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MFN0366-A1 (I. Perroteau) - Tecniche biochimiche-molecolari: Western blot

Solo per uso didattico, vietata la riproduzione, la diffusione o la vendita

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Trasferimento(blotting)

Gel di elettroforesi

Membrana per western blot

-

+



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Anticorpo primario ---> anticorpo secondario coniugato all’enzima ---> reazionedi biolimunescenza ---> luce che impressiona una lastra fotografica


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Colorazione ditutte le proteine

Anti-actina

Pesi molecolari

A B C D

Anti-erbB4


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Esempio: Nell’encefalo, quale (i) delle 6 regioni d’interesse contengono leproteine A, B,C, D, E e F?



1. Estrazione delle proteine da ciascun campione

Prelievo delle 6regioni:campione 1-6

--->

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4.incubazione del filtro con l’anticopo primario per rivelare la proteine “A”, lavaggio,incubazione con adeguato anticorpo secondario coniugato all’enzima, lavaggio,bioluminescenza ed esposizione della lastra fotografica


1. Estrazione delleproteine e caricamento“positivo”;

2. Elettroforesi;

3. trasferimento dalgel di elettroforesi alfiltro (“blot”),

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5. Lastrafotograficadoposviluppo

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--->

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Lo stesso protocollo è stato ripetuto 5 altre volte, eciascun filtro è stato poi incubato con l’anticorpoprimario anti-B, oppure l’anticorpo primario anti-C,…..etc


Per ciascun filtro lazona d’interesse è stataritagliata per ilconfronto dei risultati

--->


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Risultati:

Anti-C

Filto incubatocon anticorpo:Anti-A

Anti-B

Anti-D

Anti-E

Anti-F

campioni 1-6


Prima interpretazione:confronto “orizzontale” dei risultati

•Le proteine “A” “B” e “D” …..

•La proteina “C” …..

•La proteina “E” …..

•La proteina “F” …..


1=encefalo;

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Risultati:

Anti-C


Anti-B

Anti-D

Anti-E

Anti-F

campioni 1-6


Prima interpretazione:confronto “orizzontale” dei risultati

•Le proteine “A” “B” e “D” non sonoespresse nei campioni N.1-3; sono espressenel N.4 e N.5 e molto espresse nel N. 6.

•La proteina “C” non è espressa nel N.1mentre negli altri l’anticorpo hariconosciuto due forme di peso molecolare(MW) diverso. N.2 e N.3 esprimonomaggiormente la forma a basso MW, N.4 eN.5, le due forme in pari misura e il N.6esprime maggiormente la forma ad alto.

•La proteina “E” è espressa in modocrescente dal N. 2 al N.6

•La proteina “F” è espressa in tutticampioni con un livello maggiore neicampioni N.4, N.5 e N.6


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Risultato

Anti-C

•Il campione N.1 …

•I campioni N. 2 e N.3 …

•……..etc


Anti-B

Anti-D

Anti-E

Anti-F

campioni 1-6


Seconda interpretazione:confronto “verticale” dei risultati


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Risultato

Anti-C

•Il campione N.1 contiene soltanto leproteine “E” e “F”•I campioni N. 2 e N.3 contiene in più,rispetto ai precedenti, la proteina “C”nella forma a basso peso molecolare(MW)•……..etc


Anti-B

Anti-D

Anti-E

Anti-F

campioni 1-6


Seconda interpretazione:confronto “verticale” dei risultati


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Northern Blotting

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Estrazione degli RNA*

Elettrophoresi*

Blot*

ibridazione

rivelazione

Northern Southern

MFN0366-A1 (I. Perroteau) - Tecniche biochimiche-molecolari:Northern blot - Southern blot

Estrazione del DNA*

Elettrophoresi*

Blot*

ibridazione

rivelazione

Northern e Southern: molto simile a Western blot nei principi. Rivelazione con sonde di acidinucleici complementari marcati con enzimi o fluorescenti (simile a quelle utilizzate peribridazione in situ)

(*) rispetto a quanto visto dettagliatamente per le proteine, apparecchi e protocollisono diversi i principi sono comuni


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Prova a ricostruire il risultato



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Western blotting(protein)

Northern blotting(mRNA)

Southern blotting(DNA)


Apparenze simili: necessità di leggere e capire le legende delle figure per saperinterpretare i risultati

Queste due tecniche mi permettono di risponderea domande correlate fra di loro: espressione diproteine e espressione di mRNA.(per semplificare: legame tra trascrizone etraduzione)

Questa tecnica mi permette dirispondere ad altri tipi didomande: mutazioni, delezioni,amplificazioni, polimorfismi(biologia forenze)

MFN0366-A1 (I. Perroteau) - Tecniche biochimiche-molecolari: Western blot - Northern blot - Southern blot

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Colture cellulariMezzo di coltura (rosso perchécon indicatore di pH)

Manipolazioni in condizioni di sterilità (sotto cappa)

Provette, pipette ereagenti sterili

Fiasche e piastreidonei alle colturecellulari

MFN0366-A1 (I. Perroteau) - Colture cellulari


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Osservazione delle cellule in colture: Microscopio rovesciato a contrasto di fase



---> Contrasto di fase: permette l’osservazione di cellule non colorate (vive)

1) L’obiettivo è separato dsoltanto dal fondodella piastra di coltura

2) la piastra o la fiasca non deve essere aperta erimane sterile e l’osservazione avviene fuoridalla cappa sterile

obiettivotavolo

cellule in coltura---> Rovesciato: obiettivi sotto il tavolo porta oggetto

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Si possono mettere incoltura cellule dissociate(isolate) oppureframmenti di tessuti(organocolture)

Il tessuto di partenza può essere “sano” oppure una biopsia di tessuto ammalato, adesempio da un tumore

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Dopo essersi moltiplicate,le cellule in coltureprimarie possono esserestaccate dalla piastra conun trattamento con unaproteasi, la tripsina, poidiluite e piastratenuovamente

In questo esempioda una piastrainiziale dopo alcunigiorni si possonodiluire le cellulecon un fattore 1/3 eottenere 3 nuovepiastre.

dopo alcuni giorni ciascuna di queste 3 piastre potrà dareluogo a 3 nuove piastre (dunque 9 in tutto)…etc.

Subculture: linea cellulare primaria

Coltura primaria

Moltiplicazionedelle cellule(alcuni giorni)

Trattamento con latripsina

In questa fase la crescità cellulare è esponenziale

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Le cellule “normali” in coltura hanno una vita finita e vanno incontro asenescenza e a morte.

Alcune cellule però possono sopravivvere edare luogo ad una linea cellulare secondaria.

La linea cellulare secondaria è costituita dacellule che hanno la capacità di dividersiall’infinito e per questo motivo la lineacellulare secondaria viene considerata comeimmortalizzata.

Colture primarie preparate a partire da biopsietumorali producono più facilmente lineecellulari secondari. Queste linee secondariepossono essere costituite da celluleimmortalizzate ma non tumorali oppure dacellule a loro volta tumorali.

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Le colture cellulari rappresentano un modello di studio di tutte lefunzioni cellulari (fisiologiche o patologiche): differenziamentocellulare (cellule staminali), proliferazione, migrazione, organizzazionetridimensionali, morte cellulare, interazioni cellulari, metabolismo,studio e sviluppo di farmaci, di biomateriali…..

Le cellule in coltura possono anche essere modificate geneticamentetramite l’inserimento, in forma transiente o nel genoma della cellulaospite, di informazione genetica esogena. I metodi che permettono difare entrare il DNA esogeno nelle cellule ospite si chiamano:“Trasfezioni”



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Trasfezioni

Un metodo per trasfettare le cellule è la lipofezione:miscele di fosfolipidi e DNA si mettono sopra lecellule e si fondono con le membrane plasmaticherilasciando all’interno delle cellule questo DNAesogeno.

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Preparare le prossime lezioni:

Nucleo (Colombo pp.237-244)

Struttura della cromatina interfasica (Colombo pp.252-259)

Struttura del nucleolo (Colombo pp. 286-287)

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