04_Gel protein

ปฏิ�บั�ติ�การที่�� 4ที่�กษะการที่�า Gel Electrophoresis (โ

ปรติ�น)

วั�ติถุ�ประสงค์�1. เพื่��อทราบหลั�กการในการแยกโปรตี�นโดยเทคน�คเจลัอ�เลัคโตีรโฟร�ซิ�ส2. สามารถเตีร�ยมเจลัอ�เลัคโตีรโฟร�ซิ�สเพื่��อแยกแลัะวิ�เคราะห!โปรตี�นได#

บัที่น�าอ�เลัคโตีรโฟร�ซิ�ส เป%นเทคน�คท��ใช้#แยกสารมหโมเลัก'ลั(macromolecule)

ท��ม�ประจ'ไฟฟ(าให#บร�ส'ทธิ์�* แลัะใช้#ในการศึ,กษาค'ณสมบ�ตี�แลัะพื่�ส/จน!ควิามบร�ส'ทธิ์�*ของสารเช้2นกรดน�วิคลั�อ�กประเภท DNA ด�งท��กลั2าวิมาแลั#วิในบทท�� 3 ส4าหร�บบทน�5จะกลั2าวิถ,งการแยกสารช้�วิโมเลัก'ลัโปรตี�น โดยอาศึ�ยหลั�กการท��โปรตี�นม�ประจ'ไฟฟ(าแลัะสามารถเคลั��อนท��ได#ในสนามไฟฟ(าโดยเคลั��อนท��ไปย�งข�5วิไฟฟ(าท��ม�ประจ'ตีรงข#ามก�นเช้2นโปรตี�นท��ม�ประจ'ส'ทธิ์�เป%นบวิกจะเคลั��อนท��ไปย�งข�5วิลับส2วินสารท��ม�ประจ'ลับจะเคลั��อนท��ไปหาข�5วิบวิกสารท��ม�ประจ'ไฟฟ(าตี2างก�นม�แรงเคลั��อนท��ในสนามไฟฟ(าตี2างก�น การเคลั�� อนท��ในสนามไฟฟ(านอกจากควิามแรงของประจ'ย�งข,5นอย/2ก�บขนาดของโมเลัก'ลั โมเลัก'ลัท��ม�ขนาดเลั6กเคลั��อนท��ได#เร6วิกวิ2าโมเลัก'ลัขนาดใหญ่2ท��ม�ประจ'เท2าก�น

การท��เจลัอ�เลัคโตีรโฟร�ซิ�สสามารถแยกโปรตี�นช้น�ดตี2างๆออกจากก�นได#เน��องจากโปรตี�นประกอบด#วิยกรดอะม�โนท��ม�ท�5งประจ'บวิกแลัะลับท4าให#เคลั��อนท��ได#ในสนามไฟฟ(าแลัะการท��โปรตี�นแตี2ลัะช้น�ดม�จ4านวินประจ'ไฟฟ(าไม2เท2าก�น จ,งเคลั��อนท��ได#ในอ�ตีราเร6วิไม2เท2าก�นในเวิลัาท��ก4าหนด โมเลัก'ลัท��ม�ประจ'ส'ทธิ์�เท2าก�บ q เม��อน4าไปเคลั��อนท��ในสนามไฟฟ(าแลัะเก�ดแรง F แรงน�5ข,5นก�บประจ' q แลัะควิามเข#มของสนามไฟฟ(า

F = (E/d)E = ควิามตี2างศึ�กย! (potential difference) ระหวิ2างข�5วิไฟฟ(าท�5งสองd = ระยะห2างระหวิ2างข�5วิไฟฟ(าท�5งสอง

ท�กษะในการแยกโปรตี�นโดยเจลัอ�เลัคโตีรโฟร�ซิ�ส (Gel electrophoresis)

สารลัะลัายการเคลั��อนท��ของโมเลัก'ลัจะเก��ยวิข#องก�บแรงเส�ยดทานโดยแรงเส�ยดทานข,5นก�บขนาดแลัะร/ปร2างของโมเลัก'ลั รวิมท�5งควิามหน�ด (viscosity)

ของตี�วิกลัางน�5นF = 6rV

F = แรงเส�ยดทานท��เก�ดข,5นก�บโมเลัก'ลัท��ม�ร/ปร2างกลัมเช้2น Globular protein

R = ร�ศึม�ของโมเลัก'ลั = ควิามหน�ดของสารลัะลัายV = ควิามเร6วิในการเคลั��อนท��ของโมเลัก'ลัในสนามไฟฟ(าในสารลัะลัายจะได#แรงท��เก�ดจากสนามไฟฟ(าเท2าก�บแรงเส�ยดทาน (E/d)q = 6rV

V = (Eq)/d6rเพื่ราะฉะน�5นควิามเร6วิในการเคลั��อนท��ของโมเลัก'ลัเป%นส�ดส2วินตีรงก�บควิาม

เข#มข#นของสนามไฟฟ(าแลัะประจ'ของโมเลัก'ลัแตี2เป%นส�ดส2วินกลั�บก�บขนาดแลัะควิามหน�ดของสารลัะลัาย โมเลัก'ลัท��ม�ประจ'แลัะขนาดตี2างก�นจะเคลั��อนท��ด#วิยควิามเร6วิไม2เท2าก�นในสนามไฟฟ(า

ท�5งน�5อ�ตีราการเคลั��อนท��ของโมเลัก'ลัข,5นอย/2ก�บประจ'ส'ทธิ์� (net charge)

กลั'2มไอออนหร�อประจ'ใด ๆ สามารถเคลั��อนท��ได#ภายใตี#สนามไฟฟ(า ประจ'ส'ทธิ์� (net

charge) ของโปรตี�นข,5นอย/2ก�บสภาพื่ค2าควิามเป%นกรด-เบส เม��อค2า pH เท2าก�บค2า

4/2


pI (isoelectric point)ของโปรตี�นจะม�ประจ'ส'ทธิ์�เป%นศึ/นย! จ,งไม2สามารถเคลั��อนท��ภายใตี#สนามไฟฟ(า แลัะหากค2า pH ส/งหร�อตี4�ากวิ2าค2า pI โปรตี�นจะเคลั��อนท��ได# ซิ,�งอ�ตีราการเคลั��อนท��ของโปรตี�นข,5นอย/2ก�บอ�ตีราส2วินระหวิ2างประจ'ตี2อมวิลัหร�อควิามหนาแน2นของประจ' (charge density) ของโปรตี�นน�5น ๆ กลั2าวิค�อ โปรตี�นท��ม�ค2าประจ'ตี2อมวิลัส/งจะสามารถเคลั��อนท��ไปได#เร6วิ ส4าหร�บการแยกโปรตี�นเป%นแถบด#วิยกระแสไฟฟ(า (zone electrophoresis) โมเลัก'ลัโปรตี�นในของผสมจะแยกออกจากก�นเป%นแถบบาง ๆ (narrow zone หร�อ band) ตีามระยะทางท��เคลั��อนท��มาจากข�5วิไฟฟ(า (electrode) ในการแยกโปรตี�นเป%นแถบด#วิยกระแสไฟฟ(าท4าได#ยากในสารลัะลัายอ�สระ (free solution) เน��องจากโปรตี�นจะเคลั��อนไหวิไปมาไม2เห6นเป%นแถบ แตี2หากให#โปรตี�นเคลั��อนท��บนตี�วิกลัางค45าจ'น (supporting medium) แทน โปรตี�นจะสามารถแยกออกมาเป%นแถบได# ตี�วิกลัางค45าจ'นท��น�ยมใช้#มากท��ส'ดในป;จจ'บ�น ค�อ เจลัพื่อลั�อะคร�ลัาไมด! (polyacrylamide gel) ในการแยกโปรตี�นโดยส2วินใหญ่2 เจลัพื่อลั�อะคร�ลัาไมด!เก�ดจากปฏิ�ก�ร�ยาการเช้��อมตี2อก�นของหน2วิยเด��ยวิของอะคร�ลัาไมด! (acrylamide

monomer) จนได#เป%นสายโซิ2ยาวิแลัะเช้��อมก�นเป%นโครงข2ายด#วิยพื่�นธิ์ะโคเวิเลันตี! (covalent bond) ซิ,�งม�หม/2ฟ;งก!ช้�น 2 หม/2 (Bifunctional compound) เช้2น N,N'-เมท�ลั�น บ�สอะคร�ลัาไมด! (N,N'-methylene bisacrylamide หร�อ บ�สอะคร�ลัาไมด!) ปฏิ�ก�ร�ยาด�งกลั2าวิท4าให#ได#โครงสร#างท��ม�ลั�กษณะเป%นร/พื่ร'น ซิ,�งม�ขนาดแตีกตี2างก�นตีามขนาดโมเลัก'ลัของโปรตี�นท��ตี#องการแยก ด�งน�5นระหวิ2างการแยกด#วิยบนเจลัพื่อลั�อะคร�ลัาไมด!ด#วิยกระแสไฟฟ(า โมเลัก'ลัโปรตี�นจะถ/กค�ดกรองด#วิยตีะแกรงสามม�ตี� (sieving

effect) จ,งท4าให#โมเลัก'ลัขนาดใหญ่2เคลั��อนท��ช้#ากวิ2าโปรตี�นขนาดเลั6ก แลัะการแยกโปรตี�นท��ท4างานได#ตีามธิ์รรมช้าตี� (native protein) ด#วิยกระแสไฟฟ(าบนเจลัพื่อลั�อะคร�ลัาไมด!ในสารลัะลัายบ�ฟเฟอร!ท��ไม2ท4าให#โปรตี�นเส�ยสภาพื่ (non-

dissociating buffer หร�อ non-denaturing buffer) เช้2น ทร�สคลัอไรด! (Tris/HCl) น�5น ข,5นอย/2ก�บควิามหนาแน2นของประจ'แลัะขนาดของโปรตี�น

สารเค์มี�ที่��ส�าค์�ญในการเก�ดโพลี�เมีอร�ของเจลีพอลี�อะค์ร�ลีาไมีด�อ�เลีค์โติรโฟร�ซิ�ส (PAGE)

1. อะคร�ลัาไมด! (Acrylamide)

4/3


2. N,N'-เมท�ลั�น บ�สอะคร�ลัาไมด! (N,N'-methylene bisacrylamide

หร�อ บ�สอะคร�ลัาไมด!)

3. เททระเมธิ์�ลั�นไดอาม�น (tetramethylenediamine, TEMED) เป%นตี�วิเร2งปฏิ�ก�ร�ยา (catalyst)

4. แอมโมเน�ยมเพื่อร!ซิ�ลัเฟตี (ammonium persulfate) เป%นตี�วิเร��มตี#น (initiator)

5. บ�ฟเฟอร!(Tris-Buffer)

เม�� อแอมโมเน�ยมเพื่อร!ซิ�ลัเฟตีลัะลัายน45า จะเก�ดอน'ม/ลัอ�สระ (free radical)ด�งปฏิ�ก�ร�ยาในร/ปโดยการเร2งปฏิ�ก�ร�ยาของ TEMED

4/4


แลั#วิอน'ม/อ�สระด�งกลั2าวิถ/กส2งให#โมเลัก'ลัของอะคร�ลัาไมด!เก�ดการแอกท�เวิตี(activate) ท4าให#เก�ดการสร#างสายยาวิของอะคร�ลัาไมด!แลัะแตี2ลัะสายจะเช้��อมโยงก�นด#วิยบ�สด�งในร/ป

http://nationaldiagnostics.com/images/1_3_1a.gifร'ปแสดงการเก�ดโพลี�เมีอร�ของพอลี�อะค์ร�ลีาไมีด�

4/5

http://nationaldiagnostics.com/images/1_3_1a.gif


การเช้��อมโยงระหวิ2างสายน�5ท4าให#ตี�วิกลัางเจลั ม�ลั�กษณะตีาข2ายหร�อเป%นร/พื่ร'น ขนาดของร/พื่ร'นถ/กก4าหนดโดยปร�มาณของอะคร�ลัาไมด!แลัะบ�สหากเพื่��มควิามเข#มข#นของสารท�5งสองจะท4าให#ตี�วิกลัางเจลัแข6งห�กแตีกง2ายแตี2ถ#าลัดควิามเข#มข#นท4าให#ตี�วิกลัางอ2อนแลัะย�ดหย'2นข,5น ค2าปร�มาณอะคร�ลัาไมด!แลัะบ�สข,5นอย/2ก�บสมการข#างลั2าง

%T = [(a+b)/m] x 100T = ปร�มาณของอะคร�ลัาไมด!แลัะบ�ส

%C = [b/(a+b)] x 100iC = ปร�มาณของบ�สเม��อเท�ยบเป%น % ก�บปร�มาณของอะคร�ลัาไมด!แลัะบ�สa = อะคร�ลัาไมด!b = บ�สเป%นกร�มm = ปร�มาตีรของบ�ฟเฟอร!เป%นลั�ตีร

โดยท��วิไปตี�วิกลัางเจลัท��เหมาะสมม� %T ปะมาณ 5-15 แลัะ %C ประมาณ 2-4

ควิามสามารถในการค�ดกรองของการแยกด#วิยวิ�ธิ์�น�5ข,5นอย/2ก�บวิ2าขนาดของร/พื่ร'นของเจลัม�ค2าใกลั#เค�ยงก�บขนาดของโปรตี�นท��เคลั��อนท��ไปบนเจลัมากน#อยเพื่�ยงใด ร/พื่ร'นของเจลัพื่อลั�อะคร�ลัาไมด!จะแปรผกผ�นก�บควิามเข#มข#นของอะคร�ลัาไมด!ในของผสมเจลั (หากควิามเข#มข#นของอะคร�ลัาไมด!เพื่��มข,5น ขนาดของร/พื่ร'นจะเลั6กลัง)

แลัะส�ดส2วินของตี�วิเช้��อมโครงข2ายบ�สอะคร�ลัาไมด!ท��ใช้#ด#วิย ในทางปฏิ�บ�ตี�ส�ดส2วินของตี�วิเช้��อมโครงข2ายจะม�ค2าคงท��แลัะประส�ทธิ์�ภาพื่ของร/พื่ร'นจะเปลั��ยนแปลังไปตีามการเลั�อกใช้#ควิามเข#มข#นของหน2วิยเด��ยวิๆของอะคร�ลัาไมด! การแยกโปรตี�นส2วินใหญ่2ใช้#เจลัท��ม�ควิามเข#มข#นของอะคร�ลัาไมด!อย/2ในช้2วิงร#อยลัะ 5 - 15 ซิ,�งเจลัท��ม�ร#อยลัะของอะคร�ลัาไมด!ตี4�าจะให#ขนาดร/พื่ร'นใหญ่2ท��ส'ดซิ,�งเหมาะส4าหร�บแยกโปรตี�น

4/6


ท��ม�ขนาดใหญ่2ให#เป%นแถบด#วิยกระแสไฟฟ(า แลัะการเพื่��มควิามเข#มข#นของอะคร�ลัาไมด!จะช้2วิยแยกโปรตี�นท��ม�ขนาดเลั6กได#ด�ข,5น

ตีารางแสดง %acrylamide แลัะขนาดของโมเลัก'ลัของโปรตี�นท��แยกได#

Acrylamide (%)

Pore (A) ขนาดโมเลัก'ลัของโปรตี�น (kDa)

3 85 100-1,000

7.5 50 10-100

30 20 0.2-2

แผ่*นเจลีสามีารถุเติร�ยมีได, 2 แบับั

1. แบบท��ม�ควิามเข#มข#นของอะคร�ลัาไมด!เท2าก�นตีลัอดท��วิแผ2นเจลั

2. แบบท��ควิามเข#มข#นของอะคร�ลัาไมด!ไม2เท2าก�นตีลัอดท��วิแผ2นเจลัหร�อเร�ยกวิ2าเกรเด�ยนตี!เจลั (gradient gel) ควิามเข#มข#นของอะคร�ลัาไมด!ม�ตี� 5งแตี2 4-20% ท��ส2วินลั2าง

การเตีร�ยมพื่อลั�อะคร�ลัาไมด!เตีร�ยมได# 2 ระบบค�อ

1. แบบตี2อเน��อง (Continuous electrophoresis )

4/7


2. แบบไม2ตี2อเน��อง ( Discontinuous Electrophoresis) ในช้�5นของ spacer gel ม�ควิามเข#มข#นของ acrylamide ตี4�าเช้2น 3-4.5% แลัะ แถบโปรตี�นในช้�5นน�5ถ/กบ�บเป%นเส#นตีรงใน spacer gel ก2อนเข#า separation ท��ม� % acrylamide ส/งกวิ2าแลัะการแยกข,5นอย/2ก�บ ประจ' น45าหน�กโมเลัก'ลัแลัะร/ปร2างในกรณ�เป%น native PAGE แลัะแยกตีามขนาดโมเลัก'ลัเพื่�ยงอย2างเด�ยวิในกรณ�เป%น SDS-PAGE ด�งน�5นจะได#แถบโปรตี�นท��คมช้�ดกวิ2าแบบตี2อเน��อง

4/8


เจลัพื่อลั�อะคร�ลัาไมด!แบบด�5งเด�มท��ใช้#แยกโปรตี�นม�ลั�กษณะเป%นเจลัทรงกระบอก (rod gel) ในหลัอดแก#วิ ป;จจ'บ�นน�ยมใช้#เจลัแผ2น (flat slab gel) หนาประมาณ 0.75 - 1.5 ม�ลัลั�เมตีรแทน ประโยช้น!ของการใช้#เจลัแผ2นค�อ สามารถแยกของผสมโปรตี�นหลัายตี�วิอย2างไปพื่ร#อมก�บโปรตี�นเท�ยบเค�ยง (marker

protein) ได#โดยตีรงในทางตีรงข#ามการแยกโปรตี�นช้น�ดเด�ยวิก�นด#วิยเจลัทรงกระบอกในแตี2ลัะคร�5งก6ยากท��จะได#ผลัการทดลัองแบบเด�ยวิก�น ท�5ง ๆ ท��ประส�ทธิ์�ภาพื่ของการเช้��อมตี2อหน2วิยเด��ยวิ ควิามยาวิของเจลั เส#นผ2านศึ/นย!กลัางของเม6ดเจลั แลัะป;จจ�ยอ��น ๆ ไม2ค2อยแตีกตี2างก�น ถ,งแม#วิ2าเจลัแผ2นจะน�ยมใช้#ก�นมากในป;จจ'บ�นแลัะไม2ค2อยเลั�อกใช้#เจลัทรงกระบอกส4าหร�บการแยกด#วิยกระแสไฟฟ(า แตี2บางคร�5งม�การเลั�อกใช้#เจลัทรงกระบอกในม�ตี�แรกตีามค'ณสมบ�ตี�ของ pI ของการแยกบนเจลัด#วิยกระแสไฟฟ(าสองม�ตี� (two-dimensional gel electrophoresis)

เน��องจากเจลัทรงกระบอกสามารถแยกโปรตี�นได#ในปร�มาณมากแลั#วิจ,งน4าเจลัทรงกระบอกมาวิางบนเจลัแผ2นเพื่��อแยกด#วิยกระแสไฟฟ(าในม�ตี�ท��สองตีามค'ณสมบ�ตี�ของขนาดโมเลัก'ลัของโปรตี�นตี2อไปด�งแสดงในร/ป

4/9


ร/ปแสดง rod gel, slab gel แลัะ 2-D gel

4/10

Sample


แม#วิ2าการแยกโปรตี�นท��ท4างานได#ตีามสภาพื่ธิ์รรมช้าตี�(native-PAGE)บนเจลัพื่อลั�อะคร�ลัาไมด!จะม�ประโยช้น!มากโดยเฉพื่าะเม��อตี#องการแยกโปรตี�นซิ,�งม�หน#าท��ทางช้�วิภาพื่ตี2างก�น แตี2การแยกโปรตี�นโดยส2วินใหญ่2จะท4าให#สายพื่อลั�เพื่ปไทด!แตีกออกเป%นสายเด��ยวิๆ (โดยเฉพื่าะโปรตี�นท��ม�สายพื่อลั�เพื่ปไทด!มากกวิ2า 1 สาย)

สารท��ช้2วิยให#สายพื่อลั�เพื่ปไทด!แยกออกจากก�น (Dissociation agent)ได#แก2สารลัดแรงตี,งผ�วิท��สามารถแตีกตี�วิเป%นประจ' (ionic detergent) ช้��อวิ2า โซิเด�ยมโดเดซิ�ลัซิ�ลัเฟตี (sodium dodecyl sulphate ย2อวิ2า SDS) การแยกโปรตี�นด#วิย SDS-PAGE เป%นการวิ�เคราะห!องค!ประกอบในของผสมได#อย2างรวิดเร6วิ จ,งม�ประโยช้น!อย2างมากในการตีรวิจสอบควิามบร�ส'ทธิ์�*ของโปรตี�นในแตี2ลัะข�5นตีอน นอกจากน�5ย�งใช้#เตีร�ยมโปรตี�นในปร�มาณน#อยๆ ส4าหร�บการวิ�เคราะห!ในบางกรณ�เท2าน�5น

ส4าหร�บการวิ�เคราะห!ด#วิย SDS-PAGE น�5นของผสมโปรตี�นจะถ/กท4าให#เส�ยสภาพื่โดยควิามร#อนท��อ'ณหภ/ม� 100°ซิ เป%นเวิลัา 2 - 5 นาท�ในสารลัะลัายท��ม� SDS

มากเก�นพื่อแลัะม�สารประเภทไทออลั (thiol) เป%นองค!ประกอบ เช้2น 2-เมอร!แคปโทเอทานอลั (2-mercaptoethanol) เพื่��อท4าลัายพื่�นธิ์ะไดซิ�ลัไฟด! (disulphide bond) ในโปรตี�น ภายใตี#ภาวิะด�งกลั2าวิน�5โปรตี�นส2วินใหญ่2จะเกาะก�บ SDS ในอ�ตีราส2วินโดยน45าหน�กท��คงท�� (1.4 กร�มของ SDS ตี2อพื่อลั�เพื่ปไทด! 1

กร�ม)

4/11


http://www.davidson.edu/academic/biology/courses/Molbio/SDSPAGE/SDSwprotein.GIF

4/12




http://www.gibthai.com/userfiles/image/technote/Western%20Blot/Western-Blot-2.jpg

จากน�5นน4าส2วินผสมของโปรตี�นแตี2ลัะตี�วิอย2าง (โปรตี�นตี�วิอย2างผสมก�บ tracking dye ซิ,�งเป%นส2วินผสมของ 50 mM Tris-HCl pH 8.8, 30%

glycerol, 2 %SDS, 0.002 %bromphenol blue ส4าหร�บด/การเคลั�� อนท��ของโปรตี�น) ใส2ลังบนเจลัทรงกระบอกแตี2ลัะแท2งหร�อแตี2ลัะช้2องของเจลัแผ2น แลัะน4าไปแยกด#วิยกระแสไฟฟ(า ซิ,�งท�5งเจลัแลัะบ�ฟเฟอร!ท��ใช้#ในการแยกม� SDS เป%นองค!ประกอบอย/2ด#วิย โปรตี�นเท�ยบเค�ยงจะให#ผลัในลั�กษณะเด�ยวิก�บเจลัช้2องอ��น ๆ โดย

4/13




โปรตี�นจะเคลั��อนท��ไปตีามน45าหน�กโมเลัก'ลัของตี�วิเอง ภายหลั�งจากการแยกด#วิยกระแสไฟฟ(า ตี4าแหน2งของแถบโปรตี�นท��แยกออกจากก�นจะปรากฏิข,5นเม��อย#อมด#วิยส� เช้2น ส�ค/แมซิ�บลั/ (Coomassie Blue) หร�อส�สารประกอบของซิ�ลัเวิอร! (silver

stain) ในการแยกด,วัยวั�ธี� SDS-PAGE SDS จะจ�บัโปรติ�นในอ�ติราส*วันโดยน�.าหน�กหน�กที่��ค์งที่��ติลีอดที่�.งเจลี (กลี*าวัค์0อ โปรติ�นที่��มี�ขนาดใหญ*มี� SDS

เกาะอย'*มีาก) ที่�าให,โปรติ�นที่�กชน�ดมี�ค์*า

ค์วัามีหนาแน*นของประจ�ติ*อน�.าหน�กโปรติ�นเที่*าก�น การแยกโปรติ�นด,วัยวั�ธี�น�.จ2งอาศั�ยการแยกโดยขนาดเพ�ยงอย*างเด�ยวัโดยไมี*มี�จ�านวันประจ�มีาเก��ยวัข,องแลัะเน��องจากระยะทางท��เคลั��อนท��ไปของสายพื่อลั�เพื่ปไทด!บนเจลัม�ควิามส�มพื่�นธิ์!โดยตีรงก�บขนาดของพื่อลั�เพื่ปไทด!เท2าน�5นการแยกโปรตี�นท��เราสนใจบนเจลัน�5ท4าได#โดยเท�ยบน45าหน�กโมเลัก'ลัระหวิ2างโปรตี�นตี�วิอย2างก�บโปรตี�นมาตีรฐานท��ร/ #ขนาดโมเลัก'ลั

การตีรวิจสอบน45าหน�กโมเลัก'ลัของตี�วิอย2างพื่อลั�เพื่ปไทด!ตี#องเข�ยนกราฟมาตีรฐานระหวิ2างค2า log ของน45าหน�กโมเลัก'ลัของพื่อลั�เพื่ปไทด!ก�บระยะทางท��เคลั��อนท��ไปของพื่อลั�เพื่ปไทด!มาตีรฐานท��ม�น45าหน�กโมเลัก'ลัตี2างก�นซิ,�งกราฟน�5ม�ควิามส�มพื่�นธิ์!ในเช้�งเส#นตีรง ด�งน�5นเม��อทราบระยะทางท��ตี�วิอย2างพื่อลั�เพื่ปไทด!เคลั��อนท��ไปจะสามารถอ2านน45าหน�กโมเลัก'ลัจากกราฟได# ด�งแสดงในร/ป

4/14


ร'ปแสดงการหาน�.าหน�กโมีเลีก�ลีของโปรติ�นโดยเที่ค์น�ค์ PAGE

เอกสารอ,างอ�ง

1. ค์'*มี0อที่างช�วัเค์มี� (2537) ผ/#ช้2วิยศึาสตีราจารย! ดร. อาภ�สสรา ช้ม�ดส! ภาควิ�ช้าสร�รวิ�ทยา คณะส�ตีวิแพื่ทย!ศึาสตีร! ม.เกษตีรศึาสตีร! พื่�มพื่!คร�5งท�� 2 ส4าน�กพื่�มพื่!ร� 5วิเข�ยวิ

2. Biochemical Techniques: Theory and

Practice (1987) John F. Robyt, Bernard J. White.

Waveland Press. Inc.

ปฏิ�บั�ติ�การการเติร�ยมี SDS-PAGE แลีะแยกโปรติ�นติ�วัอย*าง

อ�ปกรณ์�1. ช้'ดเจลัอ�เลัคโตีรโฟร�ซิ�ส

4/15

http://www.amazon.com/s/ref=si3_rdr_bb_author?index=books&field-author-exact=Bernard%20J.%20White

http://www.amazon.com/s/ref=si3_rdr_bb_author?index=books&field-author-exact=John%20F.%20Robyt

http://www.amazon.com/Biochemical-Techniques-Practice-John-Robyt/dp/0881335568/ref=si3_rdr_bb_product

http://www.amazon.com/Biochemical-Techniques-Practice-John-Robyt/dp/0881335568/ref=si3_rdr_bb_product


2. Pipette, tips

สารเค์มี�1. Distilled water

2. 30% Acrylamide

3. 1.5 M Tris-HCl pH 8.8

4. 0.5 M Tris-HCl pH 6.8

5. 10%SDS(w/v)

6. 10% Ammonium persulfate (APS)(w/v)

7. TEMED

8. SDS-Electrophoresis buffer (25 mM Tris-HCl pH 8.3, 192

mM glycine, 0.1%SDS)

9. Tracking dye(50 mM Tris-HCl pH 8.8, 30% glycerol(v/v),

2%SDS(w/v), 0.002% (w/v) bromphenol blue)

10. ส�ย#อม Coomassie gel stain (0.2% Coomassie R-250,

7.5% acetic acid แลัะ 40% methanol)แลัะ Coomassie Rapid

Destain (7.5% acetic acid, 5% methanol)

การที่ดลีอง1. เตีร�ยม set กระจกส4าหร�บเทเจลั2. เตีร�ยมหลัอดทดลัอง 2 หลัอดส4าหร�บใส2สารท��เป%น stacking gel แลัะ

separating gel แลั#วิใส2สารในหลัอดทดลัองตีามลั4าด�บ 1-5

3. เม��อพื่ร#อมจะเทใส2ในกระจกจ,งเตี�ม 6-7 ร�บเขย2าให#เข#าก�นแลั#วิเทท�นท�ก2อนเจลัจะแข6งในหลัอดทดลัองโดยเทเจลัส2วิน Separating gel ก2อนท�5งไวิ#ประมาณ 20 นาท�ให#เจลัแข6ง

4. แลั#วิจ,งเทในส2วิน Stacking gel แลั#วิใส2หวิ�5. หลั�งจากน�5นเตีร�ยมตี�วิอย2างโปรตี�นผสมก�บ Tracking dye ใน

อ�ตีราส2วิน 3:1

6. เอากระจกท��เตีร�ยมเจลัไปใส2ในช้'ด chamber เตี�มบ�ฟเฟอร!แลัะถอดหวิ�ใส2ตี�วิอย2างโปรตี�นในช้2อง(well) แลั#วิเส�ยบปลั�?กเช้��อมตี2อก�บ power

source ด�งในร/ปข#างลั2าง

4/16


http://porpax.bio.miami.edu/~cmallery/150/protein/

page.jpg

7. ใช้#เวิลัาแยกโปรตี�นในสนามไฟฟ(าประมาณ 40 นาท�8. ย#อมแถบโปรตี�นโดยใช้# Coomassie gel stain หลั�งจากเห6นแถบ

โปรตี�น destain gel โดย Coomassie Rapid Destain

9. ค4านวิณหาขนาดโมเลัก'ลัของโปรตี�นแลัะบ�นท,กผลัการทดลัอง

Stacking gel

4.5%

Separating gel10%

1. Distilled water 1.8 ml 2 ml2. 1.5 M Tris-HCl pH 8.8

- 1.65 ml

3. Acrylamide 40% 0.45 ml 1.3 ml4. 0.5 M Tris-HCl pH 6.8

0.75 ml -

5. 10%SDS 20 l 65 l*6. 10% APS 10l 20 l*7. TEMED 5 l

4/17

http://porpax.bio.miami.edu/~cmallery/150/protein/page.jpg

http://porpax.bio.miami.edu/~cmallery/150/protein/page.jpg


5 l*หมายเหตี' เตี�มสารเคม� 1-5 ลังในหลัอดทดลัองตีามลั4าด�บเม��อพื่ร#อมจะเทใส2ในกระจกจ,งเตี�ม 6-7 ร�บเขย2าให#เข#าก�นแลั#วิเทท�นท�ก2อนเจลัจะแข6งในหลัอดทดลัอง

รายงานปฏิ�บั�ติ�การการแยกโปรติ�นโดยเจลีอ�เลีค์โติรโฟร�ซิ�ส

ผ่ลีการที่ดลีอง

(ร'ปการแยกโปรติ�นในเจลีอ�เลีค์โติรโฟร�ซิ�ส)

สร�ปแลีะวั�จารณ์�ผ่ลีการที่ดลีอง............................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................

4/18


.................................................................................................

.................................................................................................

.................................................................................................

.................................................................................................

.................................................................................................

.................................................................................................

.................................................................................................

..........................

ขนาดโมเลัก'ลัของโปรตี�นตี�วิอย2างค�อ ...............................kDa

4/19

Rf

Log Molecular weight (kDa)


แบับัฝึ6กห�ด

1. จากตีารางข#างลั2างถ#าโปรตี�นท��สนใจม�น45าหน�กโมเลัก'ลัประมาณ 50 kDa ควิรใช้# Acrylamide ……………..%

Acrylamide(%)

Pore(A)

ขนาดโมเลัก'ลัของโปรตี�น (kDa)

3 85 100-1,000

7.5 50 10-100

30 20 0.2-2

2. จง label แสดงแถบโปรตี�นขนาด 19.5 , 26.5 , 34, 45, 61, 82,

144 แลัะ 213 kDa ท��อย/2ในสารสก�ดจากเซิลัลั! E.coli (B) จากการท4า SDS-PAGE 12%

4/20


3. จากการท4า SDS-PAGE แบบท��ม�แลัะไม2ม� 2-เมอร!แคปโทเอทานอลั 2-

mercaptoethanol (R-SH) จงเตี�มน45าหน�กโมเลัก'ลัในช้2องวิ2างตี2อไปน�5

4/21

12000 Da

12000 Da

................

..........Da

................

..........Da

................

..........Da..........................Da

..................

kDa

ท�กษะในการแยกโปรตี�นโดยเจลัอ�เลัคโตีรโฟร�ซิ�ส (Gel electrophoresis)4/22

Documents

04_Gel protein