-原著-

微小 RNA-21 对人乳腺癌细胞株紫杉醇耐药性的影响及其机制

赵遵兰1, 2

, 蔡颖1, 2

, 王洋洋1, 2

, 夏春磊3, 李从新

3, 陈素莲

4, 杨清玲

4, 陈昌杰

4

1. 蚌埠医学院临床检验诊断学实验中心，安徽 蚌埠 233000

2. 蚌埠医学院肿瘤转化医学中心，安徽 蚌埠 233000

3. 蚌埠医学院生物科学系，安徽 蚌埠 233000

4. 蚌埠医学院生物化学与分子生物学教研室，安徽 蚌埠 233000

收稿日期:2014-09-23 接受日期：2015-03-06

基金项目：国家自然科学基金（81071848）；安徽省自然科学基金（1508085MH159）；安徽

省教育厅自然科学重点研究项目（KJ2013A184，KJ2010A240）；国家级大学生创新项目

（201310367014）

第一作者：赵遵兰(1989-),女，硕士研究生，主要从事癌症发生发展的机制研究；E-mail：

zhaozunlan@163.com；http://orcid.org/0000-0002-4741-2198

通讯作者：陈昌杰（1968-），男，博士，教授，硕士生导师，主要从事基因诊断与生物治

疗研究； E-mail：tochenchangjie@163.com；http://orcid.org/0000-0001-9646-320X

[摘要] 目的：探讨微小 RNA-21 (miR-21)对两人乳腺癌细胞紫杉醇耐药株 MCF-7/PR 和

SKBR-3/PR 细胞生物学活性的影响。方法：体外研究采用紫杉醇逐步加量诱导法建立人乳腺

癌细胞紫杉醇耐药株；通过观察细胞形态的变化和检测耐药基因 MDR1、BCRP、MRP1 的表达

以鉴定耐药细胞株；检测在MCF-7和 SKBR-3 亲本及耐药细胞中miR-21和凋亡相关基因Bax、

Bcl-2 的表达水平；并用 miR-21 抑制剂和模拟物分别转染 MCF-7 和 SKBR-3 耐药和亲本细胞

株，MTT 法和流式细胞术检测转染 miR-21 抑制剂后细胞对紫杉醇的敏感程度和细胞周期、

凋亡的变化，并检测耐药基因和凋亡相关基因的表达。结果：成功建立人乳腺癌 MCF-7/PR、

SKBR-3/PR 耐药细胞株，耐药细胞株中耐药基因 MDR1、BCRP、MRP1 表达均升高，抗凋亡基

因 Bcl-2 升高，凋亡基因 Bax 下降，miR-21 表达升高(P<0.05)；与对照组相比，miR-21 抑

制剂可提高耐药细胞株对紫杉醇的药物敏感性，增加细胞凋亡水平，增加细胞周期 G0/G1期

细胞(P<0.05)，并可抑制耐药细胞株耐药基因的表达，降低 Bcl-2/Bax 比值(P<0.05)，而

miR-21 模拟物可刺激亲本细胞出现耐药细胞形态改变，并上调耐药基因的表达及

Bcl-2/Bax 比值(P<0.05)。结论：乳腺癌紫杉醇耐药细胞株 MCF-7/PR 和 SKBR-3/PR 的 miR-21

表达上调；抑制 miR-21 的表达可逆转人乳腺癌 MCF-7/PR、SKBR-3/PR 细胞株对紫杉醇化疗

的耐药性。

[关键词] miRNA-21；乳腺癌；耐药性

The effects of miRNA-21 on multidrug resistance and their mechanism in

Paclitaxel-resistance breast cancer cells

ZHAO Zun-lan1,2, CAI Ying

1,2, WANG Yang-yang

1,2, XIA Chun-lei

3, LI Cong-xin

3, CHEN

Su-lian4, YANG Qing-ling

4, CHEN Chang-jie

4(1.Clinical Testing and Diagnose

Experimental Center, Bengbu Medical College,Bengbu,233000,China; 2. Centre for

Translational Medicine on Tumor, Bengbu Medical College, Bengbu,233000,China; 3.

Department of Bioscience, Bengbu Medical College, Bengbu,233000,China;

4.Department of Biochemistry & Molecular Biology, Bengbu Medical College, Bengbu,

233000, China)

Corresponding author： CHEN Chang-jie，E-mail：tochenchangjie@163.com

[Abstract] Objective: To explore the effects of miR-21 gene expression changes on

paclitaxel resistance in human breast cancer cells MCF-7/PR and SKBR-3/PR. Methods:

Paclitaxel-resistant cell line of human breast cancer (MCF-7/PR and SKBR-3/PR ) was

established by continuous stepwise selection in increasing concentration of

paclitaxel. Cellular morphology, mRNA and protein level of MDR1, BCRP and MRP1 were

investigated to determine the drug resistance features of MCF-7/PR and SKBR-3/PR

cell lines. RT-PCR and western blotting were used to analyze the expression of Bax,

Bcl-2 and miR-21 between parental and paclitaxel-resistant cells. After synthetic

miR-21 inhibitor and miR-21 mimic were respectively transfected into MCF-7/PR,

SKBR-3/PR and MCF-7, SKBR-3 breast cancer cells with lipofectamine 2000 vector,

miR-21 level was determined by RT-PCR. Western bloting was employed to detect the

protein level of P-gp, Bcl-2 and Bax. MTT assay was used to measure the drug

sensitivity, while flow cytometry was performed to analyze the cell cycle and

apoptosis. Results: The level of MDR1, BCRP, MRP1, Bcl-2/Bax and miR-21 in MCF-7/PR

and SKBR-3/PR were significantly higher than that in MCF-7 and SKBR-3. The protein

levels of P-gp, Bcl-2 were up-regulated, and Bax was down-regulated compared with

parental cells. All these results showed that paclitaxel-resistant breast cancer

cell lines MCF-7/PR and SKBR-3/PR were established successfully. miR-21 was

significantly downregulated after miR-21 inhibitor was transfected. Additionally,

downregulation of miR-21 in the MCF-7/PR and SKBR-3/PR breast cancer cell lines were

concurrent with the downregulation of the level of MDR1 , BCRP, MRP1 and Bcl-2/Bax

(P<0.05). Also our results demonstrated that miRNA inhibitors specially targeting

miR-21 significantly suppressed G0/G1 transition of the cell cycle, and induced cell

apoptosis in MCF-7/PR and SKBR-3/PR breast cancer cells. In addition, the MTT results

showed that miR-21 inhibitors induced sensitivity to the paclitaxel in human breast

cancer cells. And miR-21 mimic can rise the level of MDR1, Bcl-2/Bax and stimulate

the morphology of parental cells to resistant cells. Conclusions: The established

MCF-7/PR and SKBR-3/PR breast cancer cells show typical multidrug resistance

characteristics, which can be used as the models for resistance mechanism study.

Downregulated miR-21 expression in MCF-7/PR and SKBR-3/PR breast cancer cells

increased sensitivity to paclitaxel.

[Key words]: miRNA-21; breast cancer; drug resistance

乳腺癌已成为我国女性最常见的恶性肿瘤之一。紫杉醇为治疗乳腺癌的一线药物，对进

展期乳腺癌具有显著的抗肿瘤活性，可提高新辅助化疗的疗效。但是乳腺癌化疗耐受导致化

疗失败仍然是乳腺癌治疗中的一个巨大的障碍。乳腺癌患者微小 RNA(microRNA, miRNA 或

miR)的差异表达与淋巴结转移、雌激素受体或人类表皮生长因子受体 2表达、化疗耐药等生

物学行为相关[1-3]

。研究发现 miR-21 与乳腺癌的临床分期、病理分级、激素受体等生物学指

标密切相关[4]。本研究通过建立人乳腺癌细胞株 MCF-7 和 SKBR-3 的紫杉醇耐药株，检测

miR-21 在 MCF-7 和 SKBR-3 亲本和耐药株中的表达差异，并进一步分析 miR-21 对紫杉醇耐

药的影响及相关机制，为临床逆转耐药，辅助化疗提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料

人乳腺癌细胞株 MCF-7、SKBR-3 购自中国科学院细胞库；紫杉醇、四甲基偶氮唑盐（MTT）、

二甲亚砜(DMSO)、焦碳酸二乙酯(DEPC)购自美国 Sigma 公司；Trizol、Lipofectamine 2000

及 Opti-DMEM 购自美国 Invitrogen 公司；逆转录试剂盒购自美国 Fermentas 公司；鼠抗人

P-糖蛋白(P-glycoprotein, P-gp)、Bcl-2、Bcl-2 相关 X 蛋白（Bcl-2 associated X protein，

Bax）和 β-actin 抗体购自美国 Santa Cruz 公司；辣根过氧化物酶(HRP)标记山羊抗小鼠

IgG 购自北京中杉金桥生物公司；细胞凋亡试剂盒购自美国 BD 公司；聚偏氟乙烯(PVDF)印迹

膜、ECL 化学发光试剂盒购自美国 Millipore 公司；has-miR-21 及人源 snRNAU6 均购自广州

复能基因有限公司；miR-21 抑制剂（5’UCAACAUCAGUCUGAUAAGCUA3’）和模拟物（正义链

5’UAGCUUAUCAGACUGAUGUUGA3’ ，反义链 5’AACAUCAGUCUGAUAAGCUAUU 3’）购自上海吉

玛 制 药 技 术 有 限 公 司 ； 多 药 耐 药 相 关 蛋 白 （ multidrug resistance-associated

protein ,MRP）1、乳腺癌耐性蛋白（breast cancer resistance protein, BCRP）、多药

耐 药 基 因 1 （ multidrug resistance 1,MDR1 ） 、 甘 油 醛 -3- 磷 酸 脱 氢 酶

（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase, GAPDH）基因的引物由南京金斯瑞生物科

技公司合成；逆转录试剂盒购自美国Thermo Scientific公司；SYBR®Premix Ex Taq™(Perfect

Real Time) 购自日本 TaKaRa 公司；All-in-one™miRNAqRT-PCR Detection Kit 购自美国

GeneCopoeia 公司；Muse Annexin V & Dead Cell Kit 购自德国 Merck Millipore 公司。

1.2 细胞培养及形态学观察

人乳腺癌细胞株 MCF-7、SKBR-3 培养于含 10%灭活胎牛血清的 RPMI1640 培养液中，置

于 37℃ 、5% 二氧化碳饱和湿度的培养箱中，每 3 天传代一次，以下实验均采用对数期生

长细胞。用倒置显微镜观察细胞形态学的变化。

1.3 MTT 法检测紫杉醇对 MCF-7、SKBR-3 细胞的半数抑制浓度

0.25%胰酶消化 MCF-7、SKBR-3 细胞，调整细胞密度为 1×105/mL，每孔 100 μL 接种于

96 孔板中；37℃、5% 二氧化碳培养箱中培养，24h 后加入含紫杉醇的培养液 100 μL，设

置药物浓度梯度（MCF-7 细胞分别为 0.001、0.01、0.1、1、10、100μmol/L；SKBR-3 细胞

分别为 0.01、0.1、1、10、50μmol/L），每一浓度设置 5 个复孔，同时设置不加药物的对

照组，继续培养 72 h；每孔加入 5 mg/mL MTT 液 20 μL，继续培养 4 h 后轻轻吸出上清液，

每孔加入 150 μL DMSO，微量震荡器震荡 10 min，用酶标仪检测 490 nm 处各孔的吸光度值；

以空白孔调零，计算细胞生长抑制率。生长抑制率（%）=1-(实验组平均吸光度值/对照组平

均吸光度值)×100%；根据生长抑制率计算半数抑制浓度（IC50），每组实验独立重复 3 次。

1.4 建立人乳腺癌紫杉醇耐药细胞株 MCF-7/PR 和 SKBR-3/PR

MCF-7、SKBR-3 细胞融合度为 70%~80%时，以 1 μmol/L 为起始浓度的紫杉醇作用于细

胞；培养 24 h 后撤药，继续常规培养，待细胞恢复稳定生长后再添加同一浓度药物，培养

24 h 撤药；继续培养至生长良好且稳定时进行浓度逐步递增性诱导，历经 6 个月建立乳腺

癌耐药细胞株 MCF-7/PR 和 SKBR-3/PR；MCF-7/PR 细胞在含 10 μmol /mL 紫杉醇培养液中稳

定生长，SKBR-3/PR 细胞在含 25 μmol/mL 紫杉醇培养液中稳定生长。

1.5 细胞转染 miR-21 抑制剂和模拟物

将miR-21 抑制剂转染MCF-7/PR和SKBR-3/PR细胞，miR-21 模拟物转染MCF-7和SKBR-3

细胞。实验分为 4 组：miR-21 抑制剂组、miR-21 模拟物组、 阴性对照组和空白对照组。

阴性对照组为不引起细胞内基因改变的基因片段加脂质体 Lipofectamine 2000 转染细胞；

空白对照组细胞仅转染脂质体。具体操作步骤如下：0.25%胰酶消化对数生长期的耐药或亲

本细胞，6 孔板中每孔接种 4×105/mL 细胞，第二天细胞贴壁达到 70%~80%；将 5 μL 浓度

为 20 μmol/L 的 miR-21 抑制剂或 miR-21 模拟物及相应阴性对照稀释于 250μL 无血清培

养基中，5μL 的 Lipofectamine 2000 稀释于 250 μL 无血清培养基中，室温静置 5 min；

将稀释的 miR-21 抑制剂或 miR-21 模拟物及相应阴性对照与稀释的 Lipofectamine 2000

混合，室温静置 20 min；6 孔板换液每孔加入 1.5mL 完全培养基，将转染混合物缓慢加入 6

孔板，培养 6 h 后更换 10% RPMI 1640 完全培养基，继续培养。

1.6 Annexin V/PI 染色检测细胞凋亡

取对数生长期细胞胰酶消化后，离心收集细胞，4 ℃预冷 PBS 洗涤细胞两次，弃上清液；

按 Muse Annexin V & Dead Cell Kit 说明书进行操作，轻轻混匀，避光孵育 20 min；流式

细胞仪检测细胞凋亡，结果采用 ModFitLTV3.0 软件进行细胞凋亡率分析。每组实验重复 3

次。

1.7 PI 染色检测细胞周期分布

取对数生长期细胞胰酶消化，离心收集细胞，4 ℃预冷 PBS 洗涤细胞两次，弃上清液；

加入 4 ℃预冷的 70%乙醇重悬细胞，4 ℃固定过夜；离心收集固定完全的细胞，弃去 70%乙

醇；4 ℃预冷 PBS 洗涤细胞两次，弃上清液；加入 500 μL 4℃预冷的 PI 染色液（5mg PI+2mg

RNaseA+0.1 mL 1.0%Trition X-100+3.7 mg EDTA+10 mL PBS，棕色瓶 4℃保存，工作浓度

50 μg/mL）重悬细胞，避光染色 30 min；流式细胞仪检测，结果采用 ModFitLTV3.0 软件

进行各周期细胞的百分比分析。每组实验重复 3 次。

1.8 实时 PCR 检测耐药、凋亡相关基因 mRNA 及 miR-21 的表达

Trizol 法提取总 RNA，根据操作说明书进行逆转录反应，分别以 SYBR®Premix Ex

Taq™(Perfect Real Time) 或 All-in-one™miRNA qRT-PCR Detection Kit 说明书进行耐药

和凋亡相关基因及 miR-21 实时 PCR 检测， GAPDH 和 snRNAU6 作为内参。相对表达量计算公

式为：RQ=2-△△CT

，其中耐药和凋亡相关基因表达的△△

CT=(CT（目的基因）-CT（GAPDH）)处理组- CT（目

的基因）- CT（GAPDH）)对照均值； miR-21 表达的△△

CT=( CT（miRNA）- CT（U6 RNA）)处理组-( CT（miRNA）- CT

（U6 RNA）)对照均值。

表 1 实时 PCR 引物序列

Table 1 The sequences of real time quantitive RT-PCR primers

基因名称 上游引物 下游引物 片段长度(bp)

MRP1 acttcctctatctctcccgaca aagactgaactcccttcctcct 246

BCRP ctcagtttatccgtggtgtgtc gattgttcgtccctgcttagac 176

MDR1 gtacccatcattgcaatagc caaacttctgctcctgagtc 157

Bcl-2 atgtgtgtggagagcgtcaa acagttccacaaaggcatcc 136

Bax ggggacgaactggacagtaa cagttgaagttgccgtcaga 122

GAPDH cagcctcaagatcatcagca tgtggtcatgagtccttcca 106

1.9 蛋白质印迹法检测蛋白表达

胰酶消化对数生长期细胞，加入蛋白裂解液，充分吹打混匀，冰上放置 30min，4 ℃

离心取上清液；采用蛋白质二喹啉甲酸法(BCA 法)进行蛋白定量分析；10% SDS-PAGE 凝胶电

泳，蛋白样品总量为 20 µg，蛋白 Marker 上样量为 5 µL；电泳结束后转至 PVDF 膜，5%脱

脂奶粉室温封闭 3 h，孵育一抗：分别加入将鼠抗人 P-gp、Bcl-2、Bax、和 β-actin 抗体

4 ℃共同孵育过夜（工作浓度为 1:1000），TBST 缓冲液洗膜 3 次，每次 10 min，辣根过氧

化物酶标记的兔抗鼠 IgG（1:5000）37 ℃孵育 2 h 后，PVDF 膜化学发光显影，BIO-RAD 成

像系统拍照,AlphaView SA 凝胶成像分析软件灰度扫描，定量分析蛋白含量。

1.10 统计学分析

所有数据采用 SPSS13.0 统计软件进行处理，计量资料以均数±标准差（ χ S± ）表示，

两样本均数间差异用 t检验，多组样本均数之间差异采用方差分析，P＜0.05 表示差异有统

计学意义。

2. 结果

2.1 人乳腺癌细胞 MCF-7 和 SKBR-3 形态学观察

光镜下， MCF-7 和 SKBR-3 细胞贴壁生长，细胞生长均匀，边缘清晰，MCF-7 细胞呈多

边形，SKBR-3 细胞呈梭形。而 MCF-7/PR 和 SKBR-3/PR 细胞胞质空泡形成、颗粒增多，细胞

伸出许多不规则树突状分支，整体呈现蜘蛛状或星状。见图 1。

图 1 人乳腺癌细胞 MCF-7 和 SKBR-3 亲本和紫杉醇耐药细胞株形态学观察 (标尺=50μm)

Fig.1 Optical morphology of MCF-7 and SKBR-3 parental and Paclitaxel resistant

cells(bar=50μm)

2.2 人乳腺癌细胞 MCF-7 和 SKBR-3 对紫杉醇的半抑制浓度

采用 MTT 法测定紫杉醇对 MCF-7 和 SKBR-3 细胞的生长抑制率，以紫杉醇药物浓度

（μmol/L）的对数值为横坐标，以细胞生长抑制率（%）为纵坐标绘制剂量-抑制率曲线。

经测定，紫杉醇作用 72 h 后 MCF-7 的 IC50为（5.64±0.15） μmol/L，SKBR-3 的 IC50为

（4.61±2.17） μmol/L。见图 2。

SKBR-3

MCF-7 MCF-7/PR

SKBR-3/PR

图 2 紫杉醇对乳腺癌 MCF-7和 SKBR-3细胞的生长抑制曲线

Fig. 2 The growth inhibition curve of MCF-7 and SKBR-3 cells treated with Paclitaxel

2.3 MCF-7、SKBR-3 亲本和紫杉醇耐药细胞耐药和凋亡相关基因 mRNA 及 miR-21 的表达

与 MCF-7 和 SKBR 细胞相比，MCF-7/PR、SKBR-3/PR 细胞株中 MDR1、BCRP、MRP1 和 Bcl-2

mRNA 表达均上调，Bcl-2/Bax 比值升高，miR-21 表达上调(均 P<0.05)，见图 3。提示人乳

腺癌细胞 MCF-7 和 SKBR-3 经紫杉醇诱导后多药耐药相关基因表达增加，说明紫杉醇耐药细

胞模型诱导成功，miR-21 在耐药细胞株中表达升高。

与相应亲本对照，* P<0.05.

图 3 MCF-7 和 SKBR-3 亲本和紫杉醇耐药细胞株中多药耐药相关基因、Bcl-2、Bax mRNA

和 miR-21 的表达水平比较

Fig.3 Expression of multidrug resistance related gene, Bcl-2, Bax mRNA and miR-21

in MCF-7 and SKBR-3 parental and Paclitaxel resistant cells

2.4 MCF-7 和 SKBR-3 亲本和紫杉醇耐药细胞耐药及凋亡相关蛋白的表达

与 MCF-7、SKBR-3 细胞株相比，MCF-7/PR、SKBR-3/PR 细胞 P-gp 和 Bcl-2 蛋白表达升

高，Bax 蛋白表达降低（均 P<0.05）。结果提示紫杉醇耐药细胞 MCF-7/PR、SKBR-3/PR 多药

耐药基因编码产物 P-gp 和抗凋亡基因 Bcl-2 蛋白表达增强。

图 4 MCF-7 和 SKBR-3 亲本及紫杉醇耐药细胞 P-gp、Bcl-2 和 Bax 蛋白表达比较

Fig. 4 P-gp, Bcl-2 and Bax protein expression in MCF-7 and SKBR-3 parental and

Paclitaxel resistant cells

2.5 miR-21 模拟物对 MCF-7 和 SKBR-3 细胞形态的影响

miR-21 模拟物作用于 MCF-7 和 SKBR-3 细胞 72h 后，光镜下可见 MCF-7 细胞株由多边形

伸出不规则分支，细胞形态延长，黏附下降；SKBR-3 细胞由正常的梭形变为更为细长，伸

出很长的树突状分支，细胞整体呈蜘蛛状或星状，表现耐药细胞的形态。

图 5 miR-21 模拟物对 MCF-7 和 SKBR-3 细胞形态的影响 (标尺=50μm)

Fig. 5 The effects of miR-21 mimic on MCF-7 and SKBR-3 cells morphology (bar=50μm)

2. 6 miR-21 抑制剂对 MCF-7/PR 和 SKBR-3/PR 细胞紫杉醇敏感性的影响

MTT 分析转染 miR-21 抑制剂后耐药细胞株增殖情况。相对于空白对照组，阴性对照组

不影响耐药细胞的增殖，而 miR-21 抑制剂可明显抑制细胞的增殖。因此，抑制 miR-21 表

达可提高乳腺癌耐药细胞对紫杉醇的敏感性。

图 6 miR-21 抑制剂对 MCF-7/PR 和 SKBR-3/PR 细胞紫杉醇敏感性的影响

Fig.6 Drug susceptibility of MCF-7/PR and SKBR-3/PR cells with Taxol action after

transfected miR-21 inhibitor

2.7 miR-21 抑制剂对 MCF-7/PR 和 SKBR-3/PR 细胞凋亡的影响

与空白对照组和阴性对照组相比，miR-21 抑制剂组 MCF-7/PR、SKBR-3/PR 细胞的凋亡

均增加(均 P＜0.05)。表明 miR-21 抑制剂能促进 MCF-7/PR、SKBR-3/PR 细胞凋亡。见表 2。

表 2 miR-21 抑制剂对 MCF-7/PR 和 SKBR-3/PR 细胞凋亡率的影响

Table 2 The cell apoptpsis of MCF-7/PR and SKBR-3/PR cell after transfected miR-21

inhibitor

（ χ S± ,%）

组别 MCF-7/PR SKBR-3/PR

空白对照组 3.863±0.1387 4.547±0.2267

阴性对照组 3.667±0.1532 4.760±0.2050

miR-21 抑制剂组 13.44±0.3327*# 17.34±0.2454

*#

与空白对照组比较，*P<0.05；与阴性对照组比较，# P<0.05

2.8 miR-21 抑制剂对 MCF-7/PR 和 SKBR-3/PR 细胞细胞周期的影响

与阴性对照组相比，miR-21 抑制剂组 MCF-7/PR、SKBR-3/PR 细胞 G0/ G1期比例升高，S

期和 G2期比例降低(P＜0.05)。提示 miR-21 抑制剂导致 MCF-7/PR、SKBR-3/PR 细胞 G0/ G1

期阻滞，见表 3。

表 3 miR-21 抑制剂对 MCF-7/PR 和 SKBR-3/PR 细胞周期的影响

Table 3 The cell cycle of MCF-7/PR and SKBR-3/PR cell after transfected miR-21

inhibitor

MCF-7/PR SKBR-3/PR

（ χ S± ，%）

组别 MCF-7/PR SKBR-3/PR

G0/G1 期 S 期 G2/M期 G0/G1 期 S 期 G2/M期

阴性对照

组

45.17

±1.074

32.27

±1.132

14.70

±0.6245

48.27

±1.110

33.47

±1.260

12.10

±0.6807

miR-21

抑制剂组

P值

58.77

±1.244

<0.05

26.83

±0.8988

<0.05

8.633

±0.6064

<0.05

70.00

±1.159

<0.05

21.57

±0.9905

<0.05

5.667

±0.9701

<0.05

2.9 miR-21 对 MCF-7/PR、SKBR-3/PR 细胞耐药和凋亡相关基因表达的影响

与空白对照组及阴性对照组比较，miR-21 抑制剂组 miR-21 表达下调，耐药相关基因

MDR1、凋亡相关基因 Bcl-2 表达下调，Bax 表达上调(均 P＜0.05)；miR-21 模拟物组耐药

相关基因 MDR1、凋亡相关基因 Bcl-2 表达上调，Bax 表达下调(均 P＜0.05)。提示抑制 miR-21

表达可逆转 MCF-7/PR、SKBR-3/PR 细胞对紫杉醇的耐药性，促进细胞凋亡。见图 8 和图 9。

图 7 miR-21 抑制剂对 MCF-7/PR 和 SKBR-3/PR 细胞 miR-21 影响

Fig. 7 Expression of miR-21 in MCF-7/PR and SKBR-3/PR cells after transfected

miR-21 inhibitor

图 8 miR-21 对 MCF-7 和 SKBR-3 亲本和紫杉醇耐药细胞 MDR1 mRNA 表达的影响

Fig.8 Expression of MDR1 mRNA in MCF-7 and SKBR-3 parental and Paclitaxel resistant

cells by miR-21

图 9 miR-21 对 MCF-7 和 SKBR-3 亲本和耐药细胞 Bcl-2 和 Bax mRNA 表达的影响

Fig.9 Expression of Bcl-2 and Bax mRNA in MCF-7 and SKBR-3 parental and Paclitaxel

resistant cells by miR-21

2. 10 miR-21 对 MCF-7/PR、SKBR-3/PR 细胞耐药和凋亡相关蛋白的表达影响

与空白对照和阴性对照组比较，miR-21 抑制剂下调耐药相关蛋白 P-gp 和凋亡相关蛋白

Bcl-2 表达，而上调 Bax 蛋白表达（P<0.05）。miR-21 模拟物上调耐药相关蛋白 P-gp 和凋

亡相关蛋白 Bcl-2 表达，而下调 Bax 蛋白表达（P<0.05）。提示抑制 miR-21 表达，可逆转

细胞耐药性，促进凋亡。

图 10 miR-21 模拟物及抑制剂对 MCF-7、SKBR-3 亲本和紫杉醇耐药细胞 P-gp、Bcl-2 和 Bax

蛋白表达的影响

Fig.10 The expression of P-gp Bcl-2 and Bax protein in MCF-7, SKBR-3 parental and

Paclitaxel resistant cells by miR-21 mimic or inhibitor

3 讨 论

紫杉醇是一种植物类抗肿瘤药物，对乳腺癌初治有效率达 32%～60%，多药耐药是肿瘤

化疗失败最常见的原因，耐药性产生与 ATP 结合盒蛋白家族（ABC）的药物转运载体的过表

达相关，包括 MDR1 及其编码产物 P-gp、MRP 和 BCRP[5]。miRNA 是一类大小在 21-23 个核苷

酸的内源性的非编码 RNA[6]，通过下调靶基因的表达或翻译而参与调节细胞的增殖、分化和

凋亡[7-8]

。miRNA 的特异性表达与特定肿瘤密切相关[9-11]

。多项研究表明，miRNA 参与乳腺癌

紫杉醇耐药过程，如 miR-221 可作为乳腺癌患者接受过新辅助化疗后产生化疗耐药的生物标

记物[12]

，miRNA-200c 的下调与乳腺癌耐药相关[13]

。说明 miRNA 的表达异常可能与乳腺癌耐

药性的获得有着极其密切的联系。

miR-21 位于 17p23.2 染色体区域的脆性位点 FRA17B，通过调控其靶基因，影响细胞的

分化、增殖和凋亡。近几年，有研究者发现 miR-21 影响肿瘤耐药性。例如，Li 等[14]

发现

miR-21 反义寡核苷酸可以抑制白血病 HL-60 细胞的活力，增加细胞的凋亡。并且 miR-21 反

义寡核苷酸可以增加 HL-60 细胞对阿糖胞嘧啶诱导凋亡的敏感性。Wang 等[15]

发现 miR-21 抑

制剂联合细胞毒性药物地塞米松或阿霉素对骨髓瘤细胞的杀伤力比单独使用细胞毒性药物

的作用明显。在对非小细胞肺癌进行研究时，抑制 miR-21 的表达能增强肺癌耐顺铂（DDP）

细胞 A549/DDP 对顺铂的药物敏感性，而过表达 miR-21 可导致 A549 细胞对化疗药物耐药性

的发生[16]

。Tomimaru 等[17]

对肝癌细胞转染 miR-21 抑制剂能够增加肝癌细胞对 INF-α/5-FU

的敏感性。然而，miR-21 对乳腺癌在临床常用药物紫杉醇耐药中的作用未见报道。

本研究主要探讨miR-21在人乳腺癌细胞紫杉醇耐药中的角色，为临床逆转耐药、辅助化

疗提供依据。首先，采用低浓度加量持续诱导法建立人乳腺癌细胞紫杉醇耐药株MCF-7/PR

和SKBR-3/PR；通过观察细胞形态、耐药指标及生物学活性进行鉴定。相对于亲本细胞株，

紫杉醇耐药细胞呈现蜘蛛状或星状生长，耐药基因MDR1及其编码蛋白P-gp、BCRP、MRP1表达

均上调，表明耐药细胞建模成功。miR-21在耐药细胞株中表达上调。

为进一步明确miR-21在MCF-7和SKBR-3细胞紫杉醇耐药中的作用，以miR-21抑制剂抑制

miR-21的表达。结果显示转染miR-21抑制剂后，相对于空白对照组和阴性对照组，MCF-7/PR

和SKBR3/PR细胞中miR-21表达下调,MDR1及其编码蛋白P-gp下调。反之，miR-21 模拟物可刺

激MCF-7和SKBR-3亲本细胞株发生耐药细胞的形态改变，出现不规则分支，上调MDR1及其编

码蛋白P-gp的表达。P-gp过表达是多药耐药主要原因。P-gp具有凋亡抑制作用，为肿瘤耐药

与凋亡耐受之间在分子水平上建立了有机的联系。P-gp可延迟凋亡级联反应，保护耐药细胞

免予自由基、放射线及细胞毒性药物等诱导的多种形式caspase依赖型凋亡[18]

。目前通过实

验证明与肿瘤相关的miR-21调控的靶基因可能包括：原肌球蛋白基因1(TPM1)、程序性细胞

死亡因子4(PDCD4)、p53介导通路的基因，转化生长因子(TGF-β)通路、磷酸酶基因(PTEN)

等。miR-21能够通过与PTEN 3’非编码区序列的特异性结合，从而调控PTEN蛋白的表达水平[19]

。PTEN基因能够编码具有双特异性磷酸酶活性的蛋白，可以调控PI3K/Akt信号转导通路，

从而调控Bcl-2和Bax的表达水平，实现对胃癌耐药的逆转[20]

。为探究miR-21是调控乳腺癌

耐药细胞凋亡机制，本研究比较了亲本细胞与耐药细胞中Bcl-2/Bax比值的变化。MCF-7/PR

和SKBR-3/PR细胞相对于亲本细胞，Bcl-2/Bax比值升高。miR-21抑制剂可下调Bcl-2/Bax比

值。反之，miR-21模拟物上调Bcl-2/Bax比值。可见Bcl-2和Bax虽不是miR-21的直接靶基因，

但它们可能通过其他因子，间接被miR-21的调控。

同时，miR-21的下调增加细胞凋亡能力，G0/G1期细胞比例增加，说明miR-21的抑制物可

促进细胞凋亡，调控细胞周期抑制细胞增殖。因此，MCF-7/PR和SKBR-3/PR对紫杉醇产生的

耐药性可能与miR-21高表达有关，抑制miR-21的表达可能会逆转紫杉醇耐药，提高药物敏感

性。

综上所述，本研究通过对人乳腺癌MCF-7/PR，SKBR-3/PR耐药细胞转染miR-21抑制剂，

对亲本细胞转染miR-21模拟物，发现miR-21可能通过调控Bcl-2和Bax影响细胞的增殖、凋亡

水平，进而参与了乳腺癌细胞对紫杉醇的耐药。本研究提示miR-21可能是潜在的能够逆转乳

腺癌化疗耐药的新靶点，对今后抗癌药物的开发和应用极具价值。

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