06 Skript Kontinuierliche Fermentation_WS2008_Nov

Übung 6 - Kontinuierliches Verfahren Stand Nov 2008 (WS2008/09)

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INTERDISZIPLINÄRES PRAKTIKUM 6. ÜBUNG

KONTINUIERLICHE FERMENTATION VON SACCHAROMYCES CEREVISIAE

1. Grundlagen

1.1 Kontinuierliche Fermentation

Erfolgt die Kultivierung von Mikroorganismen kontinuierlich, so wird dem Reaktor

ständig frisches Kulturmedium zugespeist und ein gleich großer Volumenstrom an

Zellsuspension aus dem Reaktor abgeführt. Das Arbeitsvolumen des Reaktors bleibt

konstant. Im kontinuierlichen Betrieb wird das sog. Fließgleichgewicht angestrebt, bei

dem sämtliche Konzentrationen im Reaktor über die Zeit konstant sind. So können

über einen längeren Zeitraum Zellen unter gleich bleibenden Bedingungen kultiviert

werden. Dies ist für die Erforschung der Kinetik und des Verhaltens eines biologi-

schen Systems (z.B. Einflussfaktoren auf den zellulären Metabolismus, Enzymaktivi-

tät, genetische Stabilität) von großer Bedeutung. Kontinuierliche Verfahren werden

vor allem im Labor eingesetzt. Ihre Nutzung im technischen Maßstab ist u.a. wegen

des hohen apparativen Aufwands (Sterilisation, Mess- und Regeltechnik) sowie gro-

ßer Kontaminationsprobleme noch relativ selten. Außerdem wird meist, um niedrige

Aufarbeitungskosten zu erhalten, eine hohe Produktendkonzentration angestrebt,

welche sich im Batch - Prozess häufig kostengünstiger realisieren lässt.

X,S

Zuluft

Abluft

VL

V, Sf

•

Medien-Feed

V, X, S•

Ernte-Abfluss

Abb.1: Schema des einstufigen, kontinuierlich betriebenen Rührreaktors.

Übung 6 – Kontinuierliches Verfahren

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Zur Bilanzierung des kontinuierlichen Prozesses wird vorausgesetzt, dass der Misch-

vorgang im Bioreaktor so gut ist, dass jedes Flüssigkeitselement im Reaktor die glei-

che Zusammensetzung hat. Diese „ideale Durchmischung“ bedeutet auch, dass die

Zusammensetzung der den Reaktor verlassenden Flüssigkeit identisch mit derjeni-

gen im Reaktor ist (Abb.1).

Wird die Zulaufflüssigkeit mit einer Fließrate V&[L/h] dem Kulturvolumen V [L] zuge-

geben, so wird diese Kultur mit einer Durchflussrate D [1/h] verdünnt.

V

VD

&= (1)

mit D Durchflussrate oder Volumenwechsel pro Stunde [1/h]

Zur Bilanzierung einer beliebigen Komponente wird die innerhalb des Reaktors

umgesetzte Masse dieser Komponente, sowie der aufgrund des Volumenwechsels

auftretenden Änderungen im Reaktor in Form einer Differentialgleichung aus zu- und

abgeführter Masse betrachtet. Bei sterilem Zulauf (XF=0) gilt für die zeitliche

Änderung der Biomassekonzentration:

XDXdt

dX⋅−⋅= µ (2)

mit X Biomassekonzentration [g/L]

t Zeit [h]

µ spezifische Wachstumsrate [1/h]

Die zeitliche Änderung der Substratkonzentration ist unter anderem abhängig von

der Biomassekonzentration:

)(1

F

SX

SSDXYdt

dS−⋅−⋅⋅−= µ (3)

mit S Substratkonzentration [g/L]

SF Substratkonzentration der Zulaufflüssigkeit [g/L]

YX/S Substratbezogener Ausbeutekoeffizient für die Biomasse X [gTS/g]

Im Fließgleichgewicht sind alle Konzentrationen im Reaktor zeitlich konstant, es gilt:


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0==dt

dS

dt

dX (4)

Nach Gleichung 2 folgt damit:

D=µ (5)

d.h. die spezifische Wachstums- entspricht der Durchflussrate, was einer

Übereinstimmung der abgeführten und der zugewachsenen Biomasse entspricht.

Daraus geht ein einzigartiger Vorteil der kontinuierlich geführten Kultur hervor,

nämlich die Möglichkeit, eine biologische Größe (µ) durch eine physikalische

Größe (D) gezielt einstellen zu können.

Zur Beschreibung der kontinuierlichen Kultivierung eines Mikroorganismus wird ein

X-D Diagramm, bei dem die Biomasse sowie gegebenenfalls auch Substrat- und

Produktkonzentration in Abhängigkeit von der Durchflussrate aufgetragen erstellt.

Für eine Kultur mit Monod-Kinetik ergibt sich beispielsweise aus den Glg. 5:

D

KDS S

−

⋅=

maxµ (6)

mit KS Monod-Konstante [g/L]

µmax maximale spezifische Wachstumsrate [1/h]

Ferner folgt im Gleichgewichtszustand aus Glg. 3 und 5:

)( SSYX FSX −⋅= (7)

so dass ein X-D Diagramm (Abb. 2) erstellt werden kann. Die Raum-Zeit-Ausbeute

stellt dabei eine wirtschaftlich relevante Größe dar.

DXRZA ⋅= (8)

mit RZA Raum – Zeit – Ausbeute [g/L/h]


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0

1

2

3

4

5

6

0 0,2 0,4 0,6 0,8 1 1,2

Durchflußrate D [1/h]

X [g/L]

RZA [g/(L*h)]

0

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10S

[g/L]Zellkonzentration X

Raum-Zeit-Ausbeute (RZA = X*D)

Substratkonzentration S DKRITDopt

Abb. 2. X-D Diagramm einer Kultur mit Monod-Kinetik

Im linken Teil des X-D Diagramms sind Biomasse- und Substratkonzentration nur

wenig von der Durchflussrate abhängig. Hier kann die Kultur durch die Zulaufrate bei

konstanten Konzentrationen im Zulauf gut geregelt werden, was als Chemostat -

Steuerung bezeichnet wird. Kleine Unregelmäßigkeiten der Pumpe werden vom

System ohne weiteres toleriert. Im rechten Teil sind Zelldichte und

Substratkonzentration dagegen sehr stark von D abhängig. In diesem Bereich ist

eine Turbidostat - Regelung sinnvoll, bei der die Regelung z.B. über die Zelldichte

(meist aufgrund von Lichtabsorption, daher dürfen die Mikroorganismen nicht zur

Agglomeration neigen, der Feststoffanteil im Medium muss gering sein, u.s.w.)

erfolgt. Wird der CO2-Anteil in der Abluft gemessen, so kann auch dieser zur

Regelung benutzt werden.

Im Rahmen dieses Experimentes soll ein X-D Diagramm der Hefe Saccharomyces

cerevisiae erstellt werden. Die Anzucht des Mikroorganismus erfolgt submers unter

kontinuierlicher Prozessführung in einem 2 Liter - Fermenter.


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1.2. Stationäre Methode zur OTR- und kLa - Bestimmung in gerührten Fermentern

mit Abgasanalytik

Die stationäre Methode beruht auf der Annahme, dass der Sauerstoffeintrag in die

Nährlösung und die Sauerstoffaufnahmerate durch die Mikroorganismen gleich sind.

Diese Annahme ist berechtigt, solange keine aktuellen Änderungen der Betriebsbe-

dingungen vorgenommen werden. Man benötigt zur Bestimmung die Sauerstoff-

bzw. Kohlendioxidkonzentration in der Zuluft und der Abluft (Abgasanalytik) sowie für

den kLa-Wert den OTR, die zugeführten Gasvolumenströme und die Konzentration

des gelösten Sauerstoffs in der Kulturbrühe (pO2).

Die Sauerstofftransferrate lässt sich aus einer Stoffbilanz für die Gasphase im stati-

onären Betriebszustand bestimmen. Vereinfachend wird angenommen, dass das

Gasgemisch nur aus den drei Stoffen Stickstoff, Sauerstoff und Kohlendioxid be-

steht, wobei Stickstoff als inert angesehen wird und nicht verbraucht oder gebildet

wird:

⋅

−−

−−−⋅= OutO

OutCOOutO

InCOInO

InO

m

In yyy

yyy

V

qOTR ,

,,

,,

, 2

22

22

2 1

1 (9)

mit OTR Sauerstofftransferrate [mol/(L·h)]

qIn zugeführter spez. Gasvolumenstrom [NL/(L·min)]

Vm Molares Gasvolumen 22,4 [NL/mol]

yO2,In O2-Molenbruch im zugeführten Gas [mol/mol]

yO2,Out O2-Molenbruch in der Abluft [mol/mol]

yCO2,In CO2-Molenbruch im zugeführten Gas [mol/mol]

yCO2,Out CO2-Molenbruch in der Abluft [mol/mol]

Bei vollständig rückvermischter Gasphase errechnet sich der volumetrische Sauer-

stofftransferkoeffizient kLa damit zu:

( )kalOOUTOabsO

LypOypL

OTRak

,2, 222100/ ⋅−⋅⋅

= (10)

mit: kLa vol. Sauerstofftransferkoeffizient [1/s]

LO2 O2-Löslichkeit [mol/L/bar]


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pabs Absolutdruck auf halber Reaktorhöhe (hier = 1) [bar]

pO2 Partialdruck des gelösten Sauerstoffs (bezogen auf Sättigung mit Prüfgas) [%]

yO2,kal O2-Molenbruch des Prüfgases (pO2-Elektrode) [mol/mol]

Bei entsprechend gut kalibrierten Messgeräten ist die stationäre Methode mit Ab-

gasanalytik die genaueste und zuverlässigste Methode der kLa-Wert-Bestimmung

und den anderen, dynamischen Methoden unbedingt vorzuziehen.

1.3 Physiologie der Hefe Saccharomyces cerevisiae

Saccharomyces cerevisiae ist möglicherweise die am meisten untersuchte Hefe.

Dies ist nicht nur eine Folge ihrer Bedeutung in der Industrie, wo sie in erster Linie

zur Erzeugung von Alkohol in der Brennerei und Brauerei und als Biomasseprodu-

zent in der Backhefeindustrie eingesetzt wird. Weitere Anwendungsgebiete dieser

Zellen liegen in der Gewinnung von Geschmacks- und Aromastoffen, Enzymen, mo-

noklonalen Antikörpern sowie in der Expression von Proteinen [HEYSE, 1995]. Aber

auch ihre besondere Art der Glucose - Verstoffwechselung hat die Neugier mancher

Wissenschaftler geweckt, so dass Saccharomyces cerevisiae zum Modellorganis-

mus für die molekulargenetische Forschung an eukaryotischen Mikroorganismen

geworden ist. Das kleine haploide Genom, die geringe Anzahl der Chromosomen

sowie die unter Standardzuchtbedingungen erreichbare Generationszeit von nur 1,5

Stunden tragen mit dazu bei [SCHLEGEL, 1992]. In der Natur findet man Hefen an

allen Standorten, an denen vergärbare, zuckerreiche Säfte frei werden: im Nektarsaft

der Blüten und auf Blättern sowie auf reifen Früchten.

Taxonomisch gehören die Hefen zur Abteilung der Pilze (Fungi) und zur Klasse der

Schlauchpilze (Ascomycetes). Die weitere Einteilung der Hefen basiert im wesentli-

chen auf ihrer Morphologie und der Art ihrer Vermehrung. Die für Saccharomyces

cerevisiae typische Art der asexuellen Vermehrung ist die Zellsprossung oder Knos-

penbildung. Die Sprosszellen können miteinander verbunden bleiben, oder sich völlig

voneinander lösen. In Abbildung 3 ist schematisch das Querschnittsbild einer ein-

zelnen Hefezelle dargestellt. Sie hat eine runde bis ovale Form und einen Durch-

messer, der zwischen 6 und 14 µm liegt [HEYSE, 1995].


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Die im Cytoplasma eingeschlossenen Organellen sind für die anabolischen und ka-

tabolischen Stoffwechselvorgänge sowie deren Energiekopplung notwendig. Nach-

folgend sollen nur die im Rahmen dieser Arbeit interessierenden biologischen

Grundlagen des Stoffwechsels der Hefen in komprimierter Form beschrieben wer-

den.

Abb. 3. Schematische Darstellung einer Hefezelle

Das Wachstumsverhalten von Saccharomyces cerevisiae ist typisch für Glucose -

sensitive Hefen, bei denen die Glucoseaufnahme nicht über die Atmungsrate kon-

trolliert ist. Im Anschluss an die Glykolyse, die Umsetzung von Glucose zu Pyruvat,

führt der Pyruvat - Stoffwechsel bei einem Überschuss an Glucose zu einer Bildung

von Ethanol, anstelle in den Citratzyklus und die Atmungskette zu münden und dort

unter Energiegewinnung zu CO2 abgebaut zu werden. Es handelt sich um eine Über-

laufreaktion (Crabtree - Effekt), die beim Abbau der Überschüsse durch Wiederauf-

nahme des Ethanols verschwindet. Maßgebend für den vollständigen Abbau ist die

verfügbare Atmungskapazität [FIECHTER, 1994; PRONK ET AL, 1996]. Diese begrenzte

respiratorische Kapazität von Hefen der Gattung Saccharomyces ist in Abbildung 4

[nach SONNLEITNER und KÄPPELI, 1986] als Flaschenhals illustriert.

Der als respiratorischer Flaschenhals bezeichnete Engpass in Abbildung 4 be-

stimmt den Weg der Kohlenstoffumsetzung zu Biomasse. Der oxidative Abbau der

Glucose ist bevorzugt. Der reduktive Weg wird nur als Ausweg bei entsprechend ho-

hem Glucoseangebot, und damit verbundener Überlastung der Respirationskapazität

zugeschaltet.


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Abb. 4. Erläuterung der Nutzung des Substrats Glucose bzw. Ethanol bei Hefen der Gattung

Saccharomyces als respiratorischer Flaschenhals [nach SONNLEITNER und KÄPPELI, 1986]

Dabei wird das zwangsweise gebildete Ethanol ins Medium ausgeschieden. Dieses

kann jedoch bei Unterschreitung der aktuellen Atmungskapazität über den oxidativen

Weg von den Zellen verbraucht werden. Solange das Überangebot an Glucose nicht

abgebaut ist, bleibt der überschüssige Ethanol unangetastet im Medium [FIECHTER,

1994].

Hefen sind fakultativ anaerob, d.h. sie sind auch unter anaeroben Bedingungen le-

bens-, bzw. wachstumsfähig. Die Glucose wird dann rein reduktiv unter Bildung von

Ethanol abgebaut. Bei dieser als alkoholische Gärung bezeichneten Kohlenstoffum-

setzung kommt es zu einem nur geringen Wachstum der Hefen. Die Anhäufung des

Ethanols im Medium fällt entsprechend stärker aus. Demzufolge werden für Hefen

der Gattung Saccharomyces für den Umsatz der Kohlenstoffquellen in Biomasse drei

verschiedene Stoffwechselwege unterschieden:

• oxidatives Wachstum auf Glucose

• reduktives Wachstum auf Glucose unter Bildung von Ethanol

• oxidatives Wachstum auf Ethanol


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1.4 Modellierung und Simulation

Zur Unterstützung von Prozessentwicklung und Prozessführung stellt die Modellie-

rung und Simulation ein wesentliches Werkzeug dar. Sowohl für die Auslegung neu-

er Anlagen als auch für Verbesserung bereits bestehender Anlagen verwendet man

kommerzielle Programmsysteme, mit denen sich stationäre Simulationen und Opti-

mierungen von Betriebspunkten durchführen lassen. Zunehmend gewinnen auch

Simulationstrainer an Bedeutung für die Aus- und Weiterbildung von Bedienungs-

personal. Oft hat die Modellbildung zur Unterstützung von Entscheidungsprozessen

weit reichende betriebliche und wirtschaftliche Folgen.

In diesem Praktikumsversuch soll Anhand eines Modells die Fermentation von Sac-

caromyces cerevisiae simuliert werden. Zunächst erfolgt eine batch - Fermentation,

die anschließend auf kontinuierliche Betriebsführung umgestellt wird. Gerade das

Umschalten auf kontinuierliche Betriebsführung kann sich durch die Wahl des fal-

schen Umschaltzeitpunktes als problematisch erweisen. Unter Umständen können

sehr lange Einschwingzeiten bis zum Erreichen eines stabilen Betriebspunktes auf-

treten. Durch eine vorherige Simulation des Vorganges soll der günstigste Zeitpunkt

für das Umschalten auf eine kontinuierliche Betriebsführung ermittelt werden. Beim

Umschalten der Durchflussrate ist man bei der Ermittlung der Zeit bis zum Erreichen

des nächsten stabilen Betriebspunktes auf grobe "Faustformeln" angewiesen. Zum

einen kann dadurch wertvolle Zeit verloren gehen, weil der Betriebspunkt bereits frü-

her erreicht wurde, zum anderen können sich auch wesentlich längere Zeiten erge-

ben.


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2. Methodik

2.1. Vorbereitende Arbeiten

2.1.1 Vorbereitung des Mediums, der Vorkultur und der Probenahme

Glucosemonohydrat: 11 g/L

Pepton [pangr. verd.] 5 g/L

Hefeextrakt 5 g/L

Vorkultur. Zweimal 50 mL Medium (in 250 mL Erlenmeyerkolben) vorbereiten und

autoklavieren. Mit 2 Impfösen Saccharomyces cerevisiae (Platte wird gestellt) animp-

fen und bei 200 U/min und 30°C für ca .1,5 d inkubieren.

Vorratsfass. Es werden 40 L Medium für die kontinuierliche Prozessführung

vorbereitet. 50 L Alu-Fass gut ausspülen, 200 g Pepton (Roth), 200 g Hefeextrakt

(Roth) getrennt in jeweils 3 L VE (voll entsalztem) Wasser lösen. 32 L VE-Wasser in

das Fass füllen und die Pepton und Hefeextraktlösungen hinzufügen. Durch die

Zugabe von 30 mL 30%ige H2SO4 (Schutzmaßnahmen beachten!) sollte sich der

pH-Wert auf 5 einstellen. 440 g Glucosemonohydrat werden separat in 1500 mL VE-

Wasser in einer Zulaufflasche autoklaviert. Werden die hier vorgegebenen

Flüssigkeitsmengen eingehalten, ergibt sich am Ende eine Medienmenge von 40 L.

Das Fass mit allen nötigen Anschlüssen versehen, einem großen Dreikant-Rührfisch

zugeben und im Autoklaven bei 121°C über Nacht (Zeiteinstellung: 90 min) auto-

klavieren. Flaschenzug benutzen!

Bestimmung der Sauerstofflöslichkeit des verwendeten Mediums. Die Bestimmung

der Sauerstofflöslichkeit des Mediums unter Kulturbedingungen erfolgt über die in

Übung 2, Kapitel 1.6 beschriebenen Gleichungen.

Probenahme. Zur Verdünnung der Proben bei der OD-Messung wird 100 mL

0,9%ige NaCl-Lösung hergestellt.

Für die Biotrockenmassebestimmung bei der kontinuierlichen Fermentation werden

10 Eppendorf-Reaktionsgefäße 2,2 mL (Trockenschrank 105°C, 24 h, abkühlen im

Exsikkator) beschriftet und im leeren Zustand auf der Analysenwaage gewogen.


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2.1.2. Aufbau des Fermenters

Bevor der Deckel auf das Kulturgefäß aufgesetzt wird, muss der O-Ring im Deckel,

bzw. die Auflagefläche des Glasgefäßes leicht mit Silikonfett eingefettet werden. Der

Deckel wird so zu dem Gefäß ausgerichtet, dass die beiden Befestigungsschrauben

des Deckels in der Draufsicht oberhalb der Schlaucholiven des Glasgefäßes platziert

sind. Die untere Schlaucholive des Gefäßes befindet sich dabei auf der linken Seite.

Mit einer Schnellverschluss-Schelle wird der Deckel auf dem Glasgefäß befestigt.

Zuvor muss jedoch der Gaseinblasring von der Deckelunterseite durch die

entsprechende Verschraubung eingeführt werden. Nachdem Kulturgefäß und Deckel

montiert sind, werden die benötigten Elektroden (die pH - Elektrode muss vorher mit

den entsprechenden Kalibrierlösungen pH 7.0 ("Nullpunkt") und pH 4.0 ("Steilheit")

kalibriert werden!) und Sonden, der Abluftkühler, sowie Zu- und Ablaufstutzen

entsprechend der Abbildung 5 in die jeweilige Deckelöffnung eingesetzt und mittels

Überwurfmuttern befestigt. Sämtliche Dichtungsringe müssen dabei dünn eingefettet

werden. Die nicht benötigten Öffnungen werden mit entsprechenden Blindstutzen

geschlossen.

Nun müssen die Stutzen mit den entsprechenden Schläuchen versehen werden. An

Zulauf- und Ablaufstutzen werden ausreichend lange Schläuche befestigt, der Zulauf

wird am Ende mit einer Sterilkupplung versehen, am Ablauf reicht ein fester Knoten.

Alle Schläuche, die in Schlauchpumpen eingelegt werden, müssen aus

Maprenschlauch sein. Der Durchmesser des Ablaufschlauches in der Pumpe muss

größer sein als der des Zulaufschlauches, um ein Überfüllen des Fermenters zu

verhindern. Am Probennahmerohr wird ein Schlauch befestigt, der mit dem

Kontiprobennehmer verbunden ist. Der Rücklauf wird am 4-fach Stutzen befestigt.

Der dritte Anschluss des 4-fach Stutzens ist für das Antischaummittel (Plurafac 1300,

1:10 verdünnen und mit einem Rührfisch versehen!) bestimmt. Am Gaseinblasring

wird ein Membranfilter (0,2 µm) befestigt, am Abluftkühler wird ein Tiefenfilter

angeschlossen, anschließend eine Wasserfalle. Bis auf den Abluftschlauch werden

sämtliche Schläuche jeweils mit einer Schlauchklemme abgeklemmt. Das Ablaufrohr

muss komplett in den Fermenter eintauchen.


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Abbildung 5: Bestückung des Fermenterdeckels

Bevor der Fermenter autoklaviert werden kann, muss er einem Dichtigkeitstest

unterzogen werden. Tritt dabei keine Luft aus, wird der Fermenter mit ca. 1 L VE-

Wasser gefüllt und im Autoklaven bei 121 °C 20 min lang autoklaviert.

Der Fermenter wird im abgekühlten Zustand mit der Regel- und Steuereinheit

verbunden. Der Zulaufschlauch wird über die Sterilkupplung mit dem Schlauch zum

Mediumfass verbunden. Über die Ablaufpumpe wird das Wasser aus dem Fermenter

entfernt, mittels Zulaufpumpe Medium in den Fermenter gefüllt. Beim Befüllen muss

die Pumpenkennlinie aufgenommen werden. Dazu wird jeweils 10 Minuten mit 50%

und 99% Pumpleistung befüllt. Zuletzt werden die pO2-Elektrode und der

Abgasmessschrank kalibriert.

Schaumsonde Abluftkühler

Blasenabscheider = Probenschleife

Impfstutzen


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2.1.3. Kalibrierung der pO2-Elektrode und der Abgasanalytik zur OTR- und kLa-

Bestimmung

Kalibrierung der pO2-Elektrode. Kalibriert wird in „% Sättigung“, wobei eine mit Luft

gesättigte Lösung als „100% gesättigt“ definiert wird. Während der Kalibrierung muss

mit gleichem Druck und Belüftungsverhältnissen gearbeitet werden, wie sie später

bei der Fermentation vorkommen. Außerdem sollte sich die Kalibriertemperatur nicht

wesentlich von der späteren Fermentationstemperatur (30 °C!) unterscheiden. Die

Kalibrierung erfolgt in zwei Schritten:

Nullpunkt-Kalibrierung:

• Stickstoff in den Fermenter einleiten

• Stabile Anzeige abwarten

• Mit Zero-Potentiometer Anzeige auf 0% pO2 einstellen

Steigungs-Kalibrierung:

• Luft in den Fermenter einleiten

• Stabile Anzeige abwarten

• Mit Slope-Potentiometer Anzeige auf 100% pO2 einstellen

Kalibrierung der Abgasanalytik (Messschrank). Die Kalibrierung des Abgasmess-

schrankes erfolgt ebenfalls in zwei Schritten:

Nullpunkt-Kalibrierung:

• Stickstoff in den Messschrank einleiten

• Stabile Anzeige abwarten (mind. 10 min!)

• Mit Nullpunkt-Potentiometer Anzeige des O2- sowie des CO2- Messgerätes auf 0% kalibrieren

Empfindlichkeits-Kalibrierung:

• Prüfgas in den Messschrank einleiten

• Stabile Anzeige abwarten (mind. 10 min)

• Mit Empfindlichkeits-Potentiometer Anzeige der O2– und CO2- Messgeräte je-weils auf 25% O2 und 5% CO2 stellen


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2.2 Batch-Fermentation

2.2.1. Beimpfen des Fermenters

Zunächst wird die OD der Vorkultur bestimmt. Aus der gemessenen OD wird dann

die Animpfmenge für 1 L Fermentervolumen mit einer Start-OD von 0,01 ermittelt.

22

2

100001,0

VKVK

FermenterStart

VKOD

mL

OD

VODV

⋅=

⋅=

Angeimpft wird mit VVK2 der 2.Vorkultur, die zuvor steril in eine Einwegspritze mit

langer Kanüle gefüllt wurde. Die Animpfmembran des Fermenters wird mit Ethanol

bedeckt. Die Fermentation erfolgt im batch - Betrieb unter den folgenden

Einstellungen:

• Begasungsrate 50% [100% = 2 L/min]

• Rührerdrehzahl 100, 250, 500, 1500 U/min

• pH-Wert ungeregelt, ca. pH 5.0

• Temperatur 30°C (20 °C für die ersten 16 Stunden)

2.2.2 Probenahme und Analytik

Zu folgenden Zeiten wird mit einer Spritze 5 mL Probe aus dem Fermenter gezogen:

• vor dem Animpfen

• zum Zeitpunkt 0 (wenn der Fermenter gerade beimpft ist)

• stündlich beim batch-Betrieb

OD-Bestimmung. Mikroküvette mit ca. 1 mL Probe befüllen und bei 600 nm OD

(Referenz 0,9% NaCl-Lösung) bestimmen. Wenn die OD den Wert 0,3 überschreitet,

Probe mit 0,9% NaCl-Lösung entsprechend verdünnen.

pH-Wert-Bestimmung. 1 mL Probe in ein Eppendorf-Reaktionsgefäß füllen, pH-Wert

messen.

HPLC-Bestimmung. 2,2 mL Eppendorf Reaktionsgefäße mit genau 1,5 mL Probe

befüllen und 20 min bei 4000 U/min zentrifugieren. Aus dem Überstand jeweils 1 mL

in weiteres beschriftetes Reaktionsgefäß pipettieren und bis zur Analyse sofort

einfrieren!


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2.2.3 Abschaltversuch

Zur Bestimmung der Sauerstofftransferrate OTR mit der dynamischen Methode wird

gegen Ende der batch – Fermentation die Luftzufuhr geschlossen und die

Rührerdrehzahl auf einen geringen Wert eingestellt. Über die Zeit für die Abnahme

der Sauerstoffpartialdrucks auf Null kann die OTR berechnet werden.

2.3 Kontinuierlicher Betrieb

2.3.1 Inbetriebnahme und Veränderung der Durchflussraten

Das Anschalten der Ismatec-Pumpe startet den kontinuierlichen Prozess.

Es sollen mindestens 5 Datenpunkte aufgezeichnet werden. Je nach gewählter

Durchflussrate muss mit unterschiedlicher Zeitdauer zur Einstellung des Fließgleich-

gewichtes gerechnet werden. Eine Faustregel besagt, dass die 3-5 fache Menge des

Arbeitsvolumens durchgesetzt werden muss, bis sich der neue Gleichgewichtszu-

stand eingestellt hat. Eine effizientere Ermittlung der Zeitpunkte zur Probennahme, in

Abhängigkeit der eingestellten Durchflussrate, gibt die vorangehende Modellierung.

Durch die Simulation des Vorganges soll im Vorfeld eine Versuchsplanung erfolgen,

dabei sollen folgende Durchflussraten berücksichtigt werden:

D = 0,05 [1/h] D = 0,1 [1/h] D = 0,15 [1/h] D = 0,2 [1/h]

D = 0,25 [1/h] D = 0,3 [1/h] D = 0,35 [1/h] D = 0,4 [1/h]

Bei der Versuchsplanung ist zu berücksichtigen, dass der Umschaltpunkt (und zu-

gleich Probenahmepunkt) nicht nachts, am Wochenende oder an Feiertagen statt-

findet.

Nach Beendigung des Versuchs muss das Flüssigkeitsvolumen im Fermenter ausge-

litert werden, um damit die genauen Durchflussraten ermitteln zu können.


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2.3.2. Probenahme

Zu folgenden Zeiten wird mit einer 5 ml Spritze jeweils ca. 5 mL Probe aus dem

Fermenter gezogen:

• vor dem Umschalten auf kontinuierliche Betriebsweise

• vor jeder Änderung des D-Wertes

pH-Bestimmung, OD – Bestimmung und HPLC – Bestimmung wie unter 2.2.2

BTM-Bestimmung. Den restlichen Überstand aus dem Zentrifugenröhrchen

vorsichtig abdekantieren und das Zentrifugenröhrchen (mit dem Sediment) in den

Trockenschrank bei 105°C legen. Nach 24 h erneut auf der Analysenwaage wiegen.


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Auswertung und Protokoll

Bitte achten Sie während des Praktikums darauf, Ihre Daten fortlaufend in einem

Laborbuch zu erfassen und benutzen Sie das Protokollblatt im Anhang.

Im Protokoll enthalten sein soll für die Batch - Fermentation:

a) Grafische Darstellung der Glucose- und Ethanolkonzentration im batch-

Betrieb.

b) Aus den Daten der OD -Bestimmung soll die maximale Wachstumsrate

(grafisch) bestimmt werden, um so auf die kritische Durchflussrate zu

schließen.

c) Ermittlung des OTR-Werts mittels Abschaltversuch und Vergleich mit dem

OTR aus der Abgasanalytik

d) Diskussion des zeitlichen Verlauf der verschiedenen Parameter (pO2, OTR,

CTR, RQ, kLa).

Für die kontinuierliche Fermentation:

a) Pumpenkennlinien

b) Vergleich der geplanten Probenahmen (Grafik aus ModelMaker) gegen die

tatsächlich durchgeführten Probenahmen

c) X-D Diagramm mit OD, Glucose und Ethanolkonzentration sowie Diskussion

des Diagramms

d) X-D Diagramm mit BTM (Biotrockenmasse), Glucose und Ethanolkonzen-

tration sowie Diskussion des Diagramms.


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Anhang A: Modellierung des Wachstums der Hefe Saccharomyces cerevisiae

Das Ziel eines Wachstumsmodells ist die mathematische Beschreibung der Kultivie-

rungsverläufe eines Bioprozesses. Diese Modelle basieren prinzipiell auf Massenbi-

lanzen, die für den betrachteten Reaktor mitsamt der mikrobiologischen und bioche-

mischen Prozesse aufgestellt werden. Für die Lösung der Bilanzen müssen Stöchi-

ometrie, Kinetik und Energetik des Bioprozesses bekannt und verstanden sein. Die

grundlegende Modellierung eines kontinuierlichen Bioprozesses wurde bereits dar-

gelegt. Hier soll nun ein komplexeres Wachstumsmodell der Hefe Saccharomyces

cerevisiae vorgestellt werden.

Von zentraler Bedeutung bei strukturierten, segregierten Modellen sind Wachstum,

Erhaltung, Stoffwechsel, Physiologie und Produktbildung bzw. Stoffwandlung der

Mikroorganismen im Reaktor. Vereinfachend dazu wird anstelle der Unterscheidung

dynamischer Vorgänge und der Unterteilung des zellulären Systems in mehrere ver-

schiedenartiger Komponenten, bei einem unstrukturierten, unsegregierten Modell ein

Mittelwert der Zelleigenschaften bzw. der physiologischen Entwicklungsprozesse

betrachtet, anhand dessen das zelluläre System in Form einer gleich verteilten, ho-

mogenen Größe zusammengefasst werden kann.

Das hier eingesetzte unstrukturierte, unsegregierte Modell basiert auf bereits entwi-

ckelten Bilanzierungen [SONNLEITNER und KÄPPELI, 1986], die an eine Reaktorausfüh-

rung in Form einer Kaskade angepasst worden sind. Mit Hilfe dieses modifizierten

Modells wurden die Kultivierungsverläufe im Voraus und versuchsbegleitend be-

stimmt. Die dadurch mögliche Vorauswahl interessanter Prozessverläufe, bzw. ent-

sprechender Betriebsbedingungen führte zu einer Verringerung des experimentellen

Aufwands.

Das Modell beschreibt das Wachstumsverhalten der Hefe Saccharomyces cerevisi-

ae unter Berücksichtigung der begrenzten respiratorischen Kapazität. Bei diesem

unstrukturierten Modell wird die zur Charakterisierung der biologischen Phase be-

trachtete Biomasse als gleich verteilte, homogene, unstrukturierte Größe angesehen.

Die Ermittlung der kinetischen Parameter beruht auf Erkenntnissen bzw. Daten, die

aus experimentellen Untersuchungen [RIEGER ET AL., 1983] mit dem Stamm Saccha-

romyces cerevisiae H1022 gewonnen wurden.


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Die stöchiometrischen Gleichungen für den Umsatz der Kohlenstoffquellen in Bio-

masse für Hefen der Gattung Saccharomyces sind wie folgt beschrieben:

• oxidatives Wachstum auf Glucose (I) (A1)

OHCONOHCNHNXOOHCIIIII OHCONXOXHXXNO 221326126 222

)( ⋅+⋅+⋅→⋅⋅+⋅+ ννννν

• reduktives Wachstum auf Glucose unter Bildung von Ethanol (II) (A2)

OHCOHCONOHCNXIIIIIIII OHCOHCONXOXHXX 622213X6126 6222II

)(NHνOHC ⋅+⋅+⋅+⋅→⋅⋅+ νννν

• oxidatives Wachstum auf Ethanol (III) (A3)

→⋅+⋅+ )(NHνOνOHC 3X2O62 III2IIIOHCONOHC 2OH2CONXOXHX1X III2III2III

⋅ν+⋅ν+⋅ν

mit: (NH3) Stickstoffquelle

ν stöchiom. Koeffizient mit Indices für Substanz bzw.

Wachstumswege I bis III

Die molekulare Zusammensetzung der Biomasse X wird dabei nach elementaranaly-

tischer Bestimmung des Anteils der jeweiligen Atome H, O und N an der Biomasse

HX, OX und NX in der Form C1HHXOOXNNX dargestellt. Weitere experimentell ermit-

telbare Größen sind die substratbezogenen Ausbeutekoeffizienten für die Biomasse

YX/S, die in Proportionalität zu den stöchiometrischen Koeffizienten wie folgt definiert

sind:

G

XX

oxidativGX

M

MY

Iν= (A4)

G

XX

reduktivGX

M

MY

IIν= (A5)

E

XX

oxidativEX

M

MY

IIIν= (A6)


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mit YX/Goxidativ Ausbeutekoeff. für oxidative Wachstum auf Glc. (I) [gTS/g]

YX/Greduktiv Ausbeutekoeff. für reduktive Wachstum auf Glc. (II) [gTS/g]

YX/Eoxidativ Ausbeutekoeff. für oxidatives Wachstum auf EtOH [gTS/g]

M Molare Masse mit Index für Substanz [g/mol]

Mit Hilfe dieser Ausbeutekoeffizienten kann unter Berücksichtigung der spezifischen

Verbrauchsraten für das Substrat Glucose sowie der spezifischen Wachstumsrate

für Ethanol, die absolute spezifische Wachstumsrate µ als Summe dieser Kompo-

nenten für die drei verschiedenen Stoffwechselwege dargestellt werden.

bzw. oxidativ

E

reduktiv

G

oxidativ

G µµµµ ++= (A7)

mit oxidativ

E

reduktiv

S

reduktiv

GX

oxidativ

S

oxidativ

GX qYqY µµ −⋅−⋅−= (A8)

und µ Wachstumsrate (Indices für Substrat und Stoffwechselweg) [1/h]

qSIndex Glucoseaufnahmerate (Index für Stoffwechselweg) [g/(g·h)]

Die Aufnahme der Glucose wird wie folgt beschrieben:

SK

Sqq

S

max,SS+

⋅= (A9)

wobei reduktivS

oxidativSS qqq += (A10)

qS Glucoseaufnahmerate [g/(g·h)]

qS,max maximale Glucoseaufnahmerate [g/(g·h)]

S Glucosekonzentration [g/L]

KS Monod-Konstante für Glucose [g/L]

Das Wachstum auf Ethanol verläuft nach der Monod-Kinetik. Dabei muss jedoch die

Priorität der Glucoseaufnahme gegenüber der des Ethanols berücksichtigt werden.

Bei entsprechender Verfügbarkeit von Glucose wird der Ethanolverbrauch inhibiert:

i

i

E

E

oxidativ

EKS

K

KE

E

+⋅

+⋅= max,µµ (A11)


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mit µE,max maximale Wachstumsrate auf Ethanol [g/(g·h)]

E Ethanolkonzentration [g/h]

KE Monod-Konstante für Ethanol [g/L]

Ki Inhibierungskonstante (Glucose) [g/L]

Die Verwertung der Glucose bzw. des Ethanols unterliegen den Regulationsmecha-

nismen der begrenzten respiratorischen Kapazität (Vergleiche 2.1). Die verfügbare

Sauerstoffaufnahmekapazität ist beschränkt durch die vorhandene Gelöstsauerstoff-

konzentration:

Ol

l

OOKO

Oqq

+⋅=

)(2

)(2max,22

(A12)

mit qO2 verfügbare Sauerstoffaufnahmekapazität [mmol/(g·h)]

qO2,max maximale respiratorische Kapazität [mmol/(g·h)]

O2(l) Gelöstsauerstoffkonzentration [mol/L]

KO Monod-Konstante für Sauerstoff [mol/L]

Solange die respiratorische Kapazität nicht überschritten wird, d.h. wenn die Gluco-

seaufnahmerate kleiner als die zur Verfügung stehende oxidative Glucose-

verbrauchskapazität ist,

SS

O

GO qq

Mq

I

≥=⋅ ˆ2

2 ν (A13)

mit Sq̂ oxidative Glucoseverbrauchskapazität [g/(g·h)]

findet die Verwertung der Glucose in Biomasse auf oxidativem Wege statt (Stoff-

wechselweg I), d.h.

0q reduktivS = und oxidativ

SS qq = , (A14)


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Bei einer vollständigen Auslastung der respiratorischen Kapazität durch das Angebot

an zu verwertender Glucose, kommt es daneben zur Produktion von Ethanol (Stoff-

wechselweg II). Eine Verwertung des Ethanols gemäß Gleichung A3 (Stoffwechsel-

weg III) wird dabei ausgeschlossen.

Für SS qq <ˆ gilt demnach mit Glg. A10

oxidativSS

reduktivS qqq −= und S

oxidativ

S qq ˆ= (A15)

reduktivS

G

E0HC

BildungE q

M

Mq

II62⋅⋅ν= (A16)

mit BildungEq Bildungsrate von Ethanol [g/(g·h)]

Nach dem vollständigen Verbrauch der Glucose im Medium, wird das vorhandene

Ethanol als Kohlenstoffquelle verwendet, wobei die Umsetzung gemäß Gleichung

A3 abläuft.

Die folgende Tabelle 2.1 gibt eine Übersicht der für die Modellierung verwendeten

Parameter. Die Mehrzahl der Zahlenwerte wurde aus den experimentell ermittelten

Daten der Literatur [SONNLEITNER und KÄPPELI, 1986] übernommen.


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Tabelle 2.1: Übersicht der für die Modellierung verwendeten Parameter

Parameter Bedeutung Wert Einheit

NX Anteil N-Atome an Biomasse 0,15 mol/mol

HX Anteil H-Atome an Biomasse 1,79 mol/mol

OX Anteil O-Atome an Biomasse 0,57 mol/mol

νE,II stöchiom. Koeffizient 1,874 -

νCO2,I stöchiom. Koeffizient 2,47 -

νCO2,II stöchiom. Koeffizient 1,89 -

νCO2,III stöchiom. Koeffizient 0,68 -

νO2,I stöchiom. Koeffizient 2,297 -

νO2,III stöchiom. Koeffizient 1,61 -

νX,I stöchiom. Koeffizient 3,53 -

MX Molare Masse der Biomasse 0,025 g/mmol

MG Molare Masse der Glucose 0,180 g/mmol

ME Molare Masse des Ethanols 0,046 g/mmol

MO Molare Masse des Sauerstoffs 0,032 g/mmol

KE Monod-Konstante von Ethanol 0,1 g/L

Ki Inhibierungskonstante durch Glucose 0,1 g/L

KS Monod-Konstante von Glucose 0,5 g/L

KO Monod-Konstante von Sauerstoff 0,1 mg/L

µE,max maximale Wachstumsrate auf Ethanol 0,17 g/(g·h)

qO2,max maximale Sauerstoffsverbrauchsrate 8,0 mmol/g/h

qS,max Maximale Glucoseverbrauchsrate 3,5 g/(g·h)

YX/Goxidativ Ausbeutekoeffizient bei oxidativem Wachstum

auf Glucose (I) 0,49 gTS/g

YX/Greduktiv Ausbeutekoeffizient bei reduktiven Wachstum

auf Glucose (II) 0,05 gTS/g

YX/Eoxidativ Ausbeutekoeffizient bei oxidativem Wachstum

auf Ethanol (III) 0,72 gTS/g

yO2,in Sauerstoffanteil in Luft (Begasung) 0,2095 -

Übung 6 - Kontinuierliches Verfahren Stand Nov 2008 (WS2008/09)

Seite 24/24

Anhang B: Protokollblatt für Versuch 6 (batch+kontinuierlich)

Datum Uhrzeit Pumpen-

stellung:

Zentr.-

röhrchen,

leer

[g]

Zentr.-

röhrchen,

mit

Biomasse

[g]

Biomasse

[g/l]

pH Gemes-

seneOD

Verdün-

nung

errechnete

OD

Ethanol

[g]

Glucose

[g]

vor dem

Animpfen

direkt nach

Animpfen

Documents

06 Skript Kontinuierliche Fermentation_WS2008_Nov