021747 Histologie Technovit Histotechnik - Kulzerkulzer-technik.de/.../histologie_1/Prospekt_Histologie_deutsch.pdf · 4 TECHNOVIT7100 Anwendung Technovit 7100 derStepbyStep-Anleitungentsprechend

Polymerisationssystemefür histologische Anwendungen

Technovit® – Histotechnik

2

Technovit®

Polymerisationssysteme für die Histotechnik

Die von Heraeus Kulzer, in Zusammenarbeit mit namhaften Wissenschaftlern und Instituten, entwickelten Systeme zurEinbettung von Gewebe in Kunststoff für histologische Untersuchungen haben sich in der Praxis seit Jahrzehntenbewährt. Sie werden zu Diagnose- und Forschungszwecken in der Medizin, der Tiermedizin und der Botanik erfolgreicheingesetzt. Ebenso in der Schneidetechnik für industrielle Anwendungen und Biomaterialien.

Die Systeme erfüllen wichtige Anforderungen, wieEinbetten bei niedriger Temperatur, Dünn- und Semidünn-schnitt-Technik sowie optimale Trenn- und Schleifeigen-schaften. Die Schnitte lassen sich gut strecken und imLichtmikroskop zeigen die gefärbten Präparate einehervorragende Morphologie.

Mit der Histo-Technik von Heraeus Kulzer werden diewissenschaftlichen und wirtschaftlichen Bedingungen fürhistologische Untersuchungen von Gewebe wesentlichverbessert.

n Einfache, rationelle Handhabung, da alle Komponen-ten aufeinander abgestimmt sind.

n Durch die besonderen Materialeigenschaften könnendie in histologischen Laboratorien eingesetztenStandard-Färbemethoden, Enzym- und Immunhisto-chemie einschließlich In-situ-Hybridisierung durchge-führt werden.

Warum Kunststoff?Im Gegensatz zu allen anderen in der Lichtmikroskopieverwendeten Einbettmitteln für die histologische Technikkönnen nach einer Kunststoffeinbettung gleichmäßigeDünn- und Semidünnschnitte angefertigt werden. Dabeibleiben morphologische Details ausgezeichnet erhalten. Inunentkalkten, in Kunststoff eingebetteten Proben lassen,sich die mineralisierten und zellulären Strukturen besserbestimmen. Sowohl die Mineralmatrix als auch dieknorpeligen und ligamentösen Gewebe sind sehr guterhalten.

Die Ergebnisse enzymatischer, immunhistochemischerUntersuchungen und auch In-situ-Hybridisierung zeigeneine sensiblere und spezifischere Aktivität, da alleTechnovit-Kunststoffe durch die spezielle Zusammenstel-lung der Polymerisationssysteme bei niedrigen Temperatu-ren und auch Minusgraden aushärten.

3

POLYMERISATIONSSYSTEME 4 Technovit® 7100 – Schnitte für histologische und industrielle Anwendungen7 Technovit® 8100 – Schnitte speziell für die Immunhistochemie10 Technovit® 9100 – Schnitte & Schliffe

TECHNOVIT-ZUBEHÖR 14 Histoform S, Q und N14 Einbettformen speziell für Technovit® 910015 Technovit® 3040 – Aufblocken15 Histobloc® Trägerteil16 Technovit® Histoblade16 Objektträgerpresse, Handprobenhalter

FÄRBEANLEITUNGEN & REAGENZIEN 18 Technovit® 710021 Technovit® 9100

Inhaltsverzeichnis

Anwendungs-beispiele/Färbungen< 18 - 23

Polymerisations-systeme< 4 - 13

Zubehör< 14 - 17

4

TECHNOVIT 7100

AnwendungTechnovit 7100 der Step by Step-Anleitung entsprechendansetzen. Die fixierten und dehydrierten Proben zuerst indie Präinfiltrations-, danach in die Infiltrationslösunglegen. Vakuumintervalle und/oder Agitation während dereinzelnen Schritte beschleunigen den Einbettvorgang.Proben für industrielle Anwendungen werden direkt in dieInfiltrationslösung gelegt oder auch ohne Vorbehandlungausgehärtet.

PolymerisationDas Polymerisationsgemisch nach Anleitung ansetzen unddie Einbettmulden damit füllen. Sofort darin die infiltrier-ten Proben orientieren. Die Polymerisation erfolgt beiRaumtemperatur.

Polymerisationstemperatur in:n Histoform S 32 °C – 38 °Cn Histoform Q 40 °C – 45 °C

Nach der Aushärtung (ca. 1½ Std.) mit Histobloc undTechnovit 3040 aufblocken (siehe auch Seite 15).

Technovit® 7100Schnitte für histologische und industrielle AnwendungTechnovit 7100 ist ein Kunststoffeinbettsystem auf Basis von HEMA* (2-Hydroxyethylmethacrylat). Verwendung findetdas hydrophile Harz in Medizin, Botanik, Zoologie sowie in der Industrie zur Einbettung von Geweben für lichtmikrosko-pische Untersuchungen. Die Schnitte können für histologische Färbungen und Enzymnachweise genutzt werden.

Technovit 7100 polymerisiert transparent aus. Aus denBlöcken lassen sich am Rotationsmikrotom gleichmäßigdünne Schnitte herstellen. Ein Herauslösen des Kunst-stoffes aus dem Block und dem Schnitt ist nicht erforder-lich und auch nicht möglich.

MaterialeigenschaftenDie chemische Polymerisation von Technovit 7100 wirdmit Hilfe eines Barbitursäurederivates in Kombination mitChloridionen und Benzoylperoxid eingeleitet. DasKatalysatorsystem enthält, im Vergleich zu herkömmlichenSystemen, keine aromatischen Amine.

Die Vorteile auf einen Blickn Unkomplizierte Handhabung.n Reproduzierbarkeit und Zuverlässigkeit der Einbet-

tungen durch ständige, dokumentierte Qualitätskon-trollen der einzelnen Komponenten.

n Niedrige Polymerisationstemperatur durch Teflon-einbettformen.

n Gleichmäßige Härte des Blockes, dadurch gleichmäßi-ge, dünnste Schnitte.

n Geringe Schrumpfungsartefakte, deshalb hervorragen-de Morphologie der Gewebe.

n Neben Routinefärbungen auch Enzymnachweisemöglich.

n Weniger toxisch durch den Katalysator aus Barbitur-säure.

n Polymerisation bei Raumtemperatur (20 °C).n Kein luftdichtes Abschließen während der Aushärtung

erforderlich.n Bei hämatologischen Beckenkammbiopsien kein

Entkalken erforderlich.* HEMA ist auch unter der Bezeichnung GMA (Glycolmethacrylat)

bekannt.

5

TECHNOVIT 7100

Weitere AnwendungsgebieteImmer wenn es darum geht, Schnitte von den eingebette-ten Materialien anzufertigen, ist Technovit 7100 DASMaterial der Wahl. Das ursprünglich für die Histologieentwickelte Technovit 7100 hat sich aufgrund seineruniversellen Anwendungsmöglichkeiten seit Jahren auchin der Industrie bewährt.

Anwendungsgebiete sind zum Beispiel Einbettungen undSchnitte von:n Kunststoffenn Folienn Papiern Textilienn organischen Präparatenn Fasern

MaterialeigenschaftenIn Fällen, in denen Materialproben geschnitten undlichtmikroskopisch untersucht werden, ermöglicht dieEinbettung mit Technovit 7100 Schnitte im µ-Bereich.Mit dem auf dieses System abgestimmten EinwegmesserTechnovit Histoblade können die Proben kostengünstig inhoher Qualität geschnitten werden.

Die Präparationen dieser Art von Proben unterscheidetsich nur geringfügig von den medizinischen Proben. Invielen Fällen ist das Einlegen in die Vorbereitungslösungnicht notwendig, wie z. B. bei Folien und Kunststoffen.

Hinweise zum Einbetten nicht medizinischerGewebeprobenn Bei Papier und Textilien ist eine Infiltration in der

Vorbereitungslösung mit Vakuum zu empfehlen.n Biologische Präparate werden wie medizinische

behandelt (fixiert, entwässert und anschließendinfiltriert).

n Materialien, die weniger temperaturempfindlich sind,können auch in größere Formen als S und Q eingebet-tet werden.

Art.-Nr. Bezeichnung Inhalt

64709003 Technovit 7100 Kombipack 1 x 500 ml Basislösung

5 x 1 g Härter 1

1 x 40 ml Härter 2

Produktdaten

Technische Daten

Farbe transparent

Dichte = spez. Gewicht g/cm3 1,07

(DIN 53479)

Brechungsindex

monomer 1,4540

polymer 1,5050

Lagertemperatur max. 25 °C

Haltbarkeit 2 Jahre

Technovit 7100

findet in vielen Bereichen

Anwendung: organische

Präparate, Kunststoffe,

Folien & Papier, Fasern

und viele mehr ...

6

TECHNOVIT 7100

Die Einbettmulden der Histoform zur Hälfte mit derPolymerisationslösung auffüllen (Einmalpipette) und dievorbereitete Probe darin orientieren und Form auffüllen(Achtung: nur die Mulde, nicht die gesamte Aussparung).Die Polymerisation erfolgt entweder komplett (2 Std.) beiRaumtemperatur oder 1 Stunde bei Raumtemperatur undanschließend 1 Stunde bei 37 °C im Wärmeschrank.

Die leicht klebrige Oberfläche (Inhibitionsschicht) kannmit einem fusselfreien Einmal-Tuch abgewischt werden.Eine zu hohe Luftfeuchtigkeit begünstigt eine stärkereInhibitionsschicht!

Abhängigkeit der maximalen Polymerisationstemperaturvon der Umgebungstemperatur

Umgebungstemp. Histoform S Histoform Q

Raumtemp. ca. 20 °C 32 37

Kühlschrank +4 °C 16 23

Kühlschrank auf Eis 0 °C 10 18

Aufblocken und ArchivierenUm die ausgehärteten Proben aus der Teflonformentnehmen zu können, werden diese mit Histobloc undTechnovit 3040 aufgeblockt (s. Seite 15).

WeiterverabeitungDie Blöcke in die Backenklemmvorrichtung am Rotations-mikrotom fest einspannen. Zum Schneiden der Blöcke,Histoblade (in Kombination mit dem Kulzer Messerhalter)oder Hartmetallmesser (Messerwinkel beachten) benut-zen. Den Schnitt trocken mit einer Pinzette abnehmenund auf ein Streckbad (Aqua dest.) aufbringen. Aufsaubere, fettfreie, auch beschichtete, Objektträgeraufziehen. Vor der Färbung mindestens 15 Minuten oderüber Nacht bei 60 °C trocknen lassen. Die nicht entplas-teten Schnitte direkt in die Farblösung bringen. Ein1-µ-Schnitt muss für die gewünschte Farbintensität längergefärbt werden als ein 5-µ-Schnitt.

Je nach Beschaffenheit der industriellen Probe z. B. nichtporöse Materialien wie Folien etc. kann auf die Schritte1 – 4 (Fixierung bis Infiltration) verzichtet werden. Eskann direkt mit der Polymerisation begonnen werden.

FixierungDie Gewebestücke wie erforderlich fixieren undnachbehandeln.

EntwässerungDie Dehydration erfolgt in Ethanol oder auch Aceton, einestufenweise Entwässerung mit HEMA in Puffer ist möglich(+4 °C).Wechselvakuum und Agitation sind zur besseren Durch-dringung während des Einbettprozesses hilfreich. EinIntermedium ist vor der Präinfiltration nicht erforderlich.

PräinfiltrationLetzte Konzentration der Entwässerungsreihe zu gleichenTeilen mit Basislösung Technovit 7100 ansetzen.Ca. 2 Stunden bei Raumtemperatur (20 °C) z. B. 50 ml96 % Ethanol : 50 ml Basislösung Technovit 7100.

InfiltrationHerstellung der Infiltrationslösung:n Basislösung Technovit 7100 100 mln + Technovit 7100 Härter 1 1 g (1 Beutel)In einem sauberen (spülmittelfreien) Glas- oder Polyethy-len-Gefäß ca. 10 Min. lösen. Die Infiltrationslösung istverschlossen bei 4 °C maximal 4 Wochen stabil.In einem genügend großen Volumen der Infiltrationslösungdie Proben, je nach Größe, bis zu 24 Stunden (Raumtem-peratur) oder länger bei 4 °C infiltrieren. Ein kurzesVakuum (Wasserstrahlpumpe) und Agitation sind hilfreich.

PolymerisationHerstellung der Polymerisationslösung:n Infiltrationsmedium (ungenutzt) 15 mln + Technovit 7100 Härter 2 1 mlca. 3 – 5 Min. mischen.Handelsübliche Pipettierhilfen und Einmalgefäß benutzen!

Step by Step

Herstellung der Lösungen im Überblick

Lösung Ethanol Basislösung Härter 1 Infiltrations- Härter 2 Anwendungs-

Technovit 7100 Technovit 7100 lösung Techovit 7100 temperatur

Präinfiltration z. B. 50 ml z. B. 50 ml Raumtemperatur

Infiltration 100 ml 1 g (1 Beutel) Raumtemperatur / 4 °C

Polymerisation S 15 ml 1 ml Raumtemperatur / 37 °C

Q 30 ml 1,5 ml Raumtemperatur / 37 °C

7

TECHNOVIT 8100

AnwendungTechnovit 8100 der Step by Step-Anleitung entsprechendansetzen. Die fixierten und dehydrierten Proben in dieInfiltrationslösung legen. Eine niedrige Temperatur undAgitation der Proben während des gesamten Einbettvor-gangs sind vorteilhaft.

PolymerisationDas Polymerisationsgemisch nach Anleitung ansetzen undin die Einbettmulden füllen. Die infiltrierten Proben darinorientieren. Mit Folien die Mulden luftdicht abdecken. ZurAushärtung die Einbettform auf eine vorgekühlte Gelplatteoder dünne Eisschicht bei 4 °C stellen.

Nach Abschluss der Polymerisation werden die Folienentfernt und mit Histobloc und Technovit 3040 aufge-blockt.

Ein Herauslösen des Kunststoffes vor der Färbung oderReaktion ist nicht möglich.

MaterialeigenschaftenTechnovit 8100 ist eine Kombination von einem nahezugeruchsfreien Weichmacher und einem hydrophilenKunststoff. Technovit 8100 ist speziell für die Kältepoly-merisation (+4 °C) entwickelt worden.

Während der Härtung muss die Einbettform absolutluftdicht verschlossen sein, da das Polymerisationssystemsauerstoffempfindlich ist.

Die Vorteile auf einen Blickn Reproduzierbarkeit und Zuverlässigkeit der Einbet-

tungen durch ständige und dokumentierte Qualitäts-kontrollen der einzelnen Komponenten.

n Niedrige Polymerisationstemperatur von 10 °C bis0 °C durch das spezielle Katalysatorsystem und dieTeflonformen.

n Uniforme Härte des Blockes, dadurch gleichmäßige,dünnste Schnitte.

n Geringe Schrumpfungsartefakte, deshalb hervorragen-de Morphologie der Gewebe.

n Routinefärbungen, Enzymnachweise und Immunhisto-chemie möglich.

n Hämatologische Beckenkammbiopsien müssen nichtentkalkt werden.

n Geringe Toxizität durch spezielle Kombination vonWeichmacher und Katalysatorsystem.

Technovit® 8100Schnitte speziell für die ImmunhistochemieTechnovit 8100 ist ein Kunststoffeinbettsystem auf Basis von HEMA für lichtmikroskopische Untersuchungen. Es eignetsich zum Einbetten von allen Geweben in Medizin, Zoologie und Botanik. Schnitte von entkalkten oder kurzentkalktenBeckenkammbiopsien und implantierte Biomaterialien können nicht nur für histologische Färbungen genutzt werden,sondern auch für Enzym- und Immunhistochemie.



5 x 0,6 g Härter 1

1 x 30 g Härter 2

1 x 500 Stk. PE-Folien

Produktdaten

Schnitte mit Technovit

8100 können nicht nur

für histologische Färbung

genutzt werden, sondern

auch für Enzym- und

Immunhistochemie.

8

TECHNOVIT 8100

Technische Daten

Farbe transparent


(DIN 53479)

Brechungsindex

monomer 1,4485

polymer 1,4990


Haltbarkeit 2 Jahre

Die folgende Anleitung zur Fixierung und Dehydrierung istnicht zwingend erforderlich. Technovit 8100 kann auchnach einer anderen Vorbehandlung infiltriert und polyme-risiert werden.

Für den ganzen Prozess sind dichtschließende Glas- oderPE-Einmalgefäße (ca. 20 ml) zu verwenden!

Tipp:Bei der Fixierung, Entwässerung und Infiltration müssendie Proben ständig bewegt werden!

FixierungUm optimale immunhistochemische Ergebnisse zuerzielen, wird empfohlen, während des gesamten Einbett-vorganges bei 4 °C zu arbeiten und kurze Fixationszeitenanzustreben. Möglichst kleinste Gewebestücke (1 mmDicke) in 2 %-igem Paraformaldehyd in PhosphatpufferpH 7,4 bei 4 °C 3 – 4 Stunden fixieren. Anschließend12 Stunden (über Nacht) in Phosphatpuffer pH 7,4 miteinem Zusatz von 6,8 %-iger Saccharose bei 4 °Cnachbehandeln.

EntwässerungDas Gewebe in kaltem Aceton 100 % mindestens1 Stunde bei 4 °C dehydrieren. Während der erstenMinuten so häufig wechseln, bis das Aceton klar bleibt.

InfiltrationHerstellung der Infiltrationslösung:n Technovit 8100 Basislösung 100 mln + Technovit 8100 Härter 1 1 Beutel, 0,6 g

In einem sauberen, spülmittelfreien PE- oder Glasgefäßlösen und dann in 4 °C stellen. Die Infiltrationslösung istbei 4 °C verschlossen maximal 4 Wochen stabil.

Probe aus dem Aceton direkt in die vorgekühlte Infiltra-tionslösung überführen. Darin bleiben die Proben 6 – 10Stunden bei 4 °C.

PolymerisationHerstellung der Polymerisationslösung:n Infiltrationslösung, 4 °C 15 mln + Technovit 8100 Härter 2, 4 °C 0,5 ml

Mit handelsüblichen Pipettierhilfen abmessen und imPE- oder Glasgefäß gut mischen. Zu diesen Polymerisa-tionsgemisch die infiltrierte Probe geben, das Gefäßverschließen und ca. 5 Minuten vorsichtig weiter mischen.

Die Farbe der Polymerisationslösung verändert sich zuerstgelblich-grünlich, wird aber farblos nach der Aushärtung.

Mit einer Einmalpipette die Mulden der Histoformvollständig füllen, das Gewebe darin orientieren und sofort

Herstellung der Lösungen im Überblick

Lösung Ethanol Basislösung Härter 1 Infiltrations- Härter 2 Anwendungs-

Technovit 8100 Technovit 8100 lösung Technovit 8100 temperatur

Infiltration 100 ml 0,6 g (1 Beutel) 4 °C

Polymerisation 15 ml 0,5 ml 4 °C auf Eis

9

TECHNOVIT 8100

mit der mitglieferten transparenten PE-Folie abdecken.Um die Mulde luftdicht zu verschließen, können auchmehrere Folien für eine Mulde benutzt werden. Blasennicht herausdrücken, sondern Polymerisationslösungnachlegen und neue Folie auflegen. Während der Polyme-risation (mindestens 3 Stunden) muss die Einbettform aufeiner Kühlplatte oder dünnen Eisschicht bei 4 °C stehen.Form und Proben nicht mit Feuchtigkeit in Kontaktbringen.

Aufblocken und ArchivierenNach der Härtung die Folien bei Raumtemperatur miteiner Pinzette entfernen. Um die ausgehärteten Probenaus der Teflonform entnehmen zu können, werden diesemit Histobloc und Technovit 3040 aufgeblockt(s. Seite 15). Nicht sofort benötigte Blöcke (für dieImmunhistochemie) in Plastikbeuteln oder ähnlichemkühl lagern.

WeiterverarbeitungBeste Schneideergebnisse erzielt man mit einemRotationsmikrotom, mit den Einmalmessern TechnovitHistoblade in Kombination mit dem Kulzer Messerhalteroder einem Hartmetallmesser (Glas-Diamantmesser). DieBlöcke fest im Backenklemmsystem am Mikrotomeinspannen. Die Schnitte mit einer Pinzette trockenabnehmen und auf einem Streckbad (Aqua dest.)

Histoform S

Material Raumtemp. Kühlschrank Kühlschrank

ca. +20 °C +4 °C auf Eis 0 °C

Technovit 8100 69 21 12

30:1

Technovit 8100 67 19 11

35:1

Technovit 8100 65 – –

40:1

aufbringen. Direkt auf beschichtete Objektträger aufzie-hen und 2 Stunden oder länger bei 37 °C trocknen. Nichtsofort benötigte Schnitte (für die Immunhistochemie) beiRaumtemperatur trocknen und maximal 5 Tage bei 4 °Clagern.

ObjektträgerbeschichtungZum Beispiel Objektträger 15 Minuten in eine Lösung von0,5 % Alcianblau (8GXL Sigma) bei 65 °C tauchen oderden Objektträger mit 0,1 % Poly-L-Lysine flüssig (Sigma)beschichten. Alle handelsüblichen beschichteten Objekt-träger können benutzt werden.

Die Schnitte müssen mindestens 2 Stunden bei 37 °Cgetrocknet sein. Die nichtentplasteten Schnitte direkt indie Farblösung bringen oder mit der enzymatischenVorbehandlung beginnen.

Ein Beispiel

n Enzymatische Vorbehandlung: Schnitt 5 – 10 Minutenin 0,01 % Trypsin mit 0,1 % CaCl2 (Calciumchlorid)pH 7,8 inkubieren (37 °C).

n Mehrmals in Phosphatpuffer (PBS) 5 Minutenauswaschen.

n 2 Stunden bei 37 °C mit Primärantikörper inkubieren,mehrmalig wechseln.

n Blockieren der endogenen Peroxidase mit 0,06 %Hydrogenperoxyd in Phosphatpuffer (PBS)(30 Minuten bei Raumtemperatur).


n 30 Minuten bei Raumtemperatur mit dem zweitenAntikörper inkubieren.


n Diaminobenzidin (DAB) wie bei Kryostat-Schnitten.n 10 – 15 Sekunden Gegenfärbung mit Hämatoxylin.n Unter fließendem Wasser 3 Minuten bläuen.n Mit Glyzerin-Gelatine eindecken.

Die Immunbestimmung ist mit der AP-, PAAP-, APAAP-,ABC-, Avidin-Biotin-, Strept-Avidin- und der Immunfluo-reszenz-Methode möglich.

Vor der Anwendung eines Netzmittels z.B. Tween imSpülpuffer wird abgeraten. Die Peroxidase soll in Puffergelöst sein.

Bei dem ständig wechselnden Angebot an neuen Produk-ten für Histochemie und Immunhistochemie ist es immerratsam, sich an den jeweiligen Herstellerangaben zuorientieren.

Histoform Q

Material Raumtemp. Kühlschrank Kühlschrank

ca. +20 °C +4 °C auf Eis 0 °C

Technovit 8100 – 69 48

30:1


35:1


40:1

10

TECHNOVIT 9100

Technovit 9100 wurde speziell zur Einbettung vonmineralisierten Geweben, aber auch Weichgewebe miterweitertem Untersuchungsspektrum in der Lichtmikros-kopie entwickelt. Die entplasteten Schnitte eignen sich fürhistologische Übersichtsfärbungen, enzym- und immun-histologische Untersuchungen, einschließlich In-situ-Hybridisierung.

Dünnschliffe für die Immunhistologie können auf Glas-objektträgern aufgeklebt und entplastet werden.

Anwendungsbereichen Hartschnitt-Technik zur Herstellung von

DünnschnittenBeispiele: Beckenkammbiopsien, kleinere spongiöseund kompakte Knochengewebeproben.

n Trenn-Dünnschliff-Technik (Trennverfahren inPunktkontakt-Technologie)Beispiele: Zahn-Kiefer-Segmente mit und ohneImplantat, nichtzementierte Endoprothesen mitSchaftknochen.

n Kombinierte Trenn-Dünnschliff-Technik und Hart-schnitt-Technik (Zielpräparation)Beispiele: Grenzflächen- und Umgebungsbeurteilungbei Metallimplantaten und nichtzementierten Endo-prothesen.

Nicht schneidbare Gewebe sind zahntragende Kiefer-abschitte mit Füllungen, Kronen und Brücken, dickeCorticalis, implantattragende (Metall oder Keramik)Kiefer- oder Röhrenknochen oder auch spröde, hyper-mineralisierte Knochenteile.

MaterialeigenschaftenDie Polymerisation des hydrophoben Technovit 9100erfolgt unter Sauerstoffausschluss, mit Hilfe einesKatalysatorsystems aus Peroxid und Amin. ZusätzlicheKomponenten wie PMMA-Pulver und -Regler ermöglicheneine gesteuerte Polymerisation bei Kälte (im Bereich von–2 bis –20 °C, je nach Volumen), die eine vollständigeAbleitung der Polymerisationswärme garantiert.

Die Vorteile des Systems auf einen Blickn Polymerisation bei Minusgraden.n Reproduzierbarkeit der Einbettergebnisse und

Zuverlässigkeit durch ständige und dokumentierteQualitätskontrollen.

n Uniforme Härte des Blocks.n Der PMMA-Block bleibt transparent.n Bessere Ergebnisse bezüglich Schneiden und Färben,

da Technovit 9100 ein Hydrophilierungsmittel enthält.n Sowohl für Dünnschnitt- als auch Säge- und Schliff-

technik einsetzbar.n Enzym- und Immunhistologie und In-situ-Hybridisie-

rung möglich (Schnitte und Schliffe).

Technovit® 9100Schnitte und SchliffeTechnovit 9100 ist ein Kunststoffeinbettsystem auf Basis von MMA (Methylmethacrylat).Verwendung findet Technovit 9100 in der Medizin, Botanik und Zoologie.



1 x 120 g PMMA-Pulver

8 x 1 g Härter 1

1 x 10 ml Härter 2

1 x 5 ml Regler

66006735 Technovit 9100 Basisflüssigkeit 5000 ml

66010251 Technovit 9100 PMMA-Pulver 1000 g

64709022 Technovit 9100 Härter 1 100 x 1 g

66039185 Technovit 9100 Härter 2 9 x 10 ml

66039184 Technovit 9100 Regler 12 x 5 ml

Produktdaten

Mehrkernige RiesenzellenToluidinblaufärbung

Gefäßprothese (Stent)Elastika Van Gieson

Ausschnitt GefäßprotheseElastika Van Gieson

Appendix Pentachromfärbungnach Movat

11

TECHNOVIT 9100

Fixation – Vorbehandlung des GewebesDie Fixierung erfolgt je nach Größe des Gewebes und demnachzuweisenden Antigen/Enzym für 12 bis 24 Stundenin unterschiedlichen Fixierlösungen. Eine Überfixation istin jedem Fall zu vermeiden.

Zum Nachweis der Antigene/Enzyme sind folgendeFixierungsmethoden möglich:a) 4 % neutrale gepufferte Formalinlösung (0,1 M

Phosphat- oder 0,02 M Phosphatpuffer für Becken-kammbiopsien)

b) 10 % gepufferte Formalinlösung (0,1 M Phosphat-puffer)

c) Fixierlösung nach Schaffer (Formol/Alkohol)d) 1,4 % Paraformaldehyd-Lösung in Kälte (+4 bis

+8 °C) für 24 – 28 Stunden (empfindlicher Enzym-nachweis wie z. B. alkalische Phosphatase, fixations-empfindliche Antigene)

Technovit 9100 Basisflüssigkeit – Komponente (1)Die Basislösung Technovit 9100 besteht aus stabilisier-tem Methylmethacrylat. Die Hydrophilie wird durch denZusatz eines geeigneten Hydrophilierungsmittels verbes-sert. Technovit 9100 Basislösung kann sowohl stabilisiertals auch entstabilisiert verwendet werden.

Technovit 9100 PMMA-Pulver – Komponente (2)Das PMMA-Pulver wird verwendet, um eine deutlicheAbsenkung des Polymerisationsschrumpfes, eineReduktion der frei werdenden Polymerisationswärme undeinen besseren Polymerisationsablauf zu gewährleisten.

Technovit 9100 Härter 1 – Komponente (3)Das Härterpulver 1 ist eine Peroxidverbindung, diezusammen mit dem Härter 2 die Polymerisation startet.

Technovit 9100 Härter 2 – Komponente (4)Die Härterflüssigkeit 2 wirkt katalytisch auf den Härter 1,um auch bei sehr niedrigen Temperaturen [< 0 °C] einegezielte Polymerisation zu ermöglichen.

Technovit 9100 Regler – Komponente (5)Dieser besteht aus einer reaktiven organischen Verbin-dung, die auch bei großen Polymerisationsmengen einegeregelte Polymerisation mit kontrolliert niedrigenTemperaturspitzen ermöglicht.

Die Komponenten

Die Anwendung

Dehydration, Intermedium und Immersion(Präinfiltration 1 – 3, Infiltration)

Die Verarbeitung darf ausschließlich in PE- oderGlasgefäßen erfolgen!Die Dehydration erfolgt in einer aufsteigenden Alkohol-reihe (Entwässerungsautomat) bei Raumtemperatur. Immangelhaft entwässerten Gewebe entstehen sogenannteLunkerstellen, die aus weißem Perlpolymerisat bestehenund das Schneiden sowie die Schnittqualität negativbeeinträchtigen. Als Intermedium wird Xylol eingesetzt.

Die Immersion (Präinfiltration 1 – 3, Infiltration) erfolgt in3 Stufen (im Entwässerungsautomaten bis zur Präinfiltra-tion 2). Die angegebenen Zeiten sind Mindestzeiten undbeziehen sich auf kleine spongiöse und kortikale Knochen-gewebeproben und Beckenkammbiopsien (für größereGewebeproben sind die Zeiten und das Volumenanzupassen).

Bezeichnung Menge Komponenten

Technovit 9100 Basislösung 1 x 1000 ml 1

stabilisiert

Technovit 9100 PMMA-Pulver 120 g 2

Technovit 9100 Härter 1 8 Beutel á 1 g 3

Technovit 9100 Härter 2 10 ml 4

Technovit 9100 Regler 5 ml 5

12

TECHNOVIT 9100

Entstabilisierung der Basislösung – Verarbeitung derKomponentenDie Basislösung Technovit 9100 kann sowohl stabilisiertals auch entstabilisiert verwendet werden. Die Verwen-dung von entstabilisierter Basislösung garantiert dasErgebnis für alle immunhistochemischen Untersuchungenanalog der Paraffin-Histologie.Chromatographiesäule mit ca. 50 g Al2O3 (aktiv, basisch,90) füllen und langsam Technovit 9100 Basislösung(Materialnummer 1) durchlaufen lassen. Eine Säulenfül-lung mit Al2O3 reicht zur Entstabilisierung von 3 - 4 Liternder Basislösung. Die entstabilisierte Lösung wird inverschließbare Braunglasflaschen portioniert und bei+4 °C für die laufende Verarbeitung gelagert (max. 5Tage) oder bei –15 °C bis –20 °C aliquotiert auf Vorratgelegt. Ab Präinfiltration 3 kann mit entstabilisierterBasislösung gearbeitet werden. Wenn mit entstabilisierterMMA-Basislösung gearbeitet wird, kann die geringereMenge Peroxid verwendet werden für die Infiltrations-lösung und Stammlösung A.

Herstellung der Lösungenn Gebrauchslösung

Herstellung der Präinfiltrations-, Infiltrations- undStammlösungen nach genauer Vorschrift entsprechendder Gebrauchsinformation für Technovit 9100.Lagertemperaturen beachten!

n PolymerisationslösungDie gekühlten Stammlösungen A und B sind unmittel-bar vor Gebrauch im Verhältnis 9 Teile (v/v) Stamm-lösung A (Messzylinder) und 1 Teil Stammlösung B(Pipette) in einem Becherglas mit Hilfe eines Glas-stabes zu mischen.

Komponenten-Nr. 1 2 3 4 5

Bezeichnung Basislösung PMMA-Pulver

Härter 1 Härter 2 Polymerisations-regler

Bearbeitungs-temperatur

Lagerfähigkeit

Präinfiltration 3 200 ml 1 g Raumtemperatur 1/2 Jahr bei –20 °C

Infiltration ad 250 ml 20 g 1 g / 2 g* 4 °C 1/2 Jahr bei –20 °C

Stammlösung A ad 500 ml 80 g 3 g / 4 g* 4 °C 1/2 Jahr bei –20 °C

Stammlösung B ad 50 ml 4 ml 2 ml 4 °C 1/2 Jahr bei –20 °C

Herstellung der Gebrauchslösungen

Erklärung „ad“: Bei der Zubereitung von Lösungen aus Festsubstanz wird das Volumen erst endgültig eingestellt, wenn gesamter

Stoff gelöst ist. Bitte Messkolben verwenden.

*Bei Verwendung von stabilisiertem Technovit 9100 muss die größere Menge an Härter 1 eingesetzt werden.

Dehydration, Intermedium und Präinfiltration

Stufe Lösung Konzen- Zeit/

tration Temperatur

Entwässerung 1 Ethanol 70 % > 1 h / RT




Entwässerung 5 Ethanol abs. > 1 h / RT

Entwässerung 6 Ethanol abs > 1 h / RT

Entwässerung 7 Ethanol abs > 1 h / RT

Intermedium 1 Xylol > 1 h / RT

Intermedium 2 Xylol > 1 h / RT

Präinfiltration 1 Xylol/Technovit 1 + 1 > 1 h / RT

9100 Basis

(stab.)

Präinfiltration 2 Technovit 9100 > 1 h / RT

(letzte Stufe Basis (stab.) +

im Automaten) Härter 1

Präinfiltration 3 Technovit 9100 > 1 h /

(Kühlschrank) (entstab.) + 4 °C

Härter 1

Infiltration Technovit 9100 > 1 h /

(Kühlschrank) (entstab.) + 4 °C

Härter 1 + nach

PMMA-Pulver 5 Tagen,

Lösung

wechseln

TIPP:Für besonders große Proben (Endoprothesen) kannzusätzlich ein handelsübliches PMMA-Granulat benutztwerden. Dadurch wird die Menge an benötigter Polymeri-sationslösung reduziert.

13

TECHNOVIT 9100

PolymerisationDas Polymerisationsgemisch wird in die vorgekühlteEinbettform gegossen. Das infiltrierte Gewebe darinorientieren, mit dem Polymerisationsgemisch randvollübergießen und anschließend evakuieren. Die Evakuierunglässt sich entweder im vorgekühlten Exsikkator bei 4 °C(leichtes Vakuum, z. B. Wasserstrahlpumpe oder Vakuum-pumpe bei 200 mbar) oder im Tiefkühlschrank mit externangeschlossener Vakuumpumpe für ca. 10 Minutendurchführen. Danach Form luftdicht verschließen!Die Polymerisation erfolgt im Bereich von –2 °C bis–15 °C, je nach Volumen der Einbettgefäße.

Zum Beispiel:Einbettform 25 mm (10 ml) und dem Schiffcheneinsatz:–2 °C bis –4 °C in ca. 24 Std.

Die Polymerisation ist in etwa 24 Stunden abgeschlossen.Die Polymerisationszeiten sind abhängig vom Polymerisa-tionsvolumen sowie der Temperatur. Je größer dasVolumen der Einbettform, umso niedriger die Temperaturwählen!Größere Proben sind somit bei niedrigeren Temperaturenauszuhärten. Dabei ist die Kältekapazität der verwendetenexplosionsgeschützten Kühleinrichtung (Tiefkühlfach imEisschrank, Tiefkühltruhe, Tiefkühlschrank, Tiefkühlwannez. B. für Paraffinblöcke mit Deckelverschluss) zu beach-ten. Reproduzierbare Ergebnisse für verschiedene Pro-bengrößen werden in einem Tiefkühlschrank mit variabeleinstellbaren Temperaturen zwischen –2 °C bis –25 °C beieiner Temperaturkonstanz von +/– 0,5 °C erzielt. Währendder Polymerisation die Gefäße nicht öffnen!

Aufblocken und ArchivierenHaben sich die Proben nach der Aushärtung auf Raum-temperatur erwärmt, wird beim Einsatz der Histoform Nmit dem Histobloc N und Technovit 3040 aufgeblockt(s. Seite 15). Vorher Schraube lösen und Deckel und Folieabnehmen. Der Block wird in der Standard-Objektklam-mer am Rotationsmikrotom für Hartschnitte fest einge-spannt.Bei Verwendung der runden Histo-Einbettformen werdenDeckel und Boden entfernt und die Probe durchgedrückt.Sie kann dann direkt ohne Aufblocken im Rundprobenhal-ter am Rotationsmikrotom für Hartschnitte eingesetztwerden.

Verarbeitung der PolymerisateJe nach Fragestellung erfolgt die Weiterverarbeitung durchHartschnitt- oder Trenn-Dünnschliff-Technik.n Herstellung von Hartschnitten mit entsprechen-

den Hartschnittmikrotomen.

n Das Gleiche gilt für Semidünnschnitte unter Verwen-dung von Glas- und Diamantmessern. Die Blöckewerden zuvor getrimmt.

n Verwendung von 16 cm-Hartmetallmessern mitSchliff D.

n Zum Schneiden der polymerisierten Technovit9100-Blöcke 30 %-iges Ethanol, sog. Schneide-flüssigkeit, verwenden.

n Schnitte auf beschichtete Objektträger aufziehen, mit50 %-igem Ethanol, sogenannte Streckflüssigkeit,strecken und mit PVC-Folie abdecken.

n Überschüssige Flüssigkeit mit Filterpapier absaugen,Objektträger stapeln und unter Druck (Schnittpresse)über Nacht bei +50 °C trocknen. Presse erst nachAbkühlung öffnen. Abdeckfolie vorsichtig vom kaltenObjektträger abziehen.

Technische Daten

Farbe transparent


(DIN 53479)

Brechungsindex

Monomer 1,4175

Polymer 1,4720


Schnitt-Entplastung

Xylol 2 – 3 x 20 Min. Raumtemperatur

2-Methoxyethylacetat (MEA) 1 x 20 Min. Raumtemperatur

Aceton reinst 2 x 5 Min. Raumtemperatur

Aceton reinst 2 x 2 Min. Raumtemperatur

Aqua dest.

Alternativ:

2-Methoxyethylacetat (MEA) 3 x 20 Min. Raumtemperatur

Absteigende Alkoholreihe

Trenn-Dünnschliff-TechnikTrennen in Punktkontakt-Technologie sowie Schleifen imFlächen- oder Linienkontaktverfahren mit entsprechendenGeräten.

Empfohlene Laborausstattung für die Anwendung desTechnovit 9100 Systemsn Chromatographiesäulen AL2O3 (aktiv, basisch, 90)n regelbarer Kühlschrankn Glasexsikkatorn Vakuumpumpen Magnetrührer

14

ZUBEHÖR

Die Vorteile auf einen Blick:n Einbettmaterial sparendes Volumen.n Schneidfreundliche Form (S + N).n Lange Lebensdauer.n Leichtes Herauslösen der Einbettungen durch.

konische Form und das Material Teflon.n Ausgezeichnete Temperaturabführung durch

Edelstahlboden.n Genaues und leichtes Befestigen der Histobloc-

Trägerteile durch spezielle Aussparung.

Histoform S:Technovit 7100/810010 MuldenMaße: B x H x T:ca. 10 x 16 x 6,5 mm

Histoform Q:Technovit 7100/8100für Aufnahmen von größeren Präparaten10 MuldenMaße: B x H x T:ca. 20 x 16 x 10 mm

Histoform N:Technovit 9100mit 4 Abdeckplatten4 MuldenMaße: B x H x T:ca. 12 x 20 x 10 mm

Zubehör Technovit® – HistotechnikHistoformen

Um den Temperaturverlauf bei der Polymerisation inniedrigen Bereichen zu halten, wurden spezielle Einbett-formen aus Teflon mit Edelstahlboden zur Wärmeabfüh-rung entwickelt. Darüber hinaus ermöglicht das spezielleProfil der Einbettformen anwendungs- und schneidfreund-liche Einbettungen. Anwendung:

1. Boden der Formabnehmen, Schiffchenund Form zusammen-stecken.

2. Einsatzauffüllen.

3. Probe im Schiffchenorientieren.

4. Bis zum Rand auffül-len. Vakuum ziehen(ca. 10 min. imExsikkator)max. 200 mbar,Vakuum ablassen.

5. Deckel aufsetzen(luftdicht).In den Kühlschrank bei–2 °C / –4 °C stellen.

Einbettformen speziell für Technovit® 9100

Polyethylen-Einbettförmchen 25 mm & „Schiffchen“-Einsatz für den Rundprobenhalter am Rotationsmikrotom.Weitere Größen: 15 - 30 - 40 - 50 mm (nur Zylinder)

15

ZUBEHÖR

Je nach Raumtemperatur ist Technovit 3040 in 5 – 10Minuten ausgehärtet und der Histobloc mit der Probe festverbunden.Die Probe kann jetzt aus der Form gelöst werden und istschneidefertig [Bild 3]. Durch das Aufblocken mit demsehr harten Technovit 3040 wird das elastische Technovit7100 bzw. Technovit 8100 so stabilisiert, dass auchdünnste Schnitte möglich sind.

Einspannen der Probe im MikrotomDurch die rechteckige Form des Histoblocs ist ein direktesEinspannen in die Backenklemmvorrichtung des Rotations-mikrotoms möglich.

Hinweis für Technovit 9100:Bei Verwendung der runden Histo-Einbettform fürTechnovit 9100 kann die Probe direkt in den Rundproben-halter eingespannt werden, aufblocken ist nicht notwendig.

Lagern und Archivieren der Proben 7100 und 8100Zur besseren Archivierung lassen sich die Histoblocsaneinanderstecken. Damit werden eine fortlaufendeNummerierung und platzsparende Lagerung ermöglicht.

Für histochemische und immunhistologische Untersu-chungen ist es empfehlenswert, die Blöcke in PE-Tütenbei +4 °C oder länger auch bei –20 °C aufzubewahren.

Technovit 3040 ist ein schnellhärtender 2-Komponenten-Kunststoff auf Methymethacrylat-Basis (MMA). ZumAufblocken und Befestigen eingebetteter Kunststoffpro-ben mit dem Histobloc oder auch zur Sockeleinbettung.Aufgrund der chemischen Zusammensetzung ist einestabile, dauerhafte Verbindung mit dem ausgehärtetenBlock Technovit 7100, Technovit 8100 oder Technovit9100 gegeben.

Histobloc – TrägerteileDie Histobloc-Träger sind adaptierbar für die HistoformS + Q oder auch für die Histoform N.

AufblockenNachdem Technovit 7100, Technovit 8100 oder Technovit9100 ausgehärtet ist, wird das Trägerteil Histobloc in diedafür vorgesehene Aussparung der TefloneinbettformHistoform S/Q oder Histoform N eingelegt [Bild 1].Wurde mit Technovit 8100 eingebettet, ist vor demAufsetzen des Trägerteils Histobloc, die Abdeckfolie vonder Probe zu entfernen.Bei der Histoform N wird der Aluminiumdeckel abgenom-men und die aufgelegte PE-Folie entfernt.Technovit 3040 möglichst dickflüssig anrühren(Mischungsverhältnis 2 – 3 Volumenanteile Pulver zu 1Volumenanteil Flüssigkeit). Das angemischte Material indie Aussparung des Histobloc gießen. [Bild 2]

Technovit® 3040 / Histobloc®

1 2 3

16

ZUBEHÖR

Technovit® Histoblade und Messerhalter Abdeckfolien

Handprobenhalter und Einsätze

Das Einmal-Histoblade ist speziell zum Schneiden von inHEMA (2-Hydroxyethylmethacrylat) eingebettetenGewebeproben sowie auch Materialien in der industriellenAnwendung bis zu 1 µ Schnittdicke geeignet.Zusammen mit dem außerordentlich stabilen Klingenhal-ter steht somit eine preisgünstige Alternative zu anderenMessern zur Verfügung.

Die Vorteile:n Schwere, stabile Ausführung.n Einfache Handhabung.n Gute Schneideergebnisse bis 1 µ Schnittdicke.n Optimierte Schnittqualität.n Verbesserte Standzeit.

Der Messerwinkel beim Einsatz des Einmal-Histobladesollte bei Microm/Thermo-Rotationsmikrotomen bei 9 °Cliegen. Sie benötigen einen Messerhalter „NR“, „SL“ oder„N“.Bei Reichert-Jung/Leica-Rotationsmikrotomen bei0 °C, benötigen Sie einen Messerhalter „N“.Bei weiteren Fragen wenden Sie sich bitte an IhrenMikrotomlieferanten.

Maße:Histoblade: 60 x 19 x 1 mm, 2 Bohrungen à 4 mmMesserhalter: 170 x 34 x 10 mm

Objektträgerpresse

Presse aus Metall zum planen Aufpressen der MMA-Schnitte auf dem Objektträger beim Trocknungsvorgang.Mindestens 50 – 70 Objektträger passen in die Objekt-trägerpresse (zwischen jeden Objektträger ein Filterpapierlegen).

PE-Folie zum Abdecken der MMA-Schnitte auf demObjektträger nach dem Strecken (z. B. Technovit 9100),Format: 25 x 75 mmDie Folie wird auch zum sauberen Verschließen derHistoform N mit der Aluplatte verwendet.

Der Handprobenhalter ist ein wichtiges Hilfsmittel für dieErstellung von planparallelen Dünnschliffen und derZielpräparation bei Anschliffen.

Handprobenhalter HFür die Anfertigung von Dünnschliffen wird der Hand-probenhalter „H“ (= Histologie) verwendet.Auf der planen Edelstahloberfläche des Handprobenhal-ters entweder einen runden oder rechteckigen Glas- oderPMMA-Objektträger, auf dem die Probe (planparallel) miteinem transparenten Kleber aufgebracht ist, anpressen.Dazu kann ein Tropfen Wasser, Öl oder Kanadabalsamverwendet werden. Proben können auch direkt auf dieMetallfläche geklebt werden.Durch die Noniuseinstellung am Einstellring des Handpro-benhalters ist es möglich, einen definierten Materialabtragzu erzielen. Der Feststellring verhindert ein Verstellen desvorgegebenen Maßes während des Schleifvorganges. DerKeramikring gewährleistet ein sicheres Abtragen bis zurgewünschten Ebene und verhindert ein Überschleifen.

Handprobenhalter M plus EinsätzeVon einer eingebetteten Probe kann auch ein Anschliff fürdie Zielpräparation angefertigt werden. Dazu verwendetman den Handprobenhalter „M“ (= Materialographie).Der Standarddurchmesser ist 40 mm. Für kleinereDurchmesser können in den Standardhalter die Einsätze32 mm, 30 mm und 25 mm eingesetzt werden.

Soll von einem Anschliff ein Dünnschliff erstellt werden,ist es möglich, in den Handprobenhalter M (Standard40 mm) den Einsatz H einzusetzen. Dann kann wie inAbschnitt Handprobenhalter H verfahren werden.

17

ZUBEHÖR

Grundlegende Informationen

zur Anwendung der Technovit® Histotechnik

AnwendungshinweisBei den beschriebenen Einbettsystemen handelt es sichum Chemikalien, daher sind einschlägige Laborvorschrif-ten und -richtlinien, die den Umgang mit Chemikalienregeln, zu beachten.

n Monomere nicht mit Arbeitsmitteln aus Metall inVerbindung bringen (z. B. Rührstab oder Pinzette ausMetall).

n Reinigen der Gefäße ohne Spülmittel.n MMA-verunreinigte Gefäße mit Aceton/Alkohol

reinigen.n Reste in Lösungsmittelabfall entsorgen oder Kunst-

stoffabfall polymerisieren.n Ausschließlich PE- oder Glasgefäße benutzen.n Chromatographiesäule (zum Entstabilisieren von

Technovit 9100 Basislösung) direkt nach Benutzungmit Aceton/Alkohol reinigen.

n Entsorgung von Aluminiumoxid mit Stabilisator:unter dem Abzug auf Aluminiumfolie abdampfen,in Restmüll geben oder in einer Reststofftonne fürkontaminierte Stoffe entsorgen.

n Zum Lösen des PMMA-Pulvers in Technovit 9100Basislösung einen Magnetrührer ohne Heizplatteverwenden.

Entsprechende Sicherheitsdatenblätter sind abrufbarunter: www.technovit.de/Service/Downloads

Wir danken für die fachliche Unterstützung:HIK-Hannover, Maren Cassens,Histologie für Implantate und Knochen,Feodor-Lynen-Straße 21, 30625 Hannover.

Liefereinheiten

Art.-Nr. Beschreibung / Inhalt

66038248 Histoform N, Einbettform aus Teflon,

Abdeckplatten aus Aluminium 1 Stk., 4 Mulden

64708992 Histoform Q, Einbettform aus Teflon, 1 Stk., 10 Mulden

64708991 Histoform S, Einbettform aus Teflon, 1 Stk.

64708955 Einbettform 25 mm, 1 Pk. (3 Zylinder, 3 Deckel)

66009903 Schiffchen-Einsatz für Einbettform 25 mm, 1 Pk. (3 Stk.)





64708805 Technovit 3040 gelb Kombipackung, 1 x 100g / 1 x 80 ml

64708806 Technovit 3040 gelb Pulver, 1000g

66022678 Technovit Universalliquid, 500 ml

64712817 Histobloc für Histoform N, 50 Stk.

64708995 Histobloc für Histoform S & Q, 100 Stk.

66021102 Anrührbecher

64701106 Spatel

64701107 Löffel

64708996 Mikrotom-Messerhalter, 17 cm

66045730 Technovit Histoblade 1 x 50 Stk.

66031158 Handprobenhalter H

66031155 Handprobenhalter M Ø 40 mm

66031159/60/61 Einsatz für Handprobenhalter M 25, 30, 32 mm

66031157 Einsatz H

64712819 Objektträgerpresse

64712818 Polyethylenfolien 75 x 25 mm, 200 Stk.

18

FÄRBUNGEN UND REAGENZIEN

Färbungsverfahren1. Die Schnitte färben in Hämatoxylin nach Gill*

(die Farbstofflösung filtrieren) 15 Min.2. Bläuen in Leitungswasser 10 Min.3. Spülen in Aqua dest.4. Schnitte gegenfärben mit Eosin 2 – 5 Min.5. Entwässern über Ethanol 96 % und 100 %6. Klären mit Xylen und eindecken in Eukitt

ErgebnisZellkerne blaubasophiles Cytoplasma blauacidophiles Cytoplasma rosaMuskelgewebe rosaBindegewebe rosa

LösungenHämatoxylin nach GillHämatoxylin (C.I. 75290) 6 gNatriumjodat 0,6 gAlumninumsulfat 52,8 gAqua dest. 690 mlEthylenglykol 250 mlEisessig 60 ml

EosinEosin Y-(alkoholisch) C.I. 45380 0,5 gEthanol 96 % 100 mlEisessig 2 Tropfen

*Nach Färbung mit Hämatoxylin (1) kann die Kunststoff-matrix mit 0,5 ml HCL (36 %) in Ethanol 70 % entfärbtwerden: kurz eintauchen und danach schnell in Leitungs-wasser weiterverarbeiten (2).

Technovit® 7100Routinefärbungen, Enzymhistochemie nach Gerrits

HÄMATOXYLIN - EOSIN

FEULGEN

GIEMSA

Färbungsverfahren1. Schnitte färben in der

Giemsa-Lösung (20 %) 1,5 Std. ZT(Giemsa Merck: 1:5 mit Aqua dest. verdünnen)

Färbungsverfahren1. Hydrolisieren in Salzsäue 5 N 20 Min. ZT2. Spülen in Aqua dest. 3 x3. Schiffs Reagenz 15 Min.4. Natriumhydrogensulfit 0,5 % 3 x 2 Min.5. Kräftig mit Leitungswasser spülen6. Entwässern, klären mit Xylen und eindecken

in Eukitt

ErgebnisDNS violett / rotandere Gewebeelemente farblos

LösungenSchiffs Reagenz

Salzsäure 5 N42 ml Salzsäure 36 % bis 100 ml auffüllen

NatriumhydrogensulfitNaHSO3 0,5 gAqua dest. 100 ml

PERIODIC – ACID – SCHIFF (PAS)

Färbungsverfahren1. 0,4 % Perjodsäure 30 Min., 56 °C2. Spülen in Leitungswasser3. Aqua dest. 3 x spülen4. Schiffs Reagenz 15 Min.5. Kräftig in Leitungswasser spülen6. Spülen in Aqua dest.7. Schnitte mit Hämatoxylin nach

Gill gegenfärben 10 Min.8. Bläuen in Leitungswasser 10 Min.9. Entwässern, klären mit Xylen und

eindecken in Eukitt

Bemerkung: Um einen unspezifischen rosa Farbschimmerzu vermeiden, kann man auch anstatt mit Leitungswasser(5) mit SuIfitwasser spülen, siehe auch Feulgen.

ErgebnisZellkerne blauGlykogen violett / rotBasalmembranen violett / rotMucin violett / rot

LösungenSchiffs ReagenzLösung 1: Pararosanilin (C.I. 42500 ) 0,5 g

1 N Salzsäure 15 mlLösung 2: Kaliummetabisulfit (K2S205) 0,5 g

Aqua dest. 85 ml

Lösung 2, Lösung 1 zufügen. Nach 24 Stunden(im Dunkeln) wird die hellbraune Lösung mit 200 mgKnochenkohle (ungefähr 2 Min.) entfärbt und anschlie-ßend filtriert.Das farblose Reagenz (Leucofuchsin) im Kühlschrankaufbewahren.Gill‘s Hämatoxylin: s. Hämatoxylin-Eosin

19


Färbungsverfahren1. Kaliumferrocyanid-Lösung 15 Min.

Die Lösung erst auf 60 °C erwärmen undanschließend filtrieren

2. Spülen in Aqua dest.3. Safranin O. 0,2 % 2 – 5 Min.4. Spülen in Essigsäure 1 %5. Entwässern, klären mit Xylen und eindecken in Eukitt

ErgebnisZellkerne rotHämosiderin blau / grün

LösungenKaliumferrocyanid-LösungKaliumferrocyanid 1 gAqua dest. 50 mlSalzsäure 2 % 50 ml

Safranin-LösungSafranin O. (C.I. 50240) 0,2 gEssigsäure 1 % 100 ml

BERLINERBLAU REAKTION NACH PERLS

PERIODIC ACID METHENAMINE SILVER (PAMS) NACH JONES

Bemerkung: Es empfiehlt sich, die Kunststoffschnitte mitMayers Albumin aufzukleben.

Färbungsverfahren1. Perjodsäure 1 % 30 Min.2. Spülen in Aqua dest. 3x3. Methenamin-Silber-Lösung 60 Min., 60 °C4. Spülen in Aqua dest., mikroskopische

Kontrolle. Zu schwach eingefärbte Schnittewieder in 3

5. Falls die Schnitte trotz der Vorbehandlung dazuneigen, sich zu lösen, diese dann nach Punkt 4auf einer Streckplatte bei 60 °C trocknen

BESTIMMUNG VON ENZYMAKTIVITÄT

Bestimmung von Enzymaktivität in Geweben, die in2-Hydroxyethyl-Methacrylat (GMA) – insbesondereTechnovit 7100 – eingebettet sind.

Frisch entnommenes Gewebe wird in 4 % neutralemFormaldehyd bei 4 °C während 2 Stunden fixiert (Immer-sion). Falls Perfusionsfixierungen gemacht werden, könnenerheblich kürzere Fixierungszeiten eingehalten werden,und die Enzymaktivität bleibt besser erhalten.

Spülflüssigkeit0,1 M Cacodylatpuffer pH 7,4, hierin kann das Materialevtl. über Nacht bei 4 °C aufbewahrt werden.

Entwässerung1. Alkohol 70 % Aceton 70 %, 30 Min. bei 4 °C2. Alkohol 96 % Aceton 96 %, 30 Min. bei 4 °C3. Alkohol 100 % Aceton 100 %, 30 Min. bei 4 °C

Präinfiltration4. Alkohol 100 % Technovit 7100 1:1, 2 Std. bei 4 °C

oderAceton 100 % Technovit 7100 1:1, 2 Std. bei 4 °C

6. Goldchlorid 0,2 % 1 – 2 Min.7. Spülen in Aqua dest.8. Natriumthiosulfat 2 % 5 Min.9. Spülen in Leitungswasser

10. Gegebenfalls kann mit HE oderSafranine O. gegengefärbt werden

11. Entwässern, klären in Xylen und eindecken in Eukitt.

ErgebnisBasalmembranen braun / schwarz

LösungenStammlösung Methenaminsilbera) Hexamethylentetramin 3 % 100 mlb) Silbernitrat 5 % 5 mla) und b) können getrennt aufbewahrt werden.

Farblösung MethenaminsilberStammlösung 50 mlBorax 5 % 5 ml

Perjodsäure: 1 % (Sigma Nr. P 7875)

Goldchlorid: 0,2 %

Natriumthiosulfat-Lösung: 2 % (Na2S2O3.5H20)

2. Kurz in Essigsäure-Lösung:4 Tropfen auf 100 ml Aqua dest. 2 Sekunden

3. Alkohol 96 % eintauchen4. Alkohol 96 % eintauchen5. Isopropanol 3 x 2 Min.6. Klären mit Xylen und eindecken in Malinol

ErgebnisZellkerne violettCytoplasma blauErythrozyten rosa

20


ALKALISCHE PHOSPHATASE NACH BURSTONE

Färbungsverfahren1. Die Kunststoffschnitte in das

Inkubationsmedium inkubieren. 1 – 3 Std.Bemerkung: In viele Fällen erweist sich eineInkubationszeit von 2 Std. als ausreichend.

2. Spülen in Aqua dest. 2 Min.3. Die Schnitte mit kernechtrot gegenfärben 5 – 10 Min.4. Spülen in Aqua dest.5. An der Luft trocknen6. Einschließen in Malinol

ErgebnisZellkerne rotEnzymaktivitätsstelle blauBemerkung: Bei dieser Reaktion ist die Wahl desEinschlussmittels von großer Wichtigkeit, da Nadelbildungdes Reaktionsproduktes auftreten kann.

LösungenPufferlösung0,2 M Tris-(hydroxymethyl)-aminomethan 2,4 gAqua dest. 100 mlDen pH-Wert mit verdünnter HCL auf 8.9einstellen und den Puffer bei 4 °C aufbewahren.

InkubationsmediumNaphtol AS-MX Phospaht, Dinatriumsalz (Sigma) 5 gN,N-Dimethylformamid 0,25 mlNach dem Auflösen anschließend hinzufügen:Aqua dest. 25 mlPufferlösung (pH 8,9) 25 mlMgSO4.7H2O 10 % 2 TropfenFast Blue BB (Sigma) 30 mg

ATP-ASE (WACHSTEIN UND MEISEL)

Färbungsverfahren1. Die Kunststoffschnitte in das

Inkubationsmedium inkubieren(vor Gebrauch filtrieren). 1 – 3 Std., 37 °CBemerkung: In viele Fällen erweist sicheine Inkubationszeit von 2 Std. als ausreichend.

2. Spülen in Aqua dest. 2 Min.3. Natriumsulfid-Lösung 30 Sek.4. Spülen in Aqua dest.5. Die Schnitte mit kernechtrot gegenfärben 5 – 10 Min.6. Spülen in Aqua dest.7. An der Luft trocknen8. Mit Eukitt oder Malinol eindecken

ErgebnisZellkerne rotEnzymaktivitätsstelle braun

Lösungen1. Tris Maleinsäurepuffer pH 7.2 Lösung A.Maleinsäure 29 gTris-(hydroxymethyl)-aminomethan 30,3 gAqua dest. 500 ml

2 g Aktivkohle hinzufügen, 10 Min. schütteln undfiltrieren. Dann fügt man zu 40 ml der Stammlösung A,20 ml 1N NaOH hinzu und füllt mit Aqua dest. bis100 ml auf (pH 7,2).

2. BleinitratlösungBleinitrat 2 gAqua dest. 100 ml

3. Magnesiumsulfat-LösungMgSO4.7H2O 1,2 gAqua dest. 100 ml

InkubationsmediumAqua dest. 22 mlDinatriumadenosin-5-Triphosphat(Boehringer, Mannheim) 25 mgTris-Maleinsäurepuffer pH 7,2 20 mlMagnesiumsulfatlösung 5 mlBleinitratlösung (tropfenweise hinzufügen,auf 42 °C erwärmen und filtrieren) 3 ml

Sulfid-LösungNatriumsulfid 2 gAqua dest. 100 mlDen pH-Wert mit 1 N HCL auf 7,0–7,5 einstellen(Kontrolle mit pH-Papier)

InfiltrationTechnovit 7100, 12 Std. bei 4 °C

Polymerisation15 Teile Technovit 7100 (Lösung A)1 Teil Technovit 7100 Härter 2, bei 4 °C

Das Gewebe kann in den Histoformen S oder Q, oderim Sorvall Einbettsystem eingebettet werden. Da diePolymerisation bei 4 °C erfolgt, wird diese langsamer alsbei Zimmertemperatur erfolgen. Sicherheitshalber ist einePolymerisationszeit von 12 Stunden bei 4 °C einzuhalten.Die 2-µ-Schnitte werden auf einem Aqua dest. auch beiZimmertemperatur getrocknet. Enzymreaktionen könnenvorgenommen werden, ohne die Kunststoffmatrix zuentfernen.

Bemerkung: Dehydrogenasen nachzuweisen istproblematisch.

Gut schütteln und anschließend vor dem Gebrauchfiltirieren.Bemerkung: Das Inkubationsmedium stets frischzubereiten.

21


Technovit 9100Routinefärbungen, Immunreaktionen,Enzymhistochemie In-situ-Hybridisierung

2. Durchführung der Immunreaktion

n Spülen in 0,01 M Phosphatpuffer (pH 7,4)n Primärantikörper 16 Std./4 °C oder

verdünnt in DAKO Antibody Dilutent 30 – 45 Min./RTn Spülpuffern DAKO EnVision Polymer

(GAM/GAR), AP gekoppeltN 30 Min./RT

n Spülpuffern Substrat-Chromogen-Lösung:

Fast Red 15 – 20 Min./RTn Gegenfärbung mit Hämatoxylin n. Mayer

3. Durchführung der Enzymhistochemie

n Spülen in 0,1 M Tris-Puffer (pH 9,4) 10 Min./RTn Inkubation in der Reaktionslösung 2 Std./37 °C

0,1M Tris-Puffer (pH 9,4)Echtblau SalzNaphthol-AS-BI-Phosphat

n Spülen in Aqua dest.n Spülen in 0,1 M Acetat-Puffer (pH 5,6) 10 Min./RTn Inkubation in der Reaktionslösung 1 Std./37 °C

0,1 M Acetat-Puffer (pH 5,6)Hexonium-PararosanilinlösungNaphthol-AS-BI-Phosphat

n Spülen in Aqua dest.n Nachfixieren in 4 % Formalin 2 – 3 Std./RTn Spülen in Leitungswassern Gegenfärbung mit Methylgrün

n Spülen in 0,01 M Phosphat- 5 Min./RTpuffer (pH 7,4)

n Inkubation in der Reaktionslösung 1 Std./RT0,1 M Phosphatpuffer (pH 6,5)Naphthol-AS-D-ChloracetatHexonium-Pararosanilinlösung

n Spülen in Aqua dest.n Gegenfärbung mit Hämatoxylin n. Mayer

Die nachfolgenden Färbungen und Nachweisreaktionensind nur wichtige exemplarische Beispiele für die Bearbei-tung von Hartschnitten. Sie gelten analog für MMA-Dünn-schliffe.Reagenzien, Antikörper, Sonden, Detektionssysteme sindvariabel.

1. Routinefärbungen

n Hämatoxylin n. Mayer fließend 30 Sek./RTwässern in Leitungswasser überführen 10 Min./RTin Aqua dest.

n Kernechtrot spülen in Aqua dest. 10 Min./RTn Methylgrün (gereingt; s. Romeis) 10 – 20 Min./RT

spülen mit Aqua dest.

n Analog zur Färbung von Paraffinschnitten

n Schnitte entakrylierenn Giemsa-Lsg. (frisch ansetzen!) 30 – 40 Min./RT

Differenzieren und Entwässernn Aceton / Xylol (95 : 5)n Aceton / Xylol (70 : 30)n Aceton / Xylol (30 : 70)n Xylol

n Schnitte entakrylierenn Haemalaun (Mayer) 10 Min./RTn Leitungswassern Ponceau-Säurefuchsin-Azophloxin 45 Min./RTn 1 %-ige Essigsäuren Phosphormolybdänsäure / Orange G 7 Min./RTn 1 %-ige Essigsäuren Lichtgrün 40 Min./RTn 1 %-ige Essigsäuren aufsteigende Alkoholreihen Xyloln Eindecken mit Eukitt oder Ähnlichem

Gegenfärben der Schnitte für Immun- und Enzymhistochemie

Antikörperinkubation

Nachweisreaktion

Alkalische und saure Phosphatase

Naphthol-AS-D-Chloracetatesterase (ASD)

HE-Färbung

Giemsa-Färbung

Masson-Goldner-Färbung

*RT = Raumtemperatur

22


1. Anfertigen von ca. 5 µm dicken Schnitten2. Schnittentplastung bei Raumtemperatur

n Xylol 2 x 20 Min.n 2-Methoxyethylacetat (2-MEA) 1 x 20 Min.n Aceton reinst 2 x 5 Min.n Aqua dest. 2 x 5 Min.Eventuell länger entplasten auch ohne 2-MEA

3. Schnitte umranden4. Blockieren der endogenen Peroxidase 3 %

H2O2 in Methanol 30 Min.5. Aqua dest. 2 x 5 Min.6. Andauung

n Fast Enzyme 10 Min. bei RT.n Pronase 0,1 %, 37 °C 10 Min.

7. Aqua dest. mind. 10 Min.8. frisches Aqua dest. evtl. auch über Nacht9. Schnitte trocknen lassen

10. Sonde auf die Schnitte auftragen, mit Deckglasverschließen und mit Fixogum abdichten

11. Schnitte in den Hybridizerlegen und 2 Stunden bei 55 °C hybridisieren

12. Schnitte aus dem Gerät nehmen, Fixogum ablösen13. Schnitte in Wasch-Puffer stellen 2 x 2 Min. bei RT

Detektion:1. AP-anti Biotin auf die

Schnitte geben 30 Min., 37 °C2. In Puffer waschen 2 x 2 Min., RT3. AP Substrat auf die Schnitte geben 30 Min., 37 °C4. In Puffer waschen 2 x 2 Min., RT5. HRP-anti Dig. auf die

Schnitte geben 30 Min., 37 °C6. In Puffer waschen 2 x 2 Min., RT7. HRP Substrat auf die Schnitte geben 30 Min., 37 °C

HRP Substrat aus Kit für Formalin und kunststoff-fixierte Beckenkämme:HRP Substrat für schäfer-fixierte Beckenkämme:n 10,5 mg 3-Aminoethylcarbazot (Sigma a 5754)n 1 ml DMSOn in 50 ml Acetatpuffer pH 5,6 (0,1 molar)n 5 µI H2O2

8. Schnitte unter fließendem Wasser spülen und evtl.kurz mit verdünntem Hämalaun gegenfärben.

9. Wässrig eindecken

Technovit® 9100KurzgebrauchsanleitungIn-situ-Hybridisierung für Schnitte

HINWEIS:Weiterführende Angaben zur ISH erfragen Sie bitte beiden entsprechenden Sondenherstellern.

Quelle: Selbstversuch mit Reagenzien der Firma Zytomed Systems GmbH

Reagenzien

2 M NATRIUMACETAT-STAMMLÖSUNG

74,13 g Natriumacetat5,5 ml Eisessigad. 500 ml Aqua dest.

0,1 M NATRIUMACETAT-PUFFER (pH 5,6)50 ml 2 M Natriumacetat-Stammlösungad. 1000 ml Aqua dest. (pH auf 5,6 einstellen)

1 M PHOSPHAT-STAMMLÖSUNG112,5 g Na2HPO4

30 g KH2PO4

ad. 1000 ml Aqua dest.

0,1 M PHOSPHATPUFFER (pH 6,5)100 ml 1 M Phosphat-Stammlösungad. 1000 ml Aqua dest. (pH auf 6,5 einstellen)

0,01 M PHOSPHATPUFFER (pH 7,4)10 ml 1 M Phosphat-Stammlösungad. 1000 ml Aqua dest. (pH auf 7,4 einstellen)

0,04 M PHOSPHATPUFFER + 10 % SUCROSE (pH 7,4)40 ml 1 M Phosphat-Stammlösung100 g Sucrose10 ml 10 % NaN3-Solutionad. 1000 ml Aqua dest. (pH 7,4)

1 M TRIS-STAMMLÖSUNG121,14 g Trisad. 1000 ml Aqua dest.

0,1 M TRIS-PUFFER (pH 9,4)100 ml 1 M Tris-Stammlösungad. 1000 ml Aqua dest. (pH auf 9,4 einstellen)

Gepufferte 4 %-ige FORMALINLÖSUNG100 ml 37 %-iges Formol4 g NaH2PO4. H2O6,5 g Na2HPO4

ad. 1000 ml Aqua dest. (pH 7,0)

8 %-ige PARAFORMALDEHYD-STAMMLÖSUNG40 g Paraformaldehydad. 500 ml Aqua dest.

Puffer

Fixierlösungen

23


1,4 %-ige PARAFORMALDEHYD-LÖSUNG35 ml 8 % Paraformaldehyd-Stammlösung65 ml Aqua dest.100 ml 0,04 M Phosphatpuffer + 10 % Sucrose(pH 7,4)

FAST RED LÖSUNG3 ml Substratpuffer in ein Plastikröhrchen geben1 Fast Red Tablette in die Lösung geben und lösen120 μl Levamisol zugeben und mischen.Lösung ca. 1 Std. haltbar.

REAKTIONSLÖSUNG: ALKALISCHE PHOSPHATASE50 ml 0,1 M Tris-Puffer (pH 9,4)50 mg Echtblau Salz25 mg Naphthol-AS-BI-Phosphat (gelöst in

0,5 ml DMSO/Triton X 100)

REAKTIONSLÖSUNG: SAURE PHOSPHATASE50 ml 0,1 M Natriumacetat-Puffer (pH 5,6)500 μl Hexonium-Pararosanilin (250 μl 4 %

Pararosanilin in 2N HCl + 250 μl 4 %Natriumnitrit in Aqua dest.; 1 Min. vortexen,5 Min. reagieren lassen)

25 mg Naphthol-AS-BI-Phosphat (gelöst in 0,5 mlDMSO/Triton X 100)

REAKTIONSLÖSUNG: ASD-CHLORACETAT-ESTERASE50 ml 0,1 M Phosphatpuffer (pH 6,5)15 mg Naphthol-AS-D-Chloracetat (gelöst in 0,5 ml

DMSO/TritonX 100)250 μl Hexonium-Pararosanilin

GIEMSA-LÖSUNG3 %-ige Lsg. aus der Stammlösung (Merck) herstel-len1-2 Tropfen 1 %-ige Essigsäure

LICHTGRÜN1 g Lichtgrün gelblich2 ml Eisessigad 1000 ml Aqua dest.

Reaktionsansätze

PHOSPHORMOLYBDÄNSÄURE / ORANGE-G30 g Phosphormolybdänsäuread. 500 ml Aqua dest.20 g Orange-Gad. 500 ml Aqua dest.– beide Lösung zusammengeben– filtrieren

PONCEAU-SÄUREFUCHSIN-AZOPHLOXIN100 ml Masson-Lsg.20 ml Azophloxinlsg.880 ml 0,2 %-ige Essigsäure

Masson-Lsg.: 1 Teil Lsg. A + 2 Teile Lsg. B

Lsg. A: 1 g Säurefuchsin (Fuchsin-S)ad. 100 ml Aqua dest.– kochen1 ml Eisessig– filtrieren

Lsg. B: 2 g Ponceau de Xylidinead. 200 ml Aqua dest.– kochen2 ml Eisessig– filtrieren

AZOPHLOXINLÖSUNG0,5 g Azophloxinad. 100 ml Aqua dest.2 ml Eisessig

Färbelösungen

Heraeus Kulzer GmbH

Division Technique

Philipp-Reis-Straße 8/13

61273 Wehrheim

Tel. +49 (0)6081.959-0

Fax +49 (0)6081.959-398

[email protected]

www.technovit.de

1/64

7055

81_0

0HE

N3/

14

Documents

021747 Histologie Technovit Histotechnik - Kulzerkulzer-technik.de/.../histologie_1/Prospekt_Histologie_deutsch.pdf · 4 TECHNOVIT7100 Anwendung Technovit 7100 derStepbyStep-Anleitungentsprechend