抗间日疟原虫抗间日疟原虫 GDHGDH 特异性特异性单抗的大量制备及纯化单抗的大量制备及纯化

主讲人：江云主讲人：江云

背景背景 疟疾是一种由媒介按蚊传播的传染性寄生虫病，疟疾是一种由媒介按蚊传播的传染性寄生虫病，全球广泛流行，我国也深受其害，发病以间日疟全球广泛流行，我国也深受其害，发病以间日疟为主，虽然我国已成功启动了消除疟疾行动计划，为主，虽然我国已成功启动了消除疟疾行动计划，但本世纪前十年曾经出现中部间日疟疫情回升，但本世纪前十年曾经出现中部间日疟疫情回升，表明疟疾控制态势仍然脆弱。间日疟原虫感染病表明疟疾控制态势仍然脆弱。间日疟原虫感染病例血液中的原虫密度通常较低，由于漏诊病例有例血液中的原虫密度通常较低，由于漏诊病例有可能成为当地传播的潜在传染源，因此，及时有可能成为当地传播的潜在传染源，因此，及时有效地发现病例，无论是在疟疾控制阶段，还是疟效地发现病例，无论是在疟疾控制阶段，还是疟疾消除进程中，都具有十分重要的意义。疾消除进程中，都具有十分重要的意义。

显微镜血涂片检查是经典疟疾诊断实验，不但需要器材，显微镜血涂片检查是经典疟疾诊断实验，不但需要器材，操作费时费力，检测结果很大程度上依赖于镜检人员的操作费时费力，检测结果很大程度上依赖于镜检人员的经验和责任心，在疟疾低流行区漏检率高，已不能满足经验和责任心，在疟疾低流行区漏检率高，已不能满足当前疟疾消除的高要求。近年来，基于免疫层析的疟疾当前疟疾消除的高要求。近年来，基于免疫层析的疟疾快速诊断技术（快速诊断技术（ Rapid Diagnostic Tests, RDTsRapid Diagnostic Tests, RDTs ）发）发展较快，因其特异性和敏感性均较高，无需仪器设备，展较快，因其特异性和敏感性均较高，无需仪器设备，操作简单，结果易判读，实施较为方便，非常适合疟疾操作简单，结果易判读，实施较为方便，非常适合疟疾现场应用，然而，迄今为止，仍无适合间日疟诊断的现场应用，然而，迄今为止，仍无适合间日疟诊断的RDTRDT可用，主要原因在于缺少敏感度高，特异性强的可用，主要原因在于缺少敏感度高，特异性强的间日疟原虫靶抗原，由于我国以间日疟流行为主，迫切间日疟原虫靶抗原，由于我国以间日疟流行为主，迫切需要研究开发适合现场应用的间日疟快速诊断技术。需要研究开发适合现场应用的间日疟快速诊断技术。

间日疟原虫（间日疟原虫（ Plasmodium vivaxPlasmodium vivax,, P.v P.v）的体外培养）的体外培养技术尚不成熟，难以提供大量实验材料，从感染者采集技术尚不成熟，难以提供大量实验材料，从感染者采集的血样，其疟原虫密度低，且含有难以去除的宿主白细的血样，其疟原虫密度低，且含有难以去除的宿主白细胞，因此，高纯度的间日疟原虫样本材料来源困难，已胞，因此，高纯度的间日疟原虫样本材料来源困难，已成为探寻间日疟原虫特异性抗原的重要瓶颈之一。通过成为探寻间日疟原虫特异性抗原的重要瓶颈之一。通过基因重组表达制备的蛋白纯度高，抗原性和天然蛋白类基因重组表达制备的蛋白纯度高，抗原性和天然蛋白类似，可成为解决缺少间日疟原虫特异性诊断抗原的新途似，可成为解决缺少间日疟原虫特异性诊断抗原的新途径之一。径之一。

有研究表明，疟原虫谷氨酸脱氢酶有研究表明，疟原虫谷氨酸脱氢酶 GDHGDH具有独特的理具有独特的理化，生物学及酶学特性，而且宿主红细胞内没有此酶，化，生物学及酶学特性，而且宿主红细胞内没有此酶，从而成为指示疟原虫感染的标志物。从而成为指示疟原虫感染的标志物。 GDHGDH是一种普遍是一种普遍存在于生物体内对碳和氮代谢起重要作用的酶，在疟原存在于生物体内对碳和氮代谢起重要作用的酶，在疟原虫整个红细胞内期均能表达，它催化谷氨酸脱氨基生成虫整个红细胞内期均能表达，它催化谷氨酸脱氨基生成酮戊二酸， 同时使辅酶酮戊二酸， 同时使辅酶 II 和和 IIII，由氧化型，由氧化型 NADNAD 和和NADPNADP 转化为还原型转化为还原型 NADHNADH 和和 NADPHNADPH。。

疟原虫疟原虫 GDHGDH 是是 NADPHNADPH生成的主要来源，而且更为重生成的主要来源，而且更为重要的是，宿主红细胞内没有此酶（要的是，宿主红细胞内没有此酶（ GDH-NADPPHGDH-NADPPH）。）。因此该酶有望成为疟疾快速诊断的新型候选分子。因此该酶有望成为疟疾快速诊断的新型候选分子。

实验方法实验方法 1.1.杂交瘤细胞的复苏与培养杂交瘤细胞的复苏与培养 从液氮中取出的细胞冰存管，置于从液氮中取出的细胞冰存管，置于 3737 摄氏度水中融摄氏度水中融

化，至仍有少量冰存在时，吸取细胞加至已装有适量化，至仍有少量冰存在时，吸取细胞加至已装有适量16401640培养基的进口瓶中，放入恒温二氧化碳细胞培养培养基的进口瓶中，放入恒温二氧化碳细胞培养箱内。第三天，选取生长良好的一瓶，将培养液全部倒箱内。第三天，选取生长良好的一瓶，将培养液全部倒出，再加入适量新配制的出，再加入适量新配制的 16401640培养液，继续放入细胞培养液，继续放入细胞培养箱中培养，重复此步，直至镜下观察细胞贴满瓶壁。培养箱中培养，重复此步，直至镜下观察细胞贴满瓶壁。

2.2.抗间日疟原虫抗间日疟原虫 GDHGDH蛋白的杂交瘤细胞蛋白的杂交瘤细胞体内腹水培养体内腹水培养

用注射器吸取用注射器吸取 5ML5ML的吹打混匀的细胞培养悬液，注入的吹打混匀的细胞培养悬液，注入1010天前预先注射过石蜡油的小鼠腹部，正常饲养两周，天前预先注射过石蜡油的小鼠腹部，正常饲养两周，选出腹部明显隆起的小鼠，将其处死固定于超净台上，选出腹部明显隆起的小鼠，将其处死固定于超净台上，小鼠用小鼠用 75%75% 酒精浸泡酒精浸泡 1min1min，用无菌眼科剪小心剪开，用无菌眼科剪小心剪开腹壁皮肤和肌肉，完全暴露腹膜，用装有适量肝素的腹壁皮肤和肌肉，完全暴露腹膜，用装有适量肝素的5ML5ML的一次性注射器将腹水迅速吸至细胞离心管中，的一次性注射器将腹水迅速吸至细胞离心管中，立即摇匀以防凝集。立即摇匀以防凝集。

3. Protein G-3. Protein G- 琼脂糖亲和层析法琼脂糖亲和层析法纯化小鼠单抗纯化小鼠单抗

Protein GProtein G 蛋白蛋白 GG 能够和小鼠能够和小鼠 IgGIgG的各个亚类均能的各个亚类均能发生结合，因而将发生结合，因而将 Protein GProtein G 固定结合于琼脂糖珠固定结合于琼脂糖珠颗粒上，形成固相吸附相，当含单抗的小鼠腹水或颗粒上，形成固相吸附相，当含单抗的小鼠腹水或杂交瘤上清通过含有杂交瘤上清通过含有 Protein G-Protein G- 琼脂糖珠的层析柱，琼脂糖珠的层析柱，单抗被特异性结合到柱子上，经过洗涤去除非特异单抗被特异性结合到柱子上，经过洗涤去除非特异性结合的杂蛋白，再通过洗脱而获得纯化的单抗性结合的杂蛋白，再通过洗脱而获得纯化的单抗IgGIgG蛋白。蛋白。

取小鼠新鲜制备的腹水，经取小鼠新鲜制备的腹水，经 4000rpm4000rpm 离心离心 3030分钟，分钟，以去除脂类等杂质。取透明的腹水液体加入等量的以去除脂类等杂质。取透明的腹水液体加入等量的0.15M 0.15M 的的 PBSPBS 混匀，再加入两倍于腹水体积的饱和硫混匀，再加入两倍于腹水体积的饱和硫酸铵溶液，于酸铵溶液，于 4400CC 的冰箱内放置的冰箱内放置 22 小时，然后经小时，然后经4000rpm4000rpm 离心离心 3030分钟，吸弃上清，将沉淀用分钟，吸弃上清，将沉淀用 PBSPBS 稀稀释为原腹水体积的释为原腹水体积的 33 倍量，按倍量，按 1ml/min1ml/min 缓慢通过层析缓慢通过层析柱（柱床体积为柱（柱床体积为 1ml1ml），然后用），然后用 1010 个柱体积的个柱体积的 PBSPBS通过柱子以充分洗涤去除柱子内残留的杂蛋白。再用通过柱子以充分洗涤去除柱子内残留的杂蛋白。再用1010 倍于床体积的倍于床体积的 0.1M 0.1M 甘氨酸甘氨酸 -HCl-HCl通过层析柱，分通过层析柱，分管收集，每管收集管收集，每管收集 1ml1ml，测定各管的蛋白浓度，合并，测定各管的蛋白浓度，合并蛋白含量高的收集管，经上述的超滤管离心浓缩，经考蛋白含量高的收集管，经上述的超滤管离心浓缩，经考马斯亮蓝马斯亮蓝 G-250G-250 法测定蛋白浓度，于法测定蛋白浓度，于 -20-2000CC 冻存备用。冻存备用。

4.4.纯化的抗间日疟原虫纯化的抗间日疟原虫 GDHGDH单抗的纯度鉴定单抗的纯度鉴定——SDS-PAGESDS-PAGE电泳电泳

11 ．安装夹心式垂直板电泳槽．安装夹心式垂直板电泳槽 22 ．分离胶制备：按表配制．分离胶制备：按表配制 20ml 15%20ml 15%分离胶，混匀分离胶，混匀

后用细长头滴管将凝胶液加至长、短玻璃板间的缝隙内，后用细长头滴管将凝胶液加至长、短玻璃板间的缝隙内，约约 8cm8cm高，用高，用 1ml1ml 注射器取少许蒸馏水，沿长玻璃板注射器取少许蒸馏水，沿长玻璃板板壁缓慢注入，约板壁缓慢注入，约 3—4mm3—4mm高，以进行水封。约高，以进行水封。约30min30min 后，凝胶与水封层间出现折射率不同的界线，后，凝胶与水封层间出现折射率不同的界线，则表示凝胶完全聚合。倾去水封层的蒸馏水，再用滤纸则表示凝胶完全聚合。倾去水封层的蒸馏水，再用滤纸条吸去多余水分。条吸去多余水分。

3.3. 浓缩胶的制备：按表配制浓缩胶的制备：按表配制 10ml 3%10ml 3% 浓缩胶，浓缩胶，混匀后用细长头滴管将浓缩胶加到已聚合的分离混匀后用细长头滴管将浓缩胶加到已聚合的分离胶上方，直至距离短玻璃板上缘约胶上方，直至距离短玻璃板上缘约 0.5cm0.5cm 处，轻处，轻轻将样品槽模板插入浓缩胶内，避免带入气泡。轻将样品槽模板插入浓缩胶内，避免带入气泡。约约 30min30min 后凝胶聚合，再放置后凝胶聚合，再放置 20—30min20—30min。待。待凝胶凝固，小心拔去样品槽模板，用窄条滤纸吸凝胶凝固，小心拔去样品槽模板，用窄条滤纸吸去样品凹槽中多余的水分，将去样品凹槽中多余的水分，将 pH8.3 Tris-pH8.3 Tris- 甘氨甘氨酸缓冲液倒入上、下贮槽中，应没过短板约酸缓冲液倒入上、下贮槽中，应没过短板约0.5cm0.5cm以上，即可准备加样。以上，即可准备加样。

4.4.样品蛋白用样品溶解液溶解，沸水浴加热样品蛋白用样品溶解液溶解，沸水浴加热 55 分钟，分钟，用微量注射器小心将样品通过缓冲液加到凝胶凹形样用微量注射器小心将样品通过缓冲液加到凝胶凹形样品槽底部，开始电泳品槽底部，开始电泳

5. 5. 当蓝色染料迁移至底部时，将电流调回到零，关当蓝色染料迁移至底部时，将电流调回到零，关闭电源。拔掉固定板，取出玻璃板，用刀片轻轻将一闭电源。拔掉固定板，取出玻璃板，用刀片轻轻将一块玻璃撬开移去，在胶板一端切除一角作为标记，将块玻璃撬开移去，在胶板一端切除一角作为标记，将胶板移至大培养皿中染色。胶板移至大培养皿中染色。

66 ．染色及脱色。将染色液倒入培养皿中，染色．染色及脱色。将染色液倒入培养皿中，染色 1h1h左右，用蒸馏水漂洗数次，再用脱色液脱色，直到蛋左右，用蒸馏水漂洗数次，再用脱色液脱色，直到蛋白区带清晰。白区带清晰。

结果结果

培养培养 77 天的细胞，数量较少天的细胞，数量较少

培养培养 1414天的杂交瘤细胞，大量紧贴瓶壁，细胞形天的杂交瘤细胞，大量紧贴瓶壁，细胞形状规则，生长状况良好。状规则，生长状况良好。

图图 3.3. 亲和层析法纯化抗间日疟原虫亲和层析法纯化抗间日疟原虫pvGDHpvGDH 蛋白特异单抗的蛋白特异单抗的 SDS-SDS-PAGEPAGE 电泳电泳

M: M: 标准蛋白标准蛋白marker marker 1-2: 1-2: 抗抗 pvGDHpvGDH 蛋白的单抗（克隆蛋白的单抗（克隆号：号： 4A3F84A3F8 ））

（单抗的重链分子量为（单抗的重链分子量为 50kd50kd ，其，其轻链分子量为轻链分子量为 26kd26kd ））

讨论讨论 在不加任何条件下直接冻存细胞时，细胞内和在不加任何条件下直接冻存细胞时，细胞内和外环境中的水都会形成冰晶，能导致细胞内发外环境中的水都会形成冰晶，能导致细胞内发生机械损伤、电解质升高、渗透压改变、脱水、生机械损伤、电解质升高、渗透压改变、脱水、PHPH改变、蛋白变性等，能引起细胞死亡。如改变、蛋白变性等，能引起细胞死亡。如向培养液加入保护剂，可使冰点降低。在缓慢向培养液加入保护剂，可使冰点降低。在缓慢的冻结条件下，能使细胞内水份在冻结前透出的冻结条件下，能使细胞内水份在冻结前透出细胞。贮存在细胞。贮存在 -130-130℃℃以下的低温中能减少冰以下的低温中能减少冰晶的形成。它们对细胞无毒性，分子量小，溶晶的形成。它们对细胞无毒性，分子量小，溶解度大，易穿透细胞。本实验采用的冻存液为解度大，易穿透细胞。本实验采用的冻存液为甘油。甘油。

冻存细胞比较脆弱，要求轻柔操作。细胞复苏时冻存细胞比较脆弱，要求轻柔操作。细胞复苏时速要快，使之迅速通过细胞最易受损的速要快，使之迅速通过细胞最易受损的 -5-5 ～～ 00℃℃，细胞仍能生长，活力受损不大。由于本实验，细胞仍能生长，活力受损不大。由于本实验采用的杂交瘤细胞对冻存剂采用的杂交瘤细胞对冻存剂 (( 甘油甘油 )) 不敏感，未不敏感，未离心去除冻存培养基，冻存细胞融化后，应当直离心去除冻存培养基，冻存细胞融化后，应当直接加入完全生长培养基中。冻存过程中保护剂的接加入完全生长培养基中。冻存过程中保护剂的选用、细胞密度、降温速度及复苏时温度、融化选用、细胞密度、降温速度及复苏时温度、融化速度等都对细胞活力有影响。本次细胞培养的实速度等都对细胞活力有影响。本次细胞培养的实验结果较为理想，获得了大量的杂交瘤细胞，细验结果较为理想，获得了大量的杂交瘤细胞，细胞复苏后的培养较为关键。胞复苏后的培养较为关键。

寻找一种快速、敏感、特异的疟原虫检测方法是寻找一种快速、敏感、特异的疟原虫检测方法是当今疟疾防治研究工作中迫切需要解决的问题之当今疟疾防治研究工作中迫切需要解决的问题之一。间日疟原虫谷氨酸脱氢酶（一。间日疟原虫谷氨酸脱氢酶（ GDHGDH）是疟原）是疟原虫物质和能量代谢过程中十分重要的功能分子虫物质和能量代谢过程中十分重要的功能分子 ,,在疟原虫整个红内期均能表达在疟原虫整个红内期均能表达 ,, 更为重要的是宿更为重要的是宿主红细胞内没有此酶，应用杂交瘤技术制备了抗主红细胞内没有此酶，应用杂交瘤技术制备了抗GDHGDH单克隆抗体，为疟原虫快速诊断试剂盒的研单克隆抗体，为疟原虫快速诊断试剂盒的研制打下基础。制打下基础。

结论结论应用杂交瘤技术制备并纯化了应用杂交瘤技术制备并纯化了抗抗 GDHGDH 单克隆抗体，为疟原单克隆抗体，为疟原虫快速诊断试剂盒的研制打下虫快速诊断试剂盒的研制打下了基础。了基础。

谢谢谢谢