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PROMOZIONE

Le caseine costituiscono il maggiore componente del latte dellamaggior parte dei mammiferi e sono secrete sotto forma di micelle, cheportano anche un’alta concentrazione di calcio. Sono fosfoproteine cherappresentano i prodotti di quattro geni, equivalenti a quelli che codifi-cano le caseine bovine αs1, αs2, β e κ. Esiste una significativa varia-zione nelle proporzioni relative delle caseine specifiche nelle diversespecie. La sequenza primaria delle caseine αs1, αs2 e β mostra una si-gnificativa variazione tra le specie collegate alla rapida evoluzione deigeni, che si suppone abbiano un precursore comune. Al contrario, le κ-caseine mostrano caratteristiche che dimostrano una loro origine e fun-zione separata laddove si ritiene stabilizzino la struttura delle micelle.Questa ricerca analizza il confronto tra gli aspetti delle caseine in ungruppo di razze di cui sono disponibili informazioni.

IntroduzioneLe caseine sono una famiglia di fosfoproteine sintetizzate nella

ghiandola mammaria come risposta alla produzione di prolattina o al-tri stimoli, che vengono secrete sotto forme di aggregati colloidali chia-mati micelle, che sono responsabili di gran parte delle specifiche carat-teristiche del latte. La loro presenza e la loro importanza per l’industriacasearia hanno fatto di loro un argomento diffuso degli studi biochimi-ci, tanto da essere le proteine alimentari ampiamente più studiate [101].Inoltre, le caseine sono considerate come marcatori delle diverse fun-zioni della mammella e sono state usate come modello per lo studio delfunzionamento dell’apparato mammario [95].Inizialmente le caseine furono considerate sostanze omogenee, finchéLindstrom-lang et al. dimostrarono che esse erano composte da due fra-zioni separate: una che precipitava in presenza di calcio, la caseina cal-cio-sensibile, e l’altra che era responsabile della stabilizzazione dellaprima, la caseina non calcio-sensibile [71]. Mellander [73] applicò latecnica dell’elettroforesi a zone alla frazione di caseina e dimostrò lapresenza di tre componenti distinti, che chiamò caseine α, β e γ. Gra-zie al miglioramento delle tecniche di elettroforesi, si trovò un numeroancora maggiore di componenti presenti nella frazione di caseina [106]e furono fatti molti studi per ottenere maggiori informazioni su questicomponenti minori. Tuttavia, è in seguito alla diffusione della biologiamolecolare negli anni ‘70 e ‘80 che oggi si sa che esistono solo quat-tro tipi di caseine e che l’eterogeneità individuata dalla elettroforesiera dovuta agli effetti del processo post-traslazionale, ad una congiun-zione alternativa del prodotto genetico, o al polimorfismo genetico [83].Nel 1984 il Comitato per la Nomenclatura e Classificazione della DairyScience Association ha proposto una nomenclatura elaborata per defi-nire le caseine bovine, e cioè αs1, αs2, β e κ. Lo studio riguarda, in par-ticolare, gli aspetti confrontabili delle caseine e dei loro geni nelle variespecie di cui sono disponibili informazioni.

Le caseine αs1Tra le caseine calcio-sensibili, le α-caseine

sono caratterizzate da una maggiore solubilità inpresenza di calcio. La differenza tra la famigliadella caseina αs1 e quella della caseina αs2 si ba-sa sulla loro diversa sequenza di aminoacidi[56,100,101].La caseina αs1 è la più consistente frazione pro-teica presente nel latte bovino. È una proteina al-tamente fosforilata ed esiste in una forma mag-giore ed in una minore, che contengono, rispetti-vamente, 8 e 9 fosfati legami gruppi/molecole[28]. La sequenza degli aminoacidi delle caseineαs1 di un certo numero di specie euteriane è statadeterminata direttamente, o dedotta dalla se-quenza di geni del DNA[1.23.47.49.52.54.60.79.]. L’allineamento diqueste sequenze è presentato nella tabella 1. Danotare la presenza di una sequenza segnale alta-mente conservata, ma molto divergente, di 15 re-sidui nelle proteine mature, che indica che sonostati codificati da una famiglia di geni in rapidaevoluzione. Mentre la lunghezza della catenapeptide matura è generalmente simile a quelladella caseina bovina αs1 (199 residui), le omolo-ghe catene di ratti e topi sono molto più lunghe, acausa dell’inserimento di una serie di ripetizioni diesapeptide [47.52.54]. Al contrario, la proteinadelle cavie è leggermente più corta con 183 resi-dui. Si può affermare che esiste una maggioreidentità dei livelli di aminoacidi tra i ruminanti(>85%) e i roditori (80%), che tra i bovini e i suinicon il 48%. C’è solo il 29% di identità degli ami-noacidi nella regione C-terminale delle caseineαs1 dei bovini e dei ratti e ancora meno nel N-ter-minale.

CONFRONTO TRA GLI ASPETTI DELLE CASEINE DEL LATTEUn’interessante studio condotto presso l’Università di Otago, in Nuova Zelanda, permette diapprofondire una delle componenti del latte maggiormente in auge nella razza Bruna. Dalla ricercaemerge che la presenza e l’importanza delle caseine nell’industria casearia ne hanno fatto unargomento diffuso degli studi biochimici, tanto da essere le proteine alimentari ampiamente piùstudiate. La loro funzione primaria è nutritiva, in quanto portano sia aminoacidi che minerali nel latte;inoltre, le caseine sono considerate come marcatori delle diverse funzioni della mammella e sono stateusate come modello per lo studio del funzionamento dell’apparato mammario.

Melanie R. Ginger*, Murray R.Grigor*** Dipartimento di Biochimica dell’ Università di Otago,Du-nedin, Nuova Zelanda**Gruppo di Ricerca per la Zootecnia da latte, Centro Ri-cerche Ruakura, Private Bag 3123, Hamilton, New ZealandIl lavoro degli autori è stato finanziato da contratti MAF Po-licy, dalla Foundation for Research, Science and Techno-logy, New Zealand.

Tutte le caseine αs1 contengono siti multipli di fo-sforilazione, compreso il sito più importante neiresidui 100-110 (numerazione come in tabella 1).La fosforilazione si verifica nei residui di serine etreonine, che comprendono parte della ripetizioneSer/Thr-X-Y (dove X è un qualsiasi amino acido eY è un residua di acidi). Quando il glutammato (oaspartato) occupa la terza posizione di questa se-quenza, il sito viene definito come sito di fosfori-lazione primaria [75]. Le serine, o le treonine fo-sforilate possono determinare la fosforilazione dialtre serine e tali siti sono chiamati siti di fosfori-lazione secondaria [75.78]. Questi sono osserva-bili sotto forma di una stringa composta da un

massimo di 6-8 serine, seguite da due glutammati. La caseina bovinaαs1 esiste in due forme fosforilate, che contengono 8-9 fosfati/mol[75.80].Sono state descritte le varianti delle αs1-caseine che si trovano in natu-ra nelle singole specie. La tabella 1 riporta la sequenza bovina per lavariante B, che contiene Glu nella posizione 192 del peptide maturo(posizione 319 nella tabella 1), invece del Gly presente nella varianteC. Mentre la forma B predomina nel bestiame Bos taurus, la forma C sitrova nel bestiame Bos indicus e si ritiene sia la forma ancestrale [83].La razza Holstein ha >95% della variante B, mentre la razza Jersey hacirca il 60% della forma B e il 40% della forma C [32.83]. Una formarara, la A, ha 13 delezioni residue tra il Glu14 e l’Alas26 numerati co-me nel peptide maturo. Sono state descritte varianti multiple delle ca-seina a caprine che si caratterizzano per livelli di espressione decisa-mente diversi [13].

Le caseine αs2Le caseine del gruppo αs2 sono un gruppo più disomogeneo ri-

spetto alle caseine αs1 e sono state identificate in un certo numero dispecie euterie, tra cui ruminanti αs2, ratti γ, topi γe ε, cavie caseina Ae conigli αs2a, αs2b [3.7.11.14.19.50.52.54.96.100]. Nella tabella 2 èriportato l’allineamento di queste sequenze. I topi ed i ratti hanno ra-ramente due geni della caseine αs2. Come per le αs1, la sequenza se-gnale è ben conservata, ma le proteine mature sono alquanto differen-ti. La caseina ε dei topi (topo b nella tabella 2) sembra essere mozzatanella sua regione N-terminale. In generale, il livello di somiglianza de-gli amino acidi tra i due omologhi nei conigli e nei topi è <40% rispet-to al 64% delle sequenze dei bovini e dei suini.Come la casine αs1, le caseine αs2 sono peptidi altamente fosforilati. Illatte bovino contiene quattro isoforme diversamente fosforilate, che con-tengono 10-13 gruppi/mol fosfati [14.28]. I siti di fosforilazione puta-tivi delle caseine bovine e delle caseine αs2 sono riportati nella tabella2.Le sequenze delle caseine a dei marsupiali, lo wallaby (Macropus eu-genii) e dell’opossum (Trichosaurus vulpecula) sono state descritte[16.35] (tabella 3). Benché siano molto simili alle caseine αs1, hannoscarsissima affinità con le famiglie dei geni euteriani delle caseine α.Hanno, tuttavia, la tipica sequenza segnale residua 15 e ci sono anchesomiglianze per quanto riguarda la posizione e la natura dei maggio-ri siti di fosforilazione. Si possono individuare almeno sette livelli diver-si di fosforilazione con lo spettrometro a massa nella caseina α dell’o-possum che è insolitamente glicosilata [35].

Le β-caseinaLa famiglia delle caseina β comprende almeno sette proteine eu-

teriane, e ora anche due marsupiali, delle quali si conosce la sequenzadi amino acidi e nucleotide [2.6.9.16.39.59.85.87.89.100.103.109].Anche le sequenze rappresentative delle β-caseine euteriane (tabella 4)sono caratterizzate da una sequenza segnale residua 15, anche se leproteine mature mostrano un certo grado di differenzazione tra le spe-cie in termini di identità di aminoacidi, che è simile a quella osservataper le caseine αs1. Le β-caseine sono particolarmente ricche di glutam-mine, la cui posizione è ben conservata, come nel caso del sito princi-pale di fosforilazione vicino al terminale-N.Il numero dei siti di fosforilazione e il livello di fosforilazione sono infe-riori a quelli osservati per le αs1-caseine e per le αs2 -caseine. La β-ca-seina bovina esiste in una forma completamente fosforilata, che contie-ne 5 fosfati/mol di proteine, mentre nel latte di altre specie (uomo, ca-pre e opossum) la β-caseina ha siti di fosforilazione multipli[35.38.39.89].

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Tabella 1 - Allineamento multiplo delle sequenze proteichedelle αs1-caseine. Allineamento delle sequenze di aminoa-cidi delle αs1-caseina di alcune specie. Le sequenze sonostate ottenute da Genbank (numero di accesso tra parente-si) e allineate usando il programma Pileup della WisconsinPackage version 9.1 Genetics Computer Group (GCG),Madison, WI. Le caseine αs1 delle cavie corrispondono al-la caseina β [49]. Le sequenze segnate sono in corsivo e ipotenziali siti di fosforilazione in neretto.

Come nel caso delle α-caseine, le β-caseine dei due marsupiali sonotroppo diverse da quelle delle β-caseine euteriane per poter essere in-serite nell’allineamento sopra riportato. Le loro sequenze (tabella 5)mostrano la presenza di una regione octapeptide replicata 17 e 16 vol-te rispettivamente nelle sequenze dello wallaby e dell’opossum.Un certo numero di frammenti di peptidi minori è stato identificato nellatte bovino. Questi frammenti comprendono le caseine γ1, γ2 e γ3 ecomponenti 5-8 del peptone proteoso.La solubilità del secondo gruppo in ambiente acido ha inizialmente de-terminato la loro errata individuazione come proteine del siero. Al con-trario, come successivamente dimostrato, esse sono il prodotto di unaproteolisi parziale delle β-caseina ad opera della plasmina[26.27.36.46].Sono state trovate tre varianti della caseina bovina B: as1, as2 e β. La va-riante αs2 predomina nel bestiame Bos indicus, mentre le varianti αs1 eαs2 hanno approssimativamente le stesse frequenze di allele nel bestia-me Holstein. L’allele B, che è del tutto assente nelle Holstein, ha una fre-quenza di allele di ~0.3 nel bestiame Jersey [83]. Le forme αs1 e β con-tengono un operone His nel residuo 67 (peptide maturo) rispetto al Propresente nella variante αs2, mentre la variante β contiene un Arg nel re-siduo 122, mentre nelle varianti αs1 e αs2 è presente un Ser [32.44.83].

Le caseine κSi conosce la sequenza degli aminoacidi o sequenza del nu-

cleotide della κ-caseina di molte specie euteriane[8.10.12.15.34.37.48.70.76.77.82.104]. Queste sequenze sono pre-sentate nella tabella 6. La κ-caseina è diversa dalle caseine calcio-sen-sibili per alcuni aspetti. È la sola caseina che è solubile in presenza diioni di calcio ed ha componenti fosfati molto più piccoli di qualsiasi al-tra caseina. I siti di fosforilizazione sono confinati nella regione terminale-C dellamolecola e sono presenti come siti singoli, a differenza dei grappoli, chegeneralmente si trovano nelle caseine calcio-sensibili. Il peptide-segna-le contiene 21 residui (invece dei 15 delle caseine calcio-sensibili. Lakappa-caseina è la sola caseina euteriana che è dimostarata contene-re parti di molecole di carboidrati. Queste caratteristiche hanno porta-to a ritenere che la κ-caseina non sia in realtà una caseina calcio-sen-sibile [8.65.81].La κ-caseina è sensibile alla segmentazione in presenza di proteasiaspartato, chimosina (rennina). Jollès et al. hanno dimostrato che nellaκ-caseina bovina la segmentazione si verifica in uno specifico legamephe-Met nella porzione terminale-C [20.62]. I prodotti di questa seg-mentazione sono un fragmento molto caricato e glicosilato del termina-le-C (chiamato macropeptide o glicomacroproteina) e il peptide idrofo-bo del terminale-N, la para κ-caseina. Nakhasi et al. [82] hanno sug-gerito che la κ-caseina possa essere classificata in due gruppi separatiin base alla specie di origine.Le κ-caseine del gruppo I (vacche, pecore, capre, bufali) sono diversedalle κ-caseine del gruppo II (ratti, topi, suini, umani) per la loro idro-fobicità, per il contenuto di carboidrati, per la composizione degli ami-noacidi e per sito di segmentazione proteolitica. Le caseine del gruppoI contengono il legame archetipo Phe-Met, mentre per le κ-caseine delgruppo II il sito di segmentazione è specificato da Phe-Ile o Phe-Leu. Ladifferenza potrebbe spiegare anche la diversità nel meccanismo dellacoagulazione nei mammiferi ruminanti e non ruminanti [53].Le κ-caseine sono le uniche caseine, almeno tra le specie euteriane, chesono glicosilate. I gruppi carboidrati sono attaccati alla κ-caseina permezzo di legami O-glisolici ai residui di serina e treonina con la por-zione terminale-C della molecola. La glicosilazione avviene post-trasla-zionalmente ed è catalizzata dalle transferasi O-glicosilate legate alla

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Tabella 2 - Allineamento multiplo delle sequenze proteichedelle as1-caseine. Allineamento delle sequenze stimate diamino acidi delle as2-caseine di vacche, capre, cavie, topi,conigli, ratti e pecore. Le sequenze sono state ottenute daGenbank (numero di accesso tra parentesi) e allineate usan-do il programma Pileup della Wisconsin Package version9.1 Genetics Computer Group (GCG), Madison, WI. Sonostati introdotti spazi vuoti per migliorare l’allineamento. Lesequenze dei ratti corrispondono alla g-caseina dei ratti[54], dei topi corrispondono alla g-caseina dei topi [96],dei topi b corrispondono alla e-caseina [52], delle cavie al-la caseina A [50].

Tabella 3 - Confronto delle sequenze di a-caseina nei mar-supiali. Le sequenze di amino acidi per la a –caseina del-l’opossum (thricosaurus vulpecula) e del tammur wallaby[16] sono state allineate usando il programma GAP delGenetic Computer Group (GCG). La sequenza del tammarè stata correlata come nella bibliografia [35]. Le sequenzesegnale sono in corsivo e i siti di fosforilazione putativi inneretto.

membrana all’interno dell’apparato di Golgi del-le cellule epiteliali della mammella [63.74.102].La glicosilazione aumenta durante la produzionedel colostro ed in risposta ad una infezione comela mastite, ma diminuisce nei periodi successividella lattazione [24]. La κ-caseina umana è mol-to più glicosilata di quella delle pecore e dellevacche e i residui di carboidrati possono rag-

giungere anche il 55% del peso totale della molecola [21]. La frazione di carboidrati della κ-caseina bovina è formata da galatto-sio, galaottosamine N- acetile e acido neuroamminico N-acetile. Lacaseina κ delle pecore contiene acido neuroamminico-glicolico-N, oltrea questi tre zuccheri [63]. La caseina κ umana è ancora più complessae contiene fucosio, galattosio, galattosamine N- acetile e acido neu-roamminico N-acetile [21.31.108].La presenza di varianti della caseina κ bovina è accuratamete descrit-ta. Due delle forme principali, la A e la B si distinguono al residuo 136e 148 (A: Thr e Asp B: Ile e Ala). La frequenza degli allele delle variantiA e B è predominante nel Bos indicus e nel bestiame Holstein, mentre èil contrario per le Jersey [32.43.83].

Proprietà fisiche e formazione delle micelleLe caseine sono refrattarie alla cristallizzazione, di conseguenza

è stato impossibile fare delle indagini sulla loro struttura utilizzando imetodi di diffrazione a raggi x [101]. Sono state, invece, utilizzate al-tre tecniche spettrometriche, come il dicroismo circolare, la dispersioneottica rotatoria e la spettroscopia a infra-rossi, per determinare le pro-porzioni degli elementi strutturali nelle soluzioni acquose delle caseineisolate [94]. I primi studi spettrografici indicavano che le caseine pos-siedono una struttura secondaria parzialmente regolare [53]. Questo èstato confermato da altre misurazioni idrodinamiche, come la NMR, chesegnalava che le caseine hanno una struttura aperta e flessibile, carat-teristica di una conformazione a spirale casuale [94.98].Le caseine sono presenti nel latte intero come aggregati termo-moleco-lari di proteine e minerali chiamati micelle. La concentrazione della ca-seina totale nel latte varia moltissimo, da meno di 10g/l a oltre 100g/l,a seconda della specie. I valori più bassi si trovano generalmente nel lat-te dei primati, per esempio 4.6 g/l negli umani, e la massima concen-trazione nei roditori, nei conigli e in alcune foche [58].Nel latte bovino le caseine ammontano a 25-26g/l con la stessa quan-tità di caseine αs1 e β (9-11 g/l) e di caseine αs2 e κ (3g/l). Inoltre, sipossono trovare anche piccole quantità di caseine non-micellari. Il lat-te umano contiene solo quantità minime di α-caseine e le β-caseine so-no quelle principali [45]. Il latte dei ratti contiene 90-100g/l di protei-ne totali e circa 60g/l di caseine [40]. Le principali caseine sono la ca-seina α (αs1) e la caseina β (41% e 36%), con minori quantità di casei-ne γ (αs2) e di caseine κ (10% e 5%) (Grigor MR Carne A. Smith MG,inedito) Il latte degli opossum contiene sia le caseine α che le caseine βin rapporto di 2:1 [35].Una tipica micella bovina contiene 104 molecole singole di caseina inassociazione collodiale con fosfato di calcio e piccole quantità di ma-gnesio, sodio, potassio e citrato [55]. Le proteine sono tenute insieme dauna miscela di interazioni idrofobiche ed elettrostatiche, che sono in-trinseche delle singole caseine e della loro interazione con il fosfato dicalcio. La presenza di fosfato di calcio è fondamentale per la conser-vazione dell’intergrità delle micelle.Waugh [107] sostiene che la caseina κ sia localizzata, soprattutto, sul-la superficie delle micelle e determini la dimensione della micella stessa.Questa affermazione è confermata dagli studi condotti con il microsco-pio elettronico, utilizzando tecniche di marcatura e immunologiche concaseina κ localizzate, soprattutto, sulla superficie delle micelle[57.68.97.98]. Dalgleish et al [18] hanno determinato la composizio-ne e la dimensione delle frazioni micellari isolate per mezzo di ultra-cen-trifugazione, analizzando le proteine ed i minerali e le misurazioni adispersione luminosa. Le loro scoperte ci dicono che la superficie dellemicelle contiene una stessa quantità di caseina α e κ (oltre a una mini-ma presenza di caseina β), mentre l’interno è formato da una quantitàequimolare di caseine α e β.

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Tabella 4 - Allineamento multiplo delle sequenze di protei-ne della b-caseina di alcune specie euteriane. Allineamen-to delle sequenze di amino acidi della b-caseina di alcunespecie. Le sequenze sono state ottenute dalla Genbank (nu-meri di accesso tra parentesi) e allineati usando il pro-gramma Pileup del Genetic Computer group (GCP). Le se-quenze segnale sono in corsivo e i potenziali siti di fosfori-lazione in neretto.

Tabella 5 - Confronto tra sequenze di b-caseina dei marsu-piali. Le sequenze di aminoacidi della caseina b dell’opossum(Trichosaurus vulpecula) [35] e della tammar wallaby (Ma-cropus eugenii) [11] sono state allineate usando il program-ma GAP del GCG. Le sequenze segnale sono in corsivo,mentre i siti putativi di fosforilazione sono in neretto. La re-gione replicata octapeptide occupa i residui da 144 a 249.

La concentrazione di calcio del latte bovino intero è di circa 30mM ol-tre il minimo della concentrazione richiesto per far precipitare le casei-ne α e β. Inoltre, gran parte del calcio è associato alle micelle sotto for-ma di una combinazione di calcio micellare (direttamente legato allecaseine per mezzo dei residui della fosforilazione) e di calcio collodia-le (associato con le micelle, ma non direttamente legato al polipeptidedella caseina) [29.55]. È stato dimostrato che i gruppi carbossile dei re-sidui di glutammato e aspartato presenti nei grappoli fosfati possonopartecipare al legame del calcio, poiché una quantità leggermente in-feriore di calcio viene legata rispetto a quanto prevedibile al numero digruppi fosfati presenti all’interno della molecola [55.101]. Tuttavia, me-no del 40% del calcio associato con le micelle è calcio micellare.

Struttura dei geni della caseinaLa struttura dei geni che caratterizza le caseine calcio-sensibili ha

rivelato la presenza di strutture conservate dei geni delle caseine αs1,αs2 e β in numerose specie. La caseina β dei ratti [66] è stata la primai cui geni furono studiati e comprende una unità tradizionale di 7.2kb,che contiene 9 esoni e 8 introni. La dimensione degli esoni varia da 21a 525 bp., mentre gli introni sono molto più grandi e costituisconol’85% del gene.L’esone I contiene la regione non traslata 5’. L’esone II è lungo 63bp econtiene la traccia di una regione non traslata, il peptide segnale e i pri-mi due amino acidi della proteina matura. Gli esoni III –VI sono corti(21-42 bp) e codificano il dominio idrofilo del terminale-N, che contie-ne tutti i siti potenziali di fosforilazione. Il principale sito di fosforilazio-ne è formato dalla congiunzione dell’esone IV e dell’esone V. L’ esone VIIè l’esone principale e codifica la porzione idrofoba terminale-C dellamolecola. L’esone VIII codifica il codone finale della proteina matura. Laregione non traslata 3’ viene codificatata, rispettivamente, dagli esoniVIII e IX.L’analisi della sequenza genomica della caseina β delle capre [93],dell’uomo [51.72] dei bovini [9] dei conigli [86.103] e dei topi[110.111] dimostra che questa struttura degli esoni si è mantenuta intutte le sei specie e che le variazioni della dimensione della unità di tra-scrizione sono dovute alle variazioni della dimensione degli introni (ta-bella 7).L’unica eccezione è la caseina umana β, in cui l’esone III è codificato inmodo criptato, a causa delle modificazioni intervenute dei siti di seg-mantazione di questo esone. Un’altra caratteristica della struttura del ge-ne della caseina riguarda la conservazione dei siti di fosforilazione. Ilsito principale di fosforilazione è formato da una fragmentazione delRNA, che si contrappone al codone glutammato (codificato dal finale 5’dell’esone V) accanto al sito secondario di fosforilazione codificato dalfianle 3’ dell’esone precedente in modo tale che essi formano parte del-la sequenza consenso della fragmentazione del RNA [66].La sequenza e la struttura dei geni che codificano le caseine αs1 di co-nigli, bovini, capre e le caseine αs2 dei bovini e dei ratti (caseina γ deiratti) e dei bovini sono state studiate [22.41.61.67.69.112]. Queste so-no geni grandi, che, nel caso dei bovini, contengono 18 o 19 esoni dis-tribuiti su 17-18.5 kd di sequenza contigua. Il confronto della sequen-za genomica nella sua lunghezza complessiva dei geni delle caseine αs1e αs2 suggerisce che ci siano molte caratteristiche comuni [41.67]. Inparticolare, queste comprendono la piccola dimensione degli esoni 5’,la struttura e la dimensione invariata dell’esone II e la separazione deisiti principali di fosforilazione nei diversi esoni e nei domini idrofobicicodificati dall’esone più grande. Inoltre, le sequenze conservate sonostate trovate nella regione laterale 5’ di tutte le caseine calcio-sensibili,dimostrando con certezza che queste sequenze sono responsabili dellaregolazione corretta degli ormoni dei geni della caseina. [8.42.47.81].

La struttura del gene della caseina κ è alquanto di-versa da quelle delle caseine calcio-sensibili. Ladimensione del peptide segnale, la distribuzionedei siti di fosforilazione e le proprietà delle se-quenze sono diverse da quelle delle caseine cal-cio-sensibili [8.81]. La struttura dei geni dei coni-

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Tabella 6 - Allineamento multiplo delle sequenze proteichedella caseina k. L’allineamento delle sequenze di aminoa-cidi previste delle caseine k selezionate. Le sequenze sonostate ottenute dalla Genbank (numeri di accesso indicati) eallineate usando il programma Pileup del GCG. La posi-zione del legane chimosina sensibile è indicato dalla lineaverticale.

Tabella 7 - L’organizzazione delle caseina b che codifica igeni di euteriani. Sono presentate le dimensioni dell’esonee dell’introne dei geni della caseina-b delle vacche [9], ca-pre [93], uomo [51], topi [111], conigli [103], ratti [66] epecore [86].Nella caseina umana l’esone III è codificato in modo crip-tato [104] e perciò l’introne ii è apparentemente più gran-de. Adattato da Bibl. [81].

gli, degli uomini e dei bovini è nota [1.5.25.42] ela sequenza parziale dei geni delle capre e dellepecore è disponibile [15.99]. Il gene della caseinaκ bovina contiene 5 esoni separati da ampie se-zioni di sequenze di introni. La dimensione com-plessiva del gene è circa 13kb. L’esone I è forma-to da 65 bp di sequenza non traslata. L’esone IIcontiene la traccia della sequenza non traslata e19 codoni che caratterizzano il peptide segnale.La traccia del peptide segnale e il terminale –Ndella polipeptide maturo vengono codificati dai33bp dell’esone III, mentre la maggior parte deipolipeptidi maturi viene codificata dall’esone IV.Concludendo, 210 nucleotidi della sequenza nontraslata sono contenuti negli esoni IV e V (4).Confrontando questo gene con quelli dei conigli edell’uomo si nota che una struttura simile è con-servata in tutte tre le specie, benché il gene dei co-nigli abbia introni più corti e, di conseguenza, siapiù piccolo degli altri. Gli elementi conservati so-no stati individuati nelle regioni prossimali dellecaseine κ di pecore, capre, vacche e uomo chesembrano essere diverse da quelle trovate nelle re-gioni laterali –5’ dei geni delle caseine calcio-sen-sibili.Esiste oggi la prova, relativa a tre specie, che i ge-ni delle caseine calcio-sensibili comprendono unapiccola famiglia di geni, che, insieme alla κ-ca-seina, formano parte del grappolo di geni sul cro-mosoma euteriano.Recentemente, Rijnkels e associati hanno presen-tato una mappa ad alta risoluzione del locus delgene della caseina di vacche e topi [88.90.92]. Illocus della caseina bovina copre un’area di 250kb e l’ordine dei quattro geni all’interno del locus,αs1, β, αs2 e κ è lo stesso presentato precedente-mente [30]. I geni strettamente collegati della ca-seina αs1 e β sono separati solamente da 20kb esono trascritti in modo convergente. La prossimitàfisica di questi due geni spiega l’alto livello di col-legamento genetico osservato per questi due geninei bovini [83]. I geni della caseina αs2 e della ca-seina κ (rispettivamente ) sono localizzati 70 e200 kb a monte del gene della caseina κ e sonotrascritti secondo lo stesso orientamento della ca-seina αs1.Questo posizionamento si è conservato nel locusdella caseina dei topi con l’eccezione che il grap-polo dei topi contiene un gene simil- αs2 in più, lacaseina ε. In tal caso i geni della caseina ε e γ so-no strettamente correlati e sono trascritti in modoconvergente. Inoltre, questo posizionamento dellacaseina αs1, simil- αs2 e κ è anche stato rilevatonel locus del gene della caseina umana, anche sel’orientamento della trascrizione dei singoli geninon sia ancora noto [33.91].

L’evoluzione dei geni della caseinaNonostante l’assenza di una omologia tra

le sequenze di codificazione delle caseine calcio-

sensitive entro e tra le diverse specie sia giustificata dalla rapida evolu-zione della famiglia di geni, ci sono delle caratteristiche conservateche indicano che questi geni possono essere evoluti da un gene ance-strale comune. Questo si riferisce alla sequenza segnale, alle regioni 5’al sito di inizio della trascizione e le regioni che codificano i principalisiti di fosforilazione. Oltre a ciò, esistono delle somiglianze nei geni del-le caseine calcio sensibili che contengono un certo numero di esonipiccoli. Ciò fa pensare che sia possibile che questi geni siano evoluti daun gene antenato comune attraverso una serie di eventi come il rime-scolamento degli esoni e la duplicazione dei geni [112]. L’orientamen-to invertito dei geni delle caseine αs1 e β e dei geni delle caseine αs2 (γ)e delle caseine ε dei topi potrebbe essere la prova della duplicazione dilarghe regioni del DNA all’interno del locus della caseina.Al contrario, i geni della caseina κ sembrano essere evoluti seguendo undiverso percorso. L’analisi della struttura dei geni della caseina κ confer-ma che la caseina κ non è imparentata con le caseine calcio-sensibili. Lapossibilità che la caseina κ sia collegata alla catena-γ del fibrinogeno èconfermata dalle somiglianze della sequenza cDNA di entrambe le pro-teine [105]. Ci sono anche un certo numero di somiglianze tra le due pro-teine, come la posizione conservata dei residui di cisteina e il legame chi-mosina-sensibile e la possibile struttura secondaria che circonda questolegame [65]. È interessante pensare che una proteina coinvolta nella co-agulazione del latte sia evoluta da una famiglia di proteine negli stadi fi-nali dei processi di coagulazione del sangue. Ci sono, in realtà, numerosesomiglianze funzionali tra questi due processi: sono originati da unasegmentazione proteolitica che determina la produzione di peptidi solu-bili (glicomacroproteine e fibrinoproteine A e B); le glicomacroproteine ele fibrinoproteine hanno una significativa carica negativa; il sito di seg-mentazione è conservato tra le specie; e i processi vengono accelleratidalla presenza di ioni di calcio e ritardati dalla presenza di moieti glico-silati [64]. Se la caseina κ e il fibrinogeno-γ sono evoluti da un comuneantenato, allora ci si può aspettare che la struttura di congiunzione deb-ba essere conservata. In realtà, in qualsiasi caso, le regioni omologhe esi-stenti tra la caseina κ e il fibrinogeno γ sono limitate su almeno un lato dagiunture nel gene del fibrinogeno-γ [4].Le ricerche condotte sulla struttura dei geni di altri membri della famigliadei fibrinogeni rivelano che le posizioni degli introni sono scarsamenteconservate tra i singoli geni. Sembra possibile che gli introni siano an-dati persi dopo la divergenza di questi geni [17]. Perciò, ammesso chequella struttura di congiunzione sia mal conservata nella famiglia nei fi-brinogeni, sembra possibile che la κ-caseina e il fibrinogeno-γ sianoevoluzionisticamente imparentati e che la divergenza delle due protei-ne dipenda dal rimescolamento degli esoni e dalla perdita di introni daparte del gene della caseina κ.

ConclusioneLe caseine sono una famiglia di proteine diverse generalmente

codificate da non più di quattro geni in tutte le specie. La funzione pri-maria delle caseine è nutritiva, in quanto portano sia aminoacidi che mi-nerali nel latte. Ad eccezione della caseina κ, ci sono altri limiti funzio-nali della struttura delle proteine se non quello di fornire siti adatti allafosforilazione e al conseguente legame di minerali come il calcio. Diconseguenza, i geni stanno evolvendo rapidamente, come testimoniatodalla decisa diversità esistente tra le caseine α e β dei marsupiali rispettoa quelle delle specie euteriane. Un futuro sbocco delle ricerche compa-rate delle caseine potrebbe riguardare lo studio delle strutture dei genidelle caseine dei marsupiali e le loro proprietà di frammentazione, leproprietà micellari dei diversi miscugli di caseina, la co-evoluzione del-le caseine κ e la chimosina dello stomaco e la regolazione dell’espres-sione dei geni delle caseine nelle diverse specie.

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