01.11.10 – Extremophile Mikroorganismen – interessante Biokatalysatoren? 08.11.10 – Aufarbeitung und Bioprozessführung – getauscht mit A. Zehnsdorfer

15.11.10 - Von der gläsernen zur maßgeschneiderten Zelle?

06.12.10 - Thermodynamik zellularer Prozesse

VL Reihe – „Weiße Biotechnologie“

Beiträge der AG Maskow

Extremophile Mikroorganismen

–

interessante Biokatalysatoren?

Stand: 01.11.2010

Für Anfragen und Anregungen :

PD Dr. Thomas Maskow

Helmholtzzentrum für Umweltforschung - UFZ

Department Umweltmikrobiologie

Permoserstr. 15

E-mail: thomas.maskow@ufz.de

Tel. 0341/235-1328

Fax: 0341/235-1351

Inhalt:

• Warum sind extremophile Mikroorganismen interessant ?

• Quellen extremophiler Mikroorganismen• Pheno- und genotypische Besonderheiten• Technische Bedeutung extremophiler

Mikroorganismen• Potential extremophiler Mikroorganismen und

Ausblick

We teach

microbiology

But we learn

from microbes

Das versteckte Potenzial der Mikroorganismen:

• Die Zahl der prokaryotischen Zellen 6,000,000,000,000,000,000,000,000,000,000 (6 x 1030) • 50% des Weltkohlenstoffes, 90% des Stickstoffs undPhosphors, sowie 108 Spezies.• 1 Gramm Boden < 109 Bakterien mit 1 000 – 5 000 Spezies.• Stammsammlungen beinhalten < 105

Spezies • > 90% manchmal >99% der Spezies einer Umweltprobe sind noch nicht

kultivierbar. • Versteckte Diversität von Pilzen + Protisten kaum untersucht. • E. coli etwa 2000 metabolische Reaktionen

Gewaltiges Synthesepotenzial technische Anwendungen !!!

Extremophile(überleben unter „lebensfeindlichen“ Bedingungen)

Resistenzmechanismen Besondere Produkte Autosteriles Arbeiten

• Extremozyme

Temperatur – vR

Halotolerant – C(Edukt, Produkt)

pH – Waschmittelzusätze

• Protektormoleküle

Sterilität –

Kostenfaktor biotechnologischer

Verfahren

Quelle: www.mibi.uni-bonn.de/extremophile.jpg

Quellen (Habitate) extremophiler

Mikroorganismen

Extremophile::

• Hyperthermophile (- 105°C)• Psychrophile (-7 – 15oC)• Halophile (- Sättigung)• Acidophile (- pH 0,5)• Alkaliphile (- pH 11)• Baro- oder Piezophile (> 800 atm)

Tiefsee

Bauwerke Heiße Quellen

Sodaseen/-wüsten

Gletscher Tiefsee

Salzseen

Nutzung von ExtremophilenHYPERTHERMOPHILE (Quelle) NutzenDNA polymerase DNA amplification by PCRAlkaline phosphatase DiagnosticProteasen und Lipasen Milch produkteLipasen, pullulanases and proteases DetergentienProteasen Bäckerei und Brauerei, Aminosäure

produktion aus KeratinAlkoholdehydrogenase Chemische SynthesenXylanases PapierbleicheS-layer proteine und Lipide Molekulare SiebeOil abbauende Mikroorganismen Surfactants für die ÖlgewinnungSchwefeloxidierende Bakterien Bioleaching, Kohle & Abgas

EntschwefelungHyperthermophilic consortia Abfallbehandlung und Methan-

produktion

PSYCHROPHILE Nutzen

Alkaline phosphatasen MolekularbiologieProteasen, Lipasen Detergentien, Zellulasen und AmylasenLipasen und Proteasen Käseherstellung und MilchverarbeitungProteasen Reinigungslösung für KontaktlinsenUngesättigte Fettsäuren Nahrungsmittelergänzung, Diätzusätzeb-galactosidasen Laktose Hydrolyse in MilchproduktenIce nucleating proteins Künstlicher Schnee, EiskremIce minus microorganisms Frostschutz für empfindliche PflanzenVerschiedene Enzyme Bioremediation, Biosensoren(e.g. oxidases) Methanogene Methanproduktion

ALKALIPHILE (Quelle) Nutzen

Proteasen, Cellulasen, Xylanasen, DetergentienLipasen and PullulanasenProteasen Gelatine Entfernung von

RöntgenfilmenElastasen, Keritinasen EnthaarungCyclodextrine Lebensmittel, Transport und Schutz von

Wirkstoffen, Enantiomerentrennung,Pharmazie

Alkaliphile Halophile ÖlgewinnungVerschiedene Mikroorganismen Antibiotika

ACIDOPHILE (Quelle) Nutzen

Schwefel oxidierende Metallgewinnung und Entschwefelung vonMikroorganismen KohleMikroorganismen Organische Säuren und Lösemittel

Alkohol dehydrogenase

Alkohol dehydrogenase (ADH) von der Archaea Sulfolobus solfataricus

Arbeitet unter harschen (vulkanischen) Bedingungen 88°C (fast siedendes Wasser), pH= 2 – 3.5 (Schwefelsäure-konzentrationen wie in Autobatterien)

ADH katalysiert die Konversion

unterschiedlicher Alkohole und hat erhebliches biotechnologisches Potential wegen seiner besonderen Stabilität

Halo- und osmophile Mikroorganismen

Extrem durch niedrige WasseraktivitätenWasseraktivität Habitat Bewohner

1.000 Reines H2O Caulobacter, Spirillum

0.995 Menschliches Blut Streptococcus, Escherichia

0.980 Meerwasser Pseudomonas, Vibria

0.800 Marmelade, Obstkuchen Penicillum

0.750 Gesalzener Fisch, Salzseen Halobacterium, Halococcus

0.700 Getreide, Trockenobst Xerophile Pilze

1 g gereinigtes Meersalz enthält 106 Mikroorganismen !!!

Wasseraktivität beeinflusst durch:

• Salze

• Zucker

• Wassermangel

• Halotolerant/-phil

• Osmophil

• Xerophil

Halotolerant oder Halophil ?

Tolerieren höhere Salzgehalte, sind aber nicht darauf angewiesen

NaCl-Gehalt Bezeichnung

1 – 6 % Schwach halophil

6 – 15 % Moderat halophil

> 15 % Extrem halophil

Salzsee Südrussland, Luftbildaufnahme

Quelle von Halophilen

Sodaseen: Etoscha-Pfanne, Namibia

Künstliche Habitate: Salzgewinnung aus Meerwasser

Oren A (2002) Halophilic microorganisms and their environment. Klywer Academic Press

Trockene Oberflächen

ResistenzmechanismenSalt – in Strategie Compatible-Solute Strategie

Osmotisches

Gegengewicht:

K+ Kleine, organische Moleküle;

Kompatibel zum Metabolismus (Compatible Solutes)

Nachteil: Benötigt spezielle, salz-tolerante Enzyme

Energetische Kosten der Synthese von Compatible Solutes

Vertreter: aerobe extrem halophile Archea,

Halobacteriales

anaerobe extrem halophile Archea, Haloanaerobiales

Vertreter aus allen 3 Domänen des Lebens

• Archea

• Bacteria

• Eucarya

Vorteil: Standard-Enzyme„kostet“ wenig Energie;

Na+/H+ Antiporter; 1:2 - 2:3

primäre Na+ Pumpen

Bisherige technische Anwendungen Habitat• Quelle für Carotinoide (Bacterioruberine) als Nahrungsergänzungs-

mittel, -färbemittel

• Produzenten während der Fermentation von Sojasoße und Thaifischsoße

Oren A (2002) Halophilic microorganisms and their environment. Klywer Academic Press

Halophile Enzyme

Widerstehen hohen Ionenstärken

Interessant für hohe ionische Edukt-/ Poduktkonzentrationen

Halophile dihydrofolat Reductase des Aarchaeon Haloferax

volcanii, isoliert aus dem Toten Meer • Einzigartige molekulare

Struktur (aktiv, stabil und löslich bei hohen Ionenstärken)

• Hoher Anteil saurer AS• Kleiner Anteil

hydrophober AS• viele Salzbrücken• Aber: noch vieles

unbekannt

Vergleich der dihydrofolat Reductase

• Halophil nicht-halophil

Anwendungen

• Viele mögliche Anwendungen von Halophilen werden untersucht:– Erdölextraktion – Gentechnischer Einbau halophiler Enzyme in

Pflanzen um die Salztoleranz zu steigern. – Behandlung von Abwässern.

BacteriorhodopsinPhysiologische Funktion: Licht grüner Spektralbereich 570 nm - protonenmotorische Kraft

Arbeitsweise: Ändert Protonisierung/Farbe in 10 ms -> technische Anwendungen

pumpt ein Proton pro Photon

Technisches Potential von BR folgt aus Licht ->Signal zu wandeln:

• Ladungstrennung

• Farbänderung

Technische Anwendungen:• Elektrostatische Energie -> photovoltaische Zelle Prototyp: 5-10 Jahre

• Während der Lichtspeicherung ändert BR die Farben• Lichtmodulatoren

• Hochauflösende Displays Prototyp entwickelt

• Genetische Techniken helfen:• Variation der Lebensdauer der Zustände

• Anregungswellenlänge

• Grundlage für 3D Speicher extrem kleiner Größe (1 Molekül reicht), hoher

Speicherkapazität pro Volumeneinheit

• Bewegungssensoren Prototypen entwickelt

• künstliche Netzhaut Prototypen entwickelt

• Licht -> elektrisches Signal -> Photozelle

Primär osmotisches Gegengewicht aber auch generelle Schutzfunktion!

Compatible Solutes – Protektormoleküle !

Schützen: Enzyme, biologische Strukturen aber auch ganze Zellen

gegen:

• Hohe Ionenstärken

• Trockenheiten

• Hohe Temperaturen

• Niedrige Temperaturen

• Gefrieren

• Denaturierende Lösemittel

• UV-Strahlung

Ursachen der generellen Schutzfunktion?

Preferential exclusion theory:

• Unterstützen die Wasserstruktur

Arakawa, T und Timascheff SN (1985) The stabilisation of proteins by osmolytes. Biophys. J. 47: 411-414Suenobu K, Nagaoka M (1998) Ab into molecular orbital study on molecular and hydration structure of ectoine. J. Phys. Chem. A 102: 7505-7511

• CS verstärken hydrophobe Kräfte

• CS wirken der Entfaltung von Proteinen entgegen

Compatible Solutes – Protektormoleküle !

Compatible Solutes: Struktur -> Funktion ?

Anderer Typen:

Dimethylsulfoniumpropionat

Vom Polyoltyp:

Glycerol Mannitol

Vom Kohlenhydrattyp: SucroseTrehalose

Vom Aminosäuretyp: EctoinProlinGlycinbeta

in

N+

CH2CH3

CH3

CH3

COO- N+

HH

COO-N

N COO-CH3

+

O

OH

OH

OH

O

O

CH2OH

OH

OH

OH

CH2OH

CH2OH

CHOH

CH2OH

C H2O H

C H

C H

OH

OH

CH O H

CH O H

C H2O H

S+COO-H3C

CH3

O

OH

OH

OH

O

CH 2OH

O

OH

OH

CH2OH

HOH2C

Welche Compatible Solutes kommen woher?

Mikroorganimus Compatible SolutesNichtphototrophe, grampositive Bakterien Glycinbetain, Prolin

Nichtphototrophe, gramnegative Bakterien Glutamat

Süßwasser-Cyanobakterien Saccharose, Trehalose

Marine Cyanobakterien Glycosylglycerin

Marine Algen Mannit, verschiedene Glykoside, Prolin, Dimethylsulfonpropionat

Salzsee-Cyanobakterien Glycinbetain

Halophile anoxygene phototrophe Bakterien

Glycinbetain, Ectoin, Trehalose

Extrem halophile Archea KCl

Halophile Grünalge Dunaliella Glycerin

Xerophile Hefen Glycerin

Xerophile fadenförmige Pilze Glycerin

Bakterienmelken 1. Phase (Wachstum und Synthese)

Wachstum und Ectoinbildung in Gegenwart hoher Ionenstärken

Quelle: www.bitop.deVorzüge:

• 3-4 Zyklen möglich

• funktioniert mit Molekülen bis 10 kDa

• erprobt von 1-3500 L

2. Phase (Produktabtrennung)

Biomasse angereichert cross-flow Filtration.

hypoosmotischen Shock -> Freisetzung der CS durch die MSC.

Zelllyse findet nicht statt, hohe Produktreinheit

Biomasse wird angereichert, CS im Permeat

3. Phase (Synthese)

Auffüllen mit hochkonzentrierter Salzlösung,

Synthese von CS

CS - Compatible Solutes

MSC - Mechanosensitive Kanäle

Eigenschaften des CS Ectoin in der Kosmetik

Beispiele für die Nutzung dieses neuesten Produktes am Markt

Ectoin ist Bestandteil der Salben der Marktführer

• Shiseido• Kanebo• Sebamed• Marbert• Dadosens

Es gibt “nach heutiger Erkenntnis” 3 Anforderungen für Leben: WasserEnergieKohlenstoff

Astrobiologen suchen gegenwärtig Leben auf dem Mars, dem Jupiter Mond Europa und dem Saturn Mond Titan

Solches Leben sollte unseren Extremophilen ähnlich sein, weil es extremer Kälte, Drücken und Trockenheit widerstehen muss.

“Schlammlawinen” wurden auf dem Mars gefunden (links). Diese könnten durch Wasserabgänge verursacht sein. Psychrophile könnten dort noch existieren.

Leben im Weltall?

Leben im Weltall?

Europa soll eine Eiskruste haben, die einen 30-Meilen tiefen Ozean umgibt. Die rötlichen Sprünge im Eis werden als Hinweise auf Leben gesehen.

Der Mond Titan ist von einem dunstigen Gas umgeben, das organische Moleküle wie Methan enthalten soll. Das könnte die Basis für Leben auf der Titanoberfläche liefern.

Leben im Weltall?

Links ist ein 3,6 Milliarden Jahre alter Meteorit vom Mars zu sehen, den man in der Antarktis gefunden hat. Man fand in ihm merkwürdige Bakterien-ähnliche Strukturen, die allerdings sehr klein sind (ca. 40-50 nm). Auf der Erde sind nur die Mycoplasmen derart klein. Man vermutet auf dem Mars damals eine ähnliche Atmosphäre wie auf der Erde. Denkbar wären Mikroorganismen wie die Cyanobakterien, die Wissenschaftler sind sich jedoch nicht einig.

Meteorite enthalten Amino säuren und einfache Zucker. Wichtige Bausteine für Leben. Meteorite können als “Transporter”dienen um Lebenskeime im Universum zu verteilen.

Eine probe von stratospherischer Luft zeigt ein bakterielle Diversität 41 km über der Erdoberfläche. (Lloyd, Harris, & Narlikar, 2001)

Indeed, we may not be alone

Leben im Weltall?

Kleines Pepetitorium:

• Was charakterisiert Extremophile und warum sind sie technologisch

besonders interessant?

• Welche Abwehrmechnanismen hat die Natur gegen Salzbelastungen

entwickelt? Nennen Sie Vor- und Nachteile.

• Welche Besonderheiten der Halophilen haben technisches Interesse erregt

und warum?

Empfehlungen für weiteres LesenZur Vertiefung der Vorlesung:

Madigan TM: Brock Mikrobiologie, Spektrumverlag Heidelberg Berlin ISBN 3-8274-0566-1

Margesin R, Schinner F (2001) Potential of halotolerant and halophilic microorganisms for biotechnology. Extremophiles 5:73-83

Mehr Details:

Oren A (2002) Halophilic microorganisms and their environment. Klywer Academic Press ISBN 1-4020-0829-5

Oren A (1999) Bioenergetic aspects of holophilism. Microbiology and Molecular Biological Reviews. 63: 334-348

Madern D, Ebel C, Zaccai G (2000) Halophilic adaptation of enzymes. Extremophiles (2000) 4:91-98

Fragen ?