Histološka tehnika. Proliferacija i diferencijacija ćelija. Matične ćelije odraslih.

• Histologija – Grčki histo – tkivo, tkanje logos - proučavati – Ime je dao – Carl Mayer 1819. godine, – Imenom je označio dio anatomije koji izučava

strukturu organa

• Danas se histologijom naziva biološka disciplina koja izučava organizaciju, strukturu i ulogu tkiva, odnosno, proučava tkiva organizma i načine na koje se ta tkiva raspoređuju da bi izgradila organe.

Tkiva su tokom historije različito grupisana Prema izgledu i rasporedu ćelija: Morfološka klasifikacija Prema ulozi koju obavljaju: Fiziološka podjela Na osnovu hemijskog sastava: Hemijska klasifikacija Prema embrionalnom porijeklu: Embriološka – ontogenetska podjela Prema historijskom porijeklu: Filogenetska podjela

• Danas se razlikuju četiri osnovna tkiva: • Epitelno • Vezivno

vezivna tkiva u užem smislu

- masno tkivo - krvno tkivo- limfno - potporna tkiva

• Mišićno • Nervno

• Svako pomenuto tkivo je građeno od nekoliko vrsta ćelija

• Mala veličina ćelije i komponenata ekstracelularnog matriksa, uslovljavaju upotrebu mikroskopa u proučavanju histologije, a to zahtijeva pripremu tkiva za posmatranje

Priprema tkiva za posmatranje pod mikroskopom

• Histološki isječak se može posmatrati pod mikroskopom samo ako je toliko tanak da kroz njega mogu prolaziti svjetlosni zraci

• Neki se objekti mogu posmatrati i bez rezanja (membrane životinja, mezenetrijum, rep punoglavca, obraz hrčka, itd.)

• Najčešće se prave tanki presjeci – mikrotom

• Idealan histološki preparat treba biti sačuvan tako da tkivo na predmetnom staklu ima istu građu i molekularni sastav kakav je imalo u organizmu

• To se teorijski može postići, ali je u praksi teško izvodljivo

Fiksacija

• Histološki preparat može biti privremen i trajan.

• Privremeni (nativni) omogućava posmatranje uzorka u svježem stanju (živom).

• Npr. drvenim štapićem se ljušte površne ćelije epitela sluznice usne šupljine

• Sadržaj se rastvori u kapljici destilovane vode ili fiziološkog rastvora

• Ringer: – 8 g NaCl, – 0,2g KCl, – 0,2g CaCl2,

– 0,2g NaHCO3 i od 1000 ml destilovane vode) ili prirodnih medija (krvni serum, amnionska tekućina).

• Odmah nakon uzimanja uzorka tkiva iz organizma mora se isto fiksirati da bi se zaustavila intracelularna enzimatska degradacija koja bi normalno uzrokovala putrefakciju (truljenje) tkiva i destrukciju celularnih detalja.

• Određeni kemijski fiksativi, kao što je pikrinska kiselina, zaštićuje tkivo, ali takođe denaturiše proteine

• Ovi tipovi fiksativa unose alteracije (oštećenja) u intermolekularnoj organizaciji koje se ponekad vide na svjetlosnom mikroskopu, ali su tolerantne u slučaju gdje rezolucija nije osobito važna

• Nedostatak ovakve fiksacije je što onemogućava primjenu histokemijskih metoda, jer su denaturisani proteini izgubili normalnu molekularnu funkciju.

• Češće se upotrebljava formalin – koncentrirana solucija formaldehida, koja uzrokuje manje promjene u tkivu jer, generalno, ne denaturiše proteine niti ozbiljno oštećuje tkivo i celularne strukture

• Radije se upotrebljava glutaraldehid koji međusobno uvezuje proteine preko amino grupa, a stepen denaturacije proteina je slabiji u odnosu na formalin.

• U većini slučajeva on zadržava antigenost tkiva tako da se mogu provesti imuno – histokemijske studije da bi se lokalizovali pojedini celularni proteini protiv kojih su formirana antitijela.

• Da bi se sačuvala cjelokupna enzimska aktivnost tkiva mora se naglo zamrznuti u tečnom azotu ili helijumu i dalje obrađivati u kriostatu.

• Fiksacija, prema tome, zadržava stanje struktura uzorka približno onom koje je bilo u normalnim životnim okolnostima.

• Fiksativi izazivaju trenutno odumiranje ćelija što spriječava aktiviranje autolitičkih, posmortalnih promjena.

• Naime, fiksativi procesom koagulacije i precipitacije stabiliziraju proteinsku osnovu (pa i enzime), blokiraju rast mikroorganizama i pripremaju tkivo za bojenje vezanjem istih u uzorku.

• Za uspješnu fiksaciju količina uzorka ne treba prelaziti 1 cm, a trajanje fiksacije ovisi o poroznosti tkiva, temperaturi, pH i koncentraciji fiksativa

• Najčešće se upotrebljavaju kombinacije, tj. složeni fiksativi (soli i kiseline hroma i žive, alkoholi, sirćetna i pikrinska kiselina-Bouinov rastvor). (druge i drugačije)

• Pošto tkivo mora biti dovoljno tanko da propusti svjetlost za mikroskopiranje na svjetlosnom mikroskopu, mora se izrezati na tanke rezove ~ 10 µm.

• Rezanje zahtijeva da tkivo ima potporu, inače će se komprimirati tokom rezanja mikrotomskim nožem.

• Zbog toga se tkivo uklapa u parafin ili epon (vještačka smola koja je mnogo tvrđa i omogućava rezanje na debljinu oko 0,1 µm za potrebe elektronske mikroskopije).

• Prvo se tkivo mora dehidrirati pošto voda u tkivu sprječava prodiranje parafina ili epona.

• Dehidracija se obavlja uranjanjem tkiva u seriju alkohola rastuće koncentracije (50, 60%, apsolutni) ako će se tkivo kalupiti u parafin.

• Nakon alkohola slijedi xilol, benzen (sredstva za izbistravanje) pošto se oni miješaju sa parafinom (alkoholi se ne miješaju).

• Ako se tkivo uklapa u epon –smole, nakon alkohola slijedi propilen oxid koji se miješa sa eponom.

• Uzorak prolazi seriju posuda sa otopljenim parafinom u termostatu da bi se u čistom parafinu formirao blok koji se obradi i pripremi za pričvršćivanje na mikrotom

• Uklopljeno tkivo se reže na mikrotomu.

• Pošto se najčešće koriste vodeni rastvori boja, rezovi se moraju osloboditi parafina (deparifinizacija) u ksilolu, a potom hidriraju u seriji alkohola opadajuće koncentracije.

• Rez se montira na predmetno staklo, nakon čega slijedi bojenje tkiva.

• Pošto je refraktivni index različitih tipova ćelija i njihovih intracelularnih organela veoma približni moraju se zato obojiti bojama da se poboljša njihovo razlikovanje i da se učine vidljivim za mikroskopičara.

• Boje apsorbuju svjetlost u dijelu vidnog spektra i dopuštaju komplementarnoj boji da prođe kroz tkivo (npr. plava boja apsorbuje žutu svjetlost i prenosi plavu boju na svaki element tkiva na koji se boja vezala).

• Mnoge boje se vežu za ćelije elektrostatski, tj. vežu se boja i ćelijska komponenta suprotnog naboja.

• Iz tog razloga kisele i bazne boje različite obojenosti se obično upotrebljavaju u kombinaciji da bi obojile supstance u ćeliji sa različitom izoelektričnom tačkom što će imati različit afinitet za ove dvije boje u odnosu na punjenje, te će konsekventno biti različite i obojenosti

• Treba napomenuti da proteini u ćeliji i tkivima imaju neutralno punjenje pri izoelektričnoj tački.

• Iznad izoelektrične tačke proteini će biti negativno nabijeni, a ispod te tačke pozitivno nabijeni.

• Prema tome, kationske boje (pozitivno punjenje) će biti vezane za negativno nabijene celularne supstance, dok će anionske boje (negativno nabijene) biti vezane za pozitivno nabijene supstance.

• Dio boje koji apsorbira svjetlo i doprinosi obojenosti boje je hromofora.

• To je dio jonizirajuće strukture koja je u širokom spektru pH i bazna (metilen blue) ili kisela (eozin).

• Bazična boja je sastavljena od kationske hromofore i neobojenog kiselog radikala; kisela boja sadrži anionsku hromatoforu i neobojen bazni radikal.

• Pošto je metilen blue plav, a eozin crveno-narandžast, tkivne komponente različitog punjenja će obojiti različite boje ako su te dvije boje upotrijebljene

• U tom slučaju negativno nabijene tkivne komponente se boje plavo i označene su kao bazofilne, jer se boje bazičnom bojom.

• Pozitivno nabijene tkivne strukture obojene crveno su označene acidofilnim, jer se boje kiselim eozinom (anionskom bojom).

• Pod uslovima pH u kojima se obavlja bojenje primjeri acidofilije su: kolagen, hemoglobin eritrocita, mitohondrije.

• Primjer bazofilije uključuje nuklearni hromatin i ribosome, ekstracelularni matrix hrskavice (zbog visoke koncentracije negativno nabijenih sulfatnih grupa proteoglikana).

• Hematoxilin, kao opće upotrebljavana boja, mora biti oksidovan do hemateina prije upotrebe, a sposobnost bojenja stiče vezanjem za teške metale kao što je željezo.

• Željezo se veže za negativno nabijene tkivne komponente.

• Određene boje, kao što je toluidin plavo se zovu metahromatske, jer je preparat obojen različito, ako je grupisan ili dispergovan.

• Toluidin blue je bazna boja koja se veže za negativno nabijene tkivne komponente bojeći ih plavo ako su te komponente dispergovane.

• Ako se veže za polianione kao što je heparin ili nukleoprotein, koji imaju gusto raspoređene negativne naboje, toluidin se nakuplja u polimeru koji apsorbuje svjetlost nižih talasnih dužina emitirajući crvenkasto – purpurnu svjetlost umjesto plave.

• Prema tome, ako tkivo sadrži gusto zbijene anionske grupe obojiće se crvenkasto umjesto plavo.

• Nakon završenog bojenja uzorak se pokriva pokrovnom ljuspicom uz pomoć smole (kanada balzam) koja se stvrdne i sprečava uticaj vanjskih faktora na obojeni rez tj. produžava vijek trajanja trajnim histološkim preparatima.

• Na lijevoj strani predmetnog stakla se nalijepi etiketa sa neophodnim podacima o tom rezu.

MIKROSKOPIJA

• Svjetlosni mikroskop je optička sprava pomoću koje možemo vidjeti sliku predmeta kojeg posmatramo pod mnogo većim vidnim kutom, nego što je onaj, pod kojim bi vidjeli isti taj predmet prostim okom u normalnoj vidnoj daljini.

• Mikroskop je građen od mehaničkog i optičkog dijela.

• Mehanički dio služi samo za uklapanje optičkih dijelova i za namještanje preparata koji želimo promatrati, a sastoji se od:

• postolja sa drškom• tubusa• stolića• makro i mikrovijka• revolvera objektiva

• Optički dio mikroskopa sastoji se od tri leće postavljene jedna iza drugeKondenzor lećaObjektiv lećeOkular lećeSprave za osvjetljavanje

preparata

• Objektiv snima samo jednu optičku ravan preparata i to jasno samo središnje dijelove koje izoštravamo.

• Crtanjem se preparat može predstaviti u prostoru u cijelom vidnom polju i u raznim dubinama upotrebom mikrovijka.

• Fluorescentni mikroskop omogućava molekulama, koje su obilježene fluorescentnim markerima, da budu locirane u ćeliji

• Fazno kontrastni mikroskop - iako se većina tkivnih rezova boji različitim bojama da bi se ćelije i njene organele učunile upadljivijim i različitim jedne od drugih, specijalni par kondenzora i objektiva čine bojenje nepotrebnim.

• FKM - pojačava razliku refraktornog indexa između celularnih organela dodajući različit kontrast različitim organelama i povećavajući intenzitet svjetla koje prolazi kroz područja sa slabijim refraktornim indexom.

• Elektronski mikroskop (transmisijski)

Scanning EM

Freeze-fracture tehnika (smrznuto lomljenje) ulazi u široku primjenu

• Uzorci tkiva se zamrznu u tečnom azotu, a potom frakturiraju (lome) oštricom; nastala frakturna površina se replicira u visokom vakuumu sa platinom (pod uglom 45˚) i ugljikom.

• Sjenčenje platinom stvara efekat sličan padanju snijega tjeran jakim vjetrom.

• Platina, kao snijeg, se nakuplja na strani uzvišenja okrenutoj pravcu "oluje", a nedostaje na udaljenoj, drugoj strani.

• Suprotno, bliska strana depresije će biti prazna dok će se platina natrpati na suprotnoj strani.

• Nakon što se tkiva uklone, platinska replika se može posmatrati transimisionim EM.

KAKO I ZAŠTO TREBA CRTATI HISTOLOŠKI PREPARAT

• Crtanje je pomoćna radnja koja omogućava da se preparat prikaže na slici onakav kakav se vidi pod mikroskopom.

• To pomaže posmatraču da preparat prouči do tančina, da zapazi svaki djelić na njemu, jer ga na slici mora predstaviti tačno – koliko je to moguće.