实验八： GFP在大肠杆菌中的诱导表达和检测

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宋 刚

2188275 gangsongsd@hotmail.com

厦门大学抗癌研究中心

一．实验目的

• 掌握外源基因在原核细胞中表达的特点和方法。

• 复习 SDS-PAGE的制备及其分离原理。

二．原核表达的一般流程二．原核表达的一般流程

获得目的基因 → → 准备表达载体 → → 将目的基因插入表达载体中（测序验证） → → 转化表达宿主菌 → → 诱导靶蛋白的表达 → → 表达蛋白的分析→ →

扩增、纯化、进一步检测

原核表达：将克隆化基因插入合适载体后导入大肠杆菌用于表达大量蛋白质的方法一般称为原核表达。这种方法在蛋白纯化、定位及功能分析等方面都有应用。大肠杆菌用于表达重组蛋白有以下特点：

——易于生长和控制；

——用于细菌培养的材料不及哺乳动物细胞系统的材料昂贵；

——有各种各样的大肠杆菌菌株及与之匹配的具各种特性的质粒可供选择。

——但是，在大肠杆菌中表达的蛋白由于缺少修饰和糖基化、磷酸化等翻译后加工，常形成包涵体而影响表达蛋白的生物学活性及构象。

三．实验原理三．实验原理

表达载体在基因工程中具有十分重要的作用，原核表达载体通常为质粒，典型的表达载体应具有以下几种元件： ——选择标志的编码序列； ——可控转录的启动子； ——转录调控序列 ( 转录终止子，核糖体结合位点 ) ；

——一个多限制酶切位点接头； ——宿主体内自主复制的序列。

原核表达载体：

pET载体系统• 本实验介绍一种常用的表达载体―― pET载体系统。 ——在 pET系列载体中，外源基因的表达受 T7噬菌体 RNA

聚合酶的调控，这类载体是 Studier等于 1990年首先构建的，后来得到很大发展。

——带有 pBR322的大肠菌素 E1 (colEl)复制区。从而赋予宿主菌氨节青霉素或卡那霉素抗性。在这些载体中，编码序列在多克隆位点插入，置于天然 T7 RNA聚合酶启动子(φ10启动子 ) 或所谓的 T7 lac启动子的控制之下，后者是带有 lac操纵子 ( larO)序列的天然 T7 RNA聚合酶启动子的衍生体。 lac阻抑物的结合能阻断转录起始。

将外源基因克隆在含有将外源基因克隆在含有 laclac 启动子的启动子的 pET-30apET-30a 表达载体表达载体（如图（如图 11 ）中，让其在）中，让其在 E.coliE.coli 中表达。先让宿主菌生中表达。先让宿主菌生长，长， lacIlacI 产生的阻遏蛋白与产生的阻遏蛋白与 lacIlacI 操纵基因结合，从而不操纵基因结合，从而不能进行外源基因的转录与表达，此时宿主菌正常生长。然后能进行外源基因的转录与表达，此时宿主菌正常生长。然后向培养基中加入向培养基中加入 laclac 操纵子的诱导物操纵子的诱导物 IPTG(IPTG( 异丙基硫代异丙基硫代 --

β-D-β-D- 半乳糖 半乳糖 )) ，阻遏蛋白不能与操纵基因结合，则，阻遏蛋白不能与操纵基因结合，则 DNADNA

外源基因大量转录并高效表达，表达蛋白可经外源基因大量转录并高效表达，表达蛋白可经 SDS-PAGESDS-PAGE 检检测。 测。

SDS-PAGE分离蛋白原理

• 组成蛋白质的氨基酸在一定 pH的溶液中会发生解离而带电，带电的性质和带电量的多少取决于蛋白质的性质及溶液的 pH值和离子强度。

• 聚丙烯酰胺凝胶在催化剂过硫酸铵（简称 Ap）和加速剂 N,N,N’N’- 四甲基乙二胺（简称 TEMED）的作用下，聚合形成三维的网状结构。蛋白质在凝胶中受电场的作用而发生迁移，不同种蛋白在凝胶的网状结构中迁移的速率不同，其速率取决于蛋白质所带电荷的多少和蛋白质的大小和形状。根据迁移速率的不同，可将不同的蛋白质进行分离。

• SDS-PAGE 是在蛋白质样品中加入 SDS和含有巯基乙醇的样品处理液， SDS是一种很强的阴离子表面活性剂，它可以断开分子内和分子间的氢键，破坏蛋白质分子的二级和三级结构。

• 强还原剂巯基乙醇可以断开二硫键破坏蛋白质的四级结构。使蛋白质分子被解聚成肽链形成单链分子。解聚后的侧链与 SDS充分结合形成带负电荷的蛋白质 -SDS复合物。

• 蛋白质分子结合 SDS阴离子后，所带负电荷的量远远超过了它原有的净电荷，从而消除了不同种蛋白质之间所带净电荷的差异。蛋白质的电泳迁移率主要决定于亚基的相对分子质量。而与其所带电荷的性质无关。

四．实验材料

五．实验步骤

1 ．目的蛋白的表达（ 1 ）含外源基因的表达菌株在 LB 培养基（含

50μg/ml Kana ）中预培养过夜（ 2 ）按 1/50 的比例稀释菌液，于 250r/min ，培养

3 小时 , 使其 OD600 值达到 0.6（ 3 ）加入 IPTG ，使其终浓度为 0.5mmol/L（ 4 ）继续培养 小时（ 5 ）取 1.5ml 菌液于 10000r/min ，离心 2min ，收

获菌体

2 ．目的蛋白的检测（ 1 ）凝胶制备 分离胶和浓缩胶分别按下表中的配方进行制备。先制分离胶，

将分离胶注入玻板后，用去离子水封口，约 30~40min 后凝聚。将胶面的水吸干后灌注浓缩胶，并插入梳子，胶凝固后即可。

（ 2 ）凝胶电泳 取 80 ml 电极缓冲液稀释 5 倍后，分别注入阴极电泳槽和阳极

电泳槽中。然后在加样孔中加入已经处理好的蛋白样品。 80V恒压 20 分钟， 120V 恒压 2 小时

（ 3 ）染色、脱色 电泳完毕，剥胶后，在摇床上染色 0.5~1 小时；之后，在脱色

液中脱色 1 小时，观察目的蛋白表达情况。

五．注意事项

• 1 ．含外源基因的表达菌株应预培养之后再转接至培养瓶中，最好不要将菌种直接接于培养瓶培养，诱导表达。

• 2 ．表达菌生长至 OD600 值 0.6 左右为诱导适合条件，避免菌生长过浓。

• 3 ．配制 SDS 胶时应注意充分混匀后加入玻璃板中，并待其充分凝固后使用。

思考题

1 ．原核表达目的蛋白的基本原理是什么？2 ． SDS-PAGE 电泳的原理是什么？