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Rev Inv Vet Perú 2018; 29(3): 957-963http://dx.doi.org/10.15381/rivep.v29i3.14841
1 Laboratorio de Microbiología y Parasitología Veterinaria, Facultad de Medicina Veterinaria, Uni-versidad Nacional Mayor de San Marcos, Lima, Perú
2 Laboratorio de Histología, Embriología y Patología Veterinaria, Facultad de Medicina Veterinaria,Universidad Nacional Mayor de San Marcos, Lima, Perú
3 E-mail: [email protected]
Recibido: 5 de diciembre de 2017Aceptado para publicación: 4 de mayo de 2018
Ausencia del virus de Necrosis Hematopoyética Epizoótica(EHNv) en truchas arcoíris (Oncorhynchus mykiss) enfermas en
piscigranjas de la sierra del Perú
ABSENCE OF EPIZOOTIC HEMATOPOIETIC NECROSIS VIRUS (EHNV) IN DISEASED RAINBOW
TROUT (Oncorhynchus mykiss) FROM FISH FARMS IN THE PERUVIAN HIGHLANDS
Karen Bautista D.1, Alberto Manchego S.1,2, Gina Castro S.1, Nieves Sandoval C.3
RESUMEN
El objetivo del presente trabajo fue monitorear la detección del virus NecrosisHematopoyética Epizoótica (EHNv) en truchas (Oncorhynchus mykiss) de piscigranjasde la Sierra del Perú. Se tomaron muestras de 111 peces enfermos (hígado, bazo, riñónanterior) de piscigranjas de las regiones de Áncash, Junín y Huancavelica, Perú. Lasmuestras de tejidos fueron procesados de inmediato para el aislamiento bacteriano y otrogrupo de muestras fueron conservadas a -196 °C para el PCR. El ADN de cada tejido fueextraído mediante el método del Trizol y luego purificado con membranas de sílica(PureLinkGenomic DNA kit). El PCR se realizó utilizando los cebadores MCP-1 específi-cos para el EHNv siguiendo la metodología propuesta por la OIE y con el kit comercialVetPCRTM EHNV Detection para su confirmación. El aislamiento bacteriano se realizó conel sembrado en agar TSA y Anacker-Ordal (agar citófaga) de cada tejido y la identifica-ción mediante tinción Gram y bioquímica bacteriana. No se detectó el ADN del EHNv enlas muestras indicando que la prevalencia del virus es menor al 5% o no está presente enlas piscigranjas muestreadas. Se aisló Yersinia ruckeri y Aeromonas spp en todas lasmuestras, indicando que la causa de la enfermedad y mortalidad presente en laspiscigranjas se debían a la infección con estas bacterias.
Palabras clave: trucha arcoíris; virus necrosis hematopoyética epizoótica; PCR;asilamiento bacteriano
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Rev Inv Vet Perú 2018; 29(3): 957-963958
K. Bautista et al.
ABSTRACT
The objective of the present study was to monitor the detection of the EpizooticHematopoietic Necrosis virus (EHNv) in trouts (Oncorhynchus mykiss) in fish farms ofthe highlands of Peru. Samples were taken from 111 diseased fish (liver, spleen, anteriorkidney) from fish farms in the regions of Ancash, Junín and Huancavelica, Peru. Thetissue samples were processed immediately for bacterial isolation and another group ofsamples were stored at -196 °C for PCR. The DNA of each tissue was extracted by theTrizol method and then purified with silica membranes (PureLink Genomic DNA kit). ThePCR was performed using the MCP-1 primers specific for the EHNv, following themethodology proposed by the OIE and with the commercial kit VetPCRTM EHNV Detectionfor confirmation. Bacterial isolation was carried out by culturing on TSA and Anacker-Ordal agar (Cytophaga agar) of each tissue, and the identification by Gram stain andbacterial biochemistry. The EHNv DNA was not detected indicating that the prevalenceof the virus is less than 5% or it is not present in the sampled fish farms. Yersinia ruckeriand Aeromonas spp were isolated in all the samples, indicating that the cause of thedisease and mortality present in the fish farms was due to the infection with these bacte-ria.
Key words: rainbow trout; epizootic hematopoietic necrosis virus; PCR; bacterial isolation
INTRODUCCIÓN
La acuicultura a nivel mundial ha mos-trado un incremento en la tasa anual de 8.3%durante los últimos 30 años, dentro de loscuales el sector destinado a la alimentaciónhumana es el que ha presentado mayor des-empeño. La acuicultura en el Perú está enproceso de continuo crecimiento, similar a latendencia mundial (Kleeberg y Rojas, 2012).El pescado es actualmente el que aportamayor contenido proteico en la dieta de lapoblación humana a nivel mundial, superan-do a las aves, cerdos y vacunos (FAO, 2016).
Las enfermedades más prevalentes enpiscigranjas del Perú donde se cultiva la tru-cha arcoíris son las de origen bacteriano. Layersiniosis causada por Yersinia ruckeri esla de mayor importancia (Sierralta et al.,2013); mientras que las infecciones produci-das por bacterias del género Aeromonas sonimportantes a nivel mundial (Beaz-Hidalgo etal., 2010). Como medida que evite el ingresode enfermedades exóticas a una región o país,la OIE ha determinado la promulgación de
lista única de enfermedades de declaraciónobligatoria para animales terrestres y acuáti-cos, en los cuales los agentes patógenos demayor peligro a nivel internacional deben sermonitoreados y declarados por los organis-mos oficiales (OIE, 2017a). Dentro de estalista se encuentra el virus de la NecrosisHematopoyética Epizoótica (EHNv).
El EHNv pertenece al géneroRanavirus de la familia Iridoviridae que secaracteriza por su alta virulencia en truchas.Son virus relativamente grandes (120-200 nmde diámetro), de tipo icosaédricos y en algu-nos casos presentan una membrana lipídicainterna entre el núcleo viral y la nucleocápside(Chinchar et al., 2009).
La infección por EHNv ha sido recono-cida desde sus inicios en Australia, donde fuereportada por primera vez en percas (Percafluviatilis) y truchas arcoíris (Oncorhynchusmykiss) en brotes que se caracterizaron porla presencia de focos necróticos en los teji-dos hematopoyéticos de riñones, hígado ybazo, causando altas tasas de mortalidad enjuveniles. Actualmente, la enfermedad es
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considerada endémica en el sureste austra-liano, aunque con presencia en forma inter-mitente (Whittington et al., 1999).
No existen datos viables en los repor-tes de la OIE (OIE, 2017a) en América delSur, lo cual puede indicar que el virus no estápresente en las truchas o que tiene una pre-valencia inferior al 5%. Debido a que el vi-rus en la trucha arcoíris tiene un comporta-miento distinto a otras especies susceptiblescomo la perca (Reddacliff y Whittington,1996), es necesario identificar al virus enanimales enfermos o moribundos. Estudiosepidemiológicos llevados a cabo por elSENASA Argentina entre 2002 y 2013 me-diante histopatología y PCR permitieron de-clarar al país como libre de la enfermedaden 2013 (SENASA Argentina, 2013).
En el presente estudio se buscó esta-blecer la presencia del EHNv en peces en-fermos y moribundos de piscigranjas de tresregiones de importancia en la piscicultura delPerú.
MATERIALES Y MÉTODOS
Lugar y Fecha de Estudio
El estudio fue realizado entre abril y ju-nio de 2014. La recolección de especímenesde truchas arcoíris (Oncorhynchus mykiss)fue realizada en tres piscigranjas ubicadasen las provincias de Huancayo, Huaraz yCastrovirreyna de los departamentos deJunín, Ancash y Huancavelica, respectiva-mente. Las muestras se analizaron en los la-boratorios de Ictiopatología y de Virología dela Facultad de Medicina Veterinaria, Univer-sidad Nacional Mayor de San Marcos, Lima.
Tamaño Muestral
La determinación del número de mues-tras mínimo para el presente estudio se basóen la información referencial publicada en elManual de Pruebas Diagnósticas para Es-
pecies Acuáticas (OIE, 2017b). A partir deesta información, para un nivel de prevalen-cia de 5% y un tamaño de lote de aproxima-damente 2000 especímenes, se calculó untamaño de muestra mínimo de 60 peces. Noobstante, se recolectaron 111 alevines enfer-mos (35 procedentes de Huaraz, 40 deHuancayo, y 36 de Castrovirreyna).
Toma de Muestras
Se realizó la captura de especímenesjuveniles con sintomatología clínica de enfer-medad (moribundos), en varias pozas decrianza de cada una de las piscigranjas bajoestudio y enviadas al laboratorio en bolsas depolietileno con 50% de la capacidad con aire.Para la eutanasia se procedió primeramentea baños de inmersión con hidrocloro debenzocaína (45 mg/l de agua) para la seda-ción completa de los peces y luego al sacrifi-cio mediante la técnica de corte medular(Roberts y Shepherd, 1980).
La necropsia de los peces fue realizadamediante la metodología establecida para es-pecies de laboratorio (Ostrander, 2000). Serealizó el examen in situ de los órganos in-ternos y posteriormente se realizó la toma demuestras de hígado, bazo y riñón por animal.Se procedió al cultivo directo de las muestraspara el aislamiento bacteriano y un pool poranimal de una porción de cada órganomuestreado fue almacenado a -196 °C pararealizar el PCR.
Aislamiento Bacteriano
Cada órgano obtenido fue procesadopara el aislamiento bacteriano utilizando ansasestériles que se introdujeron directamente enel parénquima de los órganos y se sembraronen Agar Tripticasa de Soya (TSA) para elaislamiento de Yersinia ruckeri u otra bac-teria Gram negativa y en agar Anacker-Ordal(agar citófaga) para aislamiento de bacteriasdel género Aeromonas. Las placas de agarsembradas fueron incubadas a 16 y 25 °Cpor 24-48 horas. Las bacterias de colonias
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bacterianas que crecieron fueron identifica-das mediante coloración Gram y bateríabioquímica.
Extracción de ADN
De los 111 peces muestreados, se ex-trajeron 2 g de cada órgano (riñón anterior,bazo e hígado), se colocaron en un morteroestéril con 2 ml de suero fisiológico y se ma-chacaron hasta obtener un pool de tejidos porpez. Este machacado fue centrifugado por 5minutos a 2500 g y el sobrenadante fuealicuotado (500 µl) en crioviales estériles de1 ml y almacenados en congelación (-70 °C).
La extracción del ADN de cada pool sehizo a partir de las muestras mediante el mé-todo de trizol y se purificó con membranasde sílica (PureLinkGenomic DNA kit) segúnlas indicaciones de los fabricantes, métododiseñado para la extracción eficiente de ADNproveniente de tejidos animales.
Reacción en Cadena de la Polimerasa(PCR)
Se realizó una PCR convencional con 5µl de DNA por muestra para la amplificaciónde un fragmento de 321 pb de la proteína dela cápside del virus de NecrosisHematopoyética Epizoótica de la familiaIridoviridae (OIE, 2012). Se utilizaron los si-guientes cebadores (primers) MCP1: M151-Forward (5’AAC-CCG-GCT-TTC-GGG-CAG-CA-3’) y M152 Reverse (5’-CGG-GGC-GGG-GTT-GAT-GAG-AT-3’) y losreactivos del kit PCR Super Mix (Invitrogen)en un volumen total de 25 µl, según indicacio-nes del fabricante. Así mismo, se utilizó comomarcador de especie a la secuencia de am-plificación de la beta-actina. Los ciclos de lareacción de la PCR fueron: 1 ciclo inicial dedesnaturalización del ADN a 94 °C durante2 min, 40 ciclos de desnaturalización durante40 s a 94 °C, de hibridización durante 30 s a50 °C, extensión durante 1 min a 72 °C, y deextensión final durante 5 min a 72 °C. Poste-riormente, las muestras fueron incubadas a4 °C hasta su revelado.
Luego de la amplificación del segmentode la secuencia MCP de EHNv mediantePCR, se procedió a la lectura de los produc-tos o amplicones mediante electroforesis engeles de agarosa. En cada criovial se colocó1.3 µl de bromuro de etidio. Se preparó, ade-más, 2 µl de buffer de carga del marcador y10 µl del marcador de peso molecular. Se pre-pararon geles de agarosa al 2% y en cadauno de los pocillos en los geles se colocaron18 µl de la mezcla contenida en cadacriovial. La corrida electroforética fue a80v A:0.3/P3-4 por 1 h. Posteriormente, losgeles fueron llevados a la campana detransiluminación para la lectura de los resul-tados (en función a las bandas obtenidas parala secuencia MP de EHNv).
PCR EHNV Detection Kit
Se siguieron las indicaciones del produc-to (BioinGentech, Chile), teniendo un ampli-ficado de 187 pb en el control positivo y de140 pb del control interno. Se preparó la mez-cla de reacción para la muestra, el controlpositivo, negativo control, y el control interno,según las indicaciones del laboratorio fabrican-te. La reacción final debería contener 13.5 µl.
Los ciclos de la reacción de la PCR fue-ron: 1 ciclo inicial de desnaturalización delADN a 94 °C durante 2 min, 30 ciclos dedesnaturalización durante 30 s a 94 °C, ali-neación a 57 °C por 30 s, extensión a 72 °Cdurante 30 s y 1 ciclo de extensión final du-rante 5 min a 72 °C. Los productos fueronrevelados por electroforesis en gel de agarosaal 1.5% conteniendo bromuro de etidio, co-rrida con una fuente eléctrica de 100v por30 min.
Análisis de la Información
Los resultados del análisis de PCR apartir de las muestras de tejidos fueron inter-pretados como positivos o negativos a EHNv(presencia/ausencia de bandas diagnósticasen la electroforesis correspondiente a MCP).
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Ausencia del virus de Necrosis Hematopoyética Epizoótica en truchas en Perú
RESULTADOS
Los resultados de los ensayos de PCRno demostraron la presencia de materialgenético de EHNv en las 111 muestras detejido de truchas arcoíris. En el PCR utilizan-do los cebadores MCP1 se obtuvieron cua-tro bandas de productos inespecíficos (contamaños diferentes a lo esperado) al revelarseen el gel de agarosa. El PCR utilizando el kitde detección EHNV de BioinGentech deter-minó la ausencia del genoma viral en todaslas muestras, observándose la amplificaciónde 187 pb solo en el control positivo de laprueba (Figura 1).
Los hallazgos a la necropsia determina-ron lesiones comunes, principalmenteesplenomegalia y hemorragias en diversosórganos internos. El análisis bacteriológicodeterminó el aislamiento de agentesbacterianos de Yersinia ruckeri yAeromonas spp en bazo e hígado de todoslos peces muestreados.
DISCUSIÓN
El uso de pruebas de PCR es el métodorecomendado por el OIE (2012) para el diag-nóstico del EHNv, y por el tipo de muestrasde animales enfermos colectadas en el pre-sente estudio, se puede estimar que las áreasmuestreadas están libres del virus. Sin em-bargo, esta afirmación debe ser confirmadacon un estudio continuo de todos los anima-les que mueren dentro de los patrones de«normalidad» en las piscigranjas (Whittingtonet al., 1994), debido a que generalmente elvirus tiene una baja prevalencia y baja tasade mortalidad (Whittington et al., 1999), pu-diendo ocurrir epizootias causadas por estevirus.
La ausencia del EHNv en el Perú esfactible debido a que la OIE la tiene registra-da como prevalente en las piscifactorías si-tuadas en los embalses de los ríosMurrumbidgee y Shoalhaven, en Nueva Ga-les del Sur, Australia (Whittington et al.,2010), y no existe registros de comercio de
Figura 1. Resultados del ensayo con VetPCRTM EHNV Detection Kit (Bioingetech, Chile) ennueve muestras de pool de órganos (bazo, riñón anterior e hígado) de trucha arcoíris(Oncorhynchus mykiss) enfermas. Carril 1, marcador de peso molecular; carril 2 al10, pool de muestras; carril 11 control negativo sin ADN; carril 12, control positivo
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productos acuícola entre el Perú y esta re-gión de Australia. En Argentina, el ServicioNacional de Sanidad y CalidadAgroalimentaria (SENASA) hizo unmonitoreo de 2006 a 2008, pudiendo declararal país en 2013 como libre de enfermedadesen salmónidos, incluyendo la necrosishematopoyética epizoótica (EHNV).
En el presente estudio, los peces estu-vieron enfermos por infecciones bacterianas,habiéndose detectado microbiológicamente lapresencia de las bacterias Yersinia ruckeriy Aeromonas spp en muestras de bazo e hí-gado, así como en algunas muestras de ri-ñón. Estas bacterias son las más prevalentesen las piscigranjas del país (Bravo y Kojagura,2004; Sirvas-Cornejo et al., 2011).
Durante el desarrollo del PCR utilizan-do los cebadores MCP propuestos por la OIEse determinó la presencia de algunas bandasinespecíficas de poco tamaño, por lo que serequirió el aumento de la temperatura de hi-bridación a 62 °C para reducir la amplifica-ción inespecífica por el uso de tejidos de lospeces, y que es una de las recomendacionespara el desarrollo de la prueba de PCR indi-cadas en el manual de pruebas de diagnósti-co de la OIE (2012). Asimismo, para confir-mar la negatividad de las muestras se usó elkit comercial VetPCRTM EHNv Detection Kit(BioinGentech), el cual tiene controles inter-nos, positivos y negativos. La diferencia deestas dos pruebas moleculares se debe a lasdiferencias de los cebadores que amplificanregiones diferentes del genoma viral.
CONCLUSIONES
No se demostró la presencia de materialgenómico para la secuencia MCP de lasespecies pertenecientes a la familiaIridoviridae, ni la presencia del virus dela Necrosis Hematopoyética Epizoótica(EHNv).
Se indica que las especies de la familiaIridoviridae no se encuentran presentesen los sistemas de crianza de truchasevaluados en el presente estudio.
LITERATURA CITADA
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