实验四 实验四 PCRPCR 基因扩增基因扩增

实验目的实验目的通过本实验学习 PCR 反应的基本原理与

实验技术。

实验原理实验原理聚合酶链式反应 (polymerase chain rea

ction,PCR) ，是一种在体外快速扩增特定基因或 DNA 序列的方法，故又称为基因的体外扩增法。

在待扩增的 DNA 片断两侧和与其两侧互补的两个寡核苷酸引物，经变性、退火和延伸若干个循环后， DNA 扩增 2n 倍。

PCRPCR 技术的原理技术的原理

1. 变性：在加热或碱性条件下可使 DNA 双螺旋的氢键断裂，形成单链 DNA ，称之为变性。

2. 退火：是模板与引物的复性。引物是与模板某区序列互补的一小段 DNA 片段。

3. 延伸：从结合在特定 DNA 模板上的引物为出发点，将四种脱氧核苷酸以碱基配对形式按5’→3’ 的方向沿着模板顺序合成新的 DNA链。

(c)(c)

(b)(b)引物引物 22

5’5’ 3’3’

3’3’

3’3’

5’5’

5’5’((d)d)

新引物新引物

5’5’ 3’3’

靶靶 DNADNA的扩增的扩增

(a)(a)5’5’ 3’3’

引物引物 113’ 3’ 5’5’

3’3’ 5’5’

引物引物 22互补链互补链 引物引物 11互补链互补链

单位长度的链单位长度的链不同长度的链不同长度的链

55’’ 33’’3’3’ 5’5’

引物引物 11互补链互补链引物引物 22互补链互补链

目的片段（不同长度的链未示出）目的片段（不同长度的链未示出）

聚合酶链式反应示意图聚合酶链式反应示意图

(e)(e)

(f)(f)

(g)(g)

温度温度（（℃）℃）

时间（时间（ miminn））

9494

7272

6060

9494℃℃变性变性（（ 1min1min））

60 60 ℃℃退火退火（（ 1min1min））

72 72 ℃℃延伸延伸（（ 1.5mi1.5minn））

循环循环 1 1 循环循环 2 2 循环循环 33

PCRPCR 反应的温度循环周期反应的温度循环周期PCR PCR 反应的每一个温度循环周期都是由反应的每一个温度循环周期都是由 DNADNA 变性、变性、引物退火和反应延伸三个步骤完成的。图中设定的引物退火和反应延伸三个步骤完成的。图中设定的反应参数是反应参数是 94℃94℃ 变性变性 1min1min ， ， 60 ℃60 ℃ 退火退火 1min1min ， ， 72 ℃72 ℃ 延伸延伸 1.5min1.5min 。如此周而复始，重复进行，直。如此周而复始，重复进行，直

至扩增产物的数量满足实验需求为止。至扩增产物的数量满足实验需求为止。

Parameter Concentration

TemplatepHdNTPsGelatinPrimersMg2+ oncentrationEnzymeTotal volume

10 attomoles(~1× 106 molecules)8.4（10mM Tris-Hcl）200 μ M(each one)100 g/ml (optional)0.5 μ M(each one);(0.1—1.0μ M)>0.5mM< 10mM1 unit25—100μ l

一般一般 PCRPCR 反应条件反应条件

实验仪器实验仪器

电泳仪

琼脂糖凝胶电泳槽琼脂糖凝胶电泳槽

PCR仪

凝胶成像系统凝胶成像系统

移液器

实验材料实验材料1 、 DNA 模板2 、 4 种 dNTP3 、引物 1 、引物 24 、 Taq 酶5 、琼脂糖6 、 DNA 相对分子质量标准物7 、吸头、 50ul PCR 管

试剂试剂 10×PCR 缓冲液 ( 含 Mg2 ＋ ) 4×dNTP ( 每种 1mmol) Tag 酶 1U/ul DNA 模板 引物 1: 5`- GGGGAATTCATGGTGAGCAAGGGC-3` 引物 2: 5`-GACCTGCAGGCATGCAAGCTTGGC-3` 引物溶液浓度 10pmol/ul

实验步骤实验步骤1 在 0.5ml RCR 管内配置 20ul 反应体系：

  CK(ul) 1#(ul)

模板 0 1

引物 1 0.4 0.4

引物 2 0.4 0.4

10× PCR Buffer 2 2

Taq 酶 0.5 0.5

dNTPs 0.4 0.4

ddH2O 14.3 15.3

Total 20 20

PCRPCR 反应程序反应程序

(1) 94℃(1) 94℃ 变性变性 5min5min ，，

(2) 94℃(2) 94℃ 变性变性 1min1min ， ，

(3) 52 ℃(3) 52 ℃ 退火退火 1min1min ，，

(4) 72 ℃(4) 72 ℃ 延伸延伸 1min1min 。。

(5) (5) 重复重复 (2)-(4)30(2)-(4)30 次次

（（ 66 ）） 72 ℃72 ℃ 延伸延伸 1min1min 。。

实验报告

要求：1 、写出本实验目的、原理；2 、实验器材及实验步骤；3 、列出实验结果示意图并分析原因。

实验结果实验结果

PCR 结果。 1 、对照 ( 无模板 ) ； 2 －6 、 PCR 产物（ 5ul 样品）