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j o u r n a l h a s p g in: w w w. e l s v i e r. c o m / l o c a t e / l w t

Nota de Investigacin

Composicin de carotenoides pigmento, contenido de polifenoles y la actividad antioxidante de extractos de repollo chino de color naranja

Mitsuru Watanabe un, *, Keiichi Musumi b, Junio Ayugase un

a Centro Nacional de Investigacin Agrcola para la Regin de Tohoku, 4 Akahira, Shimokuriyagawa, Morioka, Iwate 020-0198, Japn

b Estacin de Cra Takii Plant, 1360 Hari, Konan, Shiga 520-3231, Japn

a r t i c l e i n f o

Historia del artculo:

Recibido 04 de octubre 2010 Recibido en forma revisada 22 de marzo 2011 Aceptado 26 de abril 2011

Palabras clave:

Col china

Los carotenoides

Prolycopene

Polifenoles

La actividad antioxidante

a b s t r a c t

Se investig la composicin de pigmento carotenoide en la col china de color naranja (OC) (Brassica rapa; cultivar (cv), Orange reina) y (normal) de col china (NC) (B. rapa; cv, Yuki),_ y evaluado las actividades antioxidantes de los extractos de carotenoides y compuestos fenlicos. Aunque los principales pigmentos de carotenoides en NC son la lutena y b-caroteno, OC contena 7Z, 9Z, 7'Z, 9'Z tetra-cis-licopeno (prolycopene) y fitoeno como los principales pigmentos carotenoides junto con bcaroteno. El contenido de carotenoides total de extractos de OC fue dos veces ms alta que los extractos de NC. El 2,20-Azino-Bis (-6-sulfnico 3-etilbenzotiazolina cido) (ABTS) actividad antioxidante con extractos de carotenoides de OC [169 _ 2 mmol Trolox equivalentes / 100 g de peso seco. (DW) (promedio _ SD)] fue significativaficativamente mayor que los extractos de carotenoides de NC (132 _ 7 mmol Trolox equivalentes / 100 g DW) (P < 0.001). Por otra parte, los fenoles totales de extractos metanlicos de OC (387 _ 11 mg / 100 g DW) fue significativaficativamente mayor que los extractos metanlicos de Carolina del Norte (263 _ 2 mg / 100 g DW) (P < 0,001), y el radical anin superxido-barrido () actividades de tipo SOD de extractos metanlicos de OC (70 _ 2%) fueron tambin ms altos que los extractos metanlicos de NC (61 _ 2%) (P < 0.001). Estos resultados sugieren que OC contiene grandes cantidades de compuestos carotenoides y fenlicos con actividad eliminadora de radicales en comparacin con NC.

2011 Elsevier Ltd. Todos los derechos reservados.

1. Introduccin

Col china (Brassica rapa) es un vegetal comn en Japn, y es rico en vitamina C y minerales como el potasio, calcio, magnesio y zinc. Composicin de pigmentos de carotenoides en muchos vegetales del gnero Brassica, como el brcoli, las coles de Bruselas, col blanca, col roja, col rizada, y cauliflower han sido investigados ( Podse dek, 2007), Y la lutena y bcaroteno fueron reportados como los carotenoides dominantes. Col china tambin contiene lutena y bcaroteno como el principal pigmento carotenoide ( Testamentos y Rangga, 1996); el contenido de bcaroteno comprendido entre 0,01 y 0,03 mg / 100 g de peso fresco ( Singh, Upadhyay, Prasad, Bahadur, y Rai, 2007). Repollo de color naranja china (OC), que fue producido por el cruce de la col y el nabo (B. rapa) y posterior retrocruzamiento chino, tiene una caracterstica de cabeza interior de color naranja intenso. Esto sugiere que la composicin de pigmento de OC difiere de la de col china (normal) (NC). Los pigmentos vegetales como carot-enoid y flcompuestos avonoid (que contienen antocianinas) poseen actividad antioxidante frente a diversas especies reactivas del oxgeno. En

Autor para correspondencia. Tel. / Fax: 81 19 643 3513. Direccin de correo electrnico: wata@affrc.go.jp (M. Watanabe).

0023-6438 / $ e see front matter 2011 Elsevier Ltd. Todos los derechos reservados. doi: 10.1016 / j.lwt.2011.04.010

breves, pigmentos carotenoides pueden apagar el oxgeno singlete (1O2) ( Conn, Schalch, y Truscott, 1991; Mascio, Kaiser, y Sies, 1989), y flcompuestos avo-noid como antocianinas y flavonol poseen actividad (similar a SOD) anin superxido-radical compactacin ( Watanabe, 2007) y exhiben inhibicin de la peroxidacin de lpidos ( Fremont, Gozzelino, Franchi, y Linard, 1998). En este estudio, el carotenoide Se analizaron los pigmentos en NC y OC, y se evaluaron las actividades antioxidantes de los extractos de carotenoides y compuestos fenlicos.

2. Materiales y mtodos

2.1. Col y preparacin del polvo chino

NC (cv, Yuki)_ y OC (cv, Orange reina) se cultivaron usando el mismo mtodo de cultivo de tnel en el mismo perodo. Despus de ajustar las plantas de vivero, se cubrieron con polietileno film, y cultivado de febrero a junio de 2008 en la Planta Takii Estacin de Cra. Tres jefes de NC y OC, que eran de la media del peso en fresco, se recolectaron y almacenaron a _20 _C hasta su uso. Para preparar polvos de coles chinas, cabezas enteras se liofilizaron y tierra individualmente utilizando un molino de muestra vibrante. Adems, se utiliz el interior de la cabeza de color naranja de otra planta

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para preparar polvo de la misma manera como cabezas enteras con el fin de investigar la composicin de pigmento carotenoide.

2.2. Preparacin de extractos de carotenoides

Extractos de carotenoides de NC o OC se prepararon de acuerdo con el mtodo general de Takaichi, Mimuro, y Tomita (2006) con menor modificationes. En breve, se extrajeron 5 g de polvo de NC o OC con 100 ml de diclorometano: solucin de metanol (2: 1, v / v) y centri-fuged a 17.000 _ se recogieron g, y el sobrenadante. Adems extraccin de pigmentos carotenoides a partir del residuo se realiz dos veces con 100 ml de diclorometano. Los extractos combinados se fifiltra a travs de un 1.0-mm Polytetrafluoroethylene (PTFE) de membrana fifiltro (JAWP04700; Nihon Millipore, Tokio, Japn), y luego 100 ml de hexano y un volumen igual de NaCl al 5% se aadieron a la fifiltrado. La mezcla se agit lentamente, y despus se dej separar en dos capas. El sobrenadante se evapor a sequedad bajo presin reducida, y el precipitado se disolvi en 50 ml de ter dietlico. Un volumen de 5 ml de 60% (w / v) de KOH se aadi a la solucin, y la fase de aire se sustituye por gas N2. Saponifide cationes se llev a cabo por debajo de 10 _C durante 16 h bajo condiciones de oscuridad. Aunque el tiempo necesario para saponifide cationes en el experimento era ms largo que el tratamiento habitual (2e3 o 4e6 h a temperatura ambiente) ( Khachik, Beecher, Goli, y Lusby, 1992; Takaichi et al., 2006), no haba cativafidiferencias signifi en el contenido de carotenoides entre la savia-onificado y unsaponifimuestras cado. Solucin de ter dietlico: Un volumen igual (50 ml) de hexano (1: 1, v / v) y 5% de NaCl se aadi a la saponificacinfisolucin cado. La capa de disolvente orgnico se recogi y se trat con 5% de NaCl y despus se evapor hasta sequedad bajo presin reducida. El residuo se disolvi en un pequeo volumen de ter dietlico y se almacen a _80 _C hasta su uso. De este modo, se prepararon tres extractos de NC o OC para el anlisis de pigmentos carotenoides.

2.3. Anlisis de pigmentos de carotenoides

Segn lo informado por Rodrguez-Bernaldo de Quirs y Costa (2006), Ionizacin qumica a presin atmosfrica tcnica (APCI) LC-MS se utiliza con frecuencia para el anlisis de carotenoides. Por lo tanto, se analiz la composi-cin de extractos de carotenoides de NC o OC utilizando un Pulsar-i sistema LC-MS QSTAR (Applied Biosystems, Foster City, CA, EE.UU.) con el modo de iones positivos de la APCI y un sistema de HPLC equipado con una fotodiodo detector de matriz. Segn el mtodo de HPLC de anlisis de carotenoides por Kanamaru, Wang, Abe, Yamada, y Kitamura (2006), acetonitrilo y etanol se utilizaron como fases mviles. Las condiciones para LC-MS fueron las siguientes: temperatura de la fuente de iones APCI, 450 _C; columna, ODS Simetra 5C18 (4.6 _ 250 mm) (Waters, Milford, MA, EE.UU.); columna temperamento-ratura, 35 _C; disolvente, acetonitrilo: etanol 8: 2; flvelocidad de flujo, 1 ml / min; deteccin de matriz de fotodiodos, 450 y 280 nm (espectro, 200e600 nm). Lutena Estndar, b-caroteno, y fitoeno, que se utilizaron para la identificacinficacin y cuantificacin de pigmentos carotenoides, se obtuvieron de Funakoshi (Tokio, Japn).

2.4. Preparacin de extractos metanlicos y la determinacin de los fenoles totales de los extractos

Polvos de NC o OC (0,2 g cada uno) se extrajeron con 10 ml de metanol a 75 _C bajo reflux durante 1 h. El extracto se evapor hasta sequedad bajo presin reducida, y el precipitado se dis-resuelto en 0,2 ml de metanol. Tres extractos de NC o OC se prepararon para analizar el contenido de polifenoles y para determinar la actividad de tipo SOD.

Los fenoles totales de extractos de NC y OC se determin por el mtodo de FolineMtodo Denis ( AOAC International, 1995) Utilizando D-() -catechin Como un estndar para la calibracin.

2.5. ABTS actividad de los radicales de captacin

ABTS actividad de los radicales de captacin se midi mediante la modificacin del mtodo descrito por Roberta, Pellegrini, Pannala, Yang, und Arroz-Evans (1999). En resumen, 0,1 g de muestra pulverizada era extrac-ted con 5 ml de diclorometano y se centrifug a 11.000 _ se recogi g durante 10 min, y el sobrenadante. El sobrenadante se evapor a sequedad bajo presin reducida, y el precipitado se disolvi en acetona: solucin de etanol (1: 1, v / v). Tres extractos se prepararon para determinar ABTS actividad antioxidante con. Un 50 amL alcuota de etanol se aadi a un volumen igual de extracto en cada pocillo de una microplaca de 96 pocillos, y la reaccin se inici aadiendo 50 mL de solucin de radical ABTS (0,4 mM de ABTS y peroxodisulfato potsico 0,15 mM). Despus de 10 min a temperatura ambiente, la absorbancia a 620 nm se midi utilizando un lector de microplacas. ABTS actividad de los radicales de captacin del extracto se expres como Trolox (SigmaeAldrich, St. Louis, EE.UU.) equivalentes.

2.6. Actividad similar a SOD

Medicin de la actividad de tipo SOD se realiz por el mtodo de ensayo WST utilizando un kit de SOD-WST (Dojindo, Kumamoto, Japn) que contiene la sal de tetrazolio soluble en agua, 2 (4-yodofenil) 3 (4-nitrofenil) - 5 (2,4 disulphophenyl) 2H-tetrazolio, sal mono-sodio (WST-1) como se describe previamente ( Watanabe, 2007). Actividades de SOD-como se ensayaron de acuerdo con el fabricante'instrucciones s utilizando extractos metanlicos a partir de polvos de NC o OC (2 mg). Actividad similar a SOD se expres como el porcentaje de inhibicin de formacin de colorante formazn soluble en agua.

2.7. Estadsticas

Estadsticamente significativafidiferencias signifi entre los anlisis se evaluaron mediante pruebas t de Student utilizando el software Prism 5 (GraphPad Software Inc., San Diego, CA, EE.UU.). Los datos se expresan como media _ SD (n 3). Las diferencias en P < 0,05 fue considerado significantefiperalte.

3. Resultados y discusin

El cromatograma de HPLC de los extractos de carotenoides de NC se muestra en la Higo. 1A. Dos grandes picos en el cromatograma de Carolina del Norte fueron identificadosfied como lutena (P1) ( Higo. 2A) y b-caroteno (P2) ( Higo. 2B). Los datos espectrales de P1 y P2 fueron los siguientes: Lmax de PDA, P1 (420, 443, y 472 nm), P2 (425, 450, y 477 nm); pico de ion molecular protonado, P1 (m / z 569,4387 (M H), C40H57O2), P2 (m / z 537,4475 (M H), C40H57) del espectro MS. Estos datos fueron consistentes con los de la lutena estndar y bcaroteno. Higo. 1B muestra el cromatograma de HPLC de los extractos de carotenoides de la cabeza interna de OC, que es de color naranja intenso. La cabeza OC contena dos principales pigmentos carotenoides (P3 y P4). P4 fue identified como phy-Toene ( Higo. 2C) sobre la base de los datos espectrales de Lmax de PDA (280 nm) y frmula de composicin (C40H64) derivadas de un pico de ion molecular protonado (m / z 545.5074, (M H)) Del espectro MS. Estos datos fueron consistentes con los de una fitoeno estndar. P3 compuesto se dedujo que 7Z, 9Z, 7'Z, 9'Z tetra-cis-licopeno (prolycopene) ( Higo. 2D) sobre la base de Lmax de PDA (414, 436, y 463 nm), y la frmula de composicin (C40H56) derivado de un pico de ion molecular protonado (m / z 537.4462, (M H)) Del espectro MS. Debido a que el pigmento principal carotenoide en tomate mandarina es prolycopene (30%e50% de los carotenoides total) ( Isaacson, Ohad, Beyer, y Hirschberg, 2004), La identificacinficationes de P3 compuesto se realiz mediante comparacin de los datos espectrales con prolycopene en el cromatograma de HPLC para el tomate mandarina (lnea, LA3183) (datos no mostrados). Los frutos de tomate mandarina prolycopene-accu mular debido a la falta de carotenoides funcional

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Higo. 1. cromatogramas de HPLC (450 nm y 280 nm) de extractos de carotenoides de las coles chinas. A, NC (450 nm); B, de color naranja cabeza interna del OC (450 nm); C, de color naranja cabeza interna del OC (280 nm); D, toda la cabeza de OC (450 nm); E, toda la cabeza de OC (280 nm). *Longitud de onda de deteccin de pico.

isomerasa (CrtISO) que convierte poli-cis-licopeno a todo-trans-licopeno ( Isaacson, Ronen, Zamir, y Hirschberg, 2002). Prolycopene no se ha detectado en otros variedades de col china hasta la fecha. Se informa sobre la tasa de absorcin de prolycopene administrado por va oral en los seres humanos a ser ms alta que la de todo-trans-licopeno ( Unlu, Bohn, Francis, Clinton, y Schwartz, 2007), Lo que sugiere que se espera pigmentos carotenoides en OC poseer ms actividades in vivo, como la actividad antioxidante, que los de NC. Higo. 1C

muestra el cromatograma de HPLC de un extracto de toda la OC incluyendo las hojas de color verdes exteriores. Este resultado sugiere que las hojas de color verdes exteriores que contienen pigmentos de clorofila tambin poseen bcaroteno adems de prolycopene y fitoeno. Adems, este resultado sugiere que OC contiene una enzima funcional CrtISO en las hojas exteriores que convierte la forma cis de pigmentos carotenoides, tales como prolycopene, a la forma trans, lo que resulta en la produccin de bcaroteno. Aunque el

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OH

HOA

B

A

B

C

D

Higo. 2. Estructuras de los principales pigmentos carotenoides en OC y NC. A, lutena; B, bcaroteno; C, prolycopene (7Z, 9Z, 7'Z, 9'Z tetra-cis-licopeno); D, fitoeno.

Higo. 4. Total fenoles y actividades de tipo SOD de extractos metanlicos de OC y NC. A, fenoles totales; B, la actividad de tipo SOD. Los datos son la media _ SD de tres-mentos expe independientes. ***P< 0.001.

cabeza interior de color naranja contena prolycopene, no contena ismeros trans de los pigmentos carotenoides, como el licopeno y bcaroteno. Estos resultados sugieren las siguientes posibilidades para acumulacin prolycopene en el interior de la cabeza de OC. Una posibilidad es una mutacin por delecin en el gen CrtISO como se encuentra en el alelo de tomate tangerinemic. Otra posibilidad es una delecin de 348 pb en el promotor de CrtISO, que suprime su expresin en el fruto del tomate tangerine3183 ( Isaacson et al., 2002). Investigaciones

A

B

Higo. 3. composicin de carotenoides y ABTS actividades antioxidante con extractos de carotenoides de OC y NC. Una composicin, de carotenoides; B, ABTS actividad de los radicales de captacin; a, bcaroteno; b, prolycopene; c, fitoeno; d, lutena. Los datos son la media _ SD de tres experimentos independientes. ***P< 0.001.

sobre las razones de la acumulacin de prolycopene en cabezas internas del OC estn en curso. La composicin de pigmento carotenoide en la cabeza OC sugiere que el color naranja se atribuye a la abun-dance de prolycopene.

Los porcentajes de los principales pigmentos de carotenoides en OC fueron los siguientes: prolycopene; 48%, bcaroteno; 23%, y fitoeno; 29%. El contenido de carotenoides total de extractos de OC fue dos veces ms alta que los extractos de NC ( Higo. 3A). Higo. 3B muestra actividad de los radicales ABTS-compactacin de los extractos de carotenoides. ABTS actividad antioxidante con extractos de OC (169 _ 2 mmol Trolox equivalentes / 100 g DW) fue significativaficativamente mayor que los extractos de NC (132 _ 7 mmol Trolox equivalentes / 100 g DW) (P < 0,001), lo que sugiere que OC contiene grandes cantidades de compuestos carotenoides con actividad de los radicales ABTS de captacin.

Higo. 4A muestra los fenoles totales de extractos metanlicos de NC o OC. Los fenoles totales de extractos metanlicos de OC (387 _ 11 mg / 100 g DW) fue mayor que los extractos metanlicos de NC (263 _ 2 mg / 100 g DW) (P < 0.001). Adems, la actividad de tipo SOD de los extractos metanlicos de OC (70 _ 2%) fue tambin ms alto que los extractos metanlicos de NC (61 _ 2%) ( Higo. 4B) (P < 0.001). Estos resultados sugieren que OC tiene ms compuestos fenlicos con actividad SOD radical de captacin de NC. Sin embargo, los de HPLC cromatogrficas-gramos de NC y OC no eran significativamente diferentes (datos no mostrados). Las investigaciones para determinar las composiciones de compuestos fenlicos en NC y OC son tambin en curso.

El contenido de carotenoides y polifenoles de las coles chinas podran verse afectados por las condiciones de cultivo y variedades. Por tanto, es necesario investigar los efectos de tales condiciones en el contenido de compuestos fenlicos y carotenoides y sus actividades antioxidantes en NC y OC.

Agradecimientos

Los autores agradecen tomate Centro de Recursos Genticos (CA, EE.UU.) para el suministro de semillas de mandarina tomate (LA3183) (Solanum Lyco-persicum L.).

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