МИНИСТЕРСТВО СЕЛЬСКОГО ХОЗЯЙСТВА РЕСПУБЛИКИ КАЗАХСТАН

АО «КАЗАГРОИННОВАЦИЯ»

Казахский научно-исследовательский ветеринарный институт

МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ ПО ВЫДЕЛЕНИЮ, КУЛЬТИВИРОВАНИЮ И ПОДДЕРЖАНИЮ ВИРУСОВ ГРИППА А

ПОДТИПОВ H5N3, H7N7 И БОЛЕЗНИ НЬЮКАСЛА

Астана 2011

2

УДК 578.832.1:619 ББК 48.73 М 94

Методические указания по выделению, культивированию и поддержанию вирусов гриппа А подтипов H5N3, H7N7 и болезни Ньюкасла; - Алматы, 2011г. - 31с. Авторы: Мырзахметова Б.Ш., кандидат биологических наук, Кутумбетов Л.Б., доктор ветеринарных наук.

ISBN 978-601-278-319-3

Методические указания предназначены для руководства при

проведении диагностических, научно-исследовательских, производст-венных и музейно-коллекционных работ, а также учебно-познавательных занятий для преподавателей и студентов ветеринарного и вирусологического профилей.

Издано в рамках программы 057 «Информационное обеспечение субъектов агропромышленного комплекса на безвозмездной основе»

Утверждено решением заседания научно-технической комиссии АО «КазАгроИнновация» от 3 декабря 2011 года, № 2

ISBN 978-601-278-319-3

3

СОДЕРЖАНИЕ

ВВЕДЕНИЕ 7 ОБЩАЯ ЧАСТЬ 8 1 ОСНОВНАЯ ЧАСТЬ 9 1.1 Подготовка лабораторной посуды и резиновых изделий 9 1.2 Приготовление солевых растворов, питательных и

защитных сред

10 1.3 Приготовление субстратов репродукции вирусов гриппа

птиц и болезни Ньюкасла

18 1.4 Подбор и подготовка экспериментальной птицы 20 1.5 Выделение, идентификация и культивирование вирусов

гриппа птиц и болезни Ньюкасла

21 1.6 Консервирование и хранение вирусов гриппа птиц и

болезни Ньюкасла

26 1.7 Освежение вирусов гриппа птиц и болезни Ньюкасла 27 1.8 Определение биологической активности вирусов гриппа

птиц и болезни Ньюкасла

28 1.9 Определение патогенности и вирулентности вирусов

гриппа птиц и болезни Ньюкасла

28 1.10 Определение антигенности вирусов гриппа птиц и

болезни Ньюкасла

29 1.11 Определение иммуногенности вирусов гриппа птиц и

болезни Ньюкасла

30 ЗАКЛЮЧЕНИЕ 31 СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННОЙ ЛИТЕРАТУРЫ 32

4

ОБОЗНАЧЕНИЯ И СОКРАЩЕНИЯ

В настоящих методических указаниях использованы следующие обозначения и сокращения:

РКЭ - развивающиеся куриные эмбрионы; ФКЭ - фибробласты куриных эмбрионов; РН - реакция нейтрализации; АП - аллантоисная полость; АЖ - аллантоисная жидкость; ХАО - хорион-аллантоисная оболочка; ИД50 – 50%-ая инфицирующая доза; ЭИД50 - 50%-ая эмбриональная инфицирующая доза; ТЦД50 - 50%-ая тканевая цитопатическая доза; СПФ свободные от патогенной микрофлоры; КРС - крупный рогатый скот; Игла - питательная среда для выращивания культур клеток,

изготовленная по рецептуре Eagle.

5

ОПРЕДЕЛЕНИЯ

В настоящих методических указаниях применены следующие термины с соответствующими определениями:

КУЛЬТУРА КЛЕТОК – клетки, способные в искусственных условиях in

vitro находиться в функционально активном состоянии. ВИРУСЫ – автономные генетические структуры, способные

функционировать и репродуцироваться в восприимчивых к ним клетках животных, растений, простейших, грибов, бактерий.

СЫВОРОТКА СПЕЦИФИЧЕСКАЯ – сыворотка крови животных, полученная после иммунизации определенным видом микроорганизма (вируса) и содержащая антитела специфические микроорганизму который использован для иммунизации.

ОСВЕЖЕНИЕ – возвращение исходных биологических свойств микроорганизма путем репродукции или культивирования в чувствительных биологических моделях (субстратах) после консервирования.

РЕПРОДУКЦИЯ – продуктивный тип взаимодействия вируса с клеткой.

ПАССАЖ – культивирование вируса в культуре ткани, курином эмбрионе или в организме восприимчивых животных путем последовательного переноса вируссодержащего материала из одной популяции в другую.

СУБСТРАТ – см. Биологическая модель. БИОЛОГИЧЕСКАЯ МОДЕЛЬ – культура клеток, развивающийся

эмбрион животных или птицы, животное и птица, чувствительные или восприимчивые к испытуемому возбудителю болезни (вирусу), которые применяются для репродукции и размножения микроорганизмов.

ВЫДЕЛЕНИЕ ВИРУСА– изоляция из источника возбудителя болезни. ИДЕНТИФИКАЦИЯ – определение родовой, видовой и типовой

принадлежности вирусов, установление их сходства или различия при сравнении с уже известными вирусами.

КУЛЬТИВИРОВАНИЕ – размножение клеток вне организма. КОНСЕРВИРОВАНИЕ – временное приостановление

репродуктивности вирусов, размножения микроорганизмов, в том числе культур клеток, с сохранением их репродуктивности и жизнеспособности.

ПОДДЕРЖАНИЕ – сохранение репродуктивных свойств вирусов или жизнеспособности культур клеток или других микроорганизмов в биологически активном состоянии.

СТАБИЛИЗАТОР – см. Защитная среда.

6

ЗАЩИТНАЯ СРЕДА – раствор, содержащий в своем составе протективные по отношению к микроорганизмам (вирусам) компоненты. Защитная среда применяется для протекции биологической активности и морфологической структуры микроорганизмов при лиофильной сушке.

ТИТР ВИРУСА – наименьшее количество вирионов, способных проявлять биологическую активность и выражается в единицах активности: бляшкообразующей (БОЕ), инфекционной (ИД50), цитотоксической (ТЦД50), летальной (ЛД50) и определяется с помощью специальных методик.

ИММУНОГЕННОСТЬ – способность антигена индуцировать гуморальный и клеточный иммунитет. Зависит от величины частиц, конформации, конфигурации, химической структуры, степени чужеродности и восприимчивости организма.

АНТИГЕННОСТЬ – мера антигенного качества. Определяется способностью антигена вызывать специфический иммунный ответ и взаимодействовать с продуктами иммунного ответа.

ПАТОГЕННОСТЬ – потенциальная способность вирусов и микробов в естественных условиях вызывать заболевание.

ВИРУЛЕНТНОСТЬ – количественная характеристика патогенности возбудителей инфекционных болезней. Выражают условными величинами - минимальной летальной дозой (МЛД), 50%-й летальной дозой (ЛД50) или 50%-й инфицирующей дозой (ИД50).

ИЗОЛЯТ ВИРУСА – популяция вируса, выделенная из организма хозяина или переносчика.

ШТАММ ВИРУСА – однородная популяция вируса, происходящая из одного вириона и у которой изучены биологические свойства.

ПЕРВИЧНАЯ КУЛЬТУРА КЛЕТОК – клетки, полученные путем ферментативного разделения из живой ткани макроорганизма и растущие вне организма в специальных сосудах с помощью питательных сред до образования монослоя. Для ее получения чаще используют клетки эмбриональных органов, обладающих наибольшей потенцией к росту.

ПИТАТЕЛЬНАЯ СРЕДА – субстраты, поддерживающие жизнедеятельность различных культур микроорганизмов и клеток. Содержат неорганические соли, низкомолекулярные синтетические вещества и сывороточные компоненты.

7

ВВЕДЕНИЕ В природе широко распространены вирусные возбудители болезней,

которые ярко проявляют свое присутствие, вызывая специфические заболевания среди восприимчивых животных. Для индикации и выделения вирусов используются специальные средства и методы. Обнаружение вирусного возбудителя дает возможность ставить соответствующий диагноз на заболевания. Кроме того, вирусные возбудители сами по себе являются основным источником для изготовления специфических диагностических и профилактических препаратов. Используемые для таких целей вирусы в начале выделяют (изолируют), подвергают идентификации и с помощью специальных методов получают штаммовые популяции с направленными свойствами. Штаммы вирусов по своим предназначениям имеют определенные отличающиеся от других иммунобиологические свойства и распределяются на основные три группы. Первую группу составляют штаммы вирусов, предназначенные для референции и их биологические свойства, условно, считают типичными для данного вида возбудителя. Во вторую группу входят штаммы, обладающие биологическими свойствами, которые близки к природным и пригодны для осуществления контроля иммуногенности вакцинных препаратов. Из таких же штаммов можно готовить инактивированные вакцины или диагностические препараты. Третью группу представляют штаммы вирусов, которые претерпели определенные изменения в условиях самой природы или с помощью исследовательских воздействий и не обладают патогенностью по отношению к восприимчивым животным и птице, но имеют иммуногенные свойства. Вирусы этой группы чаще используются в изготовлении живых видов вакцинных препаратов. Их можно применять также при получении диагностических средств.

Известно, что популяция микроорганизмов, в том числе вирусов в процессе репродукции подвержена изменчивости, тогда как технологии изготовления вакцинных и диагностических препаратов требуют применения вирусных образцов со стабильными биологическими показателями. Поэтому, для исключения вероятного изменения необходимых стандартизированных биологических свойств популяцию штаммов вирусов поддерживают в условиях, которые не стимулируют такие изменения или стимулируют в наименьшей степени. К таким условиям относятся консервирование путем сублимационного высушивания и хранение при температуре минус 20 оС и ниже.

В настоящих методических указаниях приведены технологические приемы, биологические объекты, физико-химические и биологические параметры, используемые при выделении, культивировании и

8

поддержании, а также определении биологических параметров вирусов гриппа птиц и болезни Ньюкасла.

ОБЩАЯ ЧАСТЬ

Работу по подготовке лабораторной посуды, приготовлению культур клеток и развивающихся куриных эмбрионов, выделению, культивированию и поддержанию вирусов осуществляют лица, хорошо владеющие техникой вирусологических исследований, предварительно прошедшие специальное обучение, получившие инструктаж и владеющие техникой по получению данного препарата.

Место проведения работ (лаборатория) должно располагать боксовыми помещениями для раздельного проведения технологических манипуляций по стерильной фильтрации питательных сред и растворов, получению культур клеток и развивающихся куриных эмбрионов, выделению, культивированию, консервированию и освежению вирусов. В боксах, используемых для приготовления культур клеток и работы с вирусами, необходимо соблюдать идеальную чистоту. Стены предбоксников и боксов должны быть облицованы плиткой, а пол и потолок – иметь гладкую поверхность. Боксы оборудуются бактерицидными лампами и принудительной вентиляцией с целью создания в них более высокого давления воздуха по сравнению с другими помещениями.

Лабораторное помещение, в котором расположены боксы, должно быть обеспечено также водопроводной и дистиллированной водой, паром, воздухом с положительным и отрицательным давлением, углекислотой и азотом. Персонал, работающий в боксах, должен иметь специальные комнаты для переодевания и стерильную спецодежду (халаты, комбинезоны, косынку/колпак) и тапочки. Лица, не имеющие отношения к процессам, описанных в данных методических указаниях, на посещение место работы с целью инспекции, обеспечиваются спецодеждой и тапочками. В лабораторных помещениях, используемых для выделения, культивирования и поддержания вируса оспы, работа с другими вирусами и микроорганизмами запрещается.

При работе с биологическими объектами соблюдают специальный санитарный режим. Работу с культурами клеток и тканей, развивающимися куриными эмбрионами и вирусами производят в стерильных условиях, поэтому поддержанию чистоты и стерильности боксовых помещений предъявляются повышенные требования. Перед началом работы, в обеденный перерыв и в конце рабочего дня необходимо обязательно включать бактерицидные лампы на 30 минут. При появлении массовых проростов в культуре клеток бактериальной и

9

грибковой микрофлоры бактерицидные лампы включают на ночь в течение 2-3 дней подряд. Входить в бокс разрешается только в специально предназначенной для этой цели одежде и обуви. Халаты, чепчики и маски предварительно стерилизуют автоклавированием. Работа в боксе проводится у пламени спиртовки или газовой горелки.

Резиновые пробки флаконов, бутылей матрасов с растворами, средами, сывороткой или культурой клеток протирают тампонами, смоченными спиртом, и фламбируют над пламенем спиртовки. Во время работы своевременно убирают раздельно «стерильную и загрязненную» вирусом посуду в специальные контейнеры. Обезвреживание посуды осуществляют автоклавированием при 2,0 кг/см2 в течение 2 часов. В конце рабочего дня проводят влажную уборку полов, стола, стульев и поверхности других предметов 1,5-2,0% раствором хлорамина. Один раз в неделю проводят санитарный день, во время которого моют полы, стены и окна с последующим 4-5-часовым облучением боксов ультрафиолетовыми лучами.

1. ОСНОВНАЯ ЧАСТЬ

1.1 Подготовка лабораторной посуды и резиновых изделий В процессе приготовления культур клеток, выделения,

культивирования и поддержания вирусов используют бутыли, колбы, матрасы, пипетки, пробирки, флаконы, воронки, резиновые пробки и трубки. Лабораторная посуда и резиновые изделия должны быть тщательно вымыты и простерилизованы. В качестве моющих средств применяют тринатрийфосфат, моющий порошок, кальцинированную и двууглекислую соду, соляную и серную кислоты.

Стеклянную посуду (новую) ополаскивают в водопроводной воде, заливают на 24 часа 25-30%-ым раствором серной кислоты (ГОСТ 4204-77), ополаскивают 10 раз в водопроводной воде и помещают в ванну с моющим раствором (150 г тринатрийфосфата на 100 л дистиллированной воды), подогретым до 50-600С и моют с помощью ершей. Затем тщательно промывают дистиллированной водой до полного удаления пены со стенок посуды, помещают на 1-2 мин в 1%-ый раствор соляной кислоты (ГОСТ 3118-77) для нейтрализации щелочи или 3-4 раза ополаскивают в этом же растворе и вновь ополаскивают в 4-х сменах деминерализованной воды. Показателем того, что посуда вымыта хорошо, является равномерное стекание со всей поверхности сосудов и отсутствие капель воды на стенках. Если после ополаскивания посуды видны капли на стенках, ее моют повторно по той же методике. При этом обращают особое внимание на чистоту ванн, в которых моется и ополаскивается посуда. Ванны и тазы должны быть обезжирены кальцинированной содой или хромовой смесью. Вымытую посуду

10

устанавливают вниз горлышками, затем сушат в сухожаровом шкафу. Посуду, бывшую в употреблении и не загрязненную парафином, воском или жиром, ополаскивают холодной водой, моют по той же методике.

Посуду, загрязненную жиром, сначала необходимо прокипятить в растворе тринатрийфосфата, затем промыть горячей водопроводной водой и вымыть, как указано выше. Если при этом посуда остается «жирной», ее следует дополнительно обработать серной кислотой и тщательно прополоскать водопроводной водой, а затем в 3-х сменах деминерализованной воды. Пипетки после работы, до мойки хранят в банке с деминерализованной водой, затем обрабатывают серной кислотой, тщательно промывают сначала проточной водопроводной, затем деминерализованной водой и высушивают в сушильном шкафу. Высушенную стеклянную посуду монтируют и стерилизуют в сушильном шкафу при температуре 1800С в течение 2-х часов. Контролем стерильности посуды является почернение сахарозы, которую кладут на все полки, где размещена посуда. Горячую посуду выгружать из сушильного шкафа не рекомендуется, так как она при быстром остывании вне сушильного шкафа отпотевает и в нее всасывается нестерильный воздух.

Новые, не бывшие в употреблении, резиновые трубки и пробки кипятят в течение 30 минут двукратно в 5%-ом растворе двууглекислой соды (ГОСТ 2156-76). После каждого кипячения их тщательно отмывают водопроводной водой до полного просветления промывной жидкости. После этого резиновые пробки и трубки кипятят 10-15 минут в 2%-ом растворе соляной кислоты. Затем промывают водопроводной и деминерализованной водой, кипятят 30 минут в деминерализованной воде, промывают свежей деминерализованной водой, высушивают на воздухе, монтируют, стерилизуют автоклавированием 2 часа при 2 кг/см2. Не рекомендуется проводить одновременную обработку черных резиновых пробок и резиновых трубок. Резиновые пробки и трубки, бывшие в употреблении, промывают водопроводной, а затем деминерализованной водой, кипятят 10 минут в деминерализованной воде, монтируют и стерилизуют автоклавированием 2 часа при 2 кг/см2.

1.2 Приготовление солевых растворов, питательных и

защитных сред. 1.2.1 Общие положения. Для приготовления солевых растворов и питательных сред

используют деминерализованную воду, полученную на ионообменных установках. Удельное сопротивление воды должно быть не менее 15х106 Ом и рН 5,7-7,0. Допускается изготовление сред и растворов на дважды или трижды дистиллированной воде. Воду получают в день

11

приготовления растворов или накануне. В последнем случае воду хранят в герметически закрытых емкостях из нержавеющей стали или бутылях.

Среды и растворы готовят из солей квалификации «химически чистые» или «чистые» для анализа. Соли растворяют в строгой последовательности, указанной в прописях. Последующую соль добавляют только после полного растворения предыдущей. Химические реактивы обязательно высушивают. Параметры условий высушивания неорганических солей указаны в таблице 1.

Таблица 1 – Температурно-временной режим сушки

неорганических солей. №№ п/п

Формула соли до

высушивания

Температура сушки, 0С Формула соли после

высушивания

Примеча- ние 37 50 80 180

1 NaCl

-

5-8 суток

-

-

NaCl

- 2 KCl KCl 3 KH2PO4 KH2PO4 4 NaH2PO42H2O - 8-12

суток- - NaH2PO4 или

NaH2PO4H2O Темп. не выше 500С

5 Na2HPO4 12H2O 15-18 суток

15-18 суток

- - Na2HPO4 2H2O или

Na2HPO4H2O

-

Для стерилизации питательных сред и растворов используют

пластины «СФ» или ЕКS-2, смонтированные на фильтре Сальникова. Рабочее давление воздуха в системе 0,3-0,5 кг/см2. Пластины предварительно промывают деминерализованной или бидистиллированной водой из расчета 2,0 л на одну пластину. Первую порцию растворов в количестве 0,5-1,0 л на одну фильтровальную пластину не используют. Нагрузка на одну пластину СФ до 10 л раствора, на пластину ЕКS-2 – до 30 л.

Готовые питательные среды, солевые растворы и сыворотку крови крупного рогатого скота контролируют на стерильность согласно ГОСТ 28085. Среды и растворы каждой серии выдерживают 5 суток при температуре 370С и 14 суток при комнатной температуре. При необходимости серию расфасовывают в мелкую посуду и выдерживают дополнительно 14 суток при комнатной температуре. Среды и растворы должны быть стерильными, прозрачными, не иметь осадка. Растворы и среды, содержащие индикатор феноловый красный, должны быть красно-оранжевого цвета. Среды с наличием бактериального и грибкового загрязнения утилизируют.

Ростовые свойства питательных сред и сыворотки крови крупного рогатого скота проверяют путем сравнения с заведомо качественными

12

образцами сред и сыворотки. Смесь заведомо известных сред и сыворотки с вновь приготовленными используют для выращивания культур клеток. Среда Игла с 10% сыворотки крови должна обеспечить образование сплошного монослоя клеток куриных эмбрионов в матрасах через 48 часов при посевной дозе 200 000 клеток/мл. Если в матрасах обнаруживается недостаточный рост культуры и очаги дегенерации клеток, то проводят повторное испытание. При получении отрицательных показателей серию среды бракуют.

1.2.2 Приготовление 10-кратного основного раствора Хенкса.

Вначале готовят отдельно раствор А по прописи, приведенной в таблице 2, а затем раствор Б по прописи, указанной в таблице 3.

Таблица 2 - Пропись раствора А.

Компоненты Количество, г/л ГОСТ Марка

Натрий хлористый (NaCl) 80,0 4233-77 хч Калий хлористый (КCl) 4,0 4234-77 хч Магний сернокислый (MgSO4) 1,0 4523-77 хч Магний хлористый (MgCl) 1,0 4209-77 хч Кальций хлористый (CaCl2 6H2O)* 1,4 4151-77 хч Примечание: * - навеску кальция хлористого берут в пересчете на безводный

Готовят точный 40%-ый раствор CaCl2 6H2O (плотность dn20 - 1,3957)

и 20%-ый раствор MgCl2 6H2O (плотность dn20 - 1,175). Необходимую количественную навеску каждой соли растворяют в 30-50 мл воды и небольшими порциями добавляют к раствору остальных солей. Полученный раствор А доводят водой до 500 мл.

Таблица 3 - Пропись раствора Б.

Компоненты Количество, г/л ГОСТ Марка Натрий фосфорнокислый однозамещенный (NaH2PO4 2H2O)

0,75

245-76

Хч

Натрий фосфорнокислый двузамещенный (Na2HPO4 12H2O)

1,5

4172-76

Хч

Калий фосфорнокислый однозамещенный (КH2PO4)

0,6

4198-75

Хч

Глюкоза кристаллическая гидратная 10,0 975-75 Хч Феноловый красный 0,2 ГФХ с. 829 Фенол сульфофталеина аммонийная соль

0,2

МРТУ 6-09-1647-64

Хч

13

Конечный объем раствора Б доводят до 460 мл. Затем к раствору Б при непрерывном перемешивании добавляют раствор А и после этого 20 мл 1%-го раствора фенолового красного. Полученный основной раствор Хенкса фильтруют через бумажный или ватно-марлевый фильтр и стерилизуют фильтрацией через пластины «СФ» или ЕКS-2. Основной раствор Хенкса хранят при температуре 40С в течение 6 месяцев.

1.2.3 Приготовление рабочего раствора Хенкса. К одному литру основного раствора Хенкса добавляют 9 л

деминерализованной воды. Доводят рН до 7,2-7,4 с помощью 7,5%-ым раствором двууглекислого натрия (NaHCO3, ГОСТ 2156-76). Стерилизуют раствор фильтрованием через пластины «СФ» или ЕКS-2 и хранят при комнатной температуре (18-200С) 3 месяца, без двууглекислого натрия – 6 месяцев. Рабочий раствор Хенкса без добавления хлористого кальция (CaCl2 6H2O) стерилизуют автоклавированием при 0,7 кг/см2 в течение 40 мин. После автоклавирования в стерильных условиях устанавливают рН (7,2-7,4) 7,5%-ым раствором двууглекислого натрия. Срок годности – 3 месяца.

1.2.4 Приготовление 7,5%-го раствора двууглекислого натрия.

Раствор двууглекислого натрия применяют для установки рН солевых растворов и питательных сред. Навеску соды засыпают в бутыль, заливают соответствующим количеством деминерализованной воды, закрывают пробкой и помещают в термостат (37+0,50С) на 2-3 суток. После полного растворения соды раствор стерилизуют фильтрованием через пластины «СФ» или ЕКS-2. Стерильный раствор соды расфасовывают во флаконы, плотно закрывают резиновыми пробками и хранят при температуре 4-60С в течение месяца.

1.2.5 Приготовление 20%-го раствора фосфатно-кислого однозамещенного калия.

Раствор применяют для подкисления растворов и питательных сред. Для его приготовления в 1 л деминерализованной воды растворяют 200 г КН2РО4 (ГОСТ 4198-75, хч) и стерилизуют фильтрованием через пластины «СФ» или ЕКS-2.

1.2.6 Приготовление 0,25%-го раствора трипсина. Для трипсинизации ткани используют 0,25%-ый раствор трипсина

«Дифко» или другого производства с равными ферментативными свойствами в солевом буферном растворе без ионов Са+ и Mg+. Состав этого солевого буферного раствора приведен в таблице 4.

14

Таблица 4 - Пропись компонентов 0,25%-го раствора трипсина.

Компоненты Количество, г/л

ГОСТ Марка

Натрий хлористый (NaCl) 8,0 4233-77 Хч Калий хлористый (КCl) 0,2 4234-77 Хч Натрий фосфорнокислый двузамещенный (Na2HPO4 2H2O)

1,447

4172-76

Xч

Калий фосфорнокислый однозамещенный (КH2PO4)

0,2

4198-75

Хч

Деминерализованная вода до 1 л

Навеску трипсина 2,5 г предварительно растворяют в небольшом объеме воды (100-150 мл), перемешивают и ставят на ночь в холодильник. Критерием растворения трипсина служит хорошая видимость контуров предметов через бутыль с раствором. Растворенный трипсин при помешивании добавляют в колбу. Полученный раствор доводят водой до 1 л. К общей смеси добавляют пенициллин и стрептомицин по 100 000 ЕД. (антибиотики растворяют в небольшом объеме раствора и наливают в колбу). Добавлением 1N раствора едкого натрия – NaOH (ГОСТ 4328-77) устанавливают рН раствора, который до фильтрации должен быть в пределах 7,2-7,3, после фильтрации 7,4-7,5.

Полученный раствор стерилизуют фильтрованием через пластины «СФ» или ЕКS-2. Готовый раствор трипсина хранят в герметически закрытых бутылях при температуре 4-6 оС не более 1 месяца, в замороженном виде при температуре минус 30 оС до 1 года.

1.2.7 Приготовление 0,5%-го гидролизата лактальбумина. Гидролизат лактальбумина в концентрации 0,5% растворяют на

растворе Хенкса и используют в качестве питательной среды для выращивания культур клеток ПЯ, ТЯ-КК49, ФКЭ. Среду готовят по прописи, указанной в таблице 5.

Таблица 5 - Пропись компонентов 0,5%-го раствора

гидролизата лактальбумина.

Компоненты Количество, г/л ГОСТ Марка 1 2 3 4

Натрий хлористый (NaCl) 8,0 4233-77 Хч Калий хлористый (КCl) 0,4 4234-77 Хч Магний сернокислый (MgSO46Н2О) или Магний сернокислый безводный

0,1 0,053

4523-77 -

Хч -

Магний хлористый (МgCl26Н2О) или Магний хлористый безводный

0,1 0,47

4209-77 -

Хч хч

15

Натрий фосфорнокислый двузамещенный (Na2HPO4 12H2O)

0,075

4172-76

Хч

Калий фосфорнокислый однозамещенный (КH2PO4)

0,06

4198-75

Хч

Продолжение таблицы 5

1 2 3 4 Глюкоза кристаллическая гидратная 1,0 975-75 Хч Кальций хлористый безводный (СаСl2)

0,2 4460-77 Хч

Феноловый красный 0,02 ГФХ с.829 Хч Натрий двууглекислый (NaHCO3) 2156-76 Хч Гидролизат лактальбумина 5 Пенициллин 100 тыс. ед. ГФХ с.521 Стрептомицин 100 тыс. ед. ГФХ с. 636 Вода деминерализованная до 1 л.

Порядок растворения компонентов: Раствор 1: натрий хлористый, калий хлористый, магний

сернокислый, глюкоза. Раствор 2: натрий фосфорнокислый однозамещенный растворять в

воде, нагретой до температуры 90 оС. Раствор 3: гидролизат лактальбумина растворять в воде, нагретой

до 90 оС, или автоклавировать при 0,7 кг/см2 в течение 10 минут. Раствор 4: хлористый кальций, тщательно перемешивать. Раствор 5: феноловый красный. Раствор 6: натрий двууглекислый. Газирование среды углекислым газом, подвести рН среды до 7,0-7,2. Раствор 7: антибиотики. Смешать растворы и стерилизовать фильтрованием через пластины

«СФ» или ЕКS-2. Среду хранят 3 месяца в герметически закрытых бутылях при температуре 4-6 оС.

1.2.8 Приготовление питательной среды по рецептуре Игла

Таблица 6 - Пропись компонентов питательной среды по рецептуре Игла.

Компоненты Состав (мг в 1000,0

мл раствора) для L-клеток

Состав (мг в 1000,0 мл раствора) для HeLa-клеток

1 2 3 л-аргинин 17,4 17,7 л-цистин 4,8 12,0 л-гистидин 3,1 7,8

16

л-изолейцин 26,2 26,2 л-лейцина 13,1 26,2 л-лизин 14,6 29,2 л-метионин 7,5 7,5 л-фенилаланин 8,3 16,5 л-треонин 11,9 23,8 л-триптофан 2,0 4,1 л-тирозин 18,1 18,1 л-валин 11,7 23,4 биотин 0,24 0,24

Продолжение таблицы 6 1 2 3

холин 0,12 0,12 холина-хлорид 0,14 0,14 витамин В12 (птероилглютаминовая кислота)

0,44 0,44

никотинамид 0,12 0,12 пантотеновая кислота 0,22 0,22 пантотенат кальция 0,48 0,48 пиридоксаль (пиридоксин хлоргидрат)

0,20 0,20

тиамин-хлоргидрат 0,34 0,34 рибофлавин 0,04 0,04 хлористый натрий 5850,0 5850,0 хлористый калий 373,0 373,0 фосфат натрия однозамещенный (NaH2PO4*1H2O)

138,0 138,0

кальций хлористый 111,0 111,0 двууглекислый натрий (NaHCO3) 1680,0 1680,0 магний хлористый (MgCl2*6H2O) 102,0 102,0 глюкоза 900,0 900,0 л-глютамин 146,2-292,3 146,2-292,3 пенициллин 50,0 50,0 стрептомицин 50,0 50,0 фенол красный 5,0 5,0 вода до 1000,0 до 1000,0

Раствор 1. В 500 мл воды, нагретой приблизительно до 80 оС,

помешивая, растворяют указанные выше количества аминокислот, после чего добавляют л-глютамин и фенол-красный.

Раствор 2. В 100,0 мл воды растворяют неорганические соли, за исключением двууглекислого натрия (NaHCO3), смешивают с предыдущим раствором неорганических солей и добавляют биотин и птероилглютаминовую кислоту (витамин В12).

Раствор 3. В 200,0 мл воды растворяют все витамины, кроме биотина и птероилглютаминовой кислоты, и антибиотики – пенициллин и стрептомицин. Все растворы стерилизуют фильтрованием через

17

стеклянный фильтр-нутч (Шотт, Иена, Германия) либо через асбестоцеллюлозные пластины Зейтца или отечественные пластины СФ (стерилизующий фильтр) после предварительного промывания водой, а затем – приготовленным раствором.

500 мл раствора 1 + 200 мл раствора 2 + 200 мл раствора 3 смешивают и доводят стерильной водой до 1000,0 мл. Можно добавить 1мг инозита на1 л.

1.2.9 Получение сыворотки крови крупного рогатого скота. В условиях относительной стерильности от клинически здоровых

животных 2-3 –летнего возраста берут кровь из яремной вены. Через стерильный резиновый шланг кровь подается по стенке в бутыли вместимостью 10 л. В каждую бутыль берут до 5 л крови. Для полного отделения сыворотки кровь выдерживают 48-72 часа при температуре 25 оС. Прозрачную сыворотку отсасывают в бутыли через сифонное устройство и стерилизуют через пластины «СФ» или ЕКS-2. Сыворотку проверяют на стерильность и ростовые свойства. Допускается использование сыворотки без консерванта, выпускаемой мясокомбинатами. Сыворотку хранят при температуре 4-6 оС в течение 6 месяцев. Сыворотка, имеющая хлопьевидный осадок фибрина, пригодна для работы с культурами клеток и тканей.

1.2.10 Приготовление 0,01%-го раствора бромкрезола. Для приготовления раствора в мерную посуду вносят 0,1 г

бромкрезолового красного и его растворяют в 100 мл 96о спирта ректификата. Полученный раствор доводят деминерализованной водой до 1000 мл. Раствор хранят при температуре 18-25 оС не более 1 месяца. Используют раствор для проверки качества мойки и ополаскивания стеклянной посуды. В чистую посуду добавляют 2-3 мл 0,01%-го раствора бромкрезола. Изменение цвета от желтого к синему свидетельствует о низком качестве мойки (желтый-хорошая мойка, синий-плохая).

1.2.11 Приготовление защитной среды для лиофилизации вируса.

В качестве защитной среды для вируса оспы при сублимационном высушивании используют среду, состоящую из пептона или гидролизата лактальбумина, сахарозы и желатина. Допускается использование в этих же целях обезжиренного молока коров.

Защитную среду, состоящую из пептона или гидролизата лактальбумина, сахарозы и желатина готовят следующим образом:

- для получения 12 л среды растворяют 2 кг пептона (ГОСТ 13805-76) или столько же сухого гидролизата лактальбумина и 2 кг сахарозы (ТУ6-092293-77) в 10 л калийфосфатного буферного раствора (52,8 г К2НРО4 и 10,9 г КН2РО4 на 10 л дистиллированной воды, используют соли

18

предварительно перекристализованные и высушенные), а также 0,2 кг желатина в 0,5 л дистиллированной воды;

- растворение производят при нагревании до 70-800С и перемешивают до полного растворения сахарозы;

- после растворения жидкости смешивают, охлаждают до комнатной температуры и отделяют осадок в виде крупных, рыхлых серо-белых хлопьев, пропуская раствор через ватно-марлевый фильтр;

- рН среды должен быть в пределах 6,8-7,2; - затем среду стерилизуют фильтрацией через пластины типа ЕКS-2,

подавая жидкость на фильтр при избыточном давлении или «самотеком», пропускная способность одной пластины – 8 л жидкости;

- суммарные потери при фильтрации составляют 1,5-2,0 л на 12 л первоначального объема среды. Стерилизующую фильтрацию среды проводят в день ее изготовления.

Плотность среды после стерилизующей фильтрации должна быть не ниже 1,07 г/мл определяют с помощью ареометра (ГОСТ 18481-81Е).

Приготовленную защитную среду стерильно расфасовывают в стерильные бутыли на 3-5-10 л, хранят при температуре 2-6 оС не более 30 суток и используют для стабилизации вируса после получения положительных результатов о ее стерильности.

Стерильность образцов защитной среды определяют по ГОСТ 28085. Для приготовления защитной среды из молока берут свежее коровье

молоко, обезжиривают его сепарированием, фасуют в стеклянные колбы или флаконы высотой столба жидкости (обрата) не выше 10 см, сосуды с обезжиренным молоком закрывают ватно-марлевыми пробками и подвергают двукратному автоклавированию текучим паром при 0,5 кг/см2 в течение 30 мин с интервалом в 18-24 час.

Стерилизованное обезжиренное молоко проверяют на стерильность и хранят до использования не более 10 сут.

1.3 Приготовление субстратов репродукции вирусов гриппа

птиц и болезни Ньюкасла. В качестве субстрата для репродукции вирусов гриппа птиц и

болезни Ньюкасла используют 10-12-суточные развивающиеся куриные эмбрионы и культуру фибробластов развивающихся куриных эмбрионов.

1.3.1 Приготовление развивающихся куриных эмбрионов. Для получения развивающихся куриных эмбрионов закладывают на

инкубацию СПФ яйца кур, не имеющих трещин и загрязнений. Инкубацию яиц проводят в течение 10-12 суток при температуре 37,5-38,00С в специальных инкубаторах для вывода цыплят с обеспечением в камере влажности воздуха не менее чем 60% и периодической вентиляции, а также переворачивания яиц на полках. Для определения наличия и развития эмбрионов яйца овоскопируют на 5-7 сутки

19

инкубации. Яйца без эмбрионов выбраковывают, а эмбрионы с наличием кровеносных сосудов инкубируют до 10-12 суточного возраста и используют в эти сроки для репродукции вируса или приготовления культуры фибробластов.

1.3.2 Приготовление фибробластов куриных эмбрионов. Для приготовления культуры фибробластов отбирают хорошо

развитые подвижные 10-11-суточные эмбрионы кур. Яйца с погибшими эмбрионами и не оплодотворенные утилизируют. Отобранные для трипсинизации инкубационные яйца с эмбрионами укладывают в специальные лотки пугой вверх, двукратно, на 2-3 секунды погружают в 2%-ый раствор йодистого калия на 960 этиловом спирте и подают в бокс.

В боксе поверхность яиц прожигают спиртом, а по окружности пуги прожигают при помощи «устройства для электротермического вскрытия эмбрионов птиц». Затем стерильным пинцетом снимают скорлупу, разрывают хорион-аллантоисную оболочку (ХАО), извлекают эмбрионы и помещают их по 50-60 или 100-120 штук в 2-х литровую колбу Эрленмейера, где трижды отмывают рабочим раствором Хенкса (рН 7,2-7,4) с антибиотиками (по 100 ЕД пенициллина и 100 мкг стрептомицина на 1 мл раствора). Затем эмбрионы размельчают ножницами, заливают 0,25%-ым раствором трипсина, подогретого до температуры 370С (в среднем по 75 мл трипсина на 8-10 куриных эмбрионов), опускают в колбу с размельченными эмбрионами стерильный магнитик, ставят колбу с содержимым на магнитную мешалку и проводят трипсинизацию со средней скоростью вращения магнитика в течение 7-8 мин. После чего суспензию клеток сливают через 4-х слойный марлевый фильтр во флаконы. Во взвесь клеток добавляют 2-3% сыворотки крови крупного рогатого скота и осаждают их центрифугированием при 1000 об/мин в течение 10 минут. Осадок ресуспендируют в питательной среде и диспергированные клетки фильтруют через 4 слоя стерильной марли.

В камере Горяева под малым увеличением микроскопа (10х20) подсчитывают концентрацию и жизнеспособность клеток в полученной трипсинизацией суспензии.

Для выращивания монослойной культуры клеток фибробластов эмбрионов используют суспензию, содержащую 90-95% жизнеспособных клеток. Процент жизнеспособных клеток определяют по формуле: у = х/с ,100, где:

Х – количество жизнеспособных клеток в 1 мл суспензии (неокрашенные);

С – общее число (окрашенных и не окрашенных) клеток в 1 мл суспензии.

Для подсчета клеток пипеткой отбирают по 0,2 мл суспензии и сливают ее в пробирку. В эту же пробирку вносят 0,8 мл краски (0,2%-ый раствор трипанового синего на физиологическом растворе) и

20

получают разведение суспензии клеток в 5 раз. Содержимое пробирки тщательно перемешивают, выдерживают 5 мин + 30 сек при температуре 37+0,50С и заполняют камеру Горяева. Подсчитывают живые (неокрашенные клетки). Конгломераты считают за одну клетку. Подсчет производят в 25 больших квадратах камеры. Полученное количество клеток умножают на 5 (степень разведения суспензии краской) и умножают на 10 000 (величина постоянная). Полученное произведение означает общее количество клеток в 1 мл суспензии. Например, в 25 больших квадратах камеры Горяева насчитывается 100 клеток. Следовательно, 100 х 5 х 10 000 = 5 000 000 клеток в 1 мл суспензии.

Для засева культуры клеток в матрасы вместимостью 1,5 л концентрация клеток в суспензии должна быть 200-300 тыс. клеток в 1 мл, следовательно, необходимо данный объем всей клеточной суспензии развести в 25 или 16 раз питательной средой.

Для выращивания культуры клеток роллерным методом концентрация клеток в суспензии должна быть 700-800 тыс. кл/мл.

Для получения культуры клеток, необходимой в определении числовых значений вирусов, суспензию клеток высевают в пенициллиновые флаконы в концентрациях 200-400 тыс. кл/мл.

Суспензию клеток разводят до необходимой концентрации питательной средой с 5-10% сыворотки крови крупного рогатого скота. В общий объем суспензии вносят по 1000 ЕД пенициллина и 1000 мкг стрептомицина на 1 л и разливают суспензию по 180-200 мл в матрасы вместимостью 1,5 л или по 450-500 мл в 5-литровые бутыли. Разлив суспензии производят в стерильном боксе над пламенем горелки. Матрасы и бутыли плотно закрывают резиновыми пробками. Матрасы размещают горизонтально, а бутыли – на роллерные установки и инкубируют при температуре 37+0,50С в течение 24-48 часов. Скорость вращения бутыли на роллерном аппарате устанавливают в пределах 10-15 оборотов в час. Через 24-48 часов все матрасы и бутыли с культурой клеток просматривают под малым увеличением микроскопа и визуально. Макроскопически – среда в матрасах и бутылях должна быть прозрачной. Микроскопически – клетки должны покрывать всю поверхность стенки сосуда сплошным слоем.

1.4 Подбор и подготовка экспериментальной птицы. Работы по выделению, идентификации и установлению

биологических свойств вирусов гриппа и болезни Ньюкасла требуют использования экспериментальной птицы. Такая птица должна отвечать требованиям, которые предусматривают использования животных и птицы, свободных от возбудителей инфекционных заболеваний, имеющих упитанность не ниже средней и интактных (не иммунных против гриппа и болезни Ньюкасла) от возбудителей гриппа и болезни

21

Ньюкасла и не содержащих в организме специфических антител против этих вирусов.

В экспериментальных исследованиях с вирусом гриппа птиц и болезни Ньюкасла используются цыплята различного возраста.

1.5 Выделение, идентификация и культивирование вирусов

гриппа птиц и болезни Ньюкасла. 1.5.1 Выделение, идентификация и культивирование

вирусов гриппа птиц. Для выделения вируса гриппа птицы используют патологический

материал, собранный от больной и павшей птицы с клиническими признаками, напоминающими гриппозную инфекцию. Такими признаками являются симптомы острой респираторной, желудочно-кишечной токсической инфекции, а также признаки нарушения функций центральной нервной системы. Паренхиматозные органы собирают в стерильную посуду, доставляют в лабораторию и подвергают замораживанию и размораживанию при температурных значениях минус 40оС и плюс 20-25 оС. Из тканей органов готовят 20% суспензию на растворе Хенкса или физиологическом растворе натрия хлорида, растирая в фарфоровой ступке с песком нейтрального стекла. Гомогенат очищают от грубых частиц центрифугированием при 3000 g в течение 30 мин. В надосадочную жидкость добавляют антибиотики в дозе 200 ЕД/см3 пенициллина, 200 мг/см3 стрептомицина и 50 мг/см3 нистатина, выдерживают при температуре 4-8 оС в течение 6 ч и затем используют для выделения вируса заражением соответствующей чувствительной биологической модели. Такими объектами для выделения вируса гриппа птицы служат цыплята и РКЭ, подобранные согласно требованиям п.п. 1.4., а также культура клеток ФКЭ.

При биологической пробе, суспензию испытуемого патологического материала вводят птице в дозе 0,1 см3 интраназально путем закапывания в ноздри пипеткой, в дозе 0,5 см3 подкожно или внутримышечно. За зараженными цыплятами ведут клиническое наблюдение в течение не менее 14 суток. В случае наличия вируса гриппа птиц у зараженных цыплят через 3-9 суток проявляются признаки острой инфекционной болезни. Болезнь развивается очень быстро и в течение 1-3 суток заканчивается летальным исходом. Птица, заболевшая гриппом с клиническими признаками, не выздоравливает.

При использовании для выделения вируса РКЭ, суспензию испытуемого патологического материала наносят в АП в дозе 0,1-0,2 см3. Зараженные РКЭ инкубируют при температуре 37-38 оС в течение до гибели (24-60 час.), определяя ежедневно их состояние овоскопированием. Эмбрионы, находящиеся перед гибелью охлаждают при температуре 4-8 оС в течение 12-18 ч. В асептических условиях

22

вскрывают охлажденные эмбрионы, собирают АЖ, которую используют в качестве вируссодержащей массы.

При использовании для выделения вируса культуры клеток, суспензию испытуемого патологического материала вводят на монослой клеток в пробирках или пенициллиновых флаконах в дозе 0,1 см3. Зараженные клетки выдерживают при температуре 37-38 оС в течение 60 мин, затем инокулят сливают, монослой несколько кратно промывают раствором Хенкса, содержащим антибиотики, вносят поддерживающую среду и культивируют при температуре 37-38 оС в течение 5-7 суток. В течение указанного срока ежедневно проводят микроскопию монослоя с целью выявления признаков наличия вируса. О присутствии вируса свидетельствует цитопатогенное действие, которое проявляется в монослое клеток с 24 ч. после инокуляции суспензии испытуемого патологического материала. Цитопатогенное действие характеризуется округлением клеток, формированием ими очаговых образований в монослое, в последующем - разрывов между клетками, приводящих к деструкции монослоя клеток. Вирус гриппа птицы накапливается в ФКЭ в титрах до 108,5 ТЦД50/см

3 и выше. В случае отсутствия цитопатогенного действия вируса в монослое

культуры клеток при первичном заражении, проводят дополнительно два «слепых» пассажа с использованием свежей культуры клеток ФКЭ. Отсутствие ЦПД на третьем «слепом» пассаже принимают за отсутствие репродуктивного вируса в исследуемом образце патологического материала. При наличии цитопатогенного действия, в каком либо пассаже, считают вирус выделенным и проводят его идентификацию.

Идентификацию выделенного вируса проводят с помощью реакции нейтрализации, поставленной на цыплятах или РКЭ или в культуре клеток ФКЭ, а также реакции торможения гемаггютинации. Для этого выделенный вирус в титре 1000 ИД50 в равных объемных соотношениях смешивают со специфической на вирус гриппа соответствующего подтипа сывороткой, полученную смесь выдерживают в течение 60 минут при температуре 37-38 оС и ею инокулируют одну из чувствительных биологических субстратов. Параллельно вирусом в указанной дозе, но без добавления сыворотки заражают цыплят или РКЭ или ФКЭ. За зараженными цыплятами ведут клиническое наблюдение в течение 12 суток, состояние РКЭ определяют овоскопированием в течение 7 суток, монослой ФКЭ микроскопируют в течение 6-7 суток. При постановке РТГА индикаторным является реакция агглютинации эритроцитов.

Вирус считают идентифицированным как вирус гриппа в случае отсутствия гибели РКЭ, ЦПД в культуре клеток ФКЭ и заболевания у цыплят, зараженных смесью испытуемого вируса со специфической сывороткой на вирус гриппа, при гибели РКЭ, наличии ЦПД в культуре

23

клеток ФКЭ и развития заболевания у цыплят, инфицированных испытуемым вирусом без добавления специфической сыворотки на вирус гриппа птицы.

Культивирование вируса гриппа птиц проводят в РКЭ и культуре клеток ФКЭ. Для культивирования вируса в РКЭ, вирус вводят в АП РКЭ в дозе 0,3 см3 и инкубируют эмбрионы при температуре 37-38 оС в течение до 72 ч. Зараженные эмбрионы овоскопируют через каждые 4-6 ч, погибающие и свежепогибшие эмбрионы охлаждают при температуре 4-8 оС. Охлажденные РКЭ асептически вскрывают, собирают АЖ. Экстраэмбриональную жидкость очищают центрифугированием при 3000 g в течение 30 минут. Осадок удаляют, а оставшуюся жидкость используют в качестве вирусной массы.

Для получения культурального вируса готовят монослойную культуру клеток ФКЭ, высевая клетки в концентрации 200-300 тыс. клеток/см3 в матрасы и 600-700 тыс. клеток/см3 - в круговые сосуды, или готовят суспензию клеток в концентрации 1000-1200 тыс. клеток/см3 для культивирования в суспензионном ферментере. Монослойную культуру клеток в матрасах и круговых сосудах, а также суспензию клеток в ферментере заражают вирусом гриппа в дозе 0,001-0,01 ТЦД50/кл, которые затем культивируют при температуре 37-38 оС в течение до развития цитопатогенного действия в 80% и более площади монослоя и дегенерации более 90% клеток в суспензии, культивируемой в реакторе. Цитопатогенное действие вируса в монослойной культуре клеток проявляется через 24-48 ч, а на 72-96 ч дегенеративному изменению подвергается максимальное количество клеток монослоя культуры. В момент максимального развития ЦПД, но без деструкции монослоя культуры клеток, сосуды с зараженной культурой клеток подвергают замораживанию. Культуральную суспензию, инкубированную с вирусом в состоянии суспензии, подвергают замораживанию при остаточном количестве живых клеток не более 20%. Культуральную суспензию после размораживания и определения в ней титра вируса используют в качестве вирусной биомассы. Вирус гриппа птиц накапливается в ФКЭ в титрах 107,5-108,0 ТЦД50/см

3. 1.5.2 Выделение, идентификация и культивирование вируса

болезни Ньюкасла. Для выделения вируса болезни Ньюкасла используют

патологический материал, собранный от больной и павшей птицы с клиническими признаками, напоминающими болезнь Ньюкасла. Такими признаками являются симптомы острой респираторной, желудочно-кишечной токсической инфекции, а также признаки нарушения функций центральной нервной системы. Паренхиматозные органы собирают в стерильную посуду, доставляют в лабораторию и подвергают замораживанию и размораживанию при температурных значениях

24

минус 40оС и плюс 20-25 оС. Из тканей органов готовят 20% суспензию на растворе Хенкса или физиологическом растворе натрия хлорида, растирая в фарфоровой ступке с песком нейтрального стекла. Гомогенат очищают от грубых частиц центрифугированием при 3000 g в течение 30 мин. В надосадочную жидкость добавляют антибиотики в дозе 200 ЕД/см3 пенициллина, 200 мг/см3 стрептомицина и 50 мг/см3 нистатина, выдерживают при температуре 4-8 оС в течение 6 ч и затем используют для выделения вируса заражением соответствующей чувствительной биологической модели. Такими объектами для выделения вируса гриппа птицы служат цыплята и РКЭ, подобранные согласно требованиям п.п. 1.4., а также культура клеток ФКЭ.

При биологической пробе, суспензию испытуемого патологического материала вводят птице в дозе 0,1 см3 интраназально путем закапывания в ноздри пипеткой, в дозе 0,5 см3 подкожно или внутримышечно. За зараженными цыплятами ведут клиническое наблюдение в течение не менее 14 суток. В случае наличия вируса болезни Ньюкасла у зараженных цыплят через 1-5 суток проявляются признаки острой инфекционной болезни. Болезнь развивается очень быстро и в течение 1-3 суток заканчивается летальным исходом. Птица, заболевшая болезнью Ньюкасла, не выздоравливает.

При использовании для выделения вируса РКЭ, суспензию испытуемого патологического материала наносят в АП в дозе 0,1-0,2 см3. Зараженные РКЭ инкубируют при температуре 37-38 оС в течение до гибели (24-60 час.), определяя ежедневно их состояние овоскопированием. Эмбрионы, находящиеся перед гибелью охлаждают при температуре 4-8 оС в течение 12-18 ч. В асептических условиях вскрывают охлажденные эмбрионы, собирают АЖ, которую используют в качестве вируссодержащей массы.

При использовании для выделения вируса культуры клеток, суспензию испытуемого патологического материала вводят на монослой клеток в пробирках или пенициллиновых флаконах в дозе 0,1 см3. Зараженные клетки выдерживают при температуре 37-38 оС в течение 60 мин, затем инокулят сливают, монослой несколько кратно промывают раствором Хенкса, содержащим антибиотики, вносят поддерживающую среду и культивируют при температуре 37-38 оС в течение 5-7 суток. В течение указанного срока ежедневно проводят микроскопию монослоя с целью выявления признаков наличия вируса. О присутствии вируса свидетельствует цитопатогенное действие, которое проявляется в монослое клеток с 24 ч. после инокуляции суспензии испытуемого патологического материала. Цитопатогенное действие характеризуется округлением клеток, формированием ими очаговых образований в монослое, в последующем - разрывов между клетками, приводящих к

25

деструкции монослоя клеток. Вирус болезни Ньюкасла накапливается в ФКЭ в титрах от 108,5 ТЦД50/см

3. В случае отсутствия цитопатогенного действия вируса в монослое

культуры клеток при первичном заражении, проводят дополнительно два «слепых» пассажа с использованием свежей культуры клеток ФКЭ. Отсутствие ЦПД на третьем «слепом» пассаже принимают за отсутствие репродуктивного вируса в исследуемом образце патологического материала. При наличии цитопатогенного действия, в каком либо пассаже, считают вирус выделенным и проводят его идентификацию.

Идентификацию выделенного вируса проводят с помощью реакции нейтрализации, поставленной на цыплятах или РКЭ или в культуре клеток ФКЭ, а также реакции торможения гемаггютинации. Для этого выделенный вирус в титре 1000 ИД50 в равных объемных соотношениях смешивают со специфической на вирус болезни Ньюкасла сывороткой, полученную смесь выдерживают в течение 60 минут при температуре 37-38 оС и ею инокулируют одну из чувствительных биологических субстратов. Параллельно вирусом в указанной дозе, но без добавления сыворотки заражают цыплят или РКЭ или ФКЭ. За зараженными цыплятами ведут клиническое наблюдение в течение 12 суток, состояние РКЭ определяют овоскопированием в течение 7 суток, монослой ФКЭ микроскопируют в течение 6-7 суток. При постановке РТГА индикаторным является реакция агглютинации эритроцитов.

Вирус считают идентифицированным как вирус болезни Ньюкасла в случае отсутствия гибели РКЭ, ЦПД в культуре клеток ФКЭ и заболевания у цыплят, зараженных смесью испытуемого вируса со специфической сывороткой на вирус болезни Ньюкасла, при гибели РКЭ, наличии ЦПД в культуре клеток ФКЭ и развития заболевания у цыплят, инфицированных испытуемым вирусом без добавления специфической сыворотки на вирус болезни Ньюкасла.

Культивирование вируса болезни Ньюкасла проводят в РКЭ и культуре клеток ФКЭ. Для культивирования вируса в РКЭ, вирус вводят в АП РКЭ в дозе 0,3 см3 и инкубируют эмбрионы при температуре 37-38 оС в течение до 72 ч. Зараженные эмбрионы овоскопируют через каждые 4-6 ч, погибающие и свежепогибшие эмбрионы охлаждают при температуре 4-8 оС. Охлажденные РКЭ асептически вскрывают, собирают АЖ. Экстраэмбриональную жидкость очищают центрифугированием при 3000 g в течение 30 минут. Осадок удаляют, а оставшуюся жидкость используют в качестве вирусной массы.

Для получения культурального вируса готовят монослойную культуру клеток ФКЭ, высевая клетки в концентрации 200-300 тыс. клеток/см3 в матрасы и 600-700 тыс. клеток/см3 - в круговые сосуды, или готовят суспензию клеток в концентрации 1000-1200 тыс. клеток/см3 для культивирования в суспензионном ферментере. Монослойную культуру

26

клеток в матрасах и круговых сосудах, а также суспензию клеток в ферментере заражают вирусом болезни Ньюкасла в дозе 0,001-0,01 ТЦД50/кл, которые затем культивируют при температуре 37-38 оС в течение до развития цитопатогенного действия в 80% и более площади монослоя и дегенерации более 90% клеток в суспензии, культивируемой в реакторе. Цитопатогенное действие вируса в монослойной культуре клеток проявляется через 24-48 ч, а на 72-96 ч дегенеративному изменению подвергается максимальное количество клеток монослоя культуры. В момент максимального развития ЦПД, но без деструкции монослоя культуры клеток, сосуды с зараженной культурой клеток подвергают замораживанию. Культуральную суспензию, инкубированную с вирусом в состоянии суспензии, подвергают замораживанию при остаточном количестве живых клеток не более 20%. Культуральную суспензию после размораживания и определения в ней титра вируса используют в качестве вирусной биомассы. Вирус болезни Ньюкасла накапливается в ФКЭ в титрах 108,5-109,0 ТЦД50/см

3. 1.6 Консервирование и хранение вирусов гриппа птиц и

болезни Ньюкасла. Для консервации отбирают вирусную суспензию, свободную от

бактериального и грибкового загрязнения с биологической активностью не ниже 107,5 ТЦД50/см

3 гриппа птиц и 108,5 ТЦД50/см3 вируса болезни

Ньюкасла, в которую добавляют пенициллин в дозе 100-200 ЕД/мл и стрептомицин - 100-200 мкг/мл. Вирусную массу, не зависимо от вида, смешивают со стерильной стабилизирующей защитной средой в равных объемных соотношениях. Смесь тщательно перемешивают. Вируссодержащую суспензию разливают с соблюдением правил асептики, в зависимости от потребности, по 1,0 см3 или 2,0 см3 или 4,0 см3 в стерильные ампулы по ОСТ 64-2-180-85 или флаконы по ТУ 64-2-100-78. Ампулы/флаконы с жидкой вирусной суспензией немедленно закрывают стерильной двухслойной марлевой салфеткой или стерильной гигроскопической ватой. Вирусный материал в ампулах/флаконах замораживают столбиком в низкотемпературных холодильных установках при температуре минус 45-500С и выдерживают при этом температурном режиме в течение 8-10 ч.

Камеру сублимационной установки дезинфицируют (фламбируют), охлаждают конденсор установки до температуры минус 45-500С, быстро загружают замороженную в ампулах/флаконах вирусную суспензию со стабилизатором в сушильные вакуум-камеры (в течение 2-3 мин), не допуская оттаивания биопрепарата в фасовках, и герметично закрывают крышку (дверь) камеры. Включают вакуум-насос и в течение 15-20 минут создают вакуум до 100 микрон, который выдерживают на протяжении всего периода сушки. Через 1-3 часа после загрузки вируса, в вакуум

27

сушильном аппарате включают медленный подогрев полок с повышением температуры биопрепарата на 1-20С в час. Общая продолжительность сушки вируса около 36-48 часов, в том числе первый период сушки (сублимация) составляет около 18-30 часов. Плюсовая температура в вируссодержащем материале не должна превышать 250С. Контроль над процессом сушки ведут по температурным данным биопрепарата и давлению в сушильной камере.

После окончания высушивания в камеру впускают стерильный воздух, пока давление в ней не уровняется с наружным.

Открыв камеру, ампулы/флаконы быстро перекладывают в вакуум-камеры, в которых вирус содержат под вакуумом в 200-250 микрон до момента запайки ампул и перекрытия флаконов.

Ампулы с сухим вирусом герметически запаивают в день разгрузки аппарата на вакуумных коллекторах при вакууме не более 250 микрон (при остаточном давлении в пределах 0,1-0,25 мм рт.ст.), а флаконы герметизируют под аналогичным вакуумом резиновыми пробками и закатывают алюминиевыми колпачками (ОСТ 64-009-86).

Наличие вакуума в ампулах/флаконах проверяют вакуумным трансформатором типа Тесла или прибором Д/Арсенваля. При отсутствии светящегося разряда или разряда с фиолетовым свечением в форме тонкого шнура (признак отсутствия вакуума или низкий вакуум) такую ампулу или флакон выбраковывают и уничтожают кипячением или автоклавированием.

Допускается ампулы/флаконы с вирусом герметизировать без создания в них вакуума. При этом ампулы/флаконы заполняют инертным стерильным газом.

Датой изготовления сухого образца вируса считается день окончания лиофилизации.

Высушенные образцы вирусов в ампулах или флаконах, после паспортизации биологических параметров, этикируют и хранят в опечатанных металлических контейнерах при температуре минус 40 оС.

1.7 Освежение вирусов гриппа птиц и болезни Ньюкасла. Вирулентные штаммы вирусов гриппа птиц и болезни Ньюкасла,

консервированные лиофильной сушкой в ампулах или флаконах, освежают на РКЭ или ФКЭ, соответственно, по той же методике, которая описана в п.п. 1.5.1, 1.5.2. При этом в качестве заражающего вирусного материала, вместо суспензии патологического материала, применяют сухое содержимое ампул или флаконов, представленное для освежения. Вирусы второго или третьего пассажа с достаточными титрами и стерильные по отношению бактерий и грибков используются как

28

освеженные. Освеженные образцы вирусов консервируют сублимационным высушиванием по п.п. 1.6.

1.8 Определение биологической активности (титра) вирусов

гриппа птиц и болезни Ньюкасла. Инфекционную активность вирусов гриппа птиц и болезни Ньюкасла

определяют титрованием в соответствующей чувствительной модели – РКЭ или ФКЭ. Для титрования содержимое трех ампул/флаконов с сухим вирусом разводят стерильной поддерживающей питательной средой до первоначального объема вируса перед сушкой, объединяют и из средней пробы готовят на той же среде 10-кратные разведения от 10-1 до 10-9.

При использовании для титрования культур клеток каждое разведение вируса вносят в 4 флакона/пробирки с монослойной культурой клеток в дозе по 1,0 см3, предварительно удалив ростовую питательную среду из них, и культивируют при температуре 37+0,5оС. Зараженную культуру клеток микроскопируют ежедневно. Поддерживающую питательную среду во флаконах с культурой клеток заменяют через каждые 48 ч.

Результаты титрования учитывают при каждой микроскопии по наличию цитопатогенных изменении в культуре клеток. ЦПИ характеризуется образованием видоизмененных (округлых, интенсивно преломляющих свет) клеток, располагающихся одиночно или группами в виде виноградных гроздьев, подвергающихся в последующем деструкции.

Результаты титрования вирусов гриппа и болезни Ньюкасла устанавливают по данным микроскопии, проведенных до 5-7 суток. Титр вирусов в культурах клеток определяют в ТЦД50.

При использовании для титрования РКЭ каждое разведение вирусов в дозе 0,2-0,3 см3 вводят в АП 4-х эмбрионов, помещают в инкубатор с температурой нагрева 37-38 оС и ведут за зараженными РКЭ наблюдение в течение 7 суток, регистрируя ежедневно гибель при овоскопии.

Учет результатов титрования проводят в течение 5-7 суток. Титр вируса устанавливают в ЭИД50, который рассчитывают по методу Рида и Менча.

1.9 Определение патогенности и вирулентности вирусов

гриппа птиц и болезни Ньюкасла. Патогенность и вирулентность вируса гриппа птицы и болезни

Ньюкасла определяют на цыплятах. Для этого испытуемым вирусом заражают птицу и ведут клиническое наблюдение за ней. Птицу заражают подкожно, внутримышечно или интраназально.

У зараженной птицы на 2-5 сутки появляются признаки острой инфекционной болезни с поражением органов дыхания и

29

пищеварительного тракта. У некоторых птиц, зараженных вирусом гриппа развивается отек головы.

Вследствие воспалительного поражения слизистой оболочки носовых полостей из носовых отверстий появляются слизисто-серозные истечения. Болезнь длится 1-3 суток и в 100% случаев заканчивается летальным исходом больной птицы.

Вирулентность вирусов, как меру патогенности, определяют титрованием вируса на восприимчивой птице.

Вирулентность вирусов гриппа и болезни Ньюкасла достигает до 107,5-109,5 ИД50/см3. Вирулентность вируса гриппа, определяемая показателем летальности бывает обычно на один – два порядка ниже, чем устанавливаемая показателем инфекционности, а велогенного вируса болезни Ньюкасла эти два показателя равны между собой.

1.10 Определение антигенности вирусов гриппа птицы и

болезни Ньюкасла. Антигенность вирусов гриппа и болезни Ньюкасла определяют по

титрам вируснейтрализующих или антигемагглютинирующих антител, вырабатываемых в ответ на введение испытуемых возбудителей. Для этого вирусами в дозах по 103 ТЦД50 прививают кроликов и через 30 суток, от всех привитых собирают пробы сыворотки крови, в которых, с помощью реакции нейтрализации или торможения гемагглютинации устанавливают титр специфических антител.

Испытуемые вирусы считаются антигенно активными в случае формирования в организме животных, привитых ими, противовирусных антител в титре от 3,0 log2.

Реакцию нейтрализации с вирусами гриппа и болезни Ньюкасла ставят в одной из чувствительных субстратов (РКЭ, ФПЭ, цыплята). Для постановки реакции нейтрализации из каждой пробы сыворотки крови, после предварительной термической обработки при температуре 56 оС в течение 30 мин готовят двукратные разведения на растворе Хенкса. Затем каждое разведение смешивают с равным объемом испытуемого вируса с титром 100 ТЦД50/0,5 см

3. Смесь выдерживают в течение 60 мин при температуре 37-38 оС и каждым разведением инокулируют культуру клеток ФКЭ в 4-х пробирках или флаконах, или четыре 10-12-суточные РКЭ. За культурой клеток ФКЭ и РКЭ наблюдают в течение 5 суток и регистрируют ЦПД и гибель. Наличие ЦПД и гибель означает об отсутствии нейтрализующей способности сыворотки, а отсутствие ЦПД и гибели – о наличии такой способности. Наивысшее разведение сыворотки, нейтрализовавшее репродукцию вируса, считается нейтрализующим титром сыворотки.

При постановке РТГА, в двукратные разведения испытуемой сыворотки добавляют в равном объеме 4 ГАЕ вирусов гриппа или

30

болезни Ньюкасла. Смесь перемешивают и выдерживают в течение 60 мин при температуре 37-38 оС. В качестве индикатора образования специфического комплекса используют суспензию эритроцитов петуха в концентрации 1%, которую добавляют в смесь вирусов и разведений сыворотки. Реакцию читают через 20 – 40 минут по агглютинации эритроцитов. Наивысшее разведение сыворотки, тормозящее агглютинацию эритроцитов, считается за титр специфических антител – антигемагглютининов на испытуемые вирусы.

1.11 Определение иммуногенности вирусов гриппа птицы и

болезни Ньюкасла. В связи с высокой патогенностью вирулентных вирусов гриппа и

болезни Ньюкасла иммуногенность их удается установить после их инактивации. Для этого вирусы инактивируют формальдегидом, используя концентрацию 0,05%, температуру 37-38 оС и экспозицию 48 ч.

В суспензию инактивированных вирусов гриппа и болезни Ньюкасла добавляют гель гидроокиси алюминия в концентрации 1,5% и таким препаратом в дозе по 1,0 см3 прививают внутримышечно 10 цыплят на каждый возбудитель.

Через 21 сутки после прививки всех привитых и других 10 не привитых цыплят заражают вирулентными вирусами гриппа и болезни Ньюкасла по отдельности. За зараженной птицей наблюдают в течение 10 суток и проводят учет результатов заражения по устойчивости к вирулентному вирусу.

Вирус считают иммуногенным, в случае если у не менее 80% птицы, привитой инактивированным вирусом, не развиваются признаки заболевания, в то время как у не менее 80% контрольных должно развиться заболевание.

Испытуемые штаммы вирусов гриппа и болезни Ньюкасла должны быть иммуногенными.

31

ЗАКЛЮЧЕНИЕ Разработанные методические указания предназначены для

руководства при проведении работ по выделению, идентификации, культивированию и длительному хранению, а также освежению полевых популяций, лабораторных и производственных штаммов вирусов гриппа птицы и болезни Ньюкасла. В документе приведены методы обработки и контроля качества лабораторной посуды, методы приготовления и рецептура необходимых солевых растворов, питательных и защитных сред, методы получения и приготовления биологических субстратов для выделения, культивирования, освежения и титрования вирусов гриппа птицы и болезни Ньюкасла, методы определения и оценки патогенности, вирулентности, антигенности, иммуногенности указанных видов вирусов.

Приведенные в документе методические правила и строгое соблюдение их при работе с вирусами гриппа птиц и болезни Ньюкасла дадут возможность изолировать и идентифицировать полевые возбудители этих болезней, культивировать и получать активную биомассу, а также поддерживать его в репродуктивном состоянии длительное время в условиях лаборатории. Методические указания могут являться руководством при получении производственных штаммов, изготовлении вакцинных и диагностических препаратов, используемых при диагностике и профилактике гриппозной и ньюкаслской болезней птицы.

Методические указания составлены на основе результатов собственных исследований авторов.

32

СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННОЙ ЛИТЕРАТУРЫ 1 Абугалиева Г.К., Кутумбетов Л.Б., Мырзахметова Б.Ш.

Иммунологическая реактивность организма животных по отношению к вирусу гриппа птиц // Материалы Международной научно-практической конференции «Актуальные проблемы микробиологии и вирусологии» МОН РК РГП «Центр биологических исследований». -Алматы, 2009. - С.219-222.

2 Мырзахметова Б.Ш., Кутумбетов Л.Б. Цитопатогенность вирусов гриппа птиц и болезни Ньюкасла //Материалы международной научно-практической конференции «Высшее образование и аграрная наука – сельскому хозяйству». - Семей-Казахстан, 2009. -Т.1. –С. 103-106.

3 Мырзахметова Б.Ш., Кутумбетов Л.Б. Иммуногенность вакцины против гриппа типа А/H7N7 инактивированной сорбированной //Материалы международной конференции, посвященные 80-летию Самарской НИВС Россельхозакадемии. – Самара, 2009. - С.299-302.

4 Мырзахметова Б.Ш., Кутумбетов Л.Б. Динамика количественного изменения иммунокомпетентных факторов крови кроликов под воздействием иммуностимуляторов //Сборник научных трудов КазНИВИ «Теория и практика борьбы с болезнями животных в Республике Казахстан». - Алматы, 2009. -Т. LV. -С.190-195.

5 Мырзахметова Б.Ш., Кутумбетов Л.Б. Антигенность вирусов гриппа и болезни Ньюкасла //Вестник науки КазАТУ им. С.Сейфуллина, №1, 2010 г.

6 Мырзахметова Б.Ш., Кутумбетов Л.Б. Оптимизация способов специфической профилактики особо опасных болезней птиц //Вестник сельскохозяйственной науки. – Алматы, 2010. - №7. -С. 63-67.

7 Мырзахметова Б.Ш., Кутумбетов Л.Б. Изменчивость некоторых фенотиповых признаков вируса гриппа типа А/H7N7 //Вестник науки КазНУ имени Аль-Фараби, серия биологическая. – Алматы, 2010. -№ 4. – С. 97-101.

8 Мырзахметова Б.Ш., Кутумбетов Л.Б. Иммуногенность инактивированной ассоциированной вакцины против гриппа птиц и болезни Ньюкасла при применении выпаиванием //Гигиена, эпидемиология и иммунобиология. – Алматы, 2010. - № 4. -С. 160-165.

9 Заявка №2010/0047.1 на инновационный патент «Инактивированная ассоциированная вакцина против гриппа птиц и болезни Ньюкасла» / Кутумбетов Л.Б., Кульбаева К.Р., Мырзахметова Б.Ш.; Приоритет от 15.01.2010 г. Комитет по правам интеллектуальной собственности МЮ РК.