010 SOP Fermentation 091110 003 - apz-rl.de · PDF fileBlueLab – SOP_010_ Fermentation 3 / 14 Anwendung im Versuch: Für die Fermentation kann handelsübliche Bäckerhefe, die in

BlueLab SOP_010_ Fermentation
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SOP_010_Fermentation (hier bes.: S. cerevisiae)
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101108001 08.11.10 Holger Mller
101109002 09.11.10 Frank Eiden
Aufbau und Benutzung des Versuchsaufbaus fr anaerobe und aerobe Hefefermentationen. Hierbei werden gleichzeitig die Gase CO2, Ethanol und O2 (nur bei aerob) sowie das produzierte Volumen gemessen.
101124003 24.11.19 Frank Eiden
ergnzende SOPs: SOP_002_Messen, SOP_003_Komplexmedium, SOP_005_Gaszhler, SOP_006_Begasung,
SOP_011_Biomasse
mitgeltende Dokumente: 003-010 Einsatzgebiet: Mittels anaerober bzw. aerober Fermentation soll unter definierten Bedingungen mit Hilfe von Hefen Ethanol produziert werden. Hinweis: die blau-gefrbten Textpassagen gelten NICHT fr das Praktikum (diese SOP ist allgemein angelegt!) Inhalt: 1. Theoretischer Hintergrund 2. Material und Methoden 3. Fermenter 4. Abgasanalytik 5. Versuchsdurchfhrung Fermentation von S. cerevisiae

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6. Aufgabenstellung und Diskussion 1TheoretischerHintergrund Hefen Hefen zhlen zu den Protoascomyceten oder Sprosspilzen. Charakteristisch sind ein septiertes Mycel sowie die Ausbildung von Kondiosporen. Ascomyceten (Schlauchpilze) gehren zusammen mit den Basidiomyceten zu den hheren Pilzen. Den eigentlichen Hefen (Saccharomycetaceae) fehlt allerdings das Mycel. Bcker- und Bierhefen sind physiologische Rassen von Saccharomyces cerevisiae. Industriell werden meist diploide oder polyploide Rassen verwandt. Da es sich um Eukaryonten handelt, ist ihre hnlichkeit zu hheren Organismen deutlich grer als bei Bakterien. Eine durchschnittliche Hefezelle hat eine nherungsweise ellipsoide Form mit den Ausmaen 5,5 x 7,0 m (Escherichia coli, 1,0 x 3,0 m). Daraus ergibt sich ein Volumen von ca. 100 m. Saccharomyces cerevisiae Die Hefe Saccharomyces cerevisiae, nach dem binomischen System mit Gattungs- und Artnamen benannt, lebt einzellig. Die Vermehrung geschieht in der asexuellen Phase durch Sprossung. Dabei werden an den Zellen nacheinander bis zu 30 Knospen gebildet, die nach der Abschnrung an der Mutterzelle sichtbare Narben hinterlassen. Das Genom ist auf einen haploiden Satz von 16 Chromosomen verteilt und umfasst zwlf Mbp (Megabasenpaare). Die Gesamtsequenz ist seit 1996 aufgeklrt und verffentlicht. S. cerevisiae ist fakultativ anaerob, das bedeutet die Energiegewinnung fr Vermehrung und Wachstum kann sowohl durch Atmung (aerob), als auch durch Grung (anaerob), erfolgen, d.h.: Veratmung von Kohlenhydraten Veratmung von Ethanol Vergrung von Kohlenhydraten. Hefen sind also in der Lage ihren Metabolismus flexibel an Umweltbedingungen anzupassen.

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Anwendung im Versuch: Fr die Fermentation kann handelsbliche Bckerhefe, die in gepresster Form als Frischhefe angeboten wird oder ggfs. in Form einer Agar-Kultur-Platte, verwendet werden. 2MaterialundMethoden Medium zur Kultivierung Das Fermentations-Medium enthlt gem SOP_003_Komplexmedium die folgenden Bestandteile: - Hefeextrakt: 3g/l - Malzextrakt: 3g/l - Pepton: 5g/l - VE-Wasser: 1000ml Sterilisation: gemeinsam (mit dem Zucker bis max. 100 g/l) Bei der Berechnung der Einwaage ist ggfs. zu beachten, dass die Glucose als Monohydrat vorliegt! Fr die Fermentation betrgt das Arbeitsvolumen max. 1.100 ml. Die Zugabe der Glucoselsung und des Inokulums stellt also eine Verdnnung des Mediums dar, da davon ausgegangen wird, dass diese keine Medienbestandteile enthalten. Die Einwaagen, sowohl fr das Fermentationsmedium, als auch fr die Vorkultur, sind vor Beginn des Praktikums zu berechnen!

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Herstellung des Mediums und der Vorkultur Die Bestandteile der Medien werden exakt, gem vorangegangener Berechnung, eingewogen und in Wasser gelst. Es wird Medium fr die Fermentation wie fr die Vorkultur bentigt. Jede Gruppe stellt fr die jeweils nachfolgende Gruppe das Fermentationsmedium sowie die Vorkultur her. Die Medien werden im Autoklaven thermisch sterilisiert. Die Beschickung und Bedienung des Autoklaven erfolgt, unter Beachtung der Anleitung am Gert, ausschlielich im Beisein eines/r Betreuers/Betreuerin!. Das Anlegen der Vorkultur erfolgt unter der Sterilbank (s. a. Kapitel 4.2). Der Erlenmeyerkolben mit dem sterilisierten Medium wird unter der clean-bench geffnet und mit Hilfe einer Impfse von einer Agarplatte (o..) beimpft. Die Zugabe der sterilen Glucose erfolgt selbstverstndlich ebenfalls unter der clean-bench. Der beimpfte Kolben wird in einem Schttel-Inkubator, bei 30 C fr ca. 20 h inkubiert, wobei darauf zu achten ist den Schttelkolben nicht gasdicht zu verschlieen. Bei der Verwendung von Schraubdeckeln, diese mit Klebeband fixieren. Das Medium und die Glucoselsung fr die Fermentation werden zur spteren Verwendung in einer Khlzelle gelagert. Hinweis: Es werden fertig sterilisierte Grundmedien bereitgestellt

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Anaerober Aufbau Mit dem unten beschriebenen Aufbau (Abb. 1) knnen anaerobe Fermentationen durchgefhrt werden. Neben der stabilen Temperierung mittels des Doppelmantel-Glasfermenters und dem Kryostaten kann der Prozess mit Hilfe des Rhrers durchgemischt werden. Die entstehenden gasfrmigen Stoffwechselprodukte wie CO2 und Ethanol knnen durch die angeschlossenen Sensoren direkt gemessen werden. Der Ethanolsensor ist derart kalibriert, dass er direkt die Menge Ethanol in der Flssigphase in Vol.% anzeigt. Das produzierte Gas geht durch den Abgasschlauch in die Khlfalle und wird volumenmg durch den Volumenmesser, den Milligascounter, erfasst. Die Messdaten werden mittels der beiden Multiplexer BACCom12 fr die Sensoren und BACCom12CB fr die Milligascounter, per RS232-Schnittstelle oder Ethernet zum Computer bertragen und dort durch die Software BACVis visualisiert und aufgezeichnet. Das gemessene Volumen wird mit dem in der BACCom12 CB integrierten Temperatursensor und dem Drucksensor (in der BACCom12) von der Software auf das Normvolumen umgerechnet. Weitere Einzelheiten entnehmen Sie bitte der Bedienungsanleitungen 3-10 (s. mitgeltende Dokumente). Die Bedienung des Gasvolumenzhlers entnehmen Sie bitte SOP_005_Gaszhler. Vergleiche auch :SOP_002_Messen

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Aufbau:
Abb. 1
A Abgasleitung des Fermenters F Kryostat zur Temeprierung B Khlfalle G Sensoren zur Bestimmung von CO2 und Ethanol C Volumenmesser (Milligascounter MGC) H Doppelmantel Glasfermenter D BACCom12 CB (Multiplexer fr MGC) I Wasserschlauch zum Kryostaten E BACCom12 (Multiplexer fr 12 Sensoren und Anschlu f. BACCom12CB J Rhrer
H
A
B
C
D
E J
I
G
F

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Aerober Aufbau (vergl. Anaerober Aufbau) Mit dem im Folgenden beschriebenen Aufbau (Abb. 2) knnen aerobe Fermentationen durchgefhrt werden. Neben der stabilen Temperierung mittels des Doppelmantel-Glasfermenters und dem Kryostaten kann der Prozess mit Hilfe des Rhrers durchgemischt werden. Die entstehenden gasfrmigen Stoffwechselprodukte wie CO2 und Ethanol sowie der Sauerstoffgehalt knnen durch die angeschlossenen Sensoren direkt gemessen werden. Der Ethanolsensor ist derart kalibriert, dass er direkt die Menge Ethanol in der Flssigphase in Vol.% anzeigt. Die Besonderheit bei diesem Aufbau ist, dass die Sensoren direkt am Fermenter die Gehalte im Headspace des Fermenters bestimmen, whrend der im Abgas angeschlossen Sensor BlueInOne die Konzentrationen von CO2 und O2 unabhngig von Feuchtegehalt und Druck bestimmt. Die Messdaten werden mittels der beiden Multiplexer BACCom12 per RS232-Schnittstelle oder Ethernet zum Computer bertragen und dort durch die Software BACVis und BACVisSingle (fr BlueInOne) visualisiert und aufgezeichnet. Weitere Einzelheiten entnehmen Sie bitte der Bedienungsanleitungen 3-10 (s. mitgeltende Dokumente). Vergleiche auch :SOP_002_Messen Im aeroben Fall (Begasung) siehe: SOP_006_Begasung

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Abb: 2
A Abgasschlauch vom Fermenter zum Analysator BlueInOne F Sensoren fr inline Messung von O2, CO2 und Ethanol
B BlueInOne fr CO2 und O2 Messung G Glasfermenter mit Doppelmantel
C BACCom12 Multiplexer fr bis zu 12 Sensoren H Wassergefllter Schlauch vom Kryostaten zum Fermenter
D Gaseinlass (einstellbar) I Glasfritte fr feinverteilte Beagsung
E Kryostat zur Temperierung J Magnetrhrer
C
B
I
H
G
F
E
D
A
J

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4Abgasanalytik
Fr die Abgas-Analytik und die Bestimmung des Ethanolgehaltes im Medium, stehen spezielle Sensoren der Firma BlueSens gas sensor GmbH zur Verfgung. Es knnen die Konzentrationen von Kohlendioxid und Sauerstoff im Abgas bestimmt werden. Der Ethanolgehalt im Medium wird ebenfalls mittels Messung im Abgas quantifiziert. a) BlueInOne b) Gassensor im PA-Gehuse

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A
O2
O2-
O2
IR-Sensoren: Die verwandten Kohlendioxid- (BCP-CO2) und Ethanol-Sensoren arbeiten mit Infrarotlicht (IR). Der Sensorkopf beinhaltet die IR Strahlungsquelle, den Detektor und die Auswertelektronik. Der Lichtstrahl durchstrahlt einen Messraum mit dem Analytgas und wird in dem Messadapter reflektiert. Ein Detektor misst die Intensitt des reflektierten Lichts, welche von der jeweiligen Analytgaskonzentration abhngig ist. Der Sensorkopf beheizt den Messadapter, so dass keine Feuchtigkeit kondensieren kann. Das Messprinzip sowohl fr Kohlendioxid als auch fr Ethanol ist ide

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