorece a formação dos

radicais HO•, que atuam como oxidantes menos seletivos no ataque aos compostos

orgânicos, porém reagem rapidamente com uma variedade de compostos. Já em baixos

valores de pH, a oxidação ocorre com maior freqüência via O3 molecular, que é mais

seletivo e reage rapidamente com grupamentos específicos.

Segundo a literatura, a oxidação de micropoluentes orgânicos pelo O3 é

somente um processo eficiente para componentes que contém grupamentos amino,

171

sistemas aromáticos ativados (ex. fenólicos) ou duplas ligações (HARRISON, 2000,

VON GUNTEN, 2003). As altas constantes das taxas de reação para a oxidação com

radicais HO• mostram que as remoções de compostos orgânicos por esses oxidantes são

muito mais rápidas, porém, mostram a natureza não seletiva dos radicais HO•. Esses

mecanismos serão abordados a seguir.

Na ozonização, o O3 molecular é muito seletivo e reage principalmente com

certos grupamentos, dentre eles o fenólico, que é um grupo doador de elétrons e pelo

qual ataque pelo ozônio ocorre. Isto pode ser bastante interessante no caso do 17β-

estradiol já que seu anel fenólico é o que confere atividade estrogênica a esse

desregulador endócrino (BIRKETT e LESTER, 2003), como apresentado na Figura

IV.2.

OH

HO

Figura IV.2. Estrutura química do 17β-estradiol.

Para se avaliar a influência do pH na degradação do 17β-estradiol pelo

processo de ozonização, três diferentes valores de pH, 3,0; 7,0 e 11 foram investigados.

A Figura IV.3 apresenta a remoção do 17β-estradiol na ozonização nas concentrações

iniciais desse estrogênio de 10µg.L-1 e 50µg.L-1 nos três valores de pH estudados.

Diferentes valores de pH foram investigados para avaliar se a atuação dos radicais HO•

seria mais efetiva do que a do O3 molecular na oxidação do 17β-estradiol, além de se

investigar os principais subprodutos formados em todos os valores de pH de reação.

172

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 100

2

4

6

8

10C17β-estradiol inicial = 10µg.L-1

C17

β-es

tradi

ol ( µg

.L-1 )

Dosagem de ozônio consumido (mg.L-1 )

pH 3 pH 7 pH 11

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 100

10

20

30

40


C 17

β-es

tradi

ol ( µg

.L-1 )


pH 3 pH 7 pH 11

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 100,00

0,02

0,04

0,06

0,08

0,10

C17

β-es

tradi

ol (µ

g.L-1

)


00,00

0,02

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

0,04

0,06

0,08

0,10

C17

β-es

tradi

ol (µ

g.L-1

)

gem de ozônio consumido (mg.L-1 )Dosa

Figura IV.3. Remoções do 17β-estradiol após a ozonização nos valores de pH 3, 7, 11. Concentração inicial de 17β-estradiol de 10 e 50 µg.L-1.

173

Em pH 3 estudou-se a ação do O3 molecular, em pH 7 os dois oxidantes

podem estar atuando. Em pH 11 a oxidação ocorre via radical HO•, pois em altos

valores de pH a decomposição do O3 em radicais secundários, principalmente os

radicais HO•, ocorre instantaneamente (HARRISON, 2000).

Outro aspecto importante da variação do pH de reação é que diferentes

espécies do composto podem estar presentes e assim, serem suscetíveis à oxidação. O

grupo reativo do 17β-estradiol é o grupamento fenólico (HUBER et al., 2003). No caso

do fenol (HB), em pH muito ácido (pH < 4) a concentração de fenolato (B-) é

desprezível, com isso, a espécie atacada pelos oxidantes seriam os fenóis. Em pH muito

básico (pH>10), todo o fenol estaria na forma de fenolato, que é a espécie mais reativa.

Segundo HOIGNÉ e BADER (1983a) a constante de taxa de reação do ozônio com o

fenolato (1,4±0,4x109 M-1s-1) é muito maior do que a constante de taxa de reação do

ozônio com o fenol (1,3±0,2x103 M-1s-1). Assim, é de se esperar que a reação de

oxidação do 17β-estradiol em pH 3 seja mais lenta do que em pH básico.

Segundo HUBER et al. (2003), a constante de taxa de reação dos estrogênios é

fortemente dependente do pH e o grupamento fenólico desprotonado dos estrogênios

reage mais rapidamente do que sua forma protonada. Esses autores determinaram as

constantes de taxas de reação do 17α-etinilestradiol com o O3 (kO3 = ∼ 7 x 109 M-1s-1) e

com o radical HO• (kOH = 9,8 x 109 M-1s-1) em pH entre 6 e 7, demonstrando que em pH

neutro, as constantes de taxa de reação desses estrogênios com o O3 e o radical HO• são

iguais.

Os experimentos de investigação da remoção do 17β-estradiol em solução

aquosa pela ozonização foram repetidos 7 vezes. A repetibilidade dos resultados foi

excelente, no entanto, para concentrações abaixo de 0,1 µg.L-1 a variabilidade foi maior.

É interessante notar que nas menores concentrações de 17β-estradiol (< 0,1 µg.L-1) a

oxidação nos três valores de pH é mais lenta, ou seja quanto menor a concentração do

17β-estradiol mais lenta é a sua oxidação. Isso ocorre porque até a remoção < 99% de

17β-estradiol os resultados foram idênticos nos três valores de pH, e o consumo de

ozônio para concentrações menores do que 0,1 µg.L-1 foi muito pequeno.

Na ozonização do 17β-estradiol, o consumo de ozônio com o tempo

praticamente não se alterou nos valores de pH investigados, como mostra a Figura IV.4.

174

A quantidade de 17β-estradiol removida por dosagem de ozônio consumido é

apresentada na Figura IV.5.

0 5 10 15 20 250

20

40

60

80

100

120

140

160

180

200

Te

mpo

( s

)


pH 3 pH 7 pH 11

Figura IV.4. Dosagem de ozônio com o tempo nos valores de pH investigados.

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 100

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

Qua

ntid

ade

de 1

7β-e

stra

diol

rem

ovid

o (µ

g)

Ozônio comsumido (mg)

pH 3 pH 7 pH 11

Figura IV.5. Quantidade de 17β-estradiol (C17β-estradiol inicial = 50 µg.L-1) removida por

dosagem de ozônio consumido.

175

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

49,88

49,90

49,92

49,94

49,96

49,98

50,00

50,02

Qua

ntid

ade

de 1

7β-e

stra

diol

rem

ovid

o (µ

g)

Ozônio consumido (mg)

Da Figura IV.5 observa-se claramente que a quantidade de 17β-estradiol

removida em função da dosagem de ozônio consumido é a mesma até se obter uma

concentração residual < 0,1 µg.L-1, portanto, até essa concentração residual a oxidação

do 17β-estradiol ocorre rapidamente.

Provavelmente, o motivo pelo qual só se observa essa mudança de

comportamento em baixíssimas concentrações é devido à reatividade do anel fenólico,

sendo este muito reativo tanto com ozônio como com os radicais HO• (HUBER et al.,

2003). No entanto, para baixíssimas concentrações observa-se uma diferença de

reatividade. Observa-se ainda que em pH 3 a reação ocorre mais lentamente do que em

pH 7 e 11, indicando que a oxidação pelo O3 é mais lenta que a oxidação pelo radical

HO• (oxidante predominante em pH 11).

O 17β-estradiol foi rápido e quase completamente oxidado nos diferentes

valores de pH investigado. Uma vez que, baixas dosagens de ozônio consumido (1,0

mg.L-1) foram suficientes para a quase completa remoção do 17β-estradiol, ou seja, foi

removido pelo menos 99,1 % do 17β-estradiol no pH 3 e 99,8 % no pH 11.

Na remoção de maiores concentrações de 17β-estradiol, não foram observados

alterações significativas no comportamento oxidativo do 17β-estradiol frente à

ozonização com a mudança do pH de reação. No entanto, para pequenas concentrações

de 17β-estradiol (< 0,1 µg.L-1) esse padrão oxidativo modificou-se. Uma concentração

residual de 17β-estradiol na faixa de ng.L-1 permaneceu, algumas vezes, mesmo com

excesso de ozônio. Contudo, essa concentração residual foi menor em pH básico, ou

seja, em pH 11 a oxidação foi mais rápida e mais eficiente para baixas concentrações.

Em todos os valores de pH investigados e dosagens de ozônio consumido,

algumas vezes foram detectadas pequenas concentrações residuais do 17β-estradiol,

como se pode observar na Figura IV.3. Foram realizados experimentos com

concentrações iniciais de 17β-estradiol de 10 e 50µg.L-1, e independentemente dessa

concentração inicial, as concentrações de 17β-estradiol residuais estiveram na faixa de

0,0 a 90 ng.L-1 para pH 3, isso equivale a remoções de 17β-estradiol > 99,1 %. No pH

11 concentrações residuais mais baixas foram observadas, na faixa de 0,0 a 30 ng.L-1.

Deve-se ressaltar que embora as remoções sejam na faixa de 99,1 a 99,8 %, a

176

concentração residual na faixa de ng.L-1 ainda é suficiente para elucidar uma resposta

estrogênica nos ensaios in vivo de atividade estrogênica (ROUTLEDGE et al., 1998,

THOMPSON et al., 2000). Essa concentração residual pode ser explicada pelo fato de

que, para que a oxidação pela ozonização ocorra, uma molécula de oxidante (O3 ou

radicais HO•) deve encontrar-se com a molécula de 17β-estradiol. Porém, as chances

desse choque são bem reduzidas no caso de baixíssimas concentrações.

Os processos convencionais empregados nas plantas de tratamento de água

potável não são eficientes na remoção de micropoluentes, como é o caso do 17β-

estradiol, isso impõe um risco constante aos humanos (JOBLING et al., 1998,

TERNES, 1998). Alguns estudos mostram que outros processos de tratamento podem

ser eficientes na remoção dessas substâncias da água potável, como é o caso da

ozonização (ALUM et al., 2004, HUBER et al., 2003).

Alguns estudos na literatura mostram a rápida oxidação de estrogênios, tais

como 17β-estradiol, estrona e 17α-etinilestradiol, pela ozonização. As altas constantes

das taxas de remoções, maiores que 99%, alcançadas com esse processo oxidativo

também são relatadas por outros pesquisadores (ALUM, et al., 2004, HUBER et al.,

2003, TERNES et al., 2003).

As dosagens de ozônio comumente usadas nas plantas de tratamento de água

são na faixa de 1,0 mg.L-1 de ozônio que como apresentado neste estudo, são suficientes

para remoção acima de 99,3 % de 17β-estradiol, quando a concentração inicial desse é

de 10 µg.L-1 em pH 7,0.

Deve-se ressaltar que as concentrações de 17β-estradiol na água de

abastecimento são menores que a estudada nesse trabalho, no entanto, as remoções na

faixa de ng L-1 só ocorreram com dosagens maiores de ozônio. Um outro fator

importante é que a água de abastecimento possui outros contaminantes orgânicos que

certamente vão consumir parte do ozônio introduzido na água. Portanto, pode-se

concluir que muito provavelmente as dosagens de ozônio aplicadas atualmente nas

plantas de tratamento de água de abastecimento não são suficientes para remover o 17β-

estradiol na sua totalidade.

177

Além disso, ainda é importante investigar se os efeitos em potencial dos DE

podem também ser efetivamente removidos nessas condições, fato este que será

discutido no item IV.6.

Como se observou, a ozonização alcançou remoções de 17β-estradiol maiores

que 99,1 % nos valores de pH investigados. O 17β-estradiol foi rapidamente oxidado

neste processo. A investigação dos subprodutos formados e se ainda apresentam

atividade estrogênica, como é o caso do 17β-estradiol, é de suma importância para se

avaliar se a ozonização também é capaz de remover o efeito deletério do 17β-estradiol e

de seus subprodutos.

IV.3.2. Remoção do 17β-Estradiol em Solução Aquosa e Efluente de ETE

Para investigar se a ozonização pode efetivamente degradar esse estrogênio em

uma matriz ambiental complexa, na qual as substâncias em questão não são os alvos

sozinhos, a ozonização do 17β-estradiol foi realizada em efluente de ETE. O efluente de

ETE, utilizado nos ensaios de ozonização, apresentou os parâmetros descritos na Tabela

IV.2. Nestes estes ensaios, foi mantido o pH original da amostra e o 17β-estradiol foi

introduzido na amostra na concentração de 50µg.L-1.

Tabela IV.2. Parâmetros da composição do efluente de ETE da Ilha do Governador. Parâmetro Valor Médio

COD (mg.L-1) 1,6 Turbidez (NTU) 4,5

pH 6,7 SST (mg.L-1) 15

A remoção do 17β-estradiol em água destilada (pH 7) e em efluente de ETE

(pH original 6,7) estão apresentados na Figura IV.6. A remoção do 17β-estradiol no

efluente de ETE ocorreu mais lentamente do que em água destilada. Com uma dosagem

de 1,0 mg.L-1de ozônio aproximadamente 80% do 17β-estradiol foi degradado, uma

remoção de 17β-estradiol de 99,6% foi alcançada com uma dosagem de 10 mg.L-1de

ozônio. Assim, observou-se que na ozonização, os oxidantes atacam outras substâncias

178

presentes no efluente de ETE além do 17β-estradiol e com isso, uma maior

concentração de ozônio seria necessária para remover o 17β-estradiol dessa matriz

ambiental complexa, como efluente de ETE.

A quantidade de 17β-estradiol adicionada na amostra de efluente de ETE foi

bastante alta, com o objetivo de se determinar analiticamente o seu desaparecimento. No

entanto, observa-se que para concentrações inferiores a 0,5 µg.L-1 a sua oxidação pela

ozonização nessa matriz é muito difícil. Com uma dosagem de ozônio de 10 mg.L-1 uma

concentração residual de 17β-estradiol de 0,2 µg.L-1 permaneceu no efluente de ETE.

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 100

10

20

30

40

50

C17

β-es

tradi

ol ( µg

.L-1 )


Efluente de ETE - pH 6,7 Solução aquosa - pH 7

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 100

2

4

6

8

10

12

C17

β-es

tradi

ol ( µg

.L-1 )


Figura IV.6. Remoção do 17β-estradiol (C17β-estradiol inicial = 50 µg.L-1) em solução aquosa e efluente de ETE pela ozonização.

Esses resultados são de extrema importância, pois os efluentes de ETE

apresentam o 17β-estradiol em concentrações na faixa de 0,5 a 12 ng.L-1 (Anexo 1). E

sendo esse efluente descartado nos corpos receptores, provavelmente, causará

problemas ambientais como feminização de peixes e outras anomalias no sistema

reprodutivo dos organismos expostos (ALLEN et al.,1999, RODGER-GRAY et al.,

179

2000). Deve-se ressaltar que os ensaios realizados in vivo com desreguladores

endócrinos relatam várias dessas anomalias e é de consenso mundial que esses efeitos

ocorram em concentrações ambientalmente relevantes (COM, 1999 (706),

COMPREHEND, 2002, UBA, 1996). Além do mais, o 17β-estradiol está sendo lançado

no meio ambiente continuamente e o seu destino pode ser a água de captação para

abastecimento humano ou irrigação.

IV.4. IDENTIFICAÇÃO DOS SUBPRODUTOS FORMADOS NA

OZONIZAÇÃO DO 17β-ESTRADIOL

Além de investigar os subprodutos formados na ozonização do 17β-estradiol,

foi também avaliada a influência do pH na formação desses subprodutos de oxidação.

Nesta etapa do estudo, duas concentrações iniciais de 17β-estradiol foram estudadas

(50µg.L-1 e 1,0mg.L-1), pois na concentração de 50µg.L-1, concentrações muito baixas

de subprodutos foram tão rapidamente formadas e degradadas que dificultaram a

identificação. Na ozonização com concentração inicial de 1,0 mg.L-1 foram formados

subprodutos em maior concentração que possibilitaram uma melhor identificação.

A Figura IV.7 apresenta a estrutura do 17β-estradiol formada após a

derivatização com BSTFA. O espectro de massa do 17β-estradiol obtido da CG/EM e os

espectros de massa do Bis-TMS estradiol obtidos da biblioteca do programa de

identificação NIST são apresentados na Figura IV.8. O espectro de massa do Bis-TMS

estradiol é caracterizado pelo íon m/z 416, e pelos íons 73, 129 e 285. Estes resultados

mostraram que a derivatização dos dois grupos –OH da molécula de 17β-estradiol foi

alcançada, formado o Bis-TMS estradiol.

OSi

H3C CH3

CH3

CH3

H3C CH3Si

O

Figura IV.7. Estrutura do produto formado da derivatização com BSTFA do 17β-estradiol.

180

40 70 100 130 160 190 220 250 280 310 340 370 400 4300

50

100

45 59

73

115

129

141 177231

285

298 326 401

416

40 70 100 130 160 190 220 250 280 310 340 370 400 4300

50

100

45 59

73

115

129

141 177231

285

298 326 401

416

40 70 100 130 160 190 220 250 280 310 340 370 400 4300

50

100

45 59

73

81 93 115

129

147 163

232

285

298326

401

416

m/ z

Abundanc e

40 70 100 130 160 190 220 250 280 310 340 370 400 4300

50

100

45 59

73

81 93 115

129

147 163

232

285

298326

401

416

40 70 100 130 160 190 220 250 280 310 340 370 400 4300

50

100

45 59

73

81 93 115

129

147 163

232

285

298326

401

416

m/ z

Abundanc e

OSi

OSi

(A)

(B)

Figura IV.8. (A) Espectro de massa (CG/EM) do 17β-estradiol, e (B) o espectro de massa do Bis-TMS estradiol obtido da biblioteca da NIST.

Os cromatogramas das amostras submetidas à espectrometria de massa da

CG/EM provenientes da ozonização do 17β-estradiol em solução aquosa (concentrações

iniciais de 50µg.L-1 e 1,0mg.L-1) nos diferentes valores de pH e dosagens de ozônio

consumido investigados, estão apresentados no Anexo 4. Esses cromatogramas

demonstram que vários subprodutos foram formados na ozonização do 17β-estradiol,

porém, as identificações foram dificultadas pela presença de contaminantes nas

amostras ozonizadas.

Neste estudo, observou-se claramente que a qualidade da água utilizada nos

ensaios de oxidação é de grande importância. Em se tratando de investigações com

substâncias em concentrações da ordem de µg.L-1 e ng.L-1, qualquer contaminante que

já esteja na água, antes dos testes, ou seja, no preparo das soluções utilizadas nos

ensaios, pode dificultar e muito todas as avaliações de oxidação, identificação de

subprodutos e como será apresentada no item a seguir, a avaliação da atividade

estrogênica.

181

Apesar de vários intermediários serem formados na ozonização do 17β-

estradiol, até o momento, somente alguns possíveis intermediários puderam ser

propostos. Para a identificação dos subprodutos foram utilizadas duas bibliotecas de

programas de identificação: NIST e WILEY 275, além de padrões de alguns possíveis

intermediários. As bibliotecas estudadas indicaram uma variedade de substâncias

químicas, porém com base na estrutura do 17β-estradiol e nos seus possíveis produtos

de oxidação, alguns compostos identificados nas bibliotecas foram descartados.

Algumas substâncias e seus espectros de massa estão apresentados no Anexo 5. O que

provavelmente está ocorrendo é que os subprodutos formados na ozonização do 17β-

estradiol apresentam estruturas químicas similares aos identificados pelas bibliotecas,

com algumas modificações em sua estrutura química, isso pode ser devido ao fato de

que não existem, nas bibliotecas, espectros de massa dos subprodutos formados na

oxidação do 17β-estradiol.

A Figura IV.9 apresenta onde preferencialmente pode começar o ataque do O3

à molécula de 17β-estradiol. Como os radicais HO• são agentes oxidantes não seletivos,

podem atacar tanto o anel fenólico como outra parte da molécula. Contudo, estudos

demonstram que o grupamento reativo dos estrogênios frente ao O3 ou radical HO• é o

grupamento fenólico (HUBER et al., 2003).

OH

HO

O3

O3

Figura IV.9. Representação da atuação do ozônio molecular sobre o anel fenólico do 17β-estradiol.

A seguir, será apresentada uma discussão sobre alguns intermediários

identificados pelas bibliotecas e os possíveis subprodutos de ozonização do 17β-

estradiol. Como esses compostos estão derivatizados, apresentam em sua estrutura

química o grupamento - Si (CH3)3.

182

O Anexo 5 apresenta alguns subprodutos identificados na espectrometria de

massa como sendo oriundos da ozonização do 17β-estradiol com seus respectivos

espectros de massa, estruturas químicas e similaridades; esses dados foram obtidos nas

bibliotecas empregadas (NIST e WILEY-275). Porém muitos foram descartados, pois

não poderiam ser subprodutos da ozonização do 17β-estradiol.

A Tabela IV.3 apresenta alguns subprodutos propostos resultante da

ozonização do 17β-estradiol identificados na espectrometria de massa das amostras de

17β-estradiol ozonizadas.

Tabela IV.3. Possíveis subprodutos formados na ozonização do 17β-estradiol de acordo com as análises de CG/EM.

Composto Nome do Composto Estrutura Química

1 Estr-5(10)-en-3-one, 17-hidroxi-, (17β)-

O

OH

2 19-nortestosterona

OH

O

3 10ε-17β-dihidroxi-1, 4-estradieno-3-one (DEO)

OH

O

OH

4 2-hidroxiestradiol

HO

OH

HO

5 Testosterona

OH

O

Para um composto ser confirmado pela cromatografia estar presente em uma

amostra são necessárias várias etapas de verificação, algumas delas como, injetar

183

padrões desses compostos numa mesma programação e mesma coluna que as amostras,

injetar em colunas e programações diferentes, para assim, confirmar a presença ou não

de um determinado composto. Neste estudo, além dos espectros de massa obtidos das

amostras de 17β-estradiol ozonizadas, padrões de alguns possíveis subprodutos da

oxidação do 17β-estradiol foram injetados na CG e CG/EM na mesma coluna e na

mesma programação das amostras de 17β-estradiol ozonizadas.

O primeiro composto a ser identificado na espectrometria de massa foi a 19-

nortestosterona, com uma baixa similaridade, de 49%, porém uma das maiores

similaridades obtidas neste estudo. Um padrão desse composto foi injetado na CG e

CG/EM e não apresentou o mesmo tempo de retenção de um intermediário presente nas

amostras de 17β-estradiol ozonizadas. Com isso, conclui-se que a 19-nortestosterona

não é um subproduto da ozonização do 17β-estradiol nas condições empregadas neste

estudo. Contudo, não está descartada a hipótese de outro isômero da 19-nortestosterona,

como por exemplo de número 1, apresentado na Tabela IV.4, porém, não foi possível

obter padrão deste composto.

O segundo composto a ser identificado pelo espectro de massa foi 10ε-17β-

dihidroxi-1, 4-estradieno-3-one (DEO), porém com uma baixa similaridade. O padrão

deste composto não foi encontrado para sua confirmação como subproduto da

ozonização do 17β-estradiol. Contudo, o DEO foi citado por OHKO et al. (2002) como

sendo um possível subproduto formado na oxidação do 17β-estradiol na fotocatálise,

sua identificação foi realizada através da espectrometria de massa, sem a confirmação

com um padrão, porém confirmado mecanisticamente. Com isso, pode-se propor que o

DEO seja um subproduto formado na ozonização do 17β-estradiol. Observa-se que um

isômero de posição deste composto também pode ser um dos subprodutos formados na

oxidação do 17β-estradiol.

Em várias amostras aquosas de 17β-estradiol ozonizadas, o 2-hidroxiestradiol

foi identificado pela espectrometria de massa com uma similaridade alta (93 %).

Segundo ZHU e CONNEY (1998) um dos maiores caminhos metabólicos do 17β-

estradiol no corpo é a 2-hidroxilação, em segundo uma 16α-hidroxilação do 17β-

estradiol para um catecol e a formação da estrona. Com isso, é de se esperar que a

oxidação do 17β-estradiol possa conduzir ao 2-hidroxiestradiol. Na espectrometria de

184

massa, pelo menos três isômeros de posição deste catecol foram identificados, porém

sem confirmação com padrões. Um padrão do 2-hidroxiestradiol foi analisado na CG e

CG/EM na mesma programação das amostras aquosas do 17β-estradiol, sendo,

confirmada a presença desse composto. Com isso, podemos propor que o 2-

hidroxiestradiol seja um dos subprodutos formados na ozonização do 17β-estradiol.

Outros estudos de oxidação do 17β-estradiol também relataram o 2-hidroxiestradiol

como subproduto de reação (OHKO et al., 2002).

A testosterona foi um dos subprodutos identificados na oxidação do 17β-

estradiol pela fotocatálise no estudo de OHKO et al. (2002). No nosso estudo, um

padrão da testosterona foi analisado e identificado como um dos subprodutos formados

na ozonização do 17β-estradiol.

Apesar de ser observado que vários subprodutos foram formados da

ozonização do 17β-estradiol, poucos puderam ser identificados ou propostos. Como, por

exemplo, não foi possível identificar subprodutos da ozonização do 17β-estradiol que

mostrassem a abertura do anel fenólico. Contudo, a identificação dos subprodutos

formados na oxidação do 17β-estradiol não é um tópico fácil de estudo, pois

pouquíssimos são os trabalhos na literatura onde são propostos esses subprodutos

(HUBER et al., 2004, OHKO et al., 2002).

Observou-se que nem todos os valores de pH apresentaram os mesmos

subprodutos formados na oxidação do 17β-estradiol. A Tabela IV.4 apresenta alguns

intermediários propostos para a oxidação do 17β-estradiol em solução aquosa em todos

os pH investigado e no efluente de ETE.

Observou-se que o pH influencia na formação dos subprodutos formados na

ozonização do 17β-estradiol. Alguns subprodutos propostos nos valores de pH 7 e 11

não foram detectados quando a ozonização foi conduzida em pH 3. Isto indica que

diferentes caminhos de reação estão ocorrendo em diferentes valores de pH de

ozonização e pode ser explicado devido ao pH 11 favorecer a formação dos radicais

HO•, que agem como oxidantes; o que já não acontece no pH 3 onde há a maior atuação

do O3 molecular na oxidação dos compostos. Além disso, em pH 11 os compostos

fenólicos se encontram na forma de íons fenolatos, espécie que não está presente em pH

ácido.

185

Tabela IV.4. Subprodutos propostos na ozonização do 17β-estradiol em água destilada e em efluente de ETE nos diferentes valores de pH investigados.

Água destilada Efluente de ETE Nome do

composto Estrutura Química pH 3 pH 7 pH 11 pH 6,7

10ε-17β-dihidroxi-1, 4-estradieno-3-one (DEO)

OH

O

OH

ND √ √ √

2-hidroxiestradiol

HO

OH

HO

ND √ √ √

Testosterona

OH

O

√ √ ND √

ND: não detectado

IV.5. DESAPARECIMENTO DAS BANDAS DE ABSORBÂNCIAS DO 17β-

ESTRADIOL APÓS A OZONIZAÇÃO

A atividade estrogênica do 17β-estradiol está relacionada com a sua estrutura

química. A posição relativa do grupo hidroxila fenólico (OH) no anel A é considerada

crucial para a alta afinidade da ligação com o RE e assim seu potencial estrogênico.

A Figura IV.10 apresenta o espectro de absorbância do 17β-estradiol em

metanol. De acordo com a literatura, as bandas de absorbância de uma substância na

faixa de comprimento de onda de 190 a 300 nm representam as ligações duplas e triplas

conjugadas da molécula, e a banda de absorbância no comprimento de onda de 288 nm

representa o anel fenólico (LIU e LIU, 2004). O espectro de absorbância do 17β-

estradiol indica que essa molécula apresenta um máximo de absorção característico em

λ = 203 nm e uma pequena banda de absorbância em λ = 280 nm.

186

Segundo LIU e LIU (2004), a estrutura conjugada principal do 17β-estradiol é

o grupo hidroxila substituinte do anel benzênico, o qual tem uma fraca absorbância na

região UV com a banda de absorbância em 288 nm. Essa banda de absorbância em um

comprimento de onda aproximado (λ = 280 nm) pode ser observada na Figura IV.13.

Este deslocamento nas bandas de absorbâncias se deve ao fato de que essas análises

foram realizadas em diferentes solventes, no caso desse estudo, o metanol e no artigo de

LIU e LIU (2004) a água.

200 220 240 260 280 3000,0

0,2

0,4

0,6

0,8

1,0

1,2

Abs

orbâ

ncia

λ (nm)

HO

OH

Figura IV.10. Espectro de absorbância do 17β-estradiol em metanol (C17β-estradiol = 50µg.L-1).

Deve-se ressaltar que esses espectros no UV foram feitos em metanol

(metodologia analítica apresentada no item III.4.8) e que esse foi o melhor solvente

encontrado para identificar os máximos de absorbância. Isso só foi possível porque as

amostras foram extraídas e concentradas em C18 e eluídas com solvente orgânico. Em

geral seria impossível obter tais espectros em concentrações tão baixas.

A resolução do espectro em metanol foi excelente e houve um pequeno

deslocamento nos máximos de absorbância, o que é esperado uma vez que o solvente

não foi a água, este mesmo deslocamento foi observado no espectro de absorção do

187

composto fenol em metanol. Observa-se que é idêntico ao da literatura apenas com o

deslocamento do máximo de absorbância.

Esse espectro valida o método aqui empregado para essas varreduras no UV. A

Figura IV.11 e o Anexo 6 apresentam os espectros de UV em metanol das amostras de

17β-estradiol ozonizadas.

A Figura IV.11 demonstra o desaparecimento das bandas de absorbâncias do

17β-estradiol pela ozonização, nos três valores de pH investigados. Observa-se a

degradação do 17β-estradiol com o aumento da dosagem de ozônio. Todas as bandas de

absorbância (203 e 280 nm) diminuíram consideravelmente depois da ozonização,

indicando que o anel fenólico parece ser rompido e conseqüentemente a remoção da

estrogenicidade do 17β-estradiol.

Este comportamento é melhor avaliado na Figura IV.12. Observa-se que há

uma redução significativa na banda de absorbância máxima em 203 nm com o aumento

da dosagem de ozônio. Contudo, em pH 3 essa redução foi menor, provavelmente nesse

pH a absorbância é devido à concentração residual de 17β-estradiol, que é maior do que

em outros valores de pH, como demonstrado na CG. Nos valores de pH 7 e 11 essa

redução foi maior indicando uma maior remoção dessa estrutura. Essas informações são

muito interessantes, pois revelam o rompimento do anel fenólico, que é a parte da

molécula a qual é atribuída a atividade estrogênica. Portanto, o rompimento do anel

fenólico leva à remoção da atividade estrogênica, não sendo necessária a mineralização

total da substância. Esses resultados concordam parcialmente com os resultados obtidos

nos testes de atividade estrogênica que serão discutidos posteriormente.

188

200 220 240 260 280 3000,0

0,2

0,4

0,6

0,8

1,0

1,2

Abso

rbân

cia

λ (nm)

pH 3 50 µg.L-1 de E2

0,5 mg.L-1 de O3

1,0 mg.L-1 de O3

5,0 mg.L-1 de O3

10 mg.L-1 de O3

200 220 240 260 280 3000,0

0,2

0,4

0,6

0,8

1,0

1,2

Abso

rbân

cia

λ (nm)


0,5 mg.L-1 de O3

1,0 mg.L-1 de O3

5,0 mg.L-1 de O3

10 mg.L-1 de O3

200 220 240 260 280 3000,0

0,2

0,4

0,6

0,8

1,0

1,2

Abso

rbân

cia

λ (nm)

pH 11 50 µg.L-1 de E2

0,5 mg.L-1 de O3

1,0 mg.L-1 de O3

5,0 mg.L-1 de O3

10 mg.L-1 de O3

Figura IV.11. Espectros de absorbância das amostras aquosas de 17β-estradiol

ozonizadas em diferentes valores de pH.

189

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 100,0

0,1

0,2

0,3

0,4

0,5

0,6

0,7

0,8

0,9

1,0

Abo

srbâ

ncia

nor

mal

izad

a


pH 3 pH 7 pH 11

Figura IV.12. Redução das absorbâncias a λ = 203 nm nos diferentes valores de pH em

função das dosagens de ozônio consumido.

IV.6. REMOÇÃO DA ATIVIDADE ESTROGÊNICA DO 17β-ESTRADIOL NA

OZONIZAÇÃO

IV.6.1. Ensaio YES

No ensaio YES, o potencial estrogênico das substâncias ou amostras testadas

pode ser medido colorimetricamente pela mudança de cor do substrato cromogênico

(CPRG) presente no meio reacional. O substrato é metabolizado pela enzima β-

galactosidase produzida como resposta à ligação da substância estrogênica no RE da

levedura. Assim, quando uma substância estrogênica está presente no ensaio YES, a

coloração do meio de análise muda de amarelo para rosa, como pode ser observado na

Figura IV.13, que apresenta a resposta estrogênica do 17β-estradiol no ensaio YES.

O 17β-estradiol é considerado um padrão dos ensaios de atividade estrogênica,

sendo assim, é usado como controle positivo no ensaio YES para demonstrar a resposta

190

estrogênica. A Figura IV.14 apresenta uma curva dose-resposta padrão do 17β-estradiol

característica do ensaio YES.

Tempo = 0 dias Tempo = 3 dias

Figura IV.13. Microplacas do ensaio YES com a curva padrão do 17β-

estradiol (Fileiras E e G), branco (Fileiras F e H).

Figura IV.14. Curva dose-resposta padrão do controle positivo 17β-estradiol no ensaio

YES realizado por WANG et al. (2003).

A Figura IV.15 apresenta a curva dose-resposta do 17β-estradiol para o ensaio

YES obtida neste estudo. A curva padrão do 17β-estradiol mostra-se uma função

sigmoidal, que foi determinada pelo método de regressão não linear.

191

1E-7 1E-6 1E-5

1,0

1,5

2,0

2,5

3,0

3,5

A corri

gido

Concentração (g.L-1 )

17β-estradiol

Figura IV.15. Curva dose-resposta padrão do controle positivo 17β-estradiol no ensaio YES. Curva de calibração do estrogênio foi produzida pela análise de 17β-estradiol na

faixa de 54,4 µg.L-1 a 26,61 ng.L-1.

Para cada ensaio, uma curva dose-resposta do 17β-estradiol foi determinada,

produzida na faixa de 54,4 µg.L-1 a 26,61 ng.L-1. O limite de detecção foi de

0,4±0,1µg.L-1, a máxima indução da β-galactosidase foi de 2,980 ± 0,1 e o EC50 foi de

2,13 ± 0,3 µg.L-1. Observa-se que a curva dose-resposta obtida está de acordo com a

literatura validando os testes aqui realizados.

IV.6.2 Atividade Estrogênica da Água Destilada

Neste estudo, observou-se que impurezas ou contaminações causam falsos

positivos nos ensaios YES. Assim, os reagentes, a água e os recipientes usados no

preparo das soluções que compõem o meio de cultivo e análise devem apresentar um

alto grau de pureza. Para isso, no ensaio YES utilizou-se água ultrapura apirogênica (<

0,001 endotoxicina / mL) obtida pelo sistema Mili-Q Biocell.

192

Primeiramente foram usadas no ensaio YES as amostras aquosas de 17β-estradiol

ozonizadas preparadas com água destilada, contudo, os experimentos não puderam ser

realizados dessa forma. A Figura IV. 16 apresenta o resultado do potencial estrogênico

da água destilada no ensaio YES.

1E-7 1E-6 1E-5 1E-4

0,8

1,0

1,2

1,4

1,6

1,8

A corri

gido


17β-estradiol

0,01 0,1 1

0,8

1,0

1,2

1,4

1,6

1,8

A corri

gido

Fator de diluição

Água Destilada

Figura IV.16. Curvas dose-resposta do 17β-estradiol e do extrato de água destilada no

ensaio YES.

193

A água destilada usada em todos os experimentos de ozonização não pôde ser

utilizada no ensaio YES devido à sua atividade estrogênica antes do preparo das

soluções aquosas de 17β-estradiol, como mostrado na Figura IV.16(B). Assim, conclui-

se que a água destilada possui contaminantes que apresentam atividade estrogênica no

ensaio YES e, portanto, não pode ser usada para avaliação da estrogenicidade das

amostras aquosas de 17β-estradiol ozonizadas. Deve-se deixar claro que essa

estrogenicidade é observada para o extrato da água destilada e que as suas

concentrações na água destilada estão abaixo de ng.L-1.

Com isso, a mesma água ultrapura usada no preparo das soluções do ensaio YES

foi utilizada para preparar todas as soluções aquosas de 17β-estradiol usadas na

ozonização.

IV.6.3. Atividade Estrogênica das Amostras Aquosas de 17β-Estradiol

Ozonizadas

Como apresentada na seção III (Materiais e Métodos), a atividade estrogênica

do 17β-estradiol após a ozonização foi avaliada em amostras com e sem preparo prévio,

ou seja, sem e com extração e concentração em EFS. Para medir a atividade estrogênica

no ensaio YES, as amostras aquosas passaram por um processo de extração, para a

concentração das amostras. A curva dose-resposta do controle positivo (17β-estradiol)

para o ensaio YES pode ser medida em uma concentração maior do que a apresentada

na amostra aquosa. Como apresentado no Anexo 7 as amostras aquosas de 17β-estradiol

ozonizadas sem o processo de extração (EFS em C18) não apresentaram atividade

estrogênica no ensaio YES ao contrário dos extratos das amostras ozonizadas como será

apresentado a seguir.

A atividade estrogênica dos extratos das amostras ozonizadas em água foi

determinada pelo ensaio YES. As microplacas de 96 poços mostrando a resposta

estrogênica ao ensaio YES das amostras são apresentadas nas Figuras IV.17 a IV.19.

194

Figura IV.17. Microplacas de 96 poços com a resposta no ensaio YES dos extratos das amostras de 17β-estradiol ozonizadas serialmente diluídos. Amostras com 10µg.L-1 de 17β-estradiol e: 1mg.L-1 de O3 e pH 3 (fileiras A e C da placa A); 5mg.L-1 de O3 e pH 3 (fileiras E e G da placa A); 1mg.L-1 de O3 e pH 7 (fileiras A e C da placa B); 5mg.L-1 de

O3 e pH 7 (fileiras E e G da placa B); As fileiras B, D, F, H são os brancos.

Figura IV.18. Microplacas de 96 poços com a resposta no ensaio YES dos extratos das amostras de 17β-estradiol ozonizadas serialmente diluídos. Amostras com 10µg.L-1 de

17β-estradiol e: 10mg.L-1 de O3 e pH 7 (fileiras A e C da placa A); curva padrão do 17β-estradiol (fileiras E e G da placa A); 10 mg.L-1 de O3 e pH 3 (fileiras A e C da

placa B); Amostras com 50µg.L-1 de 17β-estradiol 10 mg.L-1 de O3 e pH 11 (fileiras E e G da placa B); As fileiras B, D, F, H são os brancos.

Figura IV.19. Microplacas de 96 poços com a resposta no ensaio YES dos extratos das amostras de 17β-estradiol ozonizadas serialmente diluídas. Amostras com 50µg.L-1 de

17β-estradiol e: 5 mg.L-1 de O3 e pH 7 (fileiras A e C da placa A). Amostras com 10µg.L-1 de 17β-estradiol e: 10 mg.L-1 de O3 e pH 11 (fileiras E e G da placa A);

Amostras com 50µg.L-1 de 17β-estradiol e: 1 mg.L-1 de O3 e pH 7 (fileiras A e C da placa B); curva padrão do 17β-estradiol (fileiras E e G da placa B); As fileiras B, D, F,

H são os brancos.

(A) (B)

(A) (B)

(A) (B)

195

As Figuras IV.17 a IV.19 apresentam as respostas estrogênicas dos extratos

das amostras aquosas de 17β-estradiol ozonizadas com uma concentração inicial de

10µg.L-1. Pode-se observar visualmente a mudança de cor, demonstrando a presença de

substâncias estrogênicas nas amostras.

Para as diluições seriais dos extratos das amostras aquosas de 17β-estradiol

ozonizadas, a atividade estrogênica foi representada pela curva dose-resposta medida no

ensaio YES, construída pelos valores de Acorrigidos versus fator de diluição. Essas curvas

dose-resposta estão apresentadas na Figura IV.20.

Pelas curvas dose-resposta apresentadas na Figura IV.20 observa-se que os

extratos das amostras ozonizadas em pH 3 são fracamente estrogênicas, e que a remoção

dessa pequena atividade estrogênica residual ocorre com o aumento da dosagem de

ozônio consumido. Já os extratos das amostras ozonizadas em pH 7 e pH 11 foram

fortemente estrogênicos no ensaio YES. Em pH 7, a atividade estrogênica só é

consideravelmente reduzida com a maior dosagem de ozônio consumido (10 mg.L-1). O

que já não ocorre com as amostras ozonizadas em pH 11, onde a atividade estrogênica

não é reduzida com o aumento da dosagem de ozônio consumido. Assim, observou-se

que o potencial estrogênico diminuiu com a redução do pH de reação.

Uma comparação qualitativa da curva dose-resposta do controle positivo do

ensaio YES (17β-estradiol) e dos extratos das amostras aquosas de 17β-estradiol

ozonizadas estão apresentadas na Figura IV.21. Cabe ressaltar que as abscissas da curva

dose-resposta do 17β-estradiol e dos extratos das amostras são diferentes, a primeira

apresenta a concentração do composto e o segundo o fator de diluição dos extratos das

amostras diluídas serialmente.

Da Figura IV.21 observa-se que os extratos das amostras ozonizadas em pH 7

e pH 11 quase atingem o máximo da absorbância alcançada pelo 17β-estradiol no

controle positivo do ensaio YES, demonstrando, que são fortemente estrogênicas.

A Figura IV.22 apresenta a curva dose-resposta e a comparação com o

controle positivo dos extratos das amostras ozonizadas com a concentração inicial de

50µg.L-1 de 17β-estradiol em pH 7.

196

1E-3 0,01 0,1 10,8

1,0

1,2

1,4

1,6

1,8

2,0

2,2

2,4

2,6

2,8

3,0C17β-estradiol inicial= 10µg.L-1 e pH 3

A corri

gido

Fator de Diluição

1,0 mg.L-1 de O3

5,0 mg.L-1 de O3

10 mg.L-1 de O3

1E-3 0,01 0,1 10,8

1,0

1,2

1,4

1,6

1,8

2,0

2,2

2,4

2,6

2,8


A corr

igid

o

Fator de Diluição

1,0 mg.L-1 de O3

5,0 mg.L-1 de O3

10 mg.L-1 de O3

1E-3 0,01 0,1 1 100,8

1,0

1,2

1,4

1,6

1,8

2,0

2,2

2,4

2,6

2,8

3,0


A corri

gido

Fator de Diluição

1,0 mg.L-1 de O3

5,0 mg.L-1 de O3

10 mg.L-1 de O3

Figura IV.20. Curva dose-resposta dos extratos das amostras aquosas de 10µg.L-1 de

17β-estradiol ozonizadas em diferentes valores de pH.

197

1E-7 1E-6 1E-5 1E-4 1E-3 0,01 0,1 1

1,0

1,5

2,0

2,5

3,0


Fator de diluição

A cor

rigid

o

Concentração (g.L-1)

17β-estradiol 1,0 mg.L-1 de O3

5,0 mg.L-1 de O3

10 mg.L-1 de O3

1E-7 1E-6 1E-5 1E-4 1E-3 0,01 0,1 10,5

1,0

1,5

2,0

2,5

3,0


Fator de diluição

A corr

igid

o


17β-estradiol 1,0 mg.L-1 de O3

5,0 mg.L-1 de O3

10 mg.L-1 de O3

1E-7 1E-6 1E-5 1E-4 1E-3 0,01 0,1 10,5

1,0

1,5

2,0

2,5

3,0


Fator de diluição

A corr

igid

o


17β-estradiol 1,0 mg.L-1 de O

3

5,0 mg.L-1 de O3

10 mg.L-1 de O3

Figura IV.21. Comparação das curvas dose- respostas do 17β-estradiol e dos extratos

das amostras aquosas de 17β-estradiol ozonizadas.

198

1E-3 0,01 0,1 1

1,0

1,5

2,0

2,5


A corri

gida

Fator de diluição

1,0 mg.L-1 de O3

5,0 mg.L-1 de O3

10 mg.L-1 de O3

1E-7 1E-6 1E-5 1E-4 1E-3 0,01 0,1 10,5

1,0

1,5

2,0

2,5

3,0


Fator de diluição

A corri

gido


17β-estradiol1,0 mg.L-1 de O3

5,0 mg.L-1 de O3

10 mg.L-1 de O3

(A)

(B)

Figura IV.22. (A) Curva dose-resposta dos extratos das amostras ozonizadas de 50µg.L-1 de 17β-estradiol e pH 7 e (B) comparação das curvas dose- respostas do 17β-

estradiol e dos extratos das amostras aquosas de 17β-estradiol ozonizadas.

Observa-se que com o aumento da concentração inicial de 17β-estradiol na

solução aquosa, ocorre um aumento na atividade estrogênica dos extratos das amostras

ozonizadas. Além disso, não houve uma redução da atividade estrogênica com o

aumento da dosagem de ozônio, como ocorreu nas amostras com concentração inicial

de 10 µg.L-1 em pH 7.

A atividade estrogênica dos extratos das amostras após a ozonização pode ser

expressa como equivalentes de 17β-estradiol em µg.L-1 (EQ-E2). O EQ-E2 faz uma

comparação da potência estrogênica da amostra com a causada pelo 17β-estradiol. Estes

199

resultados estão apresentados na Figura IV.23 e Tabela IV.5. A Figura IV.24 apresenta

uma comparação dos EQ-E2 dos extratos das amostras aquosas de 17β-estradiol

ozonizadas.

0 2 4 6 8 100

2

4

6

8

4900

4920

4940

4960

4980

5000C17β-estradiol inicial= 10µg.L-1

EQ

-E2 (µg

.L-1 )

Dosagem de ozônio consumido (mg.L-1)

pH 3pH 7pH 11

0 2 4 6 8 100

2

4

6

8


EQ

-E2 (µg

.L-1)


pH 7

Figura IV.23. EQ-E2 dos extratos das amostras aquosa de 17β-estradiol ozonizadas

com 10 µg.L-1 e 50 µg.L-1.

200

1 5 100123456789

10111213

EQ

-E2 (µg

.L-1 )


CE2

= 10 µg.L-1, pH 3 C

E2

= 10 µg.L-1,pH 7 CE

2

= 10 µg.L-1,pH 11 CE

2

= 50 µg.L-1,pH 7

Figura IV.24. EQ-E2 dos extratos das amostras aquosas de 17β-estradiol ozonizadas.

Tabela IV.5. Valores de EQ-E2 dos extratos das amostras aquosas de 17β-estradiol ozonizadas.

EQ-E2

(µg.L-1) C17β-estradiol inicial= 10µg.L-1

EQ-E2

(µg.L-1) C17β-estradiol inicial = 50µg.L-1

Dosagem de ozônio consumido

(mg.L-1) pH 3 pH 7 pH 11 pH 7

1,0 0,46 3,33 5,75 9,70 5,0 0,00 3,00 5,50 8,47 10 0,00 0,40 4,49 8,04

Na Figura IV.23 observa-se uma grande remoção do EQ-E2 dos extratos das

amostras aquosas de 17β-estradiol ozonizadas. Contudo, um residual ainda permaneceu

na amostra, além disso, este residual aumenta com o aumento do pH de reação.

A Figura IV.24 mostra que as atividades estrogênicas apresentadas pelos

extratos das amostras de 17β-estradiol aumentam com o aumento do pH de reação. Esse

aumento também é notado quando a concentração inicial de 17β-estradiol é maior.

201

Da Tabela IV.5 observou-se que após a ozonização, ainda permaneceu um

resíduo de EQ-E2 no extrato. Das análises químicas (CG) da solução aquosa de 17β-

estradiol após a ozonização concluiu-se que uma alta remoção do 17β-estradiol foi

alcançada, maior do que 99,1%, porém observou-se algumas vezes um residual de 17β-

estradiol de até 90 ng.L-1 nas amostras ozonizadas em pH 3. Contudo, em pH 11 a

concentração residual de 17β-estradiol foi menor do que 30 ng.L-1 e, mesmo assim, a

atividade estrogênica foi maior. A Figura IV.25 apresenta a quantidade de 17β-estradiol

presente nas mesmas amostras aquosas ozonizadas que foram utilizadas nos ensaios

YES. Como não houve tempo hábil para a construção de uma nova curva de calibração

do 17β-estradiol, os resultados estão apresentados em área do pico e os cromatogramas

do CG, apresentados no Anexo 8.

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 100

10000

20000

30000

40000

50000

60000

70000

80000

90000

Áre

a do

pic

o


pH 3 pH 7 pH 11

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 100

1000

2000

3000

4000

5000

6000

7000

8000

9000

10000

Área

do

Pico


Figura IV.25. Quantidade de 17β-estradiol presente nas amostras aquosas ozonizadas em água ultrapura apirogênica.

Os resultados indicam que em pH 7 e 11 a atividade estrogênica não foi

completamente removida com a significativa diminuição da concentração de 17β-

estradiol, mesmo com um aumento da dosagem de ozônio, provavelmente, há a

formação de subprodutos que podem ter estrogenicidade similar à do 17β-estradiol,

nestes valores de pH, já que este foi rapidamente removido no início da ozonização.

202

É interessante notar que em pH 3 houve maior remoção da estrogenicidade da

amostra. No entanto, em pH 3 a remoção do 17β-estradiol foi mais lenta (Figura IV.25).

No pH 11 houve maior remoção do 17β-estradiol (>99,8%) e no entanto, as amostras

ozonizadas apresentaram maior estrogenicidade. Portanto, provavelmente, os

intermediários formados em pH 7 e 11 apresentam estrogenicidade e os formados em

pH 3 não.

Uma explicação para esse fato pode estar na natureza do oxidante, pois em pH

11 tem-se o radical HO• como oxidante, que é inespecífico. Nesse pH também foi

observado um maior número de subprodutos.

Outra conclusão bastante importante é que as análises químicas sozinhas não

devem ser usadas sozinhas para se avaliar a remoção de micropoluentes de amostras

aquosas ambientais, como os desreguladores endócrinos. Pois, mesmo que esses

tratamentos alcancem altíssimas remoções, podem não ser totalmente eficiente na

remoção dessas substâncias. Assim, ensaios que avaliam os efeitos deletérios dos DE

devem ser usados em conjunto com as análises químicas clássicas na avaliação da

remoção de DE do meio ambiente.

O extrato da amostra original de 17β-estradiol com concentração inicial de

10µg.L-1 em solução aquosa apresentaria uma concentração de 5.000 µg.L-1 de 17β-

estradiol no extrato. Pela curva dose-resposta do 17β-estradiol do ensaio YES sabe-se

que a máxima resposta estrogênica se dá com uma concentração de 54,5 µg.L-1. A

amostra inicial de 17β-estradiol ozonizada tem concentração muito maior do que a da

máxima resposta da curva dose resposta do controle do ensaio YES, sendo assim,

conclui-se que esta amostra original é fortemente estrogênica e que, teria que ser diluída

para poder ser medida neste ensaio.

Outra observação importante nestes ensaios está apresentada na Figura IV.26

que mostra as remoções dos EQ-E2 dos extratos das amostras de 17β-estradiol

ozonizadas.

203

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

99,89

99,90

99,91

99,92

99,93

99,94

99,95

99,96

99,97

99,98

99,99

100,00

99,89

99,90

99,91

99,92

99,93

99,94

99,95

99,96

99,97

99,98

99,99

100,00

Rem

oção

do

EQ

-E2 (

%)


C17β-estradiol = 10 µg.L-1 e pH 3C17β-estradiol = 10 µg.L-1 e pH 7C17β-estradiol = 10 µg.L-1 e pH 11C17β-estradiol = 50 µg.L-1 e pH 7

Figura IV.26. Remoção do EQ-E2 dos extratos das amostras ozonizadas.

Alguns dos extratos das amostras ozonizadas ainda continuam sendo

fortemente estrogênicos, apresentando máxima resposta estrogênica para o ensaio YES,

porém muito menor do que o extrato da amostra inicial de 17β-estradiol (C17β-estradiol

inicial = 10 µg.L-1 em solução aquosa) apresentaria. Da Figura IV.26 observa-se que

uma alta remoção da atividade estrogênica da amostra de 17β-estradiol foi alcançada

com a ozonização, acima de 99,89%. Contudo, algumas amostras ozonizadas ainda

apresentam potencial estrogênico.

Assim, apesar de ser observada alta remoção da atividade estrogênica, maiores

do que 99,89 %, os resíduos de potencial estrogênico presentes no extrato das amostras

aquosas de 17β-estradiol ozonizadas, indica que as amostras ainda continuam sendo

fortemente estrogênicas. O potencial estrogênico das substâncias é observado em

baixíssimas concentrações, sendo assim, um resíduo de substâncias estrogênicas, na

ordem de ng.L-1, faz com que a amostra aquosa ainda continue sendo estrogênica.

As respostas estrogênicas do ensaio YES são produzidas na faixa de µg.L-1. Na

literatura, outros ensaios in vivo demonstram atividade estrogênica em amostras em

concentrações na ordem de ng.L-1, como por exemplo, o ensaio de determinação de

204

VTG em peixes expostos a substâncias estrogênicas, onde os efeitos estrogênicos são

observados na faixa de 1 a 100 ng.L-1 (ROUTLEDGE et al., 1998, THOMPSON et al.,

2000).

Deve-se ressaltar que embora a ozonização tenha sido muito eficiente na

remoção do 17β-estradiol, alcançando remoções maiores do que 99,8%, não foi

totalmente suficiente para concentrações na faixa de ng.L-1 em pH 7 e 11, mesmo

considerando as altas dosagens de ozônio consumido. As concentrações em ng.L-1 são

suficientes para causar efeitos em peixes e em outros organismos, portanto, a remoção

deve ser maior que a obtida nesse trabalho.

Estudos na literatura (ALUM et al., 2004, HUBER et al., 2004, KIM, et al.,

2004) demonstram a redução da atividade estrogênica de estrogênios, tais como o 17β-

estradiol e o 17α-etinilestradiol, com alguns processos oxidativos. HUBER et al. (2004)

observaram uma redução da atividade estrogênica de uma amostra aquosa de 17α-

etinilestradiol em pH 8 pela ozonização. Contudo, neste estudo os autores usaram

espécies capturadoras de radicais HO•, sendo assim, os autores estudaram somente a

oxidação dessa substância via ozônio molecular. No presente estudo, também foi

observada a perda da atividade estrogênica do 17β-estradiol quando a ozonização foi

conduzida em pH 3, no qual a oxidação ocorre mais efetivamente via ozônio molecular.

Porém, em plantas de tratamento de água ou efluentes, provavelmente, a ozonização

será conduzida em pH acima de 3, no qual a ação dos radicais HO• deverá ser

considerada.

ALUM et al. (2004) investigaram a ozonização de três DE, o bisfenol A, o

17β-estradiol e o 17α-etinilestradiol. Os autores observaram que houve rápida

transformação dos compostos após a ozonização, com remoções maiores que 99%.

Contudo, atividade estrogênica residual foi observada no final da ozonização, e

concluíu-se que, provavelmente, os subprodutos formados da oxidação exercem


Os resultados dos estudos de KIM et al. (2004) demonstraram que na

ozonização do 17β-estradiol a atividade estrogênica não diminuiu consideravelmente

com o aumento da dosagem de ozônio, sugerindo que há a formação de subprodutos que

205

podem ter estrogenicidade similar à do 17β-estradiol, já que este foi rapidamente

removido no início da ozonização.

IV.6.4. Atividade Estrogênica de Possíveis Subprodutos Formados na

Ozonização do 17β-Estradiol

A atividade estrogênica de dois possíveis subprodutos formados na ozonização

do 17β-estradiol foi avaliada. A Figura IV.27 apresenta as curvas dose-resposta do 2-

hidroxiestradiol e da testosterona.

O EC50 para o 17β-estradiol, que corresponde à concentração de 17β-estradiol

que elucida 50% da resposta estrogênica, foi determinada a partir da curva dose-

resposta (que foi calculada usando os métodos de regressão não-linear). O EC50 e a

potência estrogênica relativa (PR) do 17β-estradiol e das substâncias químicas estudas

estão apresentadas na Tabela IV.6.

Tabela IV.6. Valores de EC50 e PR para os possíveis subprodutos formados na ozonização do 17β-estradiol

Substância Química EC50 (g.L-1) PR 17β-estradiol 2,13 x 10-6 1 Testosterona - -

2-hidroxiestradiol 2,33 x 10-5 0,1

206

1E-7 1E-6 1E-5 1E-4

1,0

1,5

2,0

2,5

3,0

A corri

gido


17β-estradiol 2-Hidroxiestradiol

1E-6 1E-5 1E-4

1,0

1,5

2,0

2,5

3,0

3,5

A corri

gido


17β-estradiol Testosterona

Figura IV.27. Curva dose-resposta do 17β-estradiol, 2-hidroxiestradiol e testosterona.

Os resultados da Tabela IV.6 indicam que o 2-hidroxiestradiol é 10 vezes

menos potente do que o 17β-estradiol, enquanto que a testosterona não apresentou

estrogenicidade nas condições do ensaio YES.

207

Como observado na identificação dos subprodutos formados na ozonização do

17β-estradiol, diferentes subprodutos foram formados de acordo com o pH de reação.

Provavelmente, esse fato pode explicar a diferença de remoção de atividade estrogênica

das soluções aquosas de 17β-estradiol ozonizadas nos diferentes valores de pH de

reação.

Observou-se que em pH 11, no qual ocorreram as maiores degradações de

17β-estradiol, uma atividade estrogênica residual permaneceu, mesmo com o aumento

da dosagem de ozônio consumido. Já em pH 3 foram observadas as maiores

concentrações residuais de 17β-estradiol, uma baixíssima atividade estrogênica estava

presente na amostra, sendo totalmente reduzida com o aumento da dosagem de ozônio

consumido.

Um dos possíveis subprodutos formados na ozonização do 17β-estradiol em

pH 11 foi o 2-hidroxiestradiol, que também foi observado em pH 7 e como visto nesta

seção, é fortemente estrogênico, sendo somente 10 vezes menos potente do que o 17β-

estradiol. Contudo, este subproduto não foi observado em pH 3.

A testosterona foi observada como possível subproduto formado na

ozonização do 17β-estradiol nos valores de pH 3 e 7, porém, não foram detectados no

pH 11. Além disso, a testosterona não apresentou estrogenicidade nas condições do

ensaio YES, contudo, esta substância pode apresenta outro efeito biológico diferente da


IV.7. TOXICIDADE CRÔNICA DO 17β-ESTRADIOL

Para avaliar a toxicidade do 17β-estradiol utilizou-se um teste de toxicidade

crônica a Ceriodaphia dubia. Este teste foi escolhido por ter a possibilidade de

investigar os efeitos potenciais do 17β-estradiol tanto nos indivíduos adultos, como em

sua reprodução.

208

A literatura comenta que há poucas informações sobre a toxicidade dessas

substâncias e que essas informações são importantes para se determinar o potencial

tóxico dessas substâncias no meio ambiente (FERNANDEZ et al., 2002).

A avaliação da toxicidade crônica do 17β-estradiol foi realizada nas

concentrações de 20 ng.L-1 a 100 µg.L-1. Os resultados deste ensaio demonstraram que

não foram observados efeitos tóxicos nas condições dos testes.

Com isso, pode-se concluir que os testes de toxicidade, que junto com as

análises químicas clássicas, estão sendo bastante usados para se avaliar os efeitos de um

determinado efluente ou substância química no meio ambiente, são ineficientes para

predizer os efeitos causados no meio ambiente por essa nova classe de micropoluentes,

os desreguladores endócrinos. Assim, os ensaios de atividade estrogênica, são os mais

indicados para avaliar os efeitos em potencial do DE. Por isso, suas metodologias

deverão ser completamente dominadas e implantadas como testes necessários para

avaliar os efeitos de efluentes descartados.

209

V. CONCLUSÕES

A ozonização foi muito eficiente para a remoção do 17β-estradiol em solução

aquosa. Com baixas dosagens de ozônio (1,0 mg.L-1 - dosagens normalmente utilizadas

em plantas de tratamento de água) foi alcançada remoção maior que 99%. O 17β-

estradiol foi rápido e quase completamente oxidado nos diferentes valores de pH

investigado (3, 7 e 11).

Contudo, o comportamento oxidativo do 17β-estradiol frente à oxidação

modificou-se em relação à concentração desse estrogênio na água e ao pH de reação.

Para remoções de maiores concentrações de 17β-estradiol, não foram observadas

alterações significativas com a mudança do pH de reação. Porém, para pequenas

concentrações de 17β-estradiol (< 0,1 µg.L-1) a oxidação tornou-se mais lenta. E

observou-se que a concentração residual diminuiu com o aumento do pH, ou seja, em

pH 11 a oxidação foi mais rápida e mais eficiente para baixas concentrações.

A ozonização do 17β-estradiol em pH 3 foi mais lenta e menos eficiente,

alcançando menores remoções (99,1%), do que nos outros dois valores de pH

investigados. Em pH 11 a oxidação foi mais rápida atingindo-se menores concentrações

residuais de 17β-estradiol.

Os experimentos realizados no efluente de ETE indicaram que o 17β-estradiol

é mais lentamente oxidado em uma matriz mais complexa, onde estão presentes outras

substâncias orgânicas oxidáveis pelo ozônio. Pois, uma concentração residual (cerca de

0,2 µg.L-1) maior do que em solução aquosa, permaneceu mesmo com uma maior

dosagem de ozônio. Assim, maiores doses de ozônio devem ser aplicadas em matrizes

aquáticas complexas, como é o caso do efluente de ETE. É de extrema importância que

os efluentes de ETE descartem mínimas concentrações desse e de outros DE, para que

seus efeitos potenciais não causem impacto nos animais que vivem nos corpos

receptores e que por outro lado, não influenciem negativamente qualidade das águas

captadas para abastecimento humano.

Apesar de ser observado que vários subprodutos foram formados na

ozonização do 17β-estradiol, poucos puderam ser identificados ou confirmados.

Contudo, o que se observou é que este ainda é um tópico difícil de ser elucidado.

210

Observou-se que diferentes subprodutos são formados em diferentes valores de pH de

reação, o que provavelmente se deve ao fato de que diferentes caminhos de reação

ocorrem em função do pH de ozonização, que conduz a atuação de diferentes oxidantes.

Os subprodutos propostos de serem formados na ozonização do 17β-estradiol em pH 11

foram o DEO e o 2-hidroxiestradiol, que não foram observados em pH 3. Somente a

testosterona foi formada em pH 3, já em pH 7 foram observados os três subprodutos de

oxidação.

Nos três valores de pH investigados, a ozonização alcançou altas remoções,

maiores do que 99,1%. Contudo, nos pH 7 e 11 as dosagens de ozônio aplicadas não

foram suficientes para remover o potencial estrogênico do 17β-estradiol, embora nesses

dois valores de pH a concentração residual de 17β-estradiol tenha sido menor do que em

pH 3. Provavelmente, os subprodutos formados nos pH 7 e 11 apresentam atividade

estrogênica, visto que diferentes subprodutos foram formados nos diferentes valores de

pH de ozonização. A ozonização em pH 11 resultou em maior estrogenicidade do que

em pH 7, possivelmente, a oxidação via radical HO• gere mais subprodutos com

atividade estrogênica, já que acima do pH 10, o ozônio é instantaneamente decomposto

em radicais HO•. Uma análise qualitativa dos cromatogramas também sugere a

formação de um maior número de subprodutos em pH 11. Provavelmente, a formação

do subproduto 2-hidroxiestradiol em pH 7 e 11 está associada a estrogenicidade residual

das amostras ozonizadas nesses pH.

Assim, conclui-se que embora a ozonização tenha sido muito eficiente na

remoção do 17β-estradiol, alcançando remoções maiores do que 99,8%, não foi

suficiente para remover a atividade estrogênica do 17β-estradiol nos valores de pH 7 e

11, mesmo considerando as altas doses de ozônio aplicadas. Sabe-se que em

concentrações de ng.L-1 desse DE são suficientes para causar efeitos em peixes e em

outros organismos, portanto, a remoção deve ser maior que a obtida nesse trabalho. A

ozonização do 17β-estradiol só foi eficiente na remoção de sua atividade estrogênica

para a ozonização em pH 3.

Por fim, este estudo confirma que para avaliar as remoções dos DE nos

tratamentos empregados, as análises químicas devem ser usadas em conjunto com

ensaios in vitro ou/e in vivo que determinem os efeitos potencias dessas substâncias.

Pois, mesmo que esses tratamentos alcancem altíssimas remoções, podem não ser

211

totalmente eficiente na remoção desses micropoluentes nas baixíssimas concentrações

que são encontradas no meio ambiente e nos quais seus efeitos são observados.

212

VI – REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

ACSH, 1999 “Endocrine Disrupters: A Scientific Perspective” American Council on Science and Health, pp. 1-36.

ABNT (Associação Brasileira de Normas Técnicas). 1995. Água – Avaliação de toxicidade crônica utilizando Ceriodaphia dúbia Richard, 1984 (Cladocera, Crustácea). ABNT NBR 13373. Rio de Janeiro. 14p

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ANEXO 1

Sumário das Concentrações Médias ou Faixas de Concentrações de Desreguladores Endócrinos Detectados no Meio Ambiente

Substância Classe da Substância Concentrações no ambiente Condições Referência

Antraceno HAP 0,07 µg.L-1 Água natural/EUA KOLPIN et al., 2002 0,005-0,05 µg.L-1 Efluente de ETE/Alemanha

0,0005-0,014 µg.L-1 Água superficial/Alemanha 0,0005-0,002 µg.L-1 Água potável/Alemanha

KUCH e BALLSCHMITER,

2001 0,14 µg.L-1 Água natural/EUA KOLPIN et al., 2002

0,0005 – 0,41µg.L-1 Água superficial/Alemanha 0,018 - 0,702µg.L-1 Efluente de ETE/Alemanha 0,01 – 0,19 mg kg-1 Sedimento marinho/Alemanha

0,004 – 1,363 mg.kg-1peso seco Lodo biológico de ETE/Alemanha

FROMME et al., 2002

0,33-0,34 µg.L-1 Afluente de ETE/Itália 0,013-0,036 µg.L-1 Efluente de ETE/Itália 0,015-0,029 µg.L-1 Água Superficial/Itália

LAGANÀ et al., 2004

0,3-5,6 µg.L-1 Água superficial/Portugal AZEVEDO et al., 2001 7-58µg.g-1 Recipiente de PC para alimentos

Bisfenol A Bisfenol

0,0001-0,0047 µg.L-1 Água armazenada em recipientes de PC

BILES et al., 1997

Dietilftalato Ftalato 0,2 µg.L-1 Água natural/EUA KOLPIN et al., 2002 0,33 – 97,8 µg.L-1 Água superficial/Alemanha 1,74 – 182 µg.L-1 Efluente de ETE/Alemanha 0,21 – 8,44 µg.L-1 Sedimento marinho/Alemanha

Di-(2-etil-exil) ftalato (DEHP) Ftalato

27,9 - 154 mg.kg-1 peso seco Lodo biológico de ETE/Alemanha

FROMME et al., 2002

239

239


0,12 – 8,80 µg.L-1 Água superficial/Alemanha 0,2 – 10,4 µg.L-1 Efluente de ETE/Alemanha 0,06 – 2,08 µg.L-1 Sedimento marinho/Alemanha

Di-n-butil ftalato (DBP) Ftalato

0,06 -2,08 mg.kg-1 Lodo biológico de ETE/Alemanha

FROMME et al., 2002

0,005 µg.L-1 Esgoto doméstico/Brasil 0,001 µg.L-1 Efluente de ETE/Alemanha 0,009 µg.L-1 Efluente de ETE/Canadá

TERNES et al., 1999a

0,073 µg.L-1 Água natural/EUA KOLPIN et al., 2002 < 0,2 – 7,6 ng.L-1 Efluente de ETE/Países Baixos <0,1 – 4,3 ng.L-1 Água Superficial/Países Baixos BELFROID et al., 1999

< 0,5 – 10 ng.L-1 Esgoto doméstico/Itália e Holanda < 0,2 – 2,2 ng.L-1 Efluente de ETE/Itália e Holanda JOHNSON et al., 2000

0,2 – 7,0 ng.L-1 Efluente de ETE/Inglaterra DESBROW et al., 1998 0,005-0,007 µg.L-1 Afluente de ETE/França 0,003-0,0045 µg.L-1 Efluente de ETE/França 0,001-0,003 µg.L-1 Água superficial/França

CARGOUËT et al., 2004

0,3 – 1,7 ng.L-1 Efluente de ETE/Itália BARONTI et al., 2000 4,5 ng.L-1 Esgoto doméstico/Suécia 2 ng.L-1 Efluente de ETE/Suécia

LARSSON et al., 1999

2-17 ng.L-1 Lodo ativado de ETE/Alemanha 0,9 ng.g-1 Sedimento marinho/Alemanha TERNES et al., 2002

0,25 – 0,52 ng.L-1 Água superficial/EUA 0,24 – 0,76 ng.L-1 Efluente de ETE/EUA

SNYDER et al., 1999

0,1 – 8,9 ng.L-1 Efluente de ETE/Alemanha 0,1 – 5,1 ng.L-1 Água biológico/Alemanha

17α-Etinilestradiol Estrogênio

Sintético

0,00015-0,0005 µg.L-1 Água potável/Alemanha


2001

240

240


15 ng.L-1 Esgoto doméstico/Alemanha 6 ng.L-1 Efluente de ETE/Canadá 21 ng.L-1 Esgoto doméstico/Brasil


9 - 6 ng.L-1 Água natural/EUA KOLPIN et al., 2002 2-12 µg/mulher/dia Naturalmente excretado na urina

< 0,6 – 12 ng.L-1 Efluente de ETE/Países Baixos < 0,3 – 5,5 ng.L-1 Água Superficial/Países Baixos

BELFROID et al., 1999

<0,5 – 20 ng.L-1 Esgoto doméstico/Itália e Holanda <0,5 – 7 ng.L-1 Efluente de ETE/Itália e Holanda

JOHNSON et al., 2000

11 - 17 ng.L-1 Afluente de ETE/França 5 - 9 ng.L-1 Efluente de ETE/França 1 - 3 ng.L-1 Água superficial/França


2,7 – 48 ng.L-1 Efluente de ETE/Inglaterra DESBROW et al., 1998 0,5-7,0 ng.L-1 Água superficial/Inglaterra 1,6-7,4 ng.L-1 Efluente de ETE/Inglaterra

XIAO et al., 2001

1,1 ng.L-1 Esgoto doméstico/Suécia 0,5 ng.L-1 Efluente de ETE/Suécia

LARSSON et al., 1999

5-49 ng.L-1 Lodo biológico de ETE/Alemanha 1,5 ng.g-1 Sedimento marinho/Alemanha TERNES et al., 2002

0,27 – 2,67 ng.L-1 Água Superficial/EUA 0,48 – 3,66 ng.L-1 Efluente de ETE/EUA

SNYDER et al., 1999

10 - 31 ng.L-1 Afluente de ETE/Itália 3 - 8 ng.L-1 Efluente de ETE/Itália

17β-Estradiol Estrogênio Natural

0,002-0,006 µg.L-1 Água Superficial/Itália LAGANÀ et al., 2004

241

241


0,15-5,2 ng.L-1 Efluente de ETE/Alemanha 0,15-3,6 ng.L-1 Água superficial/Alemanha 17β-Estradiol Estrogênio

Natural 0,0002-0,002 µg.L-1 Água potável/Alemanha


2001 0,02 a 0,05 µg.L-1 Água superficial/Brasil STUMPF et al., 1999

0,04 µg.L-1 Esgoto doméstico/Brasil 0,027 µg.L-1 Esgoto doméstico/Alemanha 0,003 µg.L-1 Efluente de ETE no Canadá 0,009 µg.L-1 Efluente de ETE/Alemanha

0,7 – 1,6 ng.L-1 Água superficial/Alemanha


0,001-0,018 µg.L-1 Afluente de ETE/França 0,004-0,007 µg.L-1 Efluente de ETE/França 0,001-0,003 µg.L-1 Água superficial/França


0,027 µg.L-1 Água natural/EUA KOLPIN et al., 2002 < 0,4 – 47 ng.L-1 Efluente de ETE/Países Baixos < 0,1 – 3,4 ng.L-1 Água Superficial/Países Baixos


<0,5 – 75 ng.L-1 Esgoto doméstico/Itália / Holanda <0,5 – 54 ng.L-1 Efluente de ETE/Itália e Holanda

JOHNSON et al., 2000

1,4 – 76 ng.L-1 Efluente de ETE/Inglaterra DESBROW et al., 1998 20 – 132 ng.L-1 Esgoto doméstico/Itália 2,5 – 82,1 ng.L-1 Efluente de ETE/Itália

BARONTI et al., 2000

6,4 – 29 ng.L-1 Efluente de ETE/Inglaterra 0,2 – 17 ng.L-1 Água natural/Inglaterra

XIAO et al., 2001

5,8 ng.L-1 Esgoto doméstico/Suécia 0,5 ng.L-1 Efluente de ETE/Suécia LARSSON et al., 1999

Estrona Estrogênio Natural

16-37 ng.g-1 anha TERNES et al., 2002 Lodo biológico de ETE/Alem

242

242


2 ng.g-1 Sedimento marinho/Alemanha TERNES et al., 2002 0,015-0,060 µg.L-1 Afluente de ETE/Itália 0,005-0,030 µg.L-1 Efluente de ETE/Itália 0,005-0,012 µg.L-1 Água Superficial/Itália


0,35 – 18 ng.L-1 Efluente de ETE/Alemanha 0,1 – 4,1 ng.L-1 Água superficial/Alemanha

Estrona Estrogênio Natural

0,0002-0,0006 µg.L-1 Água potável/Alemanha


2001 0,019 µg.L-1 Água natural/EUA KOLPIN et al., 2002

2 – 120 ng.L-1 Efluente de ETE/Países Baixos < 0,5 – 28 ng.L-1 Água Superficial/Países Baixos


24 – 188 ng.L-1 Esgoto doméstico/Itália 0,43 – 18 ng.L-1

243

Efluente de ETE/Itália BARONTI et al., 2000

2 – 4 ng.L-1 Água superficial/Inglaterra 1,2 – 3,1 ng.L-1 Água natural/Inglaterra

XIAO et al., 2001

0,023-0,048 µg.L-1 Afluente de ETE/Itália 0,001 µg.L-1 Efluente de ETE/Itália

0,002-0,005 µg.L-1 Água Superficial/Itália LAGANÀ et al., 2004

0,01-0,015 µg.L-1 Afluente de ETE/França 0,005-0,007 µg.L-1 Efluente de ETE/França

Estriol Estrogênio Natural

0,001-0,003 µg.L-1 Água superficial/França


0,2-0,4 µg.L-1 Afluente de ETE/Itália 0,015-0,083 µg.L-1 Efluente de ETE/Itália Genisteína Fitoestrogênio 0,004-0,007 µg.L-1 Água Superficial/Itália


243

Substância Condições Classe da Substância Concentrações no ambiente Referência

0,16-1,19 µg.L-1 Água Superficial/EUA 0,17 – 37,0 µg.L-1 Efluente de ETE/EUA

SNYDER et al., 1999

0,8 µg.L-1 Água natural/EUA KOLPIN et al., 2002 0,258-0,77 µg.L-1 Efluente de ETE/Alemanha 0,007-0,134 µg.L-1 Água superficial/Alemanha 0,003-0,016 µg.L-1 Água potável/Alemanha


2001 4,2-8,8 µg.L-1 Afluente de ETE/Itália 1,12-2,2 µg.L-1 Efluente de ETE/Itália 1,3-1,5 µg.L-1 Água Superficial/Itália


0,2-4,0 µg.L-1 Água superficial/Portugal AZEVEDO et al., 2001 40-343 µg.L-1 Afluente de ETE/Espanha 6-289 µg.L-1 Efluente de ETE/Espanha

Nonilfenol (NP)

Produto de degradação do

nonilfenol etoxilado

(Alquilfenol etoxilado)

18-644 µg.L-1 Águas Superficiais/Espanha SOLÉ et al., 2000

3,2 – 17,8 µg.L-1

244

Água Superficial/EUA 4,9 – 332,0 µg.L-1 Efluente de ETE/EUA

SNYDER et al., 1999

24-938 µg.L-1 Afluente de ETE/Espanha 10 µg.L-1 Efluente de ETE/Espanha

Nonilfenol polietoxilado

(NPE)

Alquilfenol polietoxilado

20-100 µg.L-1 Águas Superficiais/Espanha SOLÉ et al., 2000

Octilfenol (OP)


octilfenol etoxilado

(Alquilfenol etoxilato

0,005 – 0,08 µg.L-1 Água Superficial/EUA SNYDER et al., 1999

244


0,016 – 0,7 µg.L-1 Efluente de ETE/EUA 0,2 µg.L-1 Água natural/EUA

KOLPIN et al., 2002

0,002-0,073 µg.L-1 Efluente de ETE/Alemanha 0,0008-0,054 µg.L-1 Água superficial/Alemanha

Octilfenol (OP)


octilfenol etoxilado

(Alquilfenol etoxilato 0,0002-0,005 µg.L-1 Água potável/Alemanha


2001

Fenantreno HAP 0,04 µg.L-1 Água natural/EUA KOLPIN et al., 2002

245

245

ANEXO 2

Sumário das Concentrações Médias ou Faixas Concentrações de Fármacos Detectados no Meio Ambiente

Substâncias Classe das Substâncias Concentrações no ambiente Condições Referência

Ácido Acetilsalicílico Analgésico 0,22 µg.L-1 Efluente de ETE/Alemanha TERNES, 1998 0,36 µg.L-1 Efluente de ETE/Alemanha 0,066 µg.L-1 Água superficial/Alemanha

TERNES, 1998

1,0 µg.L-1 Esgoto doméstico/Brasil 0,02 a 0,03 µg.L-1 Água superficial/Brasil

STUMPF et al.,1999

0,049 µg.L-1 Água superficial/Canadá WINKLER et al., 2001 0,01 – 18 ng.L-1 Água superficial/Mar do Norte WEIGEL et al., 2002 19,3-43,5 ng.L-1 Água superficial/Áustria AHRER et al., 2001

1-9 ng.L-1 Água superficial/ Suíça BUSER et al, 1998a 0,46µg.L-1 Efluente de ETE/Suécia

0,23-0,68µg.L-1 Efluente de ETE/Itália ANDREOZZI et al., 2003c

0,41-5,77 ng.L-1

246

Águas naturais/Itália CALAMARI et al., 2003 60 ng.L-1 Efluente de ETE/Suíça

Ácido Clofíbrico Maior metabólico do de 3 agentes reguladores de

lipídeos

5 – 25 ng.L-1 Água superficial/ Suíça MOL et al., 2000

0,38 µg.L-1 Efluente de ETE/Alemanha Ácido Fenofíbrico

Maior metabólico do de 3 agentes reguladores de

lipídeos 0,45 µg.L-1 Água superficial/Alemanha TERNES, 1998

Betaxolol β-bloqueador 0,057 µg.L-1 Efluente de ETE/Alemanha TERNES, 1998 Bisoprolol β-bloqueador 0,057 µg.L-1 Efluente de ETE/Alemanha TERNES, 1998

246


1,2 µg.L-1 Esgoto doméstico/Brasil 1,0 µg.L-1 Efluente de ETE/Brasil

STUMPF et al., 1999

0,025 µg.L-1 Água superficial/Brasil STUMPF et al., 1999 2,2 µg.L-1 Efluente de ETE/Alemanha 0,35 µg.L-1 Água superficial/Alemanha

TERNES, 1998

0,91µg.L-1 Efluente de ETE/Itália 1,07µg.L-1 Efluente de ETE/França

ANDREOZZI et al., 2003b

0,79-57,15 ng.L-1 Águas naturais/Itália CALAMARI et al., 2003

ezafibrato Agente regulador de lipídeo

4,8-20,4 ng.L-1 Água superficial/Áustria AHRER et al., 2001 0,98-1,2µg.L-1 Efluente de ETE/França

0,87µg.L-1 Efluente de ETE/Suécia 0,3-0,5µg.L-1 Efluente de ETE/Itália

1,03µg.L-1 Efluente de ETE/Grécia


2,1 µg.L-1 Efluente de ETE/Alemanha 0,25 µg.L-1 Água superficial/Alemanha

TERNES, 1998

0,03-0,25 µg.L-1 Água superficial/ Suíça

Antiepiléptico

Carbamazepina

0,1-0,8 µg.L-1 Efluente de ETE/ Suíça MOL et al., 2000

0,20 µg.L-1 Efluente de ETE/Alemanha TERNES, 1998 1,62µg.L-1 Efluente de ETE/França ANDREOZZI et al., 2003b Cetoprofeno Antiinflamatório

0,02-0,3 µg.L-1 Água superficial/Espanha FARRÉ et al., 2001 Cetoprofeno Antiinflamatório 0,02-0,87 µg.L-1 Efluente de ETE/Espanha FARRÉ et al., 2001

247

247


0,02 µg.L-1 Água natural/EUA KOLPIN et al., 2002 45 - 450 ng.L-1 Efluente de ETE/ Suíça GOLET et al., 2001

0,03µg.L-1 Efluente de ETE/Suécia 0,04-0,07µg.L-1 Efluente de ETE/Itália

0,07µg.L-1 Efluente de ETE/Grécia 0,06µg.L-1 Efluente de ETE/França


5 - 18 ng.L-1 Água superficial/Suíça 313 - 568 ng.L-1 Esgoto doméstico/ Suíça

Ciprofloxacina Antibiótico

62 – 106 ng.L-1 Efluente de ETE/ Suíça GOLET et al., 2002

0,42 µg.L-1 Água natural/EUA KOLPIN et al., 2002 Clorotetraciclina Antibiótico 0,15 µg.L-1 Água superficial/EUA LINDSEY et al., 2001

0,13-2,13 ng.L-1 Águas naturais/Itália CALAMARI et al., 2003 0,033 µg.L-1 Efluente de ETE/Alemanha

Diazepan Medicamento Psiquiátrico

0,053 µg.L-1 Água superficial/Alemanha TERNES et al., 2001a

Dimetilaminofenazona Analgésico 0,4 µg.L-1 Água de subsolo/Alemanha REDDERSEN et al., 2002 0,02 a 0,06 µg.L-1 Água superficial/Brasil STUMPF et al., 1999

0,81 µg.L-1 Efluente de ETE/Alemanha 0,15 µg.L-1 Água superficial/Alemanha

TERNES, 1998

200-370 ng.L-1 Efluente de ETE/ Suíça <1-12ng.L-1 Água superficial/ Suíça

BUSER et al., 1998b

6,2 ng.L-1 Água superficial/Mar do Norte WEIGEL et al., 2002 28,3-392,1 ng.L-1 Água superficial/Áustria AHRER et al., 2001 0,47-5,45µg.L-1 Efluente de ETE/Itália


Diclofenaco Antiinflamatório

0,25-0,41µg.L-1 Efluente de ETE/França ANDREOZZI et al., 2003b

248

248


60-381 ng.L-1 Efluente de ETE/Espanha 31-610 ng.L-1 Água superficial/Espanha

FARRÉ et al., 2001

10-150 ng.L-1 Água superficial/ Suíça Diclofenaco Antiinflamatório

0,1-0,7 µg.L-1 Efluente de ETE/ Suíça MOL et al., 2000

1,40-15,90 ng.L-1 Águas naturais/Itália CALAMARI et al., 2003 0,1 µg.L-1 Água natural/EUA KOLPIN et al., 2002 0,15 µg.L-1 Água superficial/Alemanha Eritromicina Antibiótico

2,5 µg.L-1 Efluente de ETE/Alemanha HIRSCH et al., 1999

0,37µg.L-1 Efluente de ETE/Itália ANDREOZZI et al., 2003b 25 ng.L-1 Água de subsolo/Alemanha SACHER et al., 2001

Fenazona Analgésico

3 µg.L-1 Água de subsolo/Alemanha REDDERSEN et al., 2002 0,95 µg.L-1 Esgoto doméstico/Brasil 0,27 µg.L-1 Efluente de ETE/Alemanha Indometacina Antiinflamatório 0,17 µg.L-1 Águas superficial/Alemanha

TERNES, 1998

4,3 µg.L-1 Esgoto doméstico/Alemanha TERNES e HIRSCH, 2000 0,66 – 4,7 µg.L-1 Efluente de ETE/Alemanha Iopamidol Meio de contraste de

Raios-X 0,49 µg.L-1 Água superficial/Alemanha

TERNES e HIRSCH, 2000

7,5 µg.L-1 Esgoto doméstico/Alemanha 0,75 – 8,1 µg.L-1 Efluente de ETE/Alemanha

0,10 µg.L-1 Água superficial/Alemanha TERNES e HIRSCH, 2000

Iopromida Meio de contraste de Raios-X

1,6 µg.L-1 Água superficial/Alemanha PUTSCHEW et al., 2001 1,6 µg.L-1 Esgoto doméstico/Alemanha

0,37 – 1,3 µg.L-1 Efluente de ETE/Alemanha Iomeprol Meio de contraste de Raios-X

0,10 µg.L-1 Água superficial/Alemanha TERNES e HIRSCH, 2000

249

249


0,01 µg.L-1 Águas superficiais/Brasil STUMPF et al., 1999 0,07 µg.L-1 Águas superficiais/Alemanha 0,37 µg.L-1 Efluente de ETE/Alemanha

TERNES, 1998

1-3,3 µg.L-1 Esgoto doméstico/ Suíça 2-81 ng.L-1 Efluente de ETE/ Suíça

1,5-7,8 ng.L-1 Água superficial/ Suíça BUSER et al., 1999

0,087 µg.L-1 Água superficial/Canadá WINKLER et al., 2001 0,87-1,5 µg.L-1 Efluente de ETE/Espanha 0,12-2,7µg.L-1 Água superficial/ Espanha

FARRÉ et al., 2001

5-80 ng.L-1 Água superficial/Suíça 0,005-1,5 µg.L-1 Efluente de ETE/ Suíça

MOL et al., 2000

0,02-1,82µg.L-1 Efluente de ETE/França 0,05 µg.L-1 Efluente de ETE/Grécia

0,02-0,18 µg.L-1 Efluente de ETE/Itália 7,11 µg.L-1 Efluente de ETE/Suécia


2,81-5,77 µg.L-1 Esgoto doméstico/Espanha 2,1-0,91 µg.L-1 Efluente de ETE/Espanha

FARRÉ et al., 2001

Ibuprofeno Antiinflamatório

4,46-78,50 ng.L-1 Águas naturais/Itália CALAMARI et al., 2003 Lincomicina Antibiótico 0,06 µg.L-1 Água natural/EUA KOLPIN et al., 2002

0,12 µg.L-1 Água natural/EUA KOLPIN et al., 2002 48 - 367 ng.L-1 Efluente de ETE/ Suíça GOLET et al., 2001

0,05-0,08 µg.L-1 Efluente de ETE/França 0,06-0,07 µg.L-1 Efluente de ETE/Itália

0,03 µg.L-1 Efluente de ETE/Suécia

Norfloxacina Antibiótico



250

250


5 – 18 ng.L-1 Água superficial/Suíça 255 – 553 ng.L-1 Esgoto doméstico/Suíça Norfloxacina Antibiótico 36 – 76 ng.L-1 Efluente de ETE/Suíça

GOLET et al., 2002

0,19-19,20 ng.L-1 Águas naturais/Itália CALAMARI et al., 2003 0,34 µg.L-1 Água natural/EUA KOLPIN et al., 2002 Oxitetraciclina Antibiótico

0,07-1,34 µg.L-1 Água superficial/EUA LINDSEY et al., 2001 Penicilina Antibiótico 1,8 a 5,9 ng.L-1 Água superficial/Alemanha MULROY, 2001

0,01-0,04µg.L-1 Efluente de ETE/França 0,01µg.L-1 Efluente de ETE/Suécia

0,01-0,09µg.L-1 Efluente de ETE/Itália 0,01µg.L-1 Efluente de ETE/Grécia


0,17 µg.L-1 Efluente de ETE/Alemanha

Propanolol β-bloqueador

0,012 µg.L-1 Água superficial/Alemanha TERNES, 1998

0,12 µg.L-1 Esgoto doméstico/Alemanha 0,095 – 0,18 µg.L-1 Efluente de ETE/Alemanha


0,043 µg.L-1 Água Superficial/Alemanha TERNES et al., 2001a Propifenazona Analgésico

1 µg/L Água de subsolo/Alemanha REDDERSEN et al., 2002 0,68 – 1,0 µg.L-1 Efluente de ETE/Alemanha

0,56 µg.L-1 Água superficial/Alemanha HIRSCH et al., 1999 Roxitrocina Antibiótico

0,05 µg.L-1 Água natural/EUA KOLPIN et al. (2002) 0,4 µg.L-1 Efluente de ETE/Alemanha 0,03 µg.L-1 Água superficial/Alemanha

HIRSCH et al., 1999

0,07-0,09 µg.L-1 Efluente de ETE/França 0,02 µg.L-1 Efluente de ETE/Suécia

Sulfametoxazol Antibiótico

0,09 µg.L-1 Efluente de ETE/Grécia ANDREOZZI et al., 2003b

251

251

Substâncias Concentrações no ambiente Classe das Substâncias Condições Referência

0,006 - 0,15 µg.L-1 Água natural/EUA KOLPIN et al., 2002 30-85 ng.L-1 Água superficial/Alemanha

0,3-1,5 µg.L-1 Efluente de ETE/Alemanha HARTIG, et al., 1999

410 ng.L-1 Água de subsolo/Alemanha SACHER et al., 2001 0,22 µg.L-1 Água subsolo/EUA

Sulfametoxazol Antibiótico

1,02µg.L-1 Água superficial/EUA LINDSEY et al., 2001

Testosterona Hormônio masculino 0,116 µg.L-1 Água natural/EUA KOLPIN et al., 2002 1,2 a 4,2 µg.L-1 Água superficial/Alemanha MULROY, 2001

0,11 µg.L-1 Água natural/EUA KOLPIN et al., 2002

Tetraciclina Antibiótico 0,11 µg.L-1 Água superficial/EUA LINDSEY et al., 2001

0,013 – 0,15 µg.L-1 Água natural/EUA KOLPIN et al., 2002 0,02-0,04µg.L-1 Efluente de ETE/França

0,08µg.L-1 Efluente de ETE/Grécia 0,05µg.L-1 Efluente de ETE/Suécia

0,03-0,13µg.L-1 Efluente de ETE/Itália


0,32 – 0,66 µg.L-1 Efluente de ETE/Alemanha 2,5 µg.L-1 Efluente de ETE/Alemanha

Trimetoprim Antibiótico

0,15 µg.L-1 Água superficial/Alemanha HIRSCH et al., 1999

0,29-2,77 ng.L-1 Águas naturais/Itália CALAMARI et al., 2003 Tilosina Antibiótico 0,04 µg.L-1 Água natural/EUA KOLPIN et al., 2002

Vancomicina Antibiótico 0,7 a 3,8 µg.L-1 Água superficial/Alemanha MULROY, 2001

252

252

ANEXO 3

Sumário de Condições de Tratamentos e Resultados Descritos na Literatura

Referência Substância Condições da amostra Tratamento Condições de tratamento Resultados

COLEMAN et al., 2000 Fotocatálise

Lâmpada de 150 W C0

a = 0,05 - 3µMol.dm-3

Em 40 minutos de tratamento, 50% do 17 β-estradiol foi degradado. Enquanto uma degradação de 98 % foi alcançada em 3,5 h de tratamento

17 β-estradiol Água destilada Filme de TiO2 de 1,5mg.cm-2

O3/H2O2

pH 7,8 Razão H2O2/O3 = 3,7g.g-1

CH2O2b= 8,8 mg.L-1

Sob condições de reais tratamento, a atrazina e os fenilureaherbicidas foram degradados cerca de 80% da antrazina e >99%

IJEPELAR et al., 2000

Águas naturais Reativo de

Fenton (Fe2+/H2O2)

Remoções de 75% de atrazina e 94% de fenilureaherbicidas foram alcançadas

Pesticidas (atrazina e

fenilureaherbicidas)

pH = 5,5 CH2O2

b= 10 mg.L-1

CFe2+c = 5,1 mg.L-1

Ozonização O3

d

Tre = 10 min. C0

a = 2µg/L, Água destilada

C = 1,0 mg/L Apenas 8% do ácido clofíbrico, 12% de ibuprofeno foram degradados , no caso do diclofenaco a degradação alcançou 96,8%

CO3d = 1,0 mg/L

Tre = 10 min C0

a = 2µg/L, Água destilada

Foram degradados 50% do ácido clofíbrico e do ibuprofeno enquanto que o diclofenaco foi totalmente degradado.

CO3d = 1,0 mg/L

Tre = 10 min. C0

a = 2µg/L, Água natural.

Cerca de 10% de ácido clofíbrico 30 % de ibuprofeno foram degradados e o diclofenaco foi quase completamente degradado.

CO3d = 3,7 mg/L

Tre = 10 min. C0

a = 2µg/L, Água natural

Foram degradados 90 % do ácido clofíbrico e do ibuprofeno, o diclofenaco foi totalmente degradado.

ZWIENER e FRIMMEL,

2000

Ácido clofíbrico,

ibuprofeno e diclorofenaco

Água destilada e

águas naturais

O3/H2O2Razão molar

(O3/H2O2) = 2:1

CO3d = 5,0 mg/L

Tre = 10 min C0

a = 2µg/L, Água natural

Foram degradados 97,9% do ácido clofíbrico, 99,4% do ibuprofeno e o diclorofenaco foi totalmente degradado.

253

253

Referência Substâncias Condições da amostra Tratamento Condições de tratamento Resultados

OHKO et al., 2001 Bisfenol A Água bi-

destilada Fotocatálise

C0a = 175 µM

LâmpTiO2 em suspensão

If = 10 mW.cm-2

ada de Hg-Xe de 200W

O Bisfenol A foi totalmente mineralizado em 20 h de tratamento. A atividade estrogênica foi reduzida para > 10% da atividade inicial do bisfenol A após 6 h de tratamento

Razão O3/CBZ = 10 C0

a = 0,8 mg.L-1

CO3d = 1,0 mg.L-1

Tre = 10 min.

ANDREOZZI, et al., 2002 Carbamazepina

(CBZ)

Água destilada e

águas naturais

Ozonização

Razão O3/CBZ = 10 C0

a = 118 mg.L-1

Tre =10 - 60 min.

O resultado indicou que uma completa remoção da carbamazepina pode ser facilmente alcançada na água potável, devido ao fato de que as concentrações desse fármaco encontradas em águas potáveis estão abaixo das empregadas nos testes. Um baixo grau de mineralização foi alcançado após 60 minutos do tratamento

Coagulação /Floculação

C0a = 50µg.L-1

pH = 6,8 0 – 107 mg/L de Al2(SO4)3 0 – 169 mg/L de Fe2(SO4)3

Teste de Jarro

O processo de coagulação/floculação com sais de alumínio e ferro não foram eficientes na remoção dos antibióticos investigados.

ADAMS et al., 2002

Antibióticos (carbadox,

sulfaclorpiridazina,

sulfadimetoxina, sulfamerazina, sulfametazina,

sulfatiazol, trimetoprim)

Água deionizada e

águas naturais

Cloração Ccloro livreg = 1,0±0,2 mg.L-1 como Cl2

Teste de Jarro

Os t0,5p foram na faixa de 0,6 a 3,6 min.

Os t0,9r ficaram na faixa de 3, 40,5 min.

Observou-se a formação de subprodutos clorados.

C0a = 50µg.L-1

pH = 7,5 Solução de hipoclorito

254

254


Troca Iônica Resinas: SACh e SBAi

Taxa = 1,2 mL.min-1

pH ≈ 7

A troca iônica não foi viável para a remoção desses antibióticos

Adsorção em CAP

As remoções de cada antibiótico foram na faixa de 57 a 97% e 81 a 98% para dosagens de CAP de 10 mg.L-1 e 20 mg.L-1 respectivamente. A adsorção em CAP foi viável no tratamento desses antibióticos

CCAPj = 0 - 50 mg.L-1

Tempo de mistura: 4 h

Osmose Reversa

Membrana de acetato celulose

Taxa = 1,9L.min-1

A osmose reversa é um método viável na remoção de fármacos de água potável.

Ozonização CO3d = 0,3 mg.L-1L

Tre =0 - 1,5min.

Na água natural: Rápidas remoções foram alcançadas, maiores de 95% para cada antibiótico. Na água deionizada as reações foram mais rápidas. A ozonização foi eficiente na oxidação desses antibióticos, concentrações de ozônio empregadas em plantas de tratamento de água potável

ADAMS et al., 2002

Antibióticos (carbadox,

sulfaclorpiridazina,

sulfadimetoxina, sulfamerazina, sulfametazina,

sulfatiazol, trimetoprim)

Água deionizada e

águas naturais

UV

Lâmpada de baixa pressão (254nm) Tk=20 °C

pH 7,5 = 30 mTre in.

O tratamento com UV, com dosagens típicas (30mJ.cm-2) usadas na desinfecção em plantas de tratamento de água, não foi eficiente na remoção desses antibióticos. Com dosagens de 3.000 mJ.cm-2 as remoções, de cada antibiótico, foram entre 50 e 80 %.

255

255

Referência Substâncias Condições da Amostra Tratamento Condições de Tratamento Resultados

UV Lâmpada de mercúrio de

baixa pressão C0

a = 1mg.L-1

As remoções completas do MMTD e MMTD-Me foram alcançadas em 60 e 45 minutos respectivamente, porém não foram obtidas mineralizações completa dessas substâncias

BOZZI et al., 2002

Intermediários farmacêuticos: MMTD-Mel e

MMTDm

Água deionizada e

águas naturais

H2O2/UV

Lâmpada de mercúrio de baixa pressão C0

a = 1mg/L; Razão H2O2/MMTD-Me =

100/1 Razão H2O2/MMTD = 100/1

Foram necessários 10 e 20 minutos para a remoções do MMTD e MMTD-Me respectivamente.

A completa mineralização dos compostos foi alcançada com 4 h de tratamento

NAKASHIMA et al., 2002 17 β-estradiol e

Bisfenol A Água


Lâmpada de luz negra (15W)TiO2 imobilizado em PTFE

C0a = 90µg.L-1

Reciclo Razão entra a área aparente

do TiO2 e o volume da solução teste = 1,0 cm2.mL-1

Degradações de 98% foram alcançadas em 1 h de tratamento

OHKO et al., 2002 17 β-estradiol Água


Lâmpada de UV (200 W) TiO2 em suspensão

0

CTiO2n = 1g.L-1

C a = 1µM

Mais do que 99% do 17β-estradiol foi degradado após 30 minutos. Em 3 h de tratamento o 17β-estradiol foi completamente mineralizado. Foram gerados intermediários sem atividade estrogênica

TERNES et al., 2002

carbamazepina, benzafibrato, diclofenaco e

ácido clofíbrico

Água deionizada e

águas naturais

Floculação

Teste de Jarro A floculação com FeCl3 foi ineficiente na

remoção desses fármacos FeCl3

C0a = 1µg.L-1

pH = 7,5

256

256


Carvão ativado pulverizado C0

a = 100 µg.L-1

Tre = 24 h

A adsorção em carvão ativado não foi eficiente na remoção desses fármacos

Adsorção em carvão ativado

Planta piloto operada em 9 meses CAG

C0a = 0,04 - 1,8 µg.L-1

Tre = 14 dias

A filtração em CAGe, foi um processo eficiente na remoção desses fármacos, pois mesmo em altas concentrações foram quase que completamente removidos.

TERNES et al., 2002

Carbamazepina, benzafibrato, diclofenaco e

ácido clofíbrico

Água deionizada e

águas naturais

Ozonização C0

a = 1µg/L

A ozonização foi muito eficiente na oxidação da carbamazepina e do diclofenaco. Com uma dosagem de 0,5 mg.L-1 foram removidos > 97%. No caso do bezafibrato o ozônio alcançou remoções de 50% com 1,0 – 1,5 mg.L-1 de O3, enquanto que se aplicando 3,0 mg.L-1 de O3 foram obtidas 90% de remoção. Em relação ao ácido clofíbrico, a ozonização apresentou uma limitada eficiência de remoção. Somente 10-15% do ácido clofíbrico foi removido com uma dosagem de 0,5 mg.L-1, mesmo com uma dosagem maior (2,5 - 3,0 mg.L-1) uma baixa remoção (40%) foi alcançada.

CO3d = 0,5 – 3,0 mg.L-1

Tre = 20 min

257

257


Ozonização pH = 2,0 e 7,0

C0a = 5,0 x 10-3 mol.dm-3

Tk = 25°C

A ozonização foi capaz de remover totalmente o paracetamol, com um baixo grau de mineralização (30%) em um longo tempo de tratamento. O paracetamol foi removido com uma razão de consumo de ozônio de 1,7 a pH 2,0 e de 2,2 a pH = 7,0. Foram identificados como subprodutos, ácidos oxálico, glioxálico e fórmico, hidroquinonas e ácido cetomalônico.

ANDREOZZI et al., 2003a

Paracetamol Água

destilada e bi-destilada

H2O2/UV Lâmp (254 nm)

O processo de H2O2/UV removeu completamente o paracetamol, com mineralização de 21% e 40% em concentrações de H2O2 de 5,0 x 10-3 e 2,0 x 10-

2mol.dm-3 respectivamente. Intermediários identificados: hidroquinona, 2 hidroxi-4-N-acetil-aminofenol e ácidos dicarboxílicos

pH = 2,0 e 7,0 ada de baixa pressão

CH2O2b= 5,0 x 10-3 e = 2,0 x

10-2mol.dm-3

ANDREOZZI et al., 2003c

Ácido clofíbrico

Água destilada Ozonização

Tre = 60 min. pH=5

C0a = 1,5x10-3 a 2,0 x 10-5 M

CO3d no líquido = 1,0 x 10-5

M

A completa remoção do ácido clofíbrico foi alcançada em 20 min de ozonização com uma mineralização de 34%.

Uma mineralização de 49% foi alcançada em 60 min de ozonização.

O conteúdo inicial de cloreto do ácido clofíbrico foi transformado em íons cloreto, indicando que não foram formados intermediários clorados perigosos

258

258


ANDREOZZI et al., 2003c

Ácido clofíbrico

Água destilada

H2O2/UV

CH2O2b= 1,0 M

Tre in C0

a =1,0x10-3 M

Lâmpada de baixa pressão (254 nm)

pH=5 = 60 m

A quase completa remoção desse metabólito foi alcançada com 60 min de tratamento, porém uma baixa mineralização foi alcançada

HUBER et al., 2003

Bezafibrato, carbamazepina,

diazepan, diclofenaco,

17α-etinilestradiol,

ibuprofeno, iopromida,

sulfametoxazol e roxitromicina

Águas naturais Ozonização

C0a µM

CO3d = 0,1; 0,2; 0,5; 1,0 e 2,0

mg.L-1

=0,5 Parâmetros das águas

naturais: pH 7,2 a 7,9; DQO = 0,8 a 3,7 mg.L-1;

alcalinidade = 0,7 a 5,8 mM HCO3

-

A ozonização foi um processo muito eficiente na remoção desses fármacos em concentrações na ordem de ng.L-1. Em diferentes amostras de águas naturais, dosagens de 0,2 a 0,5mg.L-1 de ozônio foram suficientes para remover mais de 97% de quase todos esses fármacos, com exceção do benzafibrato.

TERNES et al., 2003

Antibióticos, β-bloqueadores, metabólito de reguladores de

lipídeos, antinflamatório, antiepiléptico,

meios de contrastes de

raio-X e estrogênios (estrona)

Efluente de ETE Ozonização

CO3d = 5, 10, 15 mg.L-1

Parâmetros do efluente de ETE: pH 7,2; COD = 23

mg.L-1; DQO = 30 mg.L-1; SST = 4,5 mg.L-1

Para uma dosagem de 5 a 15mg.L-1 de ozônio (tempo de contato de 18 min), a estrona e quase todos os fármacos foram totalmente removidos, somente os meios de contraste de Raio-X foram ainda detectados no efluente. Esses fármacos foram removidos numa faixa de 13 a 89% com dosagens de ozônio de 10 e 15 mg.L-1

259

259


NAKASHIMA et al., 2003

Estrona e 17β-estradiol

Água e efluente de

ETE Fotocatálise

Lâmpada de luz negra (15W)TiO2 imobilizado em PTFE

Reciclo C0

a = 250µg.L-1

If = 1,2mW.cm-2

O 17β-estradiol e estrona em solução aquosa foram rapidamente degradados. Em efluente de ETE, a estrona foi aproximadamente 90% degradada. Com uma modificação no processo de fotocatálise, os autores esperam tratar efluentes de ETE eficientemente com uma relativa baixa energia e em menor tempo

SUZUKI et al.,

2003

Mistura de 17β-estradiol e 17α-etinilestradiol

Água destilada

Enzimas lignolíticas do

fungo White hotC0

a =1,0x10-7 M

A atividade estrogênica de uma mistura desses estrogênios foi reduzida em 80% depois de 1 h de tratamento e a completa remoção foi alcançada após 8 h de tratamento.

Ozonização

C0a = 10 nM

Tk = 20°C Tempo de contato = 1-120

min CO3

d = 1,5 mg.L-1

O ozônio oxidou rapidamente o bisfenol A, 17β-estradiol e 17α-etinilestradiol em condições usadas no tratamento de água potável. A atividade estrogênica dos três DE diminuiu, porém uma estrogenicidade residual permaneceu devido aos subprodutos de oxidação.

ALUM et al., 2004

Bisfenol A, 17β-estradiol e


Água destilada

Cloração pH = 7,5,

0

Tk = 20°C

CCl (NaOCl) = 1,0 mg.L-1

C a = 10 nM,

Tempo de contato = 1-24h

Exceto o bisfenol A, o cloro foi capaz de oxidar esses DE. A oxidação do bisfenol A, abaixo do limite de detecção, só foi atingida após 4h de cloração. A cloração também resultou em um aumento da atividade estrogênica do bisfenol A e 17α-etinilestradiol em até 4h de tratamento. No caso do 17β-estradiol, baixos níveis de atividade estrogênica foram alcançados.

260

260


COLEMAN et al., 2004

17β-estradiol, estrona e 17α-etinilestradiol

Água bi-destilada

Fotocatálise e fotólise

TiO2 imobilizado Lâmpada de 152 W (alta

pressão de mercúrio) C0

a =10µg.L-1 Fotólise = Lâmpada de UVA

Uma rápida remoção da atividade estrogênica dos três estrogênios foram alcançadas com a fotocatálise. Com 10 min de tratamento, 50% da atividade estrogênica foi removida. Remoções de 100% foram alcançadas com 1 h de fotocatálise. A fotólise levou um tempo maior para remover a mesma atividade estrogênica.

Bioreatores com MnO2

Área superficial do MnO2 = 7,32 m2.g-1

C0a =5000 a 20.000 ng.L-1

TRHo = 1,08 h

Foi alcançada uma remoção de 81,7% da atividade estrogênica do 17α-etinilestradiol. Ambas as adsorção e degradação do 17α-etinilestradiol ocorrem no reator de MnO2

Filtração em CAG

Tamanho do grão = 0,5-2,05mm

±Densidade = 480 50 kg.m-3

C0a =5000 a 20.000 ng.L-1

TRHo = 1,20 h

A remoção da atividade estrogênica do 17α-etinilestradiol nesse processo foi de 99,8%.

RUDDER et al., 2004


Água destilada

Área superficial = 2 m2.g-1

C0a =5000 a 20.000 ng.L-1

TRHo = 1,12 h

A remoção da atividade estrogênica do 17α-etinilestradiol pelo processo de filtração em areia foi de 17,3%.

Filtração em areia

VOGNA et al., 2004a Carbamazepina Água

destilada H2O2/UV

CH2O2b= 5,0 mM

Lâmpada de baixa pressão (254 nm)

Tre in C0

a =2,0x10-2 mM

A carbamazepina foi rápida e totalmente degradada em 4 min de tratamento, como uma remoção de 35% de COT.

pH=5 = 4 m

Intermediários formados na oxidação da carbamazepina são substâncias mais tóxicas e perigosas do que o fármaco original.

261

261


Ozonização

pH = 5,0; 5,5; 6,0 e 7,0 Radical capturador= álcool

tert-butil C0

a =1,0x10-4 M CO3

d no líquido =1,0 x 10-4M

VOGNA et al., 2004b

Diclofenaco Água destilada

H2O2/UV

Lâmpada de UV = 17W, baixa pressão (254nm), com

I0p = 2,7 x 10-6E.s-1

CH2O2b= 0,1 ou 1,0 M pH = 7,0

C0a =2,0x10-2 mM

Ambos os processos foram eficientes na degradação do diclofenaco com uma completa conversão de cloro em íon cloreto e mineralização de 32% para ozonização e 39% para o H2O2/UV. Porém, no caso do H2O2/O3 com somente 52% de conversão do cloro em íons cloreto.

KIM et al., 2004

Ozonização

C0a = 5,2 µM

Tf = 20°C Tempo de contato = 30 min

Experim e sem ácido fúlvico

A ozonização removeu 99% do 17β-estradiol, com uma dose de ozônio de 5 mg de O3.L-1 após 15 min de tratamento. Com uma dose de ozônio de 15 mg.L-1 foi necessária 4 min de tratamento para alcançar a mesma remoção de 17β-estradiol. Quando o 17β-estradiol foi ozonizado sozinho, a atividade estrogênica não diminuiu consideravelmente com o aumento da dosagem de ozônio, sugerindo que há a formação de subprodutos que podem ter estrogenicidade similar ao 17β-estradiol, já que este foi rapidamente removido no início da ozonização. Na presença de ácidos fúlvicos, não foi observado a formação de subprodutos com estrogenicidade, pois a atividade estrogênica diminuiu com o aumento da dosagem de ozônio.

17β-estradiol Água destilada CO3

d = 5,0 - 15 mg.L-1

pH = 6,0 entos com

262

262


COLEMAN et al., 2005

Fotocatálise e fotólise

TiO2 imobilizado Lâmpada de 250 W que

emite na região UVB e UVCpH = 3,5 – 4,0

C0a =3µM

17β-estradiol, 17α-

etinilestradiol e estriol

Água destilada e ultra pura

A fotocatálise e a fotólise foram muito eficiente para a degradação desses estrogênios.

Entretanto, a fotocatálise foi mais efetiva do que a fotólise.

aConcentração inicial da substância investigada (fármaco ou DE); bConcentração inicial do H2O2; cConcentração inicial de Fe2+; dConcentração inicial de ozônio; eTempo de reação; fIntensidade de irradiação; gConcentração de cloro livre; hCátion de ácido forte; iÂnion de base forte; jConcentração inicial de carvão ativado em pó. kTemperatura; l5-metil 1,3,4-thiadiazole-2-thiol; m5-metil 1,3,4-thiadiazole-2-metilthiol;

o

pPoder de irradiação; qTempos para remoção de 50 % do fármaco; rTempos para remoção de 90 % do fármaco;

263

263

nConcentração inicial de TiOTempo de retenção hidráulica;

2;

ANEXO 4

Cromatogramas das Amostras Submetidas à Espectrometria de Massas

1. Amostras aquosas de 17β-estradiol (C17β-estradiol inicial = 50 µg.L-1) ozonizadas

com uma dosagem de ozônio consumido de 1,0 mg.L-1 e pH: (A) pH 3, (B) pH 7, (C)

pH 11.

4.00 6.00 8.00 10.00 12.00 14.00 16.00 18.00 20.000

1000000

2000000

3000000

4000000

5000000

6000000

7000000

Time-->

AbundanceTIC: AN7759.D

4.00 6.00 8.00 10.00 12.00 14.00 16.00 18.00 20.000

1000000

2000000

3000000

4000000

5000000

6000000

7000000

8000000

Time-->


4.00 6.00 8.00 10.00 12.00 14.00 16.00 18.00 20.000

500000

1000000

1500000

2000000

2500000

3000000

3500000

4000000

4500000

5000000

Time-->


(A)

(B)

(C)

264



pH 11.

4.00 6.00 8.00 10.00 12.00 14.00 16.00 18.00 20.000

1000000

2000000

3000000

4000000

5000000

6000000

7000000

8000000

Time-->


4.00 6.00 8.00 10.00 12.00 14.00 16.00 18.00 20.000

500000

1000000

1500000

2000000

2500000

3000000

3500000

4000000

4500000

5000000

5500000

6000000

Time-->


4.00 6.00 8.00 10.00 12.00 14.00 16.00 18.00 20.000

500000

1000000

1500000

2000000

2500000

3000000

3500000

4000000

4500000

5000000

5500000

Time-->


(B)

(C)

(A)

265


com uma dosagem de ozônio consumido de 10 mg.L-1 e pH: (A) pH 3, (B) pH 7, (C) pH

11.

4.00 6.00 8.00 10.00 12.00 14.00 16.00 18.00 20.000

1000000

2000000

3000000

4000000

5000000

6000000

7000000

8000000

9000000

Time-->


4.00 6.00 8.00 10.00 12.00 14.00 16.00 18.00 20.000

500000

1000000

1500000

2000000

2500000

3000000

3500000

4000000

Time-->


4.00 6.00 8.00 10.00 12.00 14.00 16.00 18.00 20.000

500000

1000000

1500000

2000000

2500000

3000000

3500000

4000000

4500000

5000000

Time-->


(B)

(C)

(A)

266

4. Amostras aquosas de 17β-estradiol (C17β-estradiol inicial = 1,0 mg.L-1) ozonizadas


pH 11.

4.00 6.00 8.00 10.00 12.00 14.00 16.00 18.00 20.00 22.000

1000000

2000000

3000000

4000000

5000000

6000000

7000000

8000000

Time-->


4.00 6.00 8.00 10.00 12.00 14.00 16.00 18.00 20.00 22.000

1000000

2000000

3000000

4000000

5000000

6000000

7000000

8000000

9000000

Time-->


4.00 6.00 8.00 10.00 12.00 14.00 16.00 18.00 20.00 22.000

1000000

2000000

3000000

4000000

5000000

6000000

7000000

8000000

9000000

1e+07

Time-->


(A)

(B)

(C)

267



pH 11.

4.00 6.00 8.00 10.00 12.00 14.00 16.00 18.00 20.00 22.000

1000000

2000000

3000000

4000000

5000000

6000000

7000000

8000000

9000000

Time-->


4.00 6.00 8.00 10.00 12.00 14.00 16.00 18.00 20.00 22.000

1000000

2000000

3000000

4000000

5000000

6000000

7000000

8000000

9000000

Time-->


4.00 6.00 8.00 10.00 12.00 14.00 16.00 18.00 20.00 22.000

1000000

2000000

3000000

4000000

5000000

6000000

7000000

8000000

9000000

Time-->


(A)

(B)

(C)

268


com uma dosagem de ozônio consumido de 10 mg.L-1 e pH: (A) pH 3, (B) pH 7, (C) pH

11.

4.00 6.00 8.00 10.00 12.00 14.00 16.00 18.00 20.00 22.000

10000

20000

30000

40000

50000

60000

70000

80000

90000

100000

110000

120000

Time-->


4.00 6.00 8.00 10.00 12.00 14.00 16.00 18.00 20.00 22.000

1000000

2000000

3000000

4000000

5000000

6000000

7000000

8000000

Time-->


4.00 6.00 8.00 10.00 12.00 14.00 16.00 18.00 20.00 22.000

1000000

2000000

3000000

4000000

5000000

6000000

7000000

8000000

9000000

Time-->


(A)

(B)

(C)

269

ANEXO 5

Alguns Subprodutos Formados na Ozonização do 17β-Estradiol Identificados na Espectrometria de Massa

Nome da Substância Estrutura Química Espectro de Massa (CG/EM) Similaridade

(%)

Testosterona

47,9 %

270

OH

O Component at scan 1283 (19.798 min) Silandrone

40 90 140 190 240 290 340 390 440 490

0

100

100

45

73

91 129

147

195 223 270 360

55

7391

129

147185 226 270 304

360

17βα-Hidroxi-5α-androstana

40 60 80 100 120 140 160 180 200 220 240 260 280 300 320 340 36

0

50

100

50

100

4155

59

73

81 95 109116

129

148

162

175 187 201

217

230

243 258333 348

m / z

A b u n d a n c e

45 55 67

73

79 91105 119

129

146 159 185 197

217

230 243 257 333 348

40 60 80 100 120 140 160 180 200 220 240 260 280 300 320 340 36

0

50

100

50

100

4155

59

73

81 95 109116

129

148

162

175 187 201

217

230

243 258333 348

45 55 67

73

79 91105 119

129

146 159 185 197

217

230 243 257 333 348

40 60 80 100 120 140 160 180 200 220 240 260 280 300 320 340 36

0

50

100

50

100

4155

59

73

81 95 109116

129

148

162

175 187 201

217

230

243 258333 348

m / z

A b u n d a n c e

45 55 67

73

79 91105 119

129

146 159 185 197

217

230 243 257 333 348

OH

16 %

270

Nome da

Substância Estrutura Química Espectro de Massa (CG/EM) Similaridade (%)

2-hidroxiestradiol

93,1

271

HO

OH

HO

Component at scan 1318 (20.244 min) Silane, [[(17á)-estra-1,3,5(10)-triene-2,3,

40 90 140 190 240 290 340 390 440 490

0

100

100

45

73

91 129 179 205229 267293 319 345 373 413504

45

73

91 129 179 205229 267 306 332 373 413

504

55,7

Estra-1,3,5(10)-triene-3,6,17-

triol, (6α,17β)-

OH

OH

HO

Component at scan 1234 (19.182 min) Silane, (estra-1,3,5(10)-trien-3,6à,17á-triy

40 90 140 190 240 290 340 390 440 490

0

100

100

45

73

91 115 147 195 229 283 309 345 414 462 508

45

73

91 129 169

229242 283 309

414

489

Estr-5(10)-em-3-one, 17-hidroxi-,

(17β)- O

OH

Component at scan 934 (15.392 min) [M Estr-5(10)-en-3-one, 17-[(trimethylsilyl)o40 80 120 160 200 240 280 320 360 400

0

100

100

45

73

91129

145 173228 256

290346

73 95

129

147 215

256

290346

40,9

OBS.: Os espectros de massa apresentados são das substâncias derivatizadas com BSTFA

271

ANEXO 6

Espectros de absorbância das amostras aquosas de 17β-estradiol ozonizadas (C17β-

estradiol inicial = 50 µg.L-1), com diferentes dosagem de ozônio consumido e valores

de pH 3, 7 e 11.

200 220 240 260 280 3000,0

0,2

0,4

0,6

0,8

1,0

1,2

Ab

sorb

ânci

a

λ (nm)


0,5 mg.L-1 de O3

1,0 mg.L-1 de O3

5,0 mg.L-1 de O3

10 mg.L-1 de O3

200 220 240 260 280 3000,0

0,2

0,4

0,6

0,8

1,0

1,2

Abso

rbân

cia

λ (nm)

pH 11 50 µg.L-1 de E

2

0,5 mg.L-1 de O3

1,0 mg.L-1 de O3

5,0 mg.L-1 de O3

10 mg.L-1 de O3

272

200 220 240 260 280 3000,0

0,2

0,4

0,6

0,8

1,0

1,2

Abso

rbân

cia

λ (nm)

pH 3 50 µg.L-1 de E

2

1,0 mg.L-1 de O3

10 mg.L-1 de O3

15 mg.L-1 de O3

200 220 240 260 280 3000,0

0,2

0,4

0,6

0,8

1,0

1,2

Abso

rbân

cia

λ (nm)

pH 11 50 µg.L-1 de E2

1,0 mg.L-1 de O3

10 mg.L-1 de O3

15 mg.L-1 de O3

200 220 240 260 280 3000,0

0,2

0,4

0,6

0,8

1,0

1,2

Abso

rbân

cia

λ (nm)


1,0 mg.L-1 de O3

5,0 mg.L-1 de O3

10 mg.L-1 de O3

20 mg.L-1 de O3

35 mg.L-1 de O3

273

200 220 240 260 280 3000,0

0,2

0,4

0,6

0,8

1,0

1,2

Abso

rbân

cia

λ (nm)


1,0 mg.L-1 de O3

5,0 mg.L-1 de O3

10 mg.L-1 de O3

20 mg.L-1 de O3

35 mg.L-1 de O3

200 220 240 260 280 3000,0

0,2

0,4

0,6

0,8

1,0

1,2

Abso

rbân

cia

λ (nm)


20 mg.L-1 de O3

60 mg.L-1 de O3

274

ANEXO 7

Atividade estrogênica das amostras aquosas de 17β-estradiol ozonizadas, usadas sem preparo prévio no ensaio YES

1. Curva dose-resposta do 17β-estradiol para esse ensaio YES

1E-7 1E-6 1E-5 1E-4

0,8

1,0

1,2

1,4

1,6

1,8

A corr

igid

o


17β-estradiol

2. Curva dose-resposta para as amostras aquosas de 17β-estradiol ozonizadas no pH 3

0,01 0,1 10,6

0,8

1,0

1,2

1,4

1,6

1,8C17β-estradiol inicial = 10 µg.L-1 e pH 3

A corr

igid

a

Fator de diluição

1,0 mg.L-1 de O3 5,0 mg.L-1 de O3 10 mg.L-1 de O3

275

3. Absorbância corrigida das amostras aquosas de 17β-estradiol ozonizadas nos valores de pH 7 e 11

0,0 0,5 1,0 1,5 2,00,6

0,8

1,0

1,2

1,4

1,6

1,8

C17β-estradiol inicial = 10 µg.L-1, pH 7 e 11

A corr

igid

o

Fator de Diluição

Amostras com pH 7 Amostras com pH 11

276

Anexo 8

Cromatogramas obtido por CG das amostras aquosas de 17β-estradiol (C17β-estradiol inicial = 10µg.L-1) ozonizadas, preparadas com água ultrapura apirogênica.

1) Condições: pH 3 e dosagem de ozônio consumido de 1,0 mg.L-1


277

3) Condições: pH 3 e dosagem de ozônio consumido de 10 mg.L-1

4) Condições: pH 7e dosagem de ozônio consumido de 1,0 mg.L-1

278


6) Condições: pH 7e dosagem de ozônio consumido de 10 mg.L-1

279



280

9) Condições: pH 11 e dosagem de ozônio consumido de 10 mg.L-1

281

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