Laboratorio de Inmunología General Semestre 2016-1

CLM 1/1 MAM

EJERCICIO EXPERIMENTAL 7

“Determinación de grupos sanguíneos”

OBJETIVO Determinar los grupo sanguíneo del sistema ABO y Rh (D) en eritrocitos de sangre de voluntarios sanos ¿CÓMO? A través de las reacciones de aglutinación directa e indirecta. INTRODUCCIÓN La determinación del grupo sanguíneo es una práctica habitual e imprescindible para la transfusión de componente hemáticos. La razón está en que el sistema inmune de algunos individuos rechaza los hematíes de otros. Esta reacción inmunológica está mediada por anticuerpos y es fácilmente visualizable in vitro mediante reacciones de aglutinación. Se conocen más de 24 grupos de antígenos eritrocitarios codificados en otros tantos loci génicos, para los cuales existen múltiples variantes alélicas. El resultado son más de 200 antígenos eritrocitarios identificables. Estos antígenos varían en su inmunogenicidad. Los más importantes a efectos transfusionales son los antígenos del sistema AB0 y los del sistema Rhesus (Rh). Sistemas ABO Los epítopos responsables son carbohidratos que aparecen en glicoesfingolípidos de membrana y también en glucoproteínas. El gen H codifica la enzima fucosil transferasa, que adiciona L-fucosa a una cadena oligosacarídica precursora. Los tres últimos azúcares de la cadena se denominan antígeno H (Figura 1). En un locus aparte está el sistema ABO, con tres alelos. El alelo A codifica una transferasa que une N-acetil galactosamina a la cadena H, mientras que el alelo B codifica una transferasa que une una D-galactosa. El alelo O no produce transferasas y por tanto no modifica la sustancia H. El azúcar unido al carbono 3 de la galactosa determina la actividad antigénica. La galactosa no acepta azúcar en el carbono 3 a no ser que haya L-fucosa unida al carbono 2.

Figura 1. Es importante destacar que estos genes son codominantes. Los individuos que expresan los alelos A y B tendrán oligosacáridos con los dos tipos de modificaciones. Así, se distinguen 4 grupos: A, B, AB y O. La importancia transfusional de estos antígenos radica en que los individuos de un grupo sintetizan

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anticuerpos frente a los oligosacáridos que no están en sus hematíes (Tabla 1). Estos anticuerpos, que se denominan isoaglutininas y que suelen ser IgM, aparecen en grandes cantidades en circulación sin necesidad de exposición previa a sangre de otros grupos. La razón parece estar en la reactividad cruzada de sustancias presentes en bacterias de la flora intestinal.

Tabla 1

Grupo sanguíneo

Genotipo Antígenos eritrocitarios

Anticuerpos séricos

A AA, AO A Anti-B

B BB, BO B Anti-A

AB AB A y B -

O OO H Anti-A, Anti-B

Sistema Rhesus (Rh) Se han identificado más de 40 antígenos del sistema Rh aunque no se sabe cuantos genes son responsables de este sistema. Son proteínas integrales de membrana con un contenido lipídico alto. D es el antígeno Rh más inmunogénico y por tanto el más importante a efectos transfusionales. La presencia de D da lugar al Rh+, mientras que la ausencia (d) da lugar al Rh-. Los anticuerpos anti D, que son IgG, aparecen en la circulación de los individuos Rh- sólo tras una exposición previa a sangre D, por ejemplo por una transfusión de hematíes o tras la gestación de un feto D. Material: - Centrífuga con rotor para tubos de 12x75. - Placa de vidrio - Aplicadores - Tubos de 10x70 mm - Pipetas Pasteur. - Antisueros anti-A, anti-AB, anti-B y anti-D. - Glóbulos rojos tipificados (A, B, AB y O) - PBS. Metodología: A)

Centrifugar la muestra sanguínea 5 min a 2000 rpm y separar el paquete celular del suero en tubos diferentes, previamente marcados.

Preparar una suspensión al 5% del paquete celular de la muestra adicionando a un tubo una gota de pipeta Pasteur del paquete celular y adicionando 19 gotas de PBS.

Rotular cuatro tubos con A, B, AB y D respectivamente, a los cuales se les agrega una gota de suspensión al 5% del paquete celular de cada tubo.

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Adicionar al tubo A dos gotas de suero anti-A, al tubo B dos gotas de suero anti-B al tubo AB dos gotas de suero anti-AB y por último al tubo rotulado D agregar dos gotas de suero anti-D.

Mezclar el contenido de los tubos y centrifugar 30 seg a 2000 rpm.

Realizar la lectura agitando suavemente el tubo para resuspender el botón formado. La presencia de cúmulos celulares indica la presencia del antígeno en la superficie del eritrocito.

B)

En el caso del suero agregar 4 gotas de este en la placa de vidrio y agregar una gota de cada una de las suspensiones de glóbulos rojos tipificados, mezclar con un agitador de madera.

Esperar entre 2 y 5 minutos para observar la aglutinación en la placa. C)

Colocar 4 gotas por separado en la placa de vidrio de la muestra problema asignada, a cada gota colocar uno de los antisuero (anti- A, anti- B, Anti-AB o Anti-D).

Mezclar cada una de las pruebas con un agitador de madera y esperar de 2 a 5 minutos para observar aglutinación en placa.

Resultados. Con las observaciones realizadas complete el siguiente cuadro y determine el grupo sanguíneo de la muestra problema.

TIPIFICACIÒN DIRECTA

A B AB D

TIPIFICACIÒN INDIRECTA

A B AB O