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1º - Padrões externos
É a forma mais utilizada de calibração. São utilizadas soluções contendo concentrações conhecidas do analito.
Formas de calibração
Os padrões são considerados “externos” pois são preparados e analisados separadamente das amostras.
Normalmente são utilizados soluções com concentrações crescentes do padrão do analito e correlacionando-se a resposta instrumental com a concentração, se obtêm uma curva de calibração.
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Formas de calibração
• A curva de calibração pode ser linear (correlação entre resposta instrumental e concentração apresenta função linear) ou polinomial (correlação entre resposta instrumental e concentração apresenta função polinomial).
Curva de calibração Curva de calibração
linear não linear
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Formas de calibração• A curva linear é mais adequada pois apresenta a mesma sensibilidade para toda a faixa de calibração. Nas curvas não lineares, a sensibilidade é função da concentração.
• Um método espectrofotometrico para a determinação quantitativa de Pb2+ em sangue forneceu uma curva de calibração linear com a seguinte equação:
Y = 0.296 X + 0.003
Sabendo que a curva foi construída na faixa de ug/L, qual a concentração de Pb em uma amostra que apresentou uma absorbância de 0.397?
Exemplo
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Formas de calibraçãoLimitação da curva de calibração normal
• A relação entre a resposta instrumental (Spadrão e Cpadrão) é
determinada quando o analito está presente na matriz da solução padrão que pode ser diferente da matriz da amostra.
• Quando se utiliza a curva de calibração normal, assumimos que qualquer diferença entre a matriz dos padrões e a matriz da amostra não afeta a inclinação da curva (sensibilidade).
• Um erro proporcional determinado é introduzido quando as diferenças entre as duas matrizes afetam a sensibilidade, como ilustrado na figura.
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Formas de calibração
Para se avaliar se as diferenças entre as inclinações das curvas são significativas, pode se aplicar os testes estatísticos F e t.
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Formas de calibração
• Quando o efeito de matriz é esperado e a matriz da amostra é conhecida, pode-se realizar uma curva por ajuste de matriz (matrix matching).
• Neste método de calibração, a matriz da amostra é adicionada nos padrões de calibração de modo a se compatibilizar a matriz e minimizar os erros.
Obs: nem sempre se consegue realizar o ajuste de matriz, pois muitas vezes é difícil obter a matriz sem o analito.
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Formas de calibração
2º - Adição de padrão
• É uma forma de calibração muito utilizada quando se tem efeito de matriz e não é possível realizar o ajuste de matriz.
• Neste método de calibração, quantidades conhecidas do analito são adicionadas a balões contendo volumes fixos da amostra. Posteriormente, o volume do balão é completado com um diluente adequado (água, ácidos diluídos, solventes orgânicos, etc.)
• As respostas instrumentais são obtidas para cada uma das soluções e se obtém a relação linear entre a quantidade de analito adicionada e a resposta instrumental.
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Formas de calibração
2º - Adição de padrão
Exemplo do preparode uma curva de
calibração por adições de padrão
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Formas de calibração
2º - Adição de padrão
• Cuidados
• Deve-se ter uma idéia da concentração do analito na amostra para se definir a alíquota da amostra a ser tomada e as adições do padrão que serão realizadas.
• A faixa linear da técnica de medida deve ser respeitada, ou seja, a soma da concentração do analito na amostra e da adição do padrão no último ponto deve ser menor que limite da faixa linear.
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Formas de calibração2º - Adição de padrão
• Cálculo
Extrapolação no gráfico
ouUtilizar a equação linear e calcular x
quando y = 0
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Formas de calibração
2º - Adição de padrão
• Como a curva de calibração por adição de padrão é construída na amostra, ela não pode ser estendida para a análise de outras amostras. Desta forma, para cada amostra deve-se construir uma curva de calibração. Este fato dificulta a aplicação deste método de calibração para análises de rotina, onde um grande número de amostras precisa ser analisado.
• O método de adições de padrão pode ser utilizado para checar a validade da curva de calibração por padrões externos (avaliação do efeito de matriz).
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Formas de calibração3º - Padrão Interno O sucesso da utilização dos métodos de calibração com padrões internos e de adições de padrão depende da habilidade do analista manusear amostras e padrões reprodutivelmente e da estabilidade do equipamento.
• Quando o procedimento não pode ser controlado de forma que todas as amostras e padrões são tratados igualmente, a exatidão e precisão do método podem ser comprometidos.
• Nos casos onde o processo analítico não é reprodutível, a padronização é possível se o sinal do analito for referenciado ao sinal gerado por outra espécie que foi adicionada em concentração fixa e conhecida em todos os padrões e amostras.
• A espécie adicionada é chamada de padrão interno e deve ser essencialmente diferente do analito.
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Formas de calibração
3º - Padrão Interno
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Formas de calibração3º - Padrão Interno• Desde que o analito e o padrão interno em qualquer amostra ou
padrão recebem o mesmo tratamento e estão sujeitos as mesmas variações, a razão dos sinais não será afetada.
• Se uma solução contem um analito de concentração CA e um padrão
interno de concentração CPI, então o sinal devido ao analito, SA, e ao
padrão interno, SPI, são: SA = kACA e SPI = kPICPI
Sendo kA e kPI, as sensibilidades do analito e do padrão internoPara se facilitar a aplicação do padrão interno, plota-se a curva de calibração relacionando-se a razão sinal do analito (SA)/sinal do padrão interno (SPI) X a concentração do analito (CA)
Para se obter a concentração do analito na amostra, basta utilizar a razão sinal do analito na amostra/sinal do padrão interno e jogar na equação da curva de calibração.
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Formas de calibração
3º - Padrão InternoCaracterísticas desejáveis:
• Ter comportamento semelhante ao do analito de interesse, de forma a estar sujeito as mesmas interferências e flutuações que o analito.
• Ser detectado simultaneamente ao analito (técnicas multielementares) e ter sinal distinto do sinal do analito. • Idealmente não estar presente na amostra (adiciona-se uma quantidade conhecida e constante) em todas as soluções (brancos, padrões, amostras).
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Exemplo
• Na determinação de anfetaminas em urina por HPLC, a efedrina foi utilizada como padrão interno. Os dois compostos apresentam tempos de retenção distintos. Os resultados obtidos para a curva de calibração, branco e amostra são apresentados abaixo:
Amostra Conc. Analito (mg/L)
Área Conc. PI (mg/L) Área
Branco 0 216 1,0 50289 Padrão 1 0,05 4529 1,0 48370 Padrão 2 0,10 11312 1,0 52360 Padrão 3 0,25 18659 1,0 42390 Padrão 4 0,50 43269 1,0 46350 Padrão 5 1,0 98562 1,0 53240
Branco amostra - 515 1,0 47235 Amostra - 63917 1,0 56759
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Métodos espectrométricos e cromatográficosFormas de calibração
1º - Padrões externos
Concentração (crescente) x Resposta Instrumental
2º - Padrões internos
C
R I
Curva de calibração
Curva de calibração com adição de matriz
Curva com ajuste de matriz
Inclinações das curvas avaliadas pelos testes estatísticos F e t.
Tcalc < Ttab as médias não diferem
Tcalc > Ttab as média diferem
Adição de Padrão
Quando não existir matriz sem o analito
Estratégia para melhorar a exatidão e precisão
PI adicionado em todas as soluções (brancos, padrões, amostras)
Resumo
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Parâmetros para calibração• Coeficiente de correlação – utilizado para
estimar o ajuste dos pontos experimentais à linha que é utilizada para estabelecer a relação linear.
i iii
ii
i
yyxx
yyxxr
2/122 ])(][)({[
)])([(
-1 ≤ r +1
19
Exemplos
R = 1
0
2
4
6
8
10
12
14
0 0.5 1 1.5 2 2.5 3 3.5 4 4.5
Concentração
Res
po
sta
inst
rum
enta
l R = -1
0
2
4
6
8
10
12
14
0 0.5 1 1.5 2 2.5 3 3.5 4 4.5
concentração
Res
po
sta
inst
rum
enta
l
R = 0.3865
0
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
0 1 2 3 4 5 6
Concentração
Resp
osta
in
str
um
en
tal
Em química analítica normalmente se trabalha com valores de r > que 0,99 (em módulo)
20
Regressão linear – Método dos Mínimos Quadrados
• Modelo simplificado:– Assume-se que as quantidades ou concentrações das
amostras de calibração são tomadas como “verdadeiras” e isentas de erro, ou então admite-se que os erros aleatórios de x são desprezíveis em relação aos de y. Nessas condições, deve-se usar a função de calibração:
y = Bx + Axx + ey
- Assume-se que os erros (s) são constantes em todos os pontos da calibração (Homoscedasticidade)
21
22
Regressão linear – Método dos Mínimos Quadrados
Calcula-se:
• A inclinação: A = Qxy/Qxx
• O intercepto: B = y – Ax• O desvio padrão da regressão (desvio
dos resíduos):
2/)( 2 NQAQS xxyyr
23
Calculando os termos:
N
xxxxiQ iixx
222 )(
)(
N
yyyyiQ iiyy
222 )(
)(
N
yxyxyyixxiQ iiiixy ))((
24
• Desvio padrão da inclinação:
• Desvio padrão do intercepto:
xx
rA
Q
sS
222 )(/)( iiirB xxNxsS
Regressão linear – Método dos Mínimos Quadrados
25
Regressão linear – Método dos Mínimos Quadrados
• Os desvios padrão podem ser utilizados para estabelecer o intervalo de confiança que contem a verdadeira inclinação e o verdadeiro intercepto:
βA = A ± tsA
βB = B ± tsB
Podem ser utilizados também para comparar curvas no estudo de efeito de matriz.
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Calculando...xi yi yi
2 xyi xi2
0 2,1 4,410 0
2 5 2510 4
4 9 8136 16
6 12,6 158,875,6 36
8 17,3 299,3138,4 64
10 21 441210 100
12 24,7 610,1296,4 144
xi = 42 yi = 91,7 yi2
=1619,6xiyi =
766,4
(xi2) = 364
28
Calculando....
N
yxyxyyixxiQ iiiixy ))((
N
xxxxiQ iixx
222 )(
)(
N
yyyyiQ iiyy
222 )(
)(
i iii
ii
i
yyxx
yyxxr
2/122 ])(][)({[
)])([(
29
Pelo Excel....
y = 1,9304x + 1,5179
R2 = 0,9978
0
5
10
15
20
25
30
0 2 4 6 8 10 12 14
Série1
Linear (Série1)