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沉沉沉沉 沉沉沉沉 PRECIPITATION PRECIPITATION

沉淀反应 PRECIPITATION

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沉淀反应 PRECIPITATION. 概念. 沉淀反应 :( precipitation) 可溶性抗原与相应抗体,在适宜条件下 发生结合,出现的沉淀现象。. 液相内沉淀试验: 指抗原抗体在以生理盐水 或其它无机盐缓冲液为反应介质的液相内 自由接触,短时间可出现反应。. 凝胶内沉淀试验: 指琼脂糖内扩散或凝胶内 扩散试验。. 第一节 液相内沉淀试验. 一、絮状沉淀试验 : (flocculation test ) 二、 免疫浊度试验 : (immunoturbidimetry). 一、絮状沉淀试验. - PowerPoint PPT Presentation

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Page 1: 沉淀反应 PRECIPITATION

沉淀反应沉淀反应PRECIPITATIONPRECIPITATION

Page 2: 沉淀反应 PRECIPITATION

•沉淀反应 :(precipitation) 可溶性抗原与相应抗体,在适宜条件下

发生结合,出现的沉淀现象。

概念概念

•液相内沉淀试验:指抗原抗体在以生理盐水 或其它无机盐缓冲液为反应介质的液相内 自由接触,短时间可出现反应。

•凝胶内沉淀试验:指琼脂糖内扩散或凝胶内 扩散试验。

Page 3: 沉淀反应 PRECIPITATION

第一节 液相内沉淀试验第一节 液相内沉淀试验

一、絮状沉淀试验 :(flocculation test)

二、免疫浊度试验 : (immunoturbidimetry)

Page 4: 沉淀反应 PRECIPITATION

• 原理

一、絮状沉淀试验一、絮状沉淀试验

抗原溶液与相应抗体溶液混合,在电解质存在下,抗原与抗体结合出现可见的絮状沉淀。

( flocculation test)

Page 5: 沉淀反应 PRECIPITATION

在抗体浓度不变的情况下随着抗原浓度不断上升免疫沉淀反应变化如图在抗体浓度不变的情况下随着抗原浓度不断上升免疫沉淀反应变化如图

Page 6: 沉淀反应 PRECIPITATION

1:2 1:4 1:8 1:16 1:32 1:64 1:128

各管抗原倍比稀释

加入抗血清

各管抗体量不变

振摇 混匀、 37℃孵育

沉淀量不同

出现沉淀量最多的管为最适比例管。

轻摇

絮 状 沉 示 意 图淀

Ag

Ab

Ag

Page 7: 沉淀反应 PRECIPITATION

•方法评价:简便、敏感度较低

•临床意义: 测定抗原抗体反应 的最适比。

Page 8: 沉淀反应 PRECIPITATION

二、免疫浊度试验二、免疫浊度试验

Distribution of radiation by Distribution of radiation by absorptionabsorption

Distribution of scattered radiationDistribution of scattered radiation

Page 9: 沉淀反应 PRECIPITATION

透射比浊法和透射比浊法和散射比浊法光路散射比浊法光路

检测器 A

检测器 B

IC

I0

I

θ

透射比浊法

散射比浊法

Page 10: 沉淀反应 PRECIPITATION

1. 透射比浊法( transmission turbidimetry)

2. 散射比浊法( nephelometry)

① 速率散射比浊法 (rate nephelometry)

② 终点散射比浊法 (endpoint nephelometr

y)

Page 11: 沉淀反应 PRECIPITATION

• 原理

(一)透射比浊法(一)透射比浊法

抗原与抗体在一定缓冲液中形成 IC ,当光线透过反应溶液时,由于溶液内复合物粒子对光线的反射和吸收,引起透射光减少, IC 越多透射光越少,可用吸光度表示。

( transmission turbidimetry)

Page 12: 沉淀反应 PRECIPITATION

用于免疫沉淀反应的一些缺陷:用于免疫沉淀反应的一些缺陷:• (1)(1) 溶液中存在的抗原-抗体复合物分子应足够大,溶液中存在的抗原-抗体复合物分子应足够大,

分子太小则阻挡不了光线的通过。分子太小则阻挡不了光线的通过。• (2)(2) 溶液中的抗原-抗体复合物的数量要足够多。溶液中的抗原-抗体复合物的数量要足够多。

如果数量太小,溶液浊度变化太小,对光通量影如果数量太小,溶液浊度变化太小,对光通量影响不大。响不大。

• (3) (3) 透射比浊是依据透射光减弱的原理来定量的,透射比浊是依据透射光减弱的原理来定量的,因此只能测定抗原-抗体反应的第二阶段,检测因此只能测定抗原-抗体反应的第二阶段,检测仍需抗原-抗体温育反应时间,检测时间较长。仍需抗原-抗体温育反应时间,检测时间较长。

Page 13: 沉淀反应 PRECIPITATION

• 原理

(二)散射比浊(二)散射比浊法法

在入射光的一定角度检测粒子发出的散射光,散射光的强度与IC 的含量呈正比。

( nephelometry)

Page 14: 沉淀反应 PRECIPITATION

• 原理

1.1. 速率散射比浊法速率散射比浊法

抗原抗体结合反应的过程中,在单位时间内两者结合的速度即在抗原抗体反应达最高峰时,测定其 IC 形成的量。抗体过量时,峰值与抗原量呈正比。

(rate nephelometry)

Page 15: 沉淀反应 PRECIPITATION

速率峰的测定

Page 16: 沉淀反应 PRECIPITATION

速率峰的测定

Page 17: 沉淀反应 PRECIPITATION

3

2

1

Time

Sca

tter

Measure the RATE After Antibody AdditionRate Nephelometry

1. Buffer addition 2. Sample Addition 3. Antibody addition

First derivative: rate of change of scatter over time;this is the SLOPE of the curve

Rat

e

Page 18: 沉淀反应 PRECIPITATION

CONCENTRATION

RA

TE

在速率峰基础上完成的标准曲线

Page 19: 沉淀反应 PRECIPITATION

抗原过剩的测定

Page 20: 沉淀反应 PRECIPITATION

RA

TE

of

S

CA

TT

ER

抗体过量时的反应

抗原过量时的反应60 850

反应时间 ( 秒 )

抗原过量自动检测

加入校正液

Page 21: 沉淀反应 PRECIPITATION

•方法评价: 敏感度高 快速 ( 不必达平衡) 抗原抗体结合的动态测定,理论上测定不受本底散射信号的影响 可检测微量样品

Page 22: 沉淀反应 PRECIPITATION

• 原理

2.2. 终点散射比浊终点散射比浊法法

让抗原抗体作用一定时间,使其反应达到平衡后,测定其 IC 形成的量。 IC 的浊度不再受时间的影响,但反应 IC 聚合产生絮状沉淀之前,进行浊度测定。

(endpoint nephelometry)

Page 23: 沉淀反应 PRECIPITATION

用于免疫沉淀反应的缺陷用于免疫沉淀反应的缺陷

(1)(1) 因为是一次性测定光吸收值,没有考虑每因为是一次性测定光吸收值,没有考虑每一个待测样本的吸收和散射效果,可测定一个待测样本的吸收和散射效果,可测定结果不准确结果不准确

(2)(2) 测定的仍是抗原-抗体反应的第二阶段,测定的仍是抗原-抗体反应的第二阶段,不适合快速检测。不适合快速检测。

(3) (3) 终点法存在反应本底,测定样本的含量终点法存在反应本底,测定样本的含量越低,本底比例越大,故在微量测定时,越低,本底比例越大,故在微量测定时,本底的干扰是影响准确测定的重要因素。 本底的干扰是影响准确测定的重要因素。

Page 24: 沉淀反应 PRECIPITATION

影响免疫比浊测定的因素影响免疫比浊测定的因素

• 11 、抗原抗体比例、抗原抗体比例• 22 、抗体的质量 、抗体的质量 抗体的特异性、效价、亲和力、抗体的特异性、效价、亲和力、 RR 型和型和

HH 型抗体型抗体• 33 、反应的溶液、反应的溶液• 44 、增浊剂的使用、增浊剂的使用

Page 25: 沉淀反应 PRECIPITATION

Beckmancoulter IMMAGE 双光径免疫浊度分析仪

第一光径:速率散射法,670nm波长, 90 度检测角,激光光源测定小分子物质。

第二光径:近红外颗粒速率免疫分析法, 940nm波长, 180 度检测角, LED 光源测定中、大型分子。

Page 26: 沉淀反应 PRECIPITATION

设计特点设计特点• (1)(1) 方法学的选择: 方法学的选择: ImmageImmage 检测仪除保留检测仪除保留了原有的速率散射比浊法外,新增加了近红了原有的速率散射比浊法外,新增加了近红外速率透射比浊分析,以使检测范围进一步外速率透射比浊分析,以使检测范围进一步扩大,检测敏感性和准确性进一步提高。扩大,检测敏感性和准确性进一步提高。

• (2)(2) 抗原过量的检测:对反应介质中抗原过量的检测:对反应介质中 PEGPEG 对对血浆样本中其它蛋白质类物质发生非特异沉血浆样本中其它蛋白质类物质发生非特异沉淀作用而引起的非特异干扰信号的出现作出淀作用而引起的非特异干扰信号的出现作出了新的防范处理。了新的防范处理。

Page 27: 沉淀反应 PRECIPITATION

• (3)(3) 新的检测项目和方法: 新的检测项目和方法: 四种方法分别是:速率散射比浊法、速四种方法分别是:速率散射比浊法、速

率免疫抑制法、近红外颗粒速率免疫分析率免疫抑制法、近红外颗粒速率免疫分析法、近红外颗粒速率散射抑制法。 法、近红外颗粒速率散射抑制法。

其中速率散射比浊法和近红外颗粒速率其中速率散射比浊法和近红外颗粒速率散射抑制法最主要用于体液(主要血浆)散射抑制法最主要用于体液(主要血浆)中小分子药物浓度的检测。这些方法的合中小分子药物浓度的检测。这些方法的合理使用,使理使用,使 ImmageImmage 进一步扩大了检测菜进一步扩大了检测菜单。单。

Page 28: 沉淀反应 PRECIPITATION

检测项目分类组合:检测项目分类组合:

•( ( 一一 ) ) 心血管疾病       心血管疾病       (( 二二 ) ) 血液病血液病检测项目:           检测项目:检测项目:           检测项目:载脂蛋白载脂蛋白 A-1A-1           抗凝血酶          抗凝血酶 IIIIII载脂蛋白载脂蛋白 BB            转铁蛋白           转铁蛋白脂蛋白脂蛋白 (a)(a)            触珠蛋白           触珠蛋白超敏超敏 CRPCRP                           BB 因子因子

Page 29: 沉淀反应 PRECIPITATION

• (( 三三 ) ) 肾功能监测        肾功能监测         (( 四四 ) ) 神经系统疾病神经系统疾病检测项目            检测项目:检测项目            检测项目:尿微量白蛋白          白蛋白尿微量白蛋白          白蛋白转铁蛋白            转铁蛋白             α2-α2- 巨球蛋白巨球蛋白α2-α2- 巨球蛋白           巨球蛋白           IgAIgA 、 、 IgGIgG 、、 IgMIgMβ2-β2- 微球蛋白              微球蛋白              α1-α1- 微球蛋白微球蛋白IgG, IgAIgG, IgA痕迹蛋白痕迹蛋白

Page 30: 沉淀反应 PRECIPITATION

• (( 五五 )) 免疫功能障碍       免疫功能障碍       (( 六六 )) 营养状态监测营养状态监测免疫球蛋白免疫球蛋白 AA           检测项目:          检测项目:免疫球蛋白免疫球蛋白 GG           白蛋白          白蛋白免疫球蛋白免疫球蛋白 MM           前白蛋白          前白蛋白免疫球蛋白免疫球蛋白 EE           转铁蛋白          转铁蛋白lgGlgG 亚型            铁蛋白亚型            铁蛋白κκ 轻链轻链 // 游离游离 κκ 轻连                 轻连                       λλ 轻链轻链 // 游离游离 λλ 轻连轻连补体补体 C3C3补体补体 C4C4C-C- 反应蛋白反应蛋白 (CRP)(CRP)

Page 31: 沉淀反应 PRECIPITATION

• (( 七七 ) ) 炎症状况监测       炎症状况监测       (( 八八 )) 类风湿性关节炎类风湿性关节炎检测项目:           检测项目检测项目:           检测项目C-C- 反应蛋白           类风湿因子反应蛋白           类风湿因子α1-α1- 酸性糖蛋白         酸性糖蛋白         C-C- 反应蛋白反应蛋白触珠蛋白            抗链球菌溶血素触珠蛋白            抗链球菌溶血素 OO铜蓝蛋白铜蓝蛋白DNase-BDNase-B

Page 32: 沉淀反应 PRECIPITATION

• (( 九九 )) 肝脏疾病         肝脏疾病         (( 十十 )) 新生儿体检新生儿体检α1-α1- 抗胰蛋白酶         抗胰蛋白酶         α1-α1- 抗胰蛋白酶抗胰蛋白酶抗凝血酶Ⅲ           抗凝血酶Ⅲ           C-C- 反应蛋白反应蛋白铜蓝蛋白           前白蛋白铜蓝蛋白           前白蛋白补体补体 C3C3 、、 C4C4免疫球蛋白免疫球蛋白 AA 、、 MM

Page 33: 沉淀反应 PRECIPITATION

• (十一)药物浓度(十一)药物浓度地高辛地高辛卡马西平卡马西平苯巴比妥苯巴比妥茶碱茶碱采布霉素采布霉素苯妥因苯妥因VPAVPA庆大霉素庆大霉素

Page 34: 沉淀反应 PRECIPITATION

第二节 凝胶内沉淀试验 第二节 凝胶内沉淀试验

一、单向琼脂扩散试验 : (single gel diffusion test) 试管法 平板法

二、双向琼脂扩散试验: (double gel diffusion test)

Page 35: 沉淀反应 PRECIPITATION

Ab

Ag

试管法单单向向琼琼脂脂扩扩散散试试验验

Page 36: 沉淀反应 PRECIPITATION

• 原理

把抗原液小心地加于已含抗体琼脂的细试管内,当对应的抗原与抗体相遇,在界面处形成清晰的乳白色沉淀环。

•方法评价: 敏感度较低、简便、 快速、实用、只能 定性不能定量、缺 乏多对分辨力。

•临床意义: 排泄物和组织匀浆中的细菌、寄生虫、螺旋体的检测。

Page 37: 沉淀反应 PRECIPITATION

平板法

标准品抗原浓度测定

不同病人抗原浓度测定

• 原理

将一定量的抗体混入琼脂凝胶中,使待测抗原在凝胶中自由扩散,与相应抗体结合形成沉淀环,沉淀环大小与抗原浓度呈正相关。

Page 38: 沉淀反应 PRECIPITATION

1. 测定沉淀环直径2. 在标准曲线上查找 相应抗原浓度

绘制标准曲线绘制标准曲线

Page 39: 沉淀反应 PRECIPITATION

影响因素影响因素 1. 抗原分子量:与扩散速度、沉淀环反相关

6. 琼脂板厚度:与沉淀环反相关

2. 抗体种类:兔抗血清优于马、羊

3. 抗体稀释度:抗体浓度大沉淀环小

4. 扩散时间:抗原含量高,扩散时间长 5. 扩散温度: 4 ~ 37℃ 内温度与扩散速度正相关

Page 40: 沉淀反应 PRECIPITATION

• 原理

二、双向琼脂扩散试验二、双向琼脂扩散试验

将可溶性抗原和抗体置于琼脂凝胶板的对应孔中,两者各自在凝胶中向四周自由扩散,当抗原与抗体相遇,在比例合适时形成沉淀线。

(double gel diffusion test)

Page 41: 沉淀反应 PRECIPITATION

原理示意图原理示意图

AbAg

模拟图

染色标本图

1. 抗原抗体双向自由扩散2.24 小时出结果3. 呈现沉淀线或弧

Page 42: 沉淀反应 PRECIPITATION

1. 检测未知抗原或抗体

2. 抗原性质分析

3. 抗体效价滴定

4. 抗原或抗体纯度鉴定

Page 43: 沉淀反应 PRECIPITATION

Ag

Ab

A B C D E F

A: 浓度 Ag 、 Ab及扩散率近似; B :浓度 Ag 、 Ab近似,扩散率 Ag> Ab ; C :浓度 Ag 、 Ab近似,扩散率 Ag< Ab ; D:浓度 Ag> Ab ,扩散率近似;

E :浓度 Ag> Ab ,扩散率 Ag> Ab ; F :浓度 Ag< Ab ,扩散率 Ag< Ab ;

Page 44: 沉淀反应 PRECIPITATION

2.2. 抗原性质分析抗原性质分析

2 表示标准 Ag

1 表示待检 Ag

待检 Ag 与标准抗原完全吻合

待检 Ag 中含有与标准 Ag 相同的 Ag;还有另外的 Ag 与 Ab相对应待检 Ag 有与 Ab 相对应的 Ag ,但与标准 Ag 不同

待检 Ag 与标准 Ag 性质相同;但含量较低;

Page 45: 沉淀反应 PRECIPITATION

1. 周围 6 个孔放不同稀释度的相应 Ab 。

2. 以出现沉淀线的血清最高稀释倍数为 该抗体的效价。

3. 可进行任意稀释。

Page 46: 沉淀反应 PRECIPITATION

“1” 为单一抗原抗体系统。

“n” 为多个抗原抗体系统。

* 可以用混合抗原鉴定抗体纯度。

* 可以用混合抗体鉴定抗原纯度。