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1 INTRODUÇÃO
Os analgésicos e antitérmicos (AA) estão entre os medicamentos mais
utilizados no ocidente (MANOUKIAN e CARSON,1996; HOLLANDER, 1994). No
cenário terapêutico nacional, a dipirona e o paracetamol são os mais consumidos. A
dipirona é o principal analgésico da terapêutica brasileira ocupando 45% do mercado,
o paracetamol 35% e o AAS em terceiro lugar, com 20% (GAZETA MERCANTIL,
22/05/2001).
Os AA constituem importante causa de hospitalização (2% a 9%),
prolongamento das internações e aumento de gastos, além de serem responsáveis
também por um grande número de intoxicações (HUIC et al.1994; FIGUERAS et
al.1994). De 1993 a 1996, foram registrados no Brasil, pelo Sistema Nacional de
Informações Tóxico-Farmacológicas (SINITOX), 217.512 casos de intoxicação
humana (BORTOLETTO e BOCHNER,1999).
De acordo com dados da OMS, os hospitais gastam de 15% a 20% de seus
orçamentos para lidar com os problemas relacionados ao mau uso de medicamentos,
que podem levar a importantes agravos à saúde dos pacientes, com relevantes
repercussões econômicas e sociais e sendo considerado atualmente um importante
problema de saúde pública (BORTOLETTO e BOCHNER, 1999).
O paracetamol, amplamente utilizado no Brasil, é um fármaco pertencente à
classe dos antiinflamatórios não-esteroidais (AINEs), usado principalmente como
analgésico e antipirético, apresenta uma baixa atividade antiinflamatória, mas tem
provado eficácia clínica no alívio temporário de dores leves a moderadas associadas
a resfriado comum, dor de cabeça, dor de dente, dores musculares, dor nas costas,
dores leves de artrite, cólicas menstruais e redução da febre, sendo eficaz em bebês,
crianças e adultos (FLOWER E VANE, 1972). Um dos mecanismos atualmente
descritos sobre a enzima cicloxigenase (COX) pode estar relacionado à inibição do
radical livre tirosil, presente na prostaglandina endoperóxido sintase (PGES).
(KULMACZ et al. 1991). No entanto, este fármaco em doses elevadas pode
desenvolver danos hepáticos e/ ou renal e óbito em três a cinco dias após a ingestão
(MITCHELL et al.1973; BLACK, 1984).
As pirazolonas são amplamente utilizadas em muitas partes do mundo,
incluindo o Extremo Oriente, África e América do Sul (CHAN et al. 1996) como
analgésico, antitérmico, antiinflamatório, uricosúrico, antiartrítico e antioxidante,
2
alcançando um volume de venda anual em torno de kilotoneladas, principalmente a
dipirona, propilfenazona (isopropilantipirina) e fenilbutazona (BENTUR et al. 2004).
Em particular a dipirona, constitui o agente analgésico e antipirético mais utilizado no
Brasil e é comercializada principalmente na forma sódica em diferentes formulações
farmacêuticas, tais como: soluções orais, comprimidos, injetáveis e supositórios
(PEREIRA et al. 2002). Seu mecanismo farmacológico de ação não está elucidado
completamente, mas sabe-se que envolve a inibição da isoenzima cicloxigenase, com
conseqüente inibição da síntese de prostaglandinas e tromboxanos em plaquetas
(BENTUR et al. 2004).
Infelizmente em diversos casos, o uso das pirazolonas dipirona e aminopirina,
mais especificamente, foi seguido por uma diminuição severa no número de
neutrófilos da circulação sanguínea, conhecido como agranulocitose (IBÁÑEZ et al.
2005). Por causa deste risco, elas foram proibidas ou retiradas do mercado em vários
países. Porém, estas drogas estão ainda disponíveis em alguns países como na
Europa que inclui Alemanha, França, Espanha e Portugal (HEDENMALM et al. 2002).
Conseqüentemente, a busca por fármacos mais seguros é uma questão de
saúde pública de fundamental importância, bem como a elucidação dos mecanismos
bioquímicos relacionados com a toxidade induzida por fármacos.
A busca por fármacos mais seguros, no que se refere à especificidade,
potência e baixa toxidade, tem evoluído muito graças aos avanços nos métodos e
técnicas utilizados, através do emprego de metodologias mais racionais, que
envolvem um planejamento de todas as fases necessárias para sua obtenção. A
modelagem molecular é uma ferramenta para o estudo e planejamento de novos
fármacos, a qual permite a construção de relações estrutura-atividade (REA) a fim
de elucidar mecanismos de ação farmacológicos ou toxicológicos, utilizando gráficos
computacionais tridimensionais e valores numéricos (CARVALHO et al. 2003).
Portanto, nosso interesse baseia-se na aplicação de métodos teóricos para
elucidação das propriedades físico-químicas e de reatividade, de novos derivados
propostos análogos do paracetamol e derivados de pirazolonas, que possam ser
importantes para a elucidação do mecanismo de ação destas moléculas realizando o
estudo da relação estrutura-atividade e toxidade, bem como seleção de parâmetros
físico-químicos fundamentais para o planejamento racional de novos derivados e de
novos candidatos a fármacos, com maior atividade e baixa toxidade.
3
2 REVISÃO BIBLIOGRÁFICA
2.1 Paracetamol
2.1.1 PROPRIEDADES DO PARACETAMOL
O paracetamol (PAR), acetaminofeno ou N-acetil-p-aminofenol, foi introduzido
na terapêutica depois de uma descoberta acidental da acetanilida, ao mesmo tempo
em que os salicilatos eram descobertos. É utilizado desde 1878 até hoje em muitos
países como analgésico e antipirético, comercializado sozinho ou associado, no
alívio de sintomas relacionados a processos virais, dores crônicas e odontológicas,
sendo ainda bastante difundido em pediatria (FLOWER e VANE, 1972).
PARNH
CH3O
OH
FIGURA 1: Fórmula estrutural do paracetamol
O PAR é um pó branco e cristalino, solúvel em água, álcool etílico,
clorofórmio, glicerina e fracamente solúvel em éter etílico. Apresenta uma fórmula
molecular C8H9O2 e peso molecular igual a 151,16g/mol. O pka do paracetamol a
25oC é 9,51 e em solução permanece estável entre pH 4 e 7 a 25oC. O composto é
estável à temperatura, luz e umidade (MERCK, 1976).
2.1.2 FARMACODINÂMICA
O PAR é uma droga analgésica e antipirética, apresentando pouca ou
nenhuma ação anti-inflamatória e seu mecanismo de ação não está completamente
elucidado, mas parece produzir analgesia por elevação do limiar da dor (FLOWER e
VANE, 1972; STRAAT et al. 1988; LISTER e MCLEAN, 1997), sendo capaz de
bloquear a cicloxigenase (COX) em locais com baixos teores de peroxidases, como
o hipotálamo, o que possivelmente explica a fraca atividade antiinflamatória do
paracetamol, uma vez que a região da inflamação geralmente contém
4
concentrações elevadas de peróxidos gerados pelos leucócitos. Estes resultados
não excluem o PAR como um membro da classe dos AINEs e explicam a sua fraca
inibição pela COX, particularmente a cicloxigenase-2 (COX-2), uma isoenzima que
produz menor efeito colateral, com um percentual de 30% de inibição máxima por
AINEs (STRAAT et al.1986), pois sua atividade inibitória sobre a ciclooxigenase
pode estar relacionada a sua capacidade de inibir o radical tirosil presente na PGES
(KULMACZ et al. 1991).
O PAR demonstrou inibir a ação de pirógeno endógeno no centro termo-
regulador por bloqueio da produção e liberação de prostaglandina no sistema
nervoso central. A febre ocorre quando a PGE elevada atua na área pré-óptica do
hipotálamo anterior, resultando em diminuição da perda de calor e aumento do
ganho de calor (STOYANOVSKY E CEDERBAUM,1999; FERNANDO et al.1980;
HARVISON et al.1988).
2.1.3 TOXIDADE
A toxidade induzida pelo PAR ocorre pelo uso de sobre-dose, deficiências
enzimáticas, doenças hepáticas ou renais e interações medicamentosas, sendo
mais grave quando por múltiplos fatores. A intoxicação hepática grave pode levar à
morte de três a cinco dias após a ingestão de dose alta de PAR, pois a via de
conjugação é saturada, aumentando a quantidade do produto oxidado N-acetil p-
benzoquinona imina (NAPQI). Após esgotar as reservas de glutationa reduzida
(GSH), a NAPQI passa a reagir com moléculas de proteínas hepáticas séricas ou
tissulares contendo grupamentos ricos em elétrons, com a capacidade de reagir nas
posições 3 e 5 por adição ao sistema Michael (Esquema 1), acarretando com isso
danos às células hepáticas e sanguíneas, problemas alérgicos e o metabólito
oxidado pode formar adutos com bases nitrogenadas, apresentando alterações a
nível de DNA e RNA (LISTER e MCLEAN, 1997; STRAAT et al.1986).
NAPQI
NO
CH3
O
NH
OCH3
HO
RS12
3
4 56
RSH +
Aduto
ESQUEMA 1: Reatividade do Intermediário reativo NAPQI com nucleófilos
5
A superdosagem do paracetamol, quando devidamente diagnosticada, é
tratada com a administração de N-acetilcisteína, que atua como substituto da
glutationa, neutralizando os derivados oxidados reativos. Há, porém, casos e
comportamentos de riscos mais difíceis de serem tratados, a auto-medicação,
interações medicamentosas, utilização em pediatria ou geriatria, insuficiências
hepáticas ou renais não diagnosticadas e deficiências enzimáticas, o que para os
países de terceiro mundo, onde a produção industrial de medicamentos é
descarregada e disponibilizada à consumidores de medicamentos desprovidos de
um sistema de farmacovigilância eficaz, acaba expondo uma parcela de sua
população, que além do baixo controle de consumo de medicamentos, também não
há notificações médica em caso de intoxicações (SKORPEN et al. 1998;
STOYANOVSKY e CEDERBAUM,1999), aliado a isso a escassez de conhecimento
sobre mecanismo de ação e farmacodinâmica por parte dos profissionais de saúde
contribui para tal risco. Estes fatos justificam a busca de novos derivados do
paracetamol mais seguros.
2.1.4 ESTRUTURA E ATIVIDADE DE DERIVADOS DO PARACETAMOL
A toxidade do paracetamol fomentou o desenvolvimento de homólogos e
análogos mais seguros. Muitos derivados foram desenvolvidos na tentativa de
diminuir sua toxidade, no entanto mantendo suas propriedades terapêuticas. Estes
estudos, muito contribuíram para a obtenção de dados da relação estrutura e
atividade do paracetamol.
2.1.4.1 Homológos Monometilados:
Nelson e col. (1991) estudaram três derivados monometilados do PAR, nos
quais esperavam modificar a conjugação do grupo acetil com o anel benzênico e
impedir a ligação com o Citocromo P450. As moléculas foram avaliadas quanto a
seu potencial citotóxico e analgésico. Os resultados mostraram uma diminuição
tanto da atividade analgésica, quanto do potencial citotóxico, quando comparados o
paracetamol (1) e 3-metilparacetamol (2) na dose de 750 mg/kg, demonstrando que
estas atividades estão diretamente relacionadas. Foi observado também, que o
composto 2-metilparacetamol (3) possui atividade muito menor e que o N-
6
metilparacetamol (4) é praticamente inativo, estando em harmonia com a prova de
função hepática, medida pela transaminase (ALT).
1
NH CH3
O
OH
2
NH CH3
O
OH
3
NH CH3
O
OH
4
NH3CCH3
O
OHH3C
H3C
FIGURA 2: Paracetamol e derivados monometilados.
Os resultados expostos na tabela 1 mostraram que estas duas atividades são
dependentes da formação do intermediário NAPQI. Quimicamente o N-metil não
pode formar o derivado quionônico, o que explica sua baixa atividade, enquanto que
os derivados 2 e 3-metil modificam a reatividade de suas formas quinona-imida,
quando comparados com o PAR, sendo que no composto 2-metil um dos locais de
reação de adição de nucleófilos ao sistema quinona-imina está impedido.
TABELA 1: Atividade biológica e toxidade de derivados monometilados do paracetamol.
Composto Atividade Analgésica
DE 50 mg/kg Dose Mg/kg
Necrose Hepática
ALT plasma 24 h – Um/ml
paracetamol (1) 84,3 (27-108) 750 3,25 ± 0,25 4030 ± 501
2-metilparacetamol (2) 94,6 (77-116) 750 2,75 ± 0,25 3251 ± 905
3-metilparacetamol (3) 177,1 (138-195) 750 0,80 ± 0,25 690 ± 189
N-metilparacetamol (4) 200 1000 0 32 ± 8
Adicionalmente, como a atividade antiinflamatória ocorre pela oxidação do
ácido araquidônico, o metabolismo do paracetamol para a formação de NAPQI é
uma reação de oxidação. A propriedade anti-oxidante do PAR e seus derivados foi
avaliada para explicar sua capacidade de formar o intermediário reativo NAPQI,
através de voltametria cíclica em diferentes condições de pH para aproximar do
sistema biológico. Os resultados do potencial de oxidação descritos na tabela 2
mostraram uma boa relação com a potência citotóxica e atividade analgésica, exceto
para o composto 3.
7
TABELA 2: Potencial redox de derivados monometilados do paracetamol.
Composto Variação do Potencial de Redox (V) em pH
0 3 6 7,4 9 12
paracetamol (1) 0,72 0,61 0,46 0,39 0,33 0,22
2-metilparacetamol (2) 0,75 0,63 0,54 0,45 0,39 0,26
3-metilparacetamol (3) 0,67 0,53 0,43 0,36 0,38 0,10
N-metilparacetamol (4) 0,84 0,78 0,74 0,68 0,63 0,53
2.1.4.2 Homológos Dimetilados:
O mecanismo de toxidade do paracetamol foi estudado usando compostos
dimetilados nas posições 2,6 e 3,5. O trabalho de reatividade do sistema quinona
imina foi realizado por Fernando e col (1980). A capacidade de reação foi avaliada
através de derivados análogos dimetilados oxidados do paracetamol com
nucleófilos.
5
NH CH3
O
OH
6
NH CH3
O
OHH3C
H3C CH3
CH3
FIGURA 3: Paracetamol e derivados dimetilados.
Os compostos 2,6-dimetilacetaminofeno (5) e 3,5-dimetilacetaminofeno (6)
foram oxidados com tetraacetato de chumbo para formar N-acetil-2,6-dimetil-p-
benzoquinona imina (5a) e N-acetil-3,5-dimetil-p-benzoquinona imina (6a),
respectivamente.
A reação do composto 5a com etanol, etanotiol e anilina formou os adutos
tetraédricos (5b, 5c e 5e), resultante da adição ao carbono ipso da imina, enquanto
que a reação com ácido clorídrico formou um produto de adição no carbono C3, o 3-
cloro-2,6-dimetil-4-hidroxi-acetanilida (5d). Surpreendentemente, produtos desta
reação mostraram uma maior reatividade no carbono C1 do que via adição de
Michael. De fato, a reação com água levou a formação de um derivado dimetil-p-
benzoquinona (5f). Estas reações estão descritas no esquema 2.
8
NH CH3
O
OH
N CH3
O
O
O
OCH3
CH3
NH CH3
O
OHClPb(AcO)4
AcOEt H3CH3C CH3 CH3H3C
5g 5a 5d
5f 5e
CH3
HClEtOEt
H2O PhNH2
OSCH2CH3
NHCOCH3
CH3
CH3
OOCH2CH3
NHCOCH3
CH3
CH35c5b
EtSHEtOH
ONHC6H5
NHCOCH3
CH3
CH3 ESQUEMA 2: Reatividade do Intermediário reativo 2,6-DM-NAPQI com nucleófilos
De forma semelhante, o esquema 3 mostra que o composto 6a reagiu com
água e anilina também na posição C1, produzindo os compostos dimetil-p-
benzoquinona (6c) e 3,5-dimetil-N-fenil-p-benzoquinona imina (6d), enquanto que o
etanotiol reagiu no carbono C3 formando o composto 3,5-dimetil-2-tioetil-4-hidroxi-
acetanilida (6b). Como os resultados diferiram da proposição original, é possível que
as condições reacionais não foram encontradas ou realmente a reatividade
molecular de NAPQI no carbono carbonílico é maior que no carbono do alceno.
NH CH3
O
OHCH3CH3
N CH3
O
OCH3CH3
N
OCH3
CH3 O
OCH3
CH3
NH CH3
O
OHCH3CH3
Pb(AcO)4
AcOEtH3CH2CS
6 6a 6b
6c6d
EtSH
H2OC6H5NH2
ESQUEMA 3: Reatividade do Intermediário reativo 3,5-DM-NAPQI com nucleófilos
9
Adicionalmente, a hepatotoxidade e a nefrotoxidade, foi avaliada através do
grau de necrose celular em ratos e camundongos. Os compostos foram
administrados pelas vias intraperitoneal (IP) e intragástrica (IG). Os valores descritos
na tabela 3 mostram que compostos 3,5 substituídos (6) e paracetamol (1)
apresentaram maior toxidade em doses crescentes, quando comparados com
derivados 2,6 substituídos (5) e N-metilparacetamol (4).
TABELA 3: Hepatotoxidade e a nefrotoxidade de derivados dimetilados
Composto Concentração Necrose Celular
Ratos Camundongos IP IG IP IG
paracetamol (1)
2 mM + 0 +++ ++
5 mM – + – +++
10 mM – +++ – ++++
N-metilparacetamol (4) 2 mM 0 – 0 –
2,6-dimetilparacetamol (5)
2 mM – 0 – 0
5 mM – 0 – 0
10 mM – + – 0
3,5-dimetilparacetamol (6)
2 mM – + – ++
5 mM – ++ – +++
10 mM – ++ – ++++
Estes resultados demonstram que provavelmente, junto com a reatividade
química, ocorre a diminuição da formação da aceto-imida-p-benzoquinona, uma vez
que as posições 2 e 6 estão impedidas estericamente pelas reações de adição, tanto
quanto a posição 3 e 5, e que o efeito estérico não deve ser o único responsável
pela formação de derivados tóxicos.
2.1.4.3 Derivados Mono e Dialquilícos:
A importância do efeito estérico foi observada no estudo de oito derivados 3-
mono e 3,5-disubstituídos do paracetamol, com grupo alquila de tamanho variável. A
toxidade foi correlacionada com o parâmetro de lipofilicidade usando o coeficiente de
partição óleo/água (Log P).
10
Os resultados (tabela 4) mostram que os derivados contendo os substituintes
volumosos, com maior valor de LogP, diminuem a oxidação primeiramente e
secundariamente ao ataque a aceto-imida-p-benzoquinona pelo maior impedimento
estérico. Outros prováveis mecanismos são pela redução dos níveis de NADPH e
GSH. Compostos monosubstituídos são mais reativos, enquanto que compostos
disubstituídos são menos reativos (Esquema 4).
Tabela 4: Valores de toxidade e LogP de derivados 3,5-dialquilados do paracetamol.
NH
H3CO
HOR1
R2
Compostos R1 R2 Controle % Tratados % Log P
1 H H 28 6 60 6 0,311
3 CH3 H 20 7 54 4 0,793
13 CH2CH3 H – – 1,306
14 CH(CH3)2 H – – 1,707
15 C(CH3)3 H – – 2,357
6 CH3 CH3 14 4 17 3 1,108
16 CH2CH3 CH2CH3 – – 1,870
17 CH(CH3)2 CH(CH3)2 – – 2,671
18 C(CH3)3 C(CH3)3 11 4 15 2 3,180
NHO
CH3HO
R
NO
CH3O
R
NHO
CH3HO
R
Cit P450
2GSH
NADPH/O2
NHO
CH3HO
R
RNO
CH3O
R
R
NHO
CH3HO
R
R
Cit P450 2GSH
NADPH/O2
NHO
CH3HO
R
GSGSH
Esquema 4: Mecanismos de redução de mono e dissubstituídos análogos do paracetamol.
11
2.1.4.4 Análogos Fluorados:
O efeito eletrônico é outro fator que pode afetar a reatividade química do
paracetamol. As ações hepatotóxica e analgésica do paracetamol foram
comparadas com seis análogos fluorados 7–12 (figura 4). As moléculas foram
avaliadas através dos modelos de inflamação e toxidade, pela contorção abdominal
induzida pela p-benzoquinona em camundongos e dosagem dos níveis de alanina
aminotransferase (ALT), respectivamente. Os resultados biológicos foram
comparados com o pKa e potencial de oxiredução (Redox), obtido através da
voltametria cíclica (V) por Barnard e col. (1993).
7 8
NH CH3
O
OH
9
F F
NH CH3
O
OHF
NH CH3
O
OH
FF
10 11
NH CF3
O
OH
12
NH CF3
O
OHF
NH CH3
O
OHF F
FF
FIGURA 4: Derivados fluorados do paracetamol.
Os compostos não mostraram nenhuma atividade analgésica em ratos,
exceto os compostos 11 e 12, que se mostraram 3,5 – 5 vezes mais ativo que o
paracetamol, e ao mesmo tempo mostraram um potencial de necrose hepática
menor do que o paracetamol. Significativamente, dos compostos avaliados nestes
modelos, duas moléculas foram mais ativas e quatro apresentaram menor efeito
tóxico que o PAR. Os resultados mostram que a molécula 12 é a mais ativa, a
molécula 10 é a menos ativa. Quanto a toxidade, a molécula 9 é a menos tóxica e 11
é a mais tóxica. Os resultados são mostrados na tabela 5.
12
TABELA 5: Propriedades dos derivados fluorados do paracetamol
Comp pKa Redox
(V) AB DE50 (mM/kg)
ToxDE50 (mM/kg)
1 9,53 1,14 2,08 3,38
7 8,10 1,24 2,53 3,96
8 7,00 1,33 4,18 4,01
9 9,05 1,52 4,28 5,88
10 4,75 1,74 4,48 3,23 11 9,14 1,37 0,48 1,42
12 8,40 1,47 0,38 –
2.1.4.5 Análogos 3,5-dissubstituídos:
Outro estudo eletrônico comparado com o paracetamol, 3,5-dialquil (6) e 3,5-
difluoro (8), foi realizado pela introdução de oxigênio (19), enxofre (20) e outros
halogênios, tais como cloro (21), bromo (22) e iodo (23) nas posições 3 e 5. TABELA 6: Propriedades dos derivados análogos 3,5-dissubstuídos do paracetamol.
NH
H3CO
HOR
R
Compostos R p.f. POx IC 50 (mM) LDH (%)
1 H – 0,28 V 0,35 0,08 50,6 2,8
6 CH3 162 0C 0,21 V 0,16 0,00 15,0 0,9
19 OCH3 141 0C 0,12 V 0,20 12,4 0,5
20 SCH3 135 0C 0,12 V 0,14 0,03 14,5 1,2
8 F 180 0C 0,32 V 1,14 0,07 42,3 0,9
21 Cl 157 0C 0,34 V 0,56 0,13 36,0 3,5
22 Br 171 0C 0,32 V 0,48 0,07 26,1 3,2
23 I 188 0C – 1,11 0,16 14,7 1,4
Branco – – – 8,2 1,0
13
Os resultados da tabela 6 mostram que substituições de grupo elétron doador
nas posições 3,5 decrescem o potencial de ionização, aumentam a inibição da ciclo-
oxigenase e diminuem a toxidade, enquanto que com grupos elétron atraentes não
alteram a toxidade e diminuem a atividade biológica, demonstrando que o parâmetro
eletrônico responsável pela atividade é o potencial de ionização.
Bessems e col.(1995) estudaram estes compostos por método ab initio,
mostrando que a saída do hidrogênio ligado ao oxigênio é muito mais favorecida, do
que do hidrogênio ligado ao N em 125 kJ/mol, sendo confirmado experimentalmente
através do espectro de ressonância magnética de spin. Na análise de densidade de
spin da semiquinona, foi observada uma alta concentração de carga no oxigênio de
aproximadamente 85%. Estes resultados explicam parcialmente a reatividade do
PAR e seus derivados, deixando ainda claro que devem ser elucidados, através de
outros métodos de cálculo molecular e experimentais.
Estudos realizados por Diniz e col. (2004) usando cálculos de química
quântica no nível de teoria B3LYP acoplado com o conjunto de base 6-31G(d), foram
empregados na obtenção da energia, potencial de ionização (PI), energia de
dissociação da ligação OH (EDLOH) e NH (EDLNH) e distribuição da densidade de
spin para o paracetamol e seus análogos 3,5-dissubstituídos. Os cálculos de
densidade de spin foram realizados para o radical formado pela abstração do grupo
hidroxila fenólico.
Os resultados mostram que o elétron desemparelhado está localizado
principalmente no oxigênio fenólico (0,31-0,40), carbonos C3 (0,17-0,27) e C5 (0,21-
0,21) localizados nas posições orto e carbono C1 (0,25-0,33) localizado na posição
para. A correlação entre a atividade analgésica, a citotoxidade e as propriedades
eletrônicas, obtidas usando matriz de correlação mostraram que o PI e a EDLOH são
significativamente relacionadas com a inibição in vitro da ciclo-oxigenase, com uma
correlação de 0,88 e 0,75, respectivamente. Enquanto que a EDLOH, EDLNH e o PI
têm uma correlação significativa com a citotoxidade (LDH), com valores de 0,90,
0,87 e 0,86, respectivamente.
2.1.4.6 Derivados Acil-Éter do Paracetamol:
As propriedades teóricas calculadas para os derivados fenólicos e éter,
funcionalizados com grupos alquílicos (Figura 5) foram relacionados com sua
14
atividade analgésica medida pelo número de contorções induzidas por ácido acético
comparados com a aspirina, realizados por Duffy e col. (2001).
NHO
OH
NH CH3
O
O
NH CH3
O
OH3C CH3
24 25 26
27 28 29
CH3
CH3
NHO
O
CH3
CH3
CH3
NH CH3
O
OH3CH2C CH2CH3
CH3
NH CH3
O
O(H3C)2HC CH(CH3)2
CH3
NH CH3
O
OCl Cl
30 31 32
NH CH3
O
OCH3H3CH2C CH2CH3
NHO
OCH3
33 34 35
NH CH3
O
O
NH CH3
O
OH
CH3
36 37 38
OH3CO
C6H5
NH CH3
O
OH
NH CH3
O
OH(H3C)3C C(CH3)3
CH3H3C
NH CH3
O
OH3C
CH3
CH3
COOH
FIGURA 5: Estrutura de derivados fenóis-éteres do paracetamol.
15
Muitas drogas do grupo dos anti-inflamatórios não esteroidais (AINEs)
comercializadas atualmente, produzem severos efeitos colaterais gastrotóxicos. Os
benefícios de produzir AINEs sem estes efeitos colaterais são óbvios,
particularmente para pacientes que requerem terapia a longo prazo. A meta desta
investigação era produzir novos AINEs, baseado no paracetamol, exibindo pequeno
ou nenhum efeito gastrotóxico. A extensão deste trabalho inclui, o projeto, a síntese
e o teste de 13 candidatos a novos fármacos. A atividade analgésica e a potência
anti-inflamatória dos candidatos à droga, foram avaliados no ensaio de contorção
abdominal de rato induzida por ácido acético e edema de pata de rato,
respectivamente.
TABELA 7: Propriedades dos derivados éteres e fenóis do paracetamol.
Compostos Analgésico
DE50 Anti-Inflamatório
DE30 Gastro
Toxidade LogP
24 0,00024 inativo 1,4 2,03
25 0,00035 0,00036 1,2 1,85 26 0,00021 inativo 1,7 3,27
27 0,00019 0,000116 1,2 1,92
28 0,00051 0,00017 1,6 2,71
29 0,00042 0,00019 2,3 3,37
30 0,00011 0,00033 2,1 2,02
31 0,00039 inativo 1,1 2,56 32 0,00037 0,00040 1,8 2,37
33 inativo inativo 1,3 -
34 0,00014 0,00033 1,3 2,69
35 - - 1,5 -
36 0,00024 0,00038 - -
37 0,000049 0,00021 2,6 3,87
38 0,00094 0,0011 9,5 1,24
Os compostos preparados e estudados por Duffy e col. (2001) são outro
grupo de moléculas, que comparados a aspirina exibiram maior atividade
analgésica, antinflamatória e gastrotoxidade (Tabela 7). Os estômagos dos ratos
foram examinados pós-morte, para avaliar a gastrotoxidade das drogas. Das 13
16
combinações descritas neste trabalho, 11 demonstraram possuir atividade
analgésica 2-10 vezes comparado a potência da aspirina. Todas as combinações
mostraram uma baixa gastrotoxidade significativa, quando comparadas com a
aspirina.
Neste grupo de moléculas não foi possível definir através de métodos de
química quântica e quais as propriedades químicas e físico-químicas responsáveis
pela resposta biológica, mas os resultados do cálculo de logP indicaram que o
aumento da lipofilicidade aumenta a atividade anti-inflamatória, mas não é possível
se obter uma boa correlação entre os compostos, o que indica que os fatores
eletrônicos são determinantes para a atividade entre todos os parâmetros de QSAR.
2.2 Pirazolonas
2.2.1 PIRAZOLONAS COMO ANTI-INFLAMATÓRIOS
O desenvolvimento de fármacos para uso como analgésicos e
antiinflamatórios durante o século XIX concentrou-se nos derivados da pirazolona
devido à fácil obtenção sintética, rica atividade biológica e alta estabilidade química
(PARK et al. 2005).
Dentre as várias substâncias das pirazolonas dotadas de propriedades
analgésicas, a antipirina 39 foi sintetizada na Alemanha em 1884. Anos mais tarde,
em 1897 surgia a isopropilantipirina 40 e a aminopirina 41. Em 1913, a Hoechst AG,
uma empresa químico-farmacêutica alemã desenvolvia o primeiro composto
injetável da família, a dipirona 42, denominada inicialmente de melubrina
(HEDENMALM et al. 2002).
39
NNH3C
H3C
O
40
NNH3C
H3C
O
41
NNH3C
H3C N
O
H3C CH3H3C
CH3
42
NNH3C
H3C N
O
H3C SO3 Na
FIGURA 6: Estruturas químicas de derivados de pirazolona.
17
Posteriormente, em 1921, era introduzida no mercado farmacêutico alemão a
primeira pirazolona de uso clínico, que na realidade era um produto composto por
50% dipirona e 50% aminopirina. A indicação terapêutica foi como analgésico e
antiespasmódico, apesar de ter sido testado até para o tratamento da tuberculose
(HEDENMALM et al. 2002).
No Brasil, a dipirona, quimicamente conhecida como ácido 1-fenil-2,3-dimetil-
5-pirazolona-4-metilaminometano-sulfônico foi introduzida em 1922, pela Hoechst
AG, com o nome de Novalgina®. Coincidentemente, no mesmo ano, Schultz
descrevia o primeiro caso de agranulocitose medicamentosa induzida por
pirazolonas (JOSEPH, 1959). No entanto, a propriedade analgésica desta família é
relevante, a qual é perfeitamente exemplificada pela dipirona que constitui o
analgésico antipirético mais utilizado no Brasil (PEREIRA et al. 2002).
O mecanismo de ação farmacológica das pirazolonas não é compreendido
completamente, mas sabe-se que envolve a inibição de isoenzimas da
cicloxigenase, da síntese do tromboxano nas plaquetas e da síntese dos
prostanóides (BENTUR et al. 2004).
2.2.2 PIRAZOLONAS E AGRANULOCITOSE
O risco de agranulocitose associada ao uso de medicamentos derivados da
pirazolona, em doses terapêuticas por curto período de tempo, foi considerado muito
baixo (IBÁÑEZ et al. 2005). Entretanto, pouca atenção foi dada à possível lise de
neutrófilos e o seqüestro de espécies reativas de oxigênio (ERO) em neutrófilos
mediadas por estes compostos.
Tal efeito poderia ser benéfico, por exemplo, no aumento de números de
neutrófilos, no entanto, pode também ser altamente prejudicial se o número de
neutrófilos circulantes já estiver diminuído. Nesse sentido, Costa e col. (2006)
avaliaram a capacidade dos derivados de pirazolonas como antipirina 39,
isopropilantipirina 40, aminopirina 41 e dipirona 42, na inibição do metabolismo de
neutrófilos humanos e sua atividade seqüestrante contra os potenciais radicais
livres, tais como superóxido (O2●-), peróxido de hidrogênio (H2O2), radical hidroxil
(HO●), lipoperóxido (ROO●) e ácido hipocloroso (HOCl) em neutrófilos.
Os resultados obtidos por Costa e col. (2006), mostraram que a aminopirina e a
dipirona inibem o metabolismo em neutrófilos induzidos pelo 12-miristato-13-acetato
18
de forbol com elevada eficiência, enquanto a isopropilantipirina teve pouco efeito e a
antipirina não teve nenhum efeito. A dipirona e a aminopirina foram sequestrantes
altamente potentes do radical HO● e HOCl, enquanto a isopropilantipirina teve pouco
efeito e a antipirina não teve nenhum efeito contra espécies reativas de oxigênio.
No entanto, nenhumas destas pirazolonas estudadas se mostraram capazes
de seqüestrar o O2●- ou H2O2. Porém, a dipirona se mostrou mais reativa contra o
radical ROO●. Estes resultados, no entanto, não elucidaram o mecanismo químico
de atuação destes compostos na resposta inflamatória induzida em neutrófilos.
Todavia, quanto aos aspectos químicos da agranulocitose, diversos estudos
têm mostrado forte evidência de que derivados de pirazolona são biologicamente
oxidadas em compostos intermediários reativos que reagem com os neutrófilos
(UETRECHT et al.1995).
2.2.2.1 Função dos Neutrófilos
Neutrófilos são leucócitos polimorfonucleares (PMNs), sendo os mais
abundantes na circulação sanguínea. Essas células participam ativamente na
resposta inata de defesa do hospedeiro. Durante esta resposta, PMNs e outras
células fagocíticas são mobilizadas para os locais do ferimento ou infecção onde
fagocitam e matam os microorganismos invasores. São os primeiros tipos de células
a chegar ao local da inflamação, onde tem um papel principal nos danos teciduais, e
em doenças não infecciosas, tais como, artrite, doença inflamatória de Bowel e lesão
tissular com reperfusão isquêmica (ABBAS et al. 1995).
O neutrófilo tem sido implicado como um mediador central da lesão tissular
em, virtualmente, todo sistema orgânico susceptível à lesão de reperfusão
(SECCOMBE e SCHAFF, 1994). Certamente, esta célula sangüínea participa de
uma série de mecanismos que são capazes de causar grave destruição tissular. No
entanto, tem sido muito difícil demonstrar um papel causal direto para o neutrófilo na
lesão de reperfusão. É possível que neutrófilos ativados estejam presentes em
tecidos reperfundidos, como uma resposta celular, normal e inespecífica, causada
pelos variados tipos de lesão endotelial (TSAO et al.1990).
Uma vez ligados à superfície endotelial, os neutrófilos aceleram a disfunção
destas células e destruição tissular através de uma variedade de mecanismos
citotóxicos. Além disso, na oclusão de capilares e pequenas arteríolas, os neutrófilos
19
ativados liberam uma série de substâncias incluindo: radicais livres de oxigênio,
enzimas citotóxicas e citocinas. Muitas destas substâncias também recrutam
leucócitos adicionais e aumentam a sua adesividade ao endotélio vascular. Estes
eventos não são restritos à superfície endotelial. Com o agravamento da lesão, os
neutrófilos infiltram os tecidos onde enzimas e radicais do oxigênio podem causar
lesão tecidual (TSAO et al.1990).
Os PMNs têm uma predisposição extraordinária como armas microbicidas,
dependentes ou independentes de oxigênio, para destruir e remover agentes
infecciosos (ABBAS et al. 1995). Os mecanismos dependentes de oxigênio
envolvem a produção de espécies reativas de oxigênio (ERO), enquanto que os
mecanismos independentes de oxigênio incluem, entre a maioria das funções do
neutrófilo, quimiotaxia, fagocitose, desgranulação, liberação de enzimas líticas e de
peptídeos bactericidas (UETRECHT et al. 1995).
Quando são ativados pelo contato ou pela ingestão de materiais estranhos
pelos fagossomos, inicia-se uma “queima respiratória” consumindo o oxigênio
molecular (O2), tendo por resultado a formação do radical superóxido (O2●-) através
da ação da NADPH-oxidase presente na membrana plasmática. (DRÖGE, 2002)
A função da NADPH-oxidase nos neutrófilos é fornecer a espécie reativa de
oxigênio que ataca os organismos invasores. O O2●- é importante como produto
preliminar, mas é convertido rapidamente a H2O2 espontaneamente ou pela enzima
superóxido dismutase (SOD). O H2O2 não é um composto inerentemente reativo.
Entretanto, H2O2 pode ser transformado em produtos altamente reativos e deletérios:
i) As interações de H2O2 com O2●- ou com níveis baixos de metais de
transição podem conduzir à formação dos radicais hidroxil (HO●).
ii) A mieloperoxidase (MPO), uma oxidoredutase do peróxido de
hidrogênio, encontrada especificamente em leucócitos granulócitos de mamíferos,
incluindo neutrófilos, monócitos, basófilos e eosinófilos, contribui consideravelmente
para a potencialidade bactericida destas células através da formação de HOCl a
partir de H2O2 e de íons cloreto. (DRÖGE, 2002; HALLIWELL e GUTTERIDGE,
2007).
Embora a resposta dos neutrófilos às diferentes circunstâncias
estimuladas por patógenos sejam geralmente benéficas para a defesa do
hospedeiro, também podem ser deletérias ao organismo se estas células forem
ativadas de maneira imprópria. Neste sentido, a superprodução de radicais livres e
20
enzimas proteolíticas, usadas no mecanismo de defesa contra as bactérias e outros
microorganismos, podem ser altamente tóxicas às células e aos tecidos
circunvizinhos. (PELLETIER et al. 2001)
A possível responsabilidade das pirazolonas sob circunstâncias pró-
oxidantes requer um estudo intensivo da reatividade destas drogas com as ERO
produzidas pelos neutrófilos.
2.3 Problemas Relacionados ao Medicamento (PRM)
Os medicamentos exercem um papel central nas práticas de saúde na
sociedade contemporânea, de tal forma que a maioria das intervenções terapêuticas
envolve a utilização de pelo menos um medicamento. Em conseqüência, pode-se
afirmar que os medicamentos estão presentes em todos os domicílios, já que os
tratamentos, de forma geral, não se esgotam nos cenários hospitalar, ambulatorial ou
no consultório médico. Em função disso surgem os problemas de saúde relacionados
a medicamentos, que são entendidos como resultados clínicos negativos e
produzidos por diversas causas. A automedicação é uma das principais causas de
PRM podendo levar a outros problemas como reações adversas graves e à
intoxicação (2º CONSENSO DE GRANADA SOBRE PRM, 2002).
Entre os medicamentos, certamente, os analgésicos constituem um dos grupos
de uso mais amplo e um dos mais procurados, por serem utilizados para o alívio da
dor, facilmente acessíveis para a aquisição e, parte deles, de venda livre. Destaca-se
a sua disponibilidade fora de estabelecimentos farmacêuticos, como bares, armazéns
e mercearias (SCHENKEL et al.1988), contrariando disposições legais. Existe ainda a
sistemática indução ao uso, pelas propagandas nos veículos de comunicação de
massa, especialmente rádio e televisão (HEINEK et al.1998).
Uma revisão sistemática sobre os atendimentos de emergência relacionados
ao uso de medicamentos considerou dados de oito ensaios retrospectivos e quatro
prospectivos. Os resultados indicaram que 28% de todos os atendimentos de
emergência estão relacionados aos medicamentos. Destes atendimentos, 70% diziam
respeito a situações evitáveis e 24% deles resultaram em internação hospitalar.
(PATEL e ZED, 2002)
No Brasil, os medicamentos são os principais agentes capazes de causar
intoxicação. Dados do Sistema Nacional de Informações Tóxico-Farmacológicas
21
(SINITOX) os apontam como os principais agentes de intoxicações em seres
humanos, com 28,5% dos casos registrados (BORTOLETTO e BOCHNER,1999).
Além do impacto dos medicamentos nas intoxicações humanas, deve-se
ressaltar a ausência de dados sobre outros eventos decorrentes do uso inadequado
de medicamentos, como a ocorrência de reações adversas e inefetividade de
tratamentos, eventualmente decorrentes da ausência de conhecimento dos pacientes
sobre os medicamentos (TIERLING et al. 2004) aliado a pobre informação usadas
pelos profissionais de saúde, em sua maioria bulários ou propaganda médica
fornecida pela industria farmacêutica.
No entanto, os riscos associados à terapêutica podem ser minimizados pelo
investimento na pesquisa de medicamentos mais seguros no que se refere à potência
e toxidade e na qualificação do conhecimento do profissional da área da saúde o que
interfere diretamente na qualidade da prescrição e dispensação de medicamentos.
Além disso, é possível considerar o uso apropriado e inteligente dos medicamentos,
através da atenção farmacêutica, como tecnologia altamente custo-efetiva, uma vez
que pode influenciar, de modo substancial, a utilização do restante do cuidado médico
necessário durante o tratamento.
2.4 Modelagem Molecular
O planejamento de fármacos assistido por computador utiliza programas
computacionais como ferramentas para a descoberta, planejamento e estudo de
fármacos, atuando em conjunto com outras áreas como química, bioquímica,
farmacologia e toxicologia, formando um campo mais vasto de atuação conhecido
como química medicinal (WERMUTH, 1996). A modelagem molecular compreende a
investigação das estruturas e propriedades moleculares usando a química
computacional e as técnicas de visualização gráfica, que fornecem uma
representação tridimensional (CARVALHO et al. 2003).
Os programas computacionais utilizados auxiliam na investigação das
interações químicas de um ligante com seu receptor e na exploração dos fatores
estruturais que estão relacionados ao efeito biológico. Como conseqüência, os
mecanismos de ação molecular dos fármacos podem ser compreendidos.
(CARVALHO et al. 2003). Segundo Thomas (2003) a atividade biológica é
compreendida pelas interações químicas entre o ligante e seu receptor, e os
22
grupamentos químicos contribuem para a formação do complexo fármaco-receptor,
portanto, é possível combinarmos os grupos funcionais responsáveis pela ação
biológica e retirarmos os fragmentos responsáveis pela toxidade.
Atualmente, os parâmetros farmacocinéticos e toxicológicos devem ser
considerados nas primeiras etapas do desenho e desenvolvimento de novos
fármacos. Em conseqüência, os estudos de ADMET (absorção, distribuição,
metabolismo, excreção e toxicidade) constituem hoje uma area de pesquisa essencial
da Química Medicinal. Deve ressaltar que os fármacos utilizados na terapêutica,
considerados clássicos foram licenciados há muitos anos, não passando por estes
estudos. Com este propósito, pretende-se aprofundar o estudo das propriedades
farmacocinéticas e toxicidades associados ao desenvolvimento químico e uso
racional de fármacos, observando as várias estratégias ou metodologias de aplicação
de conceitos de ADMET no planejamento e utilização de fármacos seguros. Estes
estudos podem ser melhorados com os cálculos das propriedades físico-químicas
responsáveis pela farmacocinética, bem como pela reatividade química dos
compostos químicos. Nestes estudos, podemos relacionar a formação de
intermediários reativos durante a fase de metabolismo de fármacos. Adicionalmente,
serão apresentadas estratégias para integrar propriedades de ADMET na descoberta
de fármacos (BORGES, 2007).
O projeto busca estruturas com atividade ou aplicação definidas, reduzindo a
toxidade, tempo e custos financeiros. Os métodos computacionais são ferramentas
que têm como objetivo entender e prever o comportamento de sistemas reais,
usados para desenhar, descrever e prever estruturas moleculares, propriedades do
estado de transição e equilíbrio de reações, propriedades termodinâmicas,
eletrônicas, conformacionais e de solubilidade. Os métodos abrangem estudos de
minimização de energia, análise conformacional, extração de propriedades
geométricas e estruturais, de reatividade e simulações de dinâmica molecular, cujos
parâmetros podem ser aperfeiçoados aos métodos estatísticos (BORGES, 2007).
Neste sentido, a busca por fármacos mais seguros derivados do paracetamol e
pirazolonas fomenta esta pesquisa na tentativa de encontrar drogas estruturalmente
simples com menos efeitos adversos, diminuição da toxidade e que sejam
economicamente viáveis e eficazes, bem como contribuir para elucidação dos
mecanismos de ação farmacológicos destes fármacos.
23
3 OBJETIVOS
3.1 Geral
Estudar a relação estrutura química e atividade biológica e toxidade de
derivados do p-aminofenol e pirazolonas.
3.2 Específicos
Obter os parâmetros físico-químicos teóricos eletrônicos, estéricos e de
solubilidade de derivados do p-aminofenol e pirazolonas;
Diferenciar os níveis de correlação nos estudos de REA usando métodos
de avaliação in vivo e in vitro, já descritos na literatura, de derivados do paracetamol;
Estudar os mecanismos da capacidade seqüestrante de radicais livres dos
derivados de pirazolonas;
Determinar que parâmetros são relevantes para explicar a reatividade
química com a atividade biológica e a toxidade química nestes compostos;
Demonstrar a importância do estudo de relação estrutura e atividade na
atenção farmacêutica e na promoção do uso racional de medicamentos.
24
4 MATERIAIS E MÉTODOS
4.1 Modelagem Molecular
Os parâmetros teóricos para derivados acil-éter do paracetamol e pirazolonas
foram calculados no Laboratório de Química Farmacêutica Computacional (LQFC)
do Núcleo de Estudos e Seleção de Biomoléculas da Amazônia (NESBAm) da
Faculdade de Farmácia da Universidade Federal do Pará, usando o método semi-
empírico PM3 (Terceira Parametrização) (STEWART, 1990). Somente as
conformações moleculares mais estáveis foram utilizadas.
As propriedades físico-químicas podem determinar os sítios ou formas de
interação da molécula com receptores biológicos, a reatividade química e os fatores
que podem afetar as propriedades de ADMET (absorção, distribuição, metabolismo,
excreção e toxidade), tais como logaritmo do coeficiente de partição octanol/água
(CLogP) e energia de hidratação (EH) (ALEXANDER et al. 2003).
Os cálculos foram realizados usando os pacotes computacionais Hyperchem
7.5 (2002) e ChemOffice (2005) em sistema operacional Windows Vista e
processador Pentium IV, Duo-Core e Core-2Duo.
Os cálculos de propriedades eletrônicas tais como orbital molecular ocupado
de maior energia (HOMO), orbital molecular desocupado de menor energia (LUMO),
potencial de ionização (PI), energia de dissociação de ligação fenólica (EDLOH) e
densidades de spin, foi realizado usando os pacotes Gaussview e Gaussian 2003
(FRISCH et al. 2004), usando teoria do funcional de densidade (TFD), no nível
B3LYP (PARR et al. 1989) com o conjunto de base 6-31 G* (HEHRE, 1986).
4.2 Logaritmo do Coeficiente de Partição (Clog P)
O Logaritmo do Coeficiente de Partição (CLog P) é um parâmetro que
expressa a solubilidade da molécula, representado como o logaritmo da razão entre
a solubilidade de uma molécula em solvente orgânico (octanol) e em solução
aquosa. Esta propriedade relaciona a capacidade da molécula vencer as barreiras
biológicas e mover-se nas diferentes biofases. Valores positivos de CLogP indicam
maior lipofilicidade, enquanto que os valores próximos de zero ou negativos indicam
maior hidrofilicidade.
25
Ele representa um importante parâmetro para estimar e compreender os
fenômenos da absorção e distribuição dos compostos em um modelo de estudo
comparativo com compostos conhecidos (EISENBERG e MCLACHLAN, 1986).
4.3 Energia de Hidratação (EH)
Este parâmetro está relacionado com a capacidade da molécula absorver ou
liberar energia, quando em contato com solvente aquoso, sendo importante para
inferir sobre o transporte e distribuição pelas diferentes biofases plasmáticas, bem
como pela atração e interação do fármaco com seu receptor ou mudança de fase.
Os valores de EH são expressos em kilocalorias por mol (kcal/mol), onde valores
negativos indicam uma reação exotérmica, enquanto que valores positivos indicam
uma reação endotérmica. Representa um importante parâmetro complementar para
a compreensão dos comportamentos ligante com um receptor e de um componente
que precisa vencer as barreiras biológicas em comparação com outras moléculas
com propriedades farmacocinéticas conhecidas (MIYAMOTO & KOLLMAN, 1993).
4.4 Energia dos Orbitais de Fronteira (HOMO E LUMO)
O HOMO está relacionado com a capacidade doadora de elétrons,
caracterizando a molécula como nucleofílico. Altos valores de HOMO indicam maior
nucleofilicidade. Enquanto que o LUMO está relacionado com a capacidade
aceptora de elétrons, caracterizando a molécula como eletrófilo. Baixos valores de
LUMO indicam maior eletrofilicidade. Seus valores são expressos em elétron-volt
(eV) (KOROLKOVAS, 1978).
Estes parâmetros estão relacionados com as regiões em que a estrutura
química do fármaco pode ser atraída por pontos específicos do receptor biológico
como regiões ricas ou deficientes em elétrons. É um importante parâmetro que
contribui para uma maior compreensão da reatividade química de um candidato a
ligante em um conjunto de moléculas em estudo (KUBINYI, 2002).
4.5. Conjunto de Compostos Estudados
26
4.5.1 DERIVADOS DO PARACETAMOL
As moléculas em estudo receberam a numeração de P1 até P14 (Figura 7), e
foram selecionados de estudos anteriores descritos por Duffy e col. (2001).
NHO
OH
NH CH3
O
O
NH CH3
O
OH3C CH3
P1 P2 P3
P4 P5 P6
CH3
CH3
NHO
O
CH3
CH3
CH3
NH CH3
O
OH3CH2C CH2CH3
CH3
NH CH3
O
O(H3C)2HC CH(CH3)2
CH3
NH CH3
O
OCl Cl
P7 P8 P9
NH CH3
O
OCH3H3CH2C CH2CH3
NHO
OCH3
P10 P11 P12
NH CH3
O
O
NH CH3
O
OH
CH3
P13 P14 PAR
NH CH3
O
OH
C6H5
NH CH3
O
OH
NH CH3
O
OH(H3C)3C C(CH3)3
CH3H3C
NH CH3
O
OH3C
CH3
CH3
FIGURA 7: Compostos 3,5-disubstituídos análogos acil-éter do paracetamol
27
4.5.2 DERIVADOS DE PIRAZOLONA
As moléculas derivadas de Pirazolona foram denominadas, antipirina P15,
isopropilantipirina P16, aminopirina P17 e dipirona DIP (Figura 8), de acordo com os
trabalhos de Costa e col. (2006).
NNH3C
H3C
ONNH3C
H3C
O NNH3C
H3C N
O
H3CCH3
H3CCH3
NNH3C
H3C N
O
H3C SO3 Na
P15 P16 P17 DIP
FIGURA 8. Estrutura dos derivados de pirazolona.
4.6 Atividade Biológica
A atividade biológica in vivo do paracetamol utilizada neste trabalho foi
selecionada de estudos anteriores de Duffy e col. (2001), bem como a atividade in
vitro selecionada a partir do trabalho de Diniz e col. (2004).
A atividade biológica dos derivados de pirazolonas foi utilizada a partir dos
trabalhos de Costa e col. (2006).
4.7 Cálculos do Potencial de Ionização (PI)
O potencial de ionização foi calculado a partir das energias de retirada de um
elétron. O cálculo do potencial de ionização foi realizado pela diferença entre a
energia da molécula neutra e o respectivo cátion radical para o paracetamol e seus
derivados (Equação 1) e derivados de pirazolonas (Equação 2).
PI = EPAR•+ – EPAR (Eq. 1)
PI = EPir•+ – EPir (Eq. 2)
28
4.8 Cálculos da Energia de Estabilização (Eiso)
A energia de estabilização (∆Eiso) foi usada para a previsão da atividade
como modelo de interação entre o radical Tirosil usando tirosil-glicina (TirO•), um
modelo simplificado do sitio ativo da prostaglandina endoperóxido-sintase (PGES) e
os derivados acil-éter do paracetamol. O ∆Eiso foi calculado como a diferença de
energia entre tirosil neutra (ETirOH) somada aos cátions radicais livres do
paracetamol e derivados (EPAR•+), menos o cátion radical tirosil (ETIrOH•+) somado
ao paracetamol e derivados neutros ( EPAR) , como demonstrado na Equação 3.
∆Eiso = (ETirOH + EPAR•+) – (ETIrO•+ + EPAR) (Eq. 3)
4.9 Mapas do Potencial Eletrostático Molecular
As superfícies dos mapas dos potenciais eletrostáticos moleculares (MEPs)
foram extraídas usando o CUBEGEN presente no Gaussian 03 (FRISH et al. 2004),
aplicado às geometria otimizadas de todas as moléculas.
Esta superfície tem valores numéricos classificados por cores que fornecem
uma medida do tamanho total da molécula assim como a posição de potenciais
eletrostáticos negativos ou positivos.
As regiões de potencial eletrostático positivo indicam o excesso de carga
positiva, conduzindo a repulsão da provável carga positiva de outra molécula,
enquanto que as regiões de potencial negativo indicam as áreas de excesso de
carga negativa, conduzindo à atração da carga positiva.
A visualização de todos os resultados dos cálculos quânticos foi executada
com o pacote computacional Molekel 4.2 (PORTMANN e LÜTHI, 2000). Os mapas
foram montados no programa Paint da Microsoft.
4.10 Cálculos dos Parâmetros Estéricos Moleculares
No estudo de correlação entre os efeitos estruturais com as propriedades
químicas e físicas é necessária uma diferenciação entre os efeitos estéricos e
efeitos eletrônicos em relação à atividade biológica estudada. Nos estudos
29
tradicionais de compostos químicos existem publicações onde teorias e protocolos
são avaliados na separação quantitativa destes efeitos, desde os primeiros trabalhos
desenvolvidos pela Equação de Taft (TAFT, 1956; CHAPMAN e SHORTER, 1972;
SHORTER, 1973; WILLIAMS, 2003). Propriedades como volume, superfície,
polarizabilidade e refratividade influenciam tanto o aspecto conformacional, quanto a
solubilidade ou reatividade, sendo importante para determinar o melhor desempenho
de uma molécula como um ligante de uma proteína em estudo.
30
5 RESULTADOS E DISCUSSÃO
5.1 Derivados do Paracetamol
As geometrias moleculares de P1–P14 e do paracetamol foram otimizadas
pelo método B3LYP/6-31G(d) são apresentadas na figura 9. As análises de
geometria molecular indicam que os compostos apresentam um efeito de
ressonância no grupo amida, exceto para o composto 3,5-diclorado (P7), indicando
um possível aumento da carga negativa no oxigênio carbonílico.
P1 P2
P3 P4
P5 P6
P7 P8
FIGURA 9: Geometria molecular de derivados acil-éter do paracetamol.
31
P9 P10
P11 P12
P13 P14
PAR
FIGURA 9: Geometria molecular de derivados acil-éter do paracetamol (continuação).
Estes resultados são importantes para um estudo de relação estrutura e
atividade, uma vez que as moléculas devem ter certo grau de homologia, permitindo
que a atividade biológica seja produzida por um mesmo mecanismo de interação
química entre o fármaco e o receptor, embora outras propriedades possam variar,
principalmente aquelas relacionadas com os parâmetros farmacocinéticos, tais como
a solubilidade. Portanto, para uma maior avaliação do potencial molecular, uma
32
análise de cargas moleculares e do mapa do potencial eletrostático (MEPs) podem
ser utilizados. O mapa do potencial eletrostático para o paracetamol e seus 14
derivados acil-éter esta descrito na figura 10.
P1 P2
P3 P4
P5 P6
P7 P8
FIGURA 10: MEPs de derivados acil-éter do paracetamol.
33
P9 P10
P11 P12
P13 P14
PAR
FIGURA 10: MEPs de derivados acil-éter do paracetamol (continuação).
34
De fato, as mesmas características geradas pelo deslocamento eletrônico
foram observadas para os mapas do potencial eletrostático para o paracetamol e
seus derivados, pois os mapas de potencial eletrostáticos 3D (MEPS) tanto do
paracetamol quanto de seus respectivos derivados, mostrados na figura 11,
apresentam duas regiões vermelhas onde altas cargas negativas são esperadas, ao
qual representam melhor probabilidade de ataque eletrofílico. No entanto, podemos
observar uma assimetria entre as duas regiões, onde a região carbonílica se
apresenta mais eletrofílica do que a região de éter ou fenol.
Por outro lado, a região azul, representa a área a qual a carga positiva é
predita de ocorrer maior probabilidade de ataque nucleofílico, presente
principalmente nos grupamentos amida e fenol. A nucleofilicidade do sistema
aromático p-aminofenol é influenciado pelos grupamentos elétron doadores ligados
nas posições 3,5, seja alquílicos, fenílicos ou benzílicos.
O potencial também é alterado pela presença de grupos alquil volumosos
tanto na amida quando no éter. Porém, uma avaliação quantitativa da carga
molecular pode ser obtida usando o método do potencial eletrostático. As cargas
moleculares do oxigênio da carbonila estão descritas na tabela 8 e serão usadas nos
estudos de QSAR.
O orbital molecular ocupado de maior energia (HOMO) é um importante
parâmetro eletrônico da estrutura molecular. Os coeficientes das regiões de HOMO
representam as regiões com capacidade doadora de elétrons, os sítios de interação
com um receptor eletrofílico e revela os grupos responsáveis pelo deslocamento de
elétrons na estabilização de um radical livre em uma provável reação de
transferência de elétrons.
Como visualizado na figura 11, são identificadas as regiões nucleofílicas dos
derivados estudados, onde as estruturas de ressonâncias indicam que a
participação do grupo amida e do fenol ou fenóxido são essenciais para a formação
do sistema de elétrons. A participação dos grupos metila ou metileno é mais
efetiva quando estão ligados ao éter do que no grupo amida. Além disso, tanto
grupos alquil quanto fenil são muito efetivos como doadores de elétrons. As mesmas
propriedades são observadas para todos os compostos.
35
P1 P2
P3 P4
P5 P6
P7 P8
P9 P10 FIGURA 11: HOMO de derivados acil-éter do paracetamol.
36
P11 P12
P13 P14
PAR
FIGURA 11: HOMO de derivados acil-éter do paracetamol (continuação)
Após este estudo de relação estrutura e atividade qualitativa, alguns
parâmetros teóricos que descrevem as propriedades eletrônicas, estéricas e de
solubilidade foram selecionadas para o estudo da relação estrutura e atividade
quantitativa (QSAR) usando valores das atividades analgésicas e anti-inflamatórias
de derivados acil-éter do paracetamol. Estes valores são mostrados na tabela 8.
37
Um estudo de QSAR foi realizado pela correlação entre valores de atividade
analgésica e propriedades teóricas, usando os parâmetros eletrônicos, estéricos e
solubilidade, através da matriz de correlação, que está apresentada na tabela 9.
O potencial de ionização (PI) representa a facilidade da doação do elétron do
PAR e seus derivados acil-éter 3,5 dissubstituídos. Toda a alteração estrutural onde
o grupo acetamida foi convertido em butilamida observa-se pequena redução do
valor do PI e as moléculas mostraram-se menos ativas como analgésico nas doses
estudadas. Não obstante, quando o grupo hidroxil foi convertido às funções éter, o
valor do PI diminuiu e a atividade antiinflamatória aumentou somente para o grupo
etoxi, mas não para o grupo benziloxi. Ao contrário, nas outras substituições na
posição éter, tais como os grupos metoxi e t-butoxi, houve aumento do valor do PI e
a atividade foi reduzida. Logo, podemos observar que o grupo etoxi tem um melhor
ajuste na cavidade formada pela interação fármaco-receptor. Adicionalmente,
substituintes elétron-doadores ou grupos alquil ou aril nas posições 3,5 (–CH3, –
CH2CH3, –CH(CH3)2, –C(CH3)3, –C6H5 e –CH2C6H5) diminuíram o valor do PI
resultando na melhor inibição da atividade inflamatória, enquanto elétron-
retiradores, como substituintes halogênicos (-Cl) aumentou o valor do PI e diminuiu a
capacidade de inibição inflamatória.
Os resultados estão de acordo com trabalhos anteriores, onde o HOMO e
LUMO tiveram uma boa correlação para a atividade anti-inflamatória para o método
in vitro de avaliação biológica para análogos 3,5-dissubstituídos do paracetamol
(DINIZ et al. 2004). Geralmente, moléculas com baixos valores de LUMO e altos
valores de HOMO são mais ativas. Nos compostos P1 e P3 , onde o grupo
acetamida foi substituído pelo butilamida e t-butoxi, o valor do HOMO teve um
pequeno aumento, enquanto que o valor de LUMO diminuiu. Logo, nestes
compostos, a atividade analgésica diminuiu. Além disso, moléculas onde o grupo
fenol foi substituído pelo grupo éter, os compostos são mais eficazes como drogas
anti-inflamatória. Nos compostos P12 e P14, grupos elétron-doadores, tais como -
OCH2CH2CH2CH3, -C6H5, e -CH2C6H5 substituídos no fenol ou em posições 3,5, o
valor de HOMO aumentou, resultando na melhor inibição inflamatória. Por outro
lado, átomos de halogênio (-Cl) elétron-retiradores diminuíram o valor de HOMO,
resultando em diminuição da capacidade de inibição inflamatória para P7.
38
39
Estes resultados estão de acordo com o mecanismo hipotético proposto para
a atividade biológica do paracetamol e análogos 3,5-dissubstituídos, através da via
radicalar com conseqüente perda de elétron ou de hidrogênio. Conseqüentemente, o
mecanismo de inibição da produção de prostaglandina começa pela doação de um
átomo de hidrogênio ou um elétron no sitio ativo da PGES, onde um grupo tirosil é o
responsável pela etapa inicial de oxidação do ácido araquidônico ou na reação de
produção do álcool endoperóxido cíclico PGH2, como mostrado na figura 12. Como
os derivados fenólicos podem reagir com o tirosil, passam para a forma de
semiquinona ou cátion radical livre, respectivamente. Portanto, a potência anti-
inflamatória pode estar relacionada a capacidade de oxidação dos derivados
fenólicos, sugerindo uma ligação entre capacidade antioxidante dos derivados
fenólicos na inibição da COX (DUFFY et al. 2001).
OO
OHOH
H
NHN
NNH
HO
Tir-348
Tir-385
Ser-530
His-207
His-388
Heme
AraquidonatoHidroperóxido
N
N N
NFe
O OHR
FIGURA 12: Reação do ácido araquidônico com tirosil-385 da COX e peroxidase.
Os resultados obtidos para o potencial de ionização mostrou um valor de
correlação de 0,48 para avaliação in vivo. Este valor de correlação para esta
propriedade é mais baixo do que o encontrado, uma vez que quando o método de
avaliação da atividade foi in vitro o nível da correlação foi de 0,88 (DINIZ et al. 2004).
Todavia, muitos fatores devem ser considerados, tais como a diferença no número
de moléculas entre os dois estudos, tendo o método in vivo o dobro de moléculas,
assim como o efeito de solubilidade. Não obstante, como o potencial de ionização
teve boa correlação com o teste biológico, expressando a relação com a saída do
elétron para derivados acil-éter do paracetamol, outro modelo de interação deve ser
pesquisado e a solubilidade deve ser considerada.
40
Tabela 9. Matriz de correlação para atividade anti-inflamatória.
DE30 PI HOMO LUMO EH CLogP Sup Vol Ref Pol
DE30 1
PI 0,48 1
HOMO -0,39 -0,96 1
LUMO -0,00 -0,34 0,38 1
EH 0,02 0,53 -0,65 -0,12 1
CLogP -0,41 -0,21 0,07 0,17 0,58 1
Sup -0,17 -0,27 0,21 0,35 0,47 0,86 1
Vol -0,39 -0,46 0,30 0,35 0,29 0,88 0,82 1
Ref -0,38 -0,44 0,23 0,19 0,21 0,75 0,59 0,94 1
Pol -0,37 -0,44 0,24 0,19 0,21 0,76 0,62 0,94 0,99 1
Um modelo hipotético que demonstra a variação de interação entre o
paracetamol e seus derivados acil-éter foi baseado no cálculo de energia de
estabilização resultante da transferência de elétrons entre duas espécies cátion
radical livre. A energia de estabilização (Eiso) é usada como um simples método de
predição da habilidade dos derivados acil-éter do paracetamol atuarem como
candidatos a AINEs através do seqüestro do radical tirosil (Tir-385). Os maiores
valores negativos demonstram a maior efetividade da reação.
Os valores de Eiso são mostrados na tabela 10. De acordo com estes valores
é possível estabelecer a seguinte estabilidade relativa para os radicais em posições
específicas: um aumento no tamanho do grupo alquila aumenta o valor de Eiso,
devido ao fato que o aumento no número de átomos de carbono no grupo fenóxido,
na acilamida, ou nas posições 3 e 5, são responsáveis pela doação de elétrons tipo
ou e indicam uma estabilidade do cátion radical formado. Entretanto, moléculas
que apresentaram diversas formas de ressonância foram mais estáveis do que o
efeito indutivo, aumentando o valor de Eiso. Ao contrário, substituições com
halogênio nas posições 3 e 5 decresceram o valor de Eiso e mostraram menor valor
de atividade anti-inflamatória. Entretanto, a presença de grupos fenila nas posições
3 e 5 mostrou o maior valor de Eiso. Este derivado pode estabilizar o radical livre
formado durante a oxidação, pelo aumento da conjugação via efeito de ressonância,
contribuindo para o aumento de Eiso. Não obstante, esta molécula não foi avaliada.
41
Este resultado demonstra que o paracetamol e derivados poderão inibir a
síntese de prostaglandina pela destruição do radical livre tirosil da COX, mais
especificamente, uma reação competitiva entre as espécies, radical tirosil e
hidrogênio metilênico do ácido araquidônico, no sítio ativo da PGES, não havendo
correlação entre os resultados obtidos teoricamente e a resposta biológica.
TABELA 10: Energia de estabilização entre derivados acil-éter do paracetamol e tirosil radical.
NH OR1
OR2
R4R3
NH
OH
+
HNO
O NH OR1
OR2
R4R3
NH
OH
+
HNO
O
Eiso
Compostos PhOH
(H)
PhOH●+
(H) Eiso
(kcal/mol)
Tirosil -761,591953 -761,2992197 0
1 -633,4223125 -633,1515817 (-13,81)
2 -672,7330409 -672,4691400 (-18,09)
3 -790,6747292 -790,4136509 (-19,86)
4 -672,7351882 -672,4670831 (-15,45)
5 -751,3626157 -751,0927409 (-14,34)
6 -829,9850986 -829,7192455 (-16,87)
7 -1513,287917 -1512,996105 (-0,58)
8 -746,5245430 -746,2620415 (-18,97)
9 -712,0436422 -711,7723825 (-13,47)
10 -864,4711598 -864,2014707 (-14,46)
11 -785,8472473 -785,5825341 (-17,58)
12 -977,5917150 -977,3390327 (-25,13)
13 -672,7340761 -672,4588306 (-10,97)
14 -829,9819826 -829,7255462 (-22,76)
PAR -515,4799833 -515,2078459 (-12,92)
42
NHO
OH
NHO
O
NHO
O
T1 T2 T3
T4 T5 T6
NHO
O
NHO
O
NHO
O
NHO
OCl Cl
T7
T8 T9
NHO
O
NHO
O
T10 T11
T12
NHO
O
NHO
OH
T13 T14
NHO
OH
NHO
OH0.15
0.05
0.04
0.21
0.08
0.28
0.020.03
0.16
PAR
NHO
OH
NHO
O
0.14
0.07
0.03
0.20
0.10
0.22
0.04
0.02
0.22
0.19
0.03
0.21
0.10
0.18
0.07
0.06
0.19
0.19
0.08
0.06
0.20
0.09
0.190.03
0.20
0.08
0.060.18
0.10
0.33
0.09
0.19
0.05
0.080.19
0.10
0.36
0.09
0.21
0.08
0.05
0.01
0.19
0.10
0.34
0.09
0.01
0.22
0.06
0.08
0.34
0.10
0.14
0.09
0.22
0.05
0.060.18
0.11
0.36
0.11
0.21
0.03
0.08
0.30
0.09
0.15
0.08
0.18
0.16
0.02
0.02
0.18
0.06
0.19
0.09
0.04
0.21
0.13
0.11
0.07
0.17
0.08
0.23
0.21
0.16
0.08
0.080.20
0.11
0.27
0.07
0.22
0.14
0.10
0.05
0.14
0.07
0.280.04
0.08
0.13
0.02 0.02
0.04
0.20
0.15
0.02
0.04
0.22
0.10
0.20
0.03
0.07
0.21
0.03
0.030.02
FIGURA 13: Contribuição de densidade de spin para o paracetamol e derivados.
Além disso, o cálculo da densidade de spin para uma abstração inicial do
elétron nos derivados acil-éter do paracetamol (figura 13) mostra contribuição
P P P
P P P P
P P P P
P P P
43
principalmente no átomo oxigênio fenólico O7 (13-15%), nos átomos de carbono C3
e C5 da posição orto (2-7%) e do carbono C1 na posição para (13-34%). A posição
fenóxido substituídos por grupos -CH3, -CH2CH3 ou -C(CH3)3 mostraram uma
contribuição de 5-8%.
Entretanto, quando fenóxido está substituído por grupos -CH2CH2CH2CH3 a
contribuição aumenta (15-18%), no entanto, quando é o grupo -CH2C6H5 a
contribuição diminui para 3%. A contribuição do nitrogênio da amida é 14-22%,
enquanto que do oxigênio carbonílico é 7-11%. As outras posições são quase na
mesma ordem de valores maior para os menos ativos, e menor para os mais ativos.
Estes resultados são similares aos obtidos nos estudos com análogos 3,5-
dissubstituídos (DINIZ et al. 2004).
A menor contribuição do elétron desemparelhado nas posições fenóxido,
amida e carbonila explicam a maior atividade anti-inflamatória para os derivados P4,
P5 e P6 e P14. Entretanto, a maior contribuição do elétron desemparelhado destas
posições esclarece a atividade anti-inflamatória ineficaz para os derivados P1, P2 e
P3.
Os parâmetros de solubilidade foram utilizados buscando a correlação com
fenômenos de absorção e transporte das moléculas. O coeficiente do logaritmo de
partição (ClogP) e a energia da hidratação (EH) foram calculados para os derivados
acil-éter do paracetamol. A potência anti-inflamatória dentro desta série aumenta
com valores de ClogP e EH. Substituintes alquila ou arila aumentam o ClogP e
diminuem valores de EH. O aumento do tamanho do substituinte aumenta a
hidrofobicidade. Esta hidrofobicidade dos grupos alquila ou arila aumentam na
ordem para acilamida: (–NHCOCH3 < –NHCOCH2CH2CH2CH3 < –NHCOC6H5),
enquanto que, tanto para alcóxido, quanto para posições 3 e 5 substituídos a ordem
é a seguinte: (–CH3 < –CH2CH3 < –CH(CH3)2 < –C(CH3)3 < –CH2CH2CH2CH3 <
–C6H5 < –CH2C6H5).
Estes resultados estão de acordo com Duffy e col. (2001) para o logP . A
baixa correlação pode ser devido aos altos valores de ClogP e baixos valores de EH
que modificam substancialmente as propriedades de ADME (absorção, distribuição,
metabolismo e excreção) ou aumentam o efeito estérico no sítio receptor. De fato,
um aumento de propriedades estéricas, tais como o volume, superfície, refratividade
e polarizibilidade, diminui a atividade anti-inflamatória. Logo, diferente dos métodos
in vitro, métodos in vivo são dependentes das propriedades de ADME.
44
Não obstante, ao contrário de estudos previamente realizados por métodos in
vitro, pouca ou nenhuma correlação foi estabelecida entre as propriedades
eletrônicas ou de solubilidade calculadas e a atividade anti-inflamatória in vivo, como
mostrado na tabela 9. Isto sugere que outros fatores, tais como hidrofobicidade e
efeitos estéricos sejam mais significativos em determinar a atividade dentro desta
série de compostos. A posição de grupos volumosos pode ser responsável pelo
impedimento estérico, preferencialmente as interações entre os grupos fenóxido,
alquila ou arila nas posições 3 e 5. Além disso, é possível que a avaliação da
atividade anti-inflamatória, usando o ensaio do edema da pata de rato induzido por
carragenina, não descreva a maior tendência entre a estrutura e a atividade para
estes derivados acil-éter do paracetamol, por causa da lipofilicidade elevada destes
compostos, o que é justificado pelos resultados alcançados, com moléculas
incalculadas ou inativas, onde o índice de inibição inflamatória foi somente a DE30.
Além disso, os resultados mostram também que o método in vitro (BESSEMS et al.
1995; DINIZ et al. 2004) pode ter mais correlação com descritores teóricos do que
métodos clássicos de avaliação biológica.
5.2 Derivados de Pirazolona
O estudo de relação estrutura e toxidade de moléculas derivadas da
pirazolona, antipirina P15, isopropilantipirina P16, aminopirina P17 e dipirona DIP
(Figura 11) foram selecionas de acordo com os trabalhos de Costa e col. (2006).
NNH3C
H3C
ONNH3C
H3C
O NNH3C
H3C N
O
H3C CH3H3C
CH3
NNH3C
H3C N
O
H3C SO3 Na
P15 P16 P17 DIP
1
23 4
56
7
1'6'
5'4'
3'
2'
FIGURA 14: Estrutura e numeração dos derivados de pirazolona.
As propriedades teóricas observadas no atual estudo são demonstradas na
tabela11. Nossos resultados revelam que a toxidade está associada com algumas
45
variáveis como valores de PI e de HOMO. Outros parâmetros foram estudados, mas
seus resultados não descreveram a toxidade e modo de ação na agranulocitose.
A energia do orbital de fronteira é um parâmetro importante da reatividade por
doação ou acepção elétrons na estrutura molecular. Se a molécula tem o valor mais
baixo do HOMO tem a capacidade de doação fraca do elétron. Ao contrário, o valor
mais elevado do HOMO implica que a molécula é um bom doador de elétron
(QUEIROZ et al. 2009). A disposição do HOMO de derivados pirazolonas pode
indicar o sítio ativo de seqüestro de radicais livres qualitativamente por
transferências de elétron. Enquanto o potencial de ionização (PI) representa a
facilidade de doação do elétron de derivados das pirazolonas.
Moléculas com hidrogênio ou alquila na posição 4 mostraram valores do
HOMO de -5,62 eV para a antipirina e -4,88 eV para o propilfenazona (PORTMAN e
LUTHI, 2000). Uma substituição do grupo hidrogênio ou alquila por grupo amino
aumentou os valores de HOMO. De fato, o valor do HOMO é -5,06 eV para o
aminopirina (QUEIROZ et al. 2009) e -1,67 eV para o dipirona (DIP).
Conseqüentemente, o resultado indica que compostos com nitrogênio na posição C4
têm maior capacidade doadora de elétrons. De acordo com os resultados, a dipirona
é o composto mais nucleofilico, teoricamente.
TABELA 11: Propriedades teóricas e biológicas de derivados da pirazolonas.
Compostos HOMO
(eV) PI
(kcal/mol) Atividade Sequestrante
Toxidade O2
•- H2O2 HO• HOCl ROO•
P15 -5,62 170,49 – – + + – –
P16 -4,88 168,69 – – ++ ++ – –
P17 -5,06 157,13 – – ++++ ++++ + +
DIP -1,67 76,89 – – ++++ ++++ ++ +
Como o PI representa a doação de elétron dos derivados de pirazolona e a
abstração de elétron é o primeiro mecanismo antioxidante, os valores de PI foram
considerados. Os valores de PI são 170,49 kcal/mol para antipirina (15), 168,69 kcal
/mol para a propilfenazona (16), 157,13 kcal/mol para aminopirina (17) e 76,89 kcal/
mol para a dipirona (DIP). Assim, moléculas com menores valor de PI tem maior
caráter elétrons doador. Portanto, os substituintes por grupos elétron-doadores na
posição 4 (-N(CH3) ou -N(CH3)CH2SO3) são importantes, pois diminuem os valores
46
do PI, resultando em melhor propriedade antioxidante, enquanto fracos substituintes
elétron-doadores (-H ou -C(CH3)2) aumentam o valor do PI, resultando na diminuição
da capacidade antioxidante.
Estes resultados estão de acordo com os resultados obtidos por Costa e col.
(2005). Em seu estudo, tanto a aminopirina quanto a dipirona impediram o “burst” de
neutrófilo induzido por 12-miristato-13-acetato de forbol com elevada eficiência,
enquanto que a isopropilantipirina teve pouco efeito e a antipirina não teve nenhum
efeito. Geralmente, a inibição da ativação do neutrófilo pode ser devida à inibição de
enzimas produtoras de ERO ou pelo efeito sequestrante direto sobre as ERO.
Levando em consideração que a principal ERO produzida por neutrófilo é mediada
pela NADPH-oxidase, gerando ânion superóxido (O2•-), com formação subseqüente
de peróxido de hidrogênio (H2O2), radical de hidroxil (HO•), lipoperóxido (ROO•) e
ácido hipocloroso (HOCl) produzido por MPO (XIA e ZWEIER, 1997). Portanto, é de
grande interesse investigar os mecanismos do efeito sequestrante das pirazolonas
estudados frente a estas espécies reativas.
No trabalho atual, os valores de HOMO e PI de derivados pirazolonas foram
estudados. Nossos resultados mostraram aumento da capacidade sequestrante de
radical livres em correlação com os valores de HOMO e PI na seguinte ordem:
antipirina (15) < propilfenazona (16) < aminopirina (17) < dipirona (DIP). Estes
valores estão de acordo e mostraram uma correlação entre a atividade sequestrante
e propriedades antioxidantes. Os resultados mostram claramente que aminopirina e
dipirona são sequestrantes altamente poderosos de HO• e HOCl, de acordo com
resultados do “burst” de neutrófilos, a isopropilantipirina teve pouco efeito e a
antipirina mostrou somente um efeito residual frente a estas duas ERO. Todavia,
nenhuma das pirazolonas estudadas foi capaz de sequestrar O2•- ou H2O2, enquanto
que a dipirona se mostrou mais reativa frente ao radical ROO•. Estes resultados
podem estar relacionados com seus valores de HOMO e PI.
A observação de uma correlação na reatividade das pirazolonas pela doação
de elétron frente à produção de EROs por neutrófilos pode ajudar a compreender
sua possível contribuição com a agranulocitose. Dois tipos principais de
agranulocitose induzidos por drogas foram descritos, um do tipo imunológico, o qual
é causado por anticorpos induzido por droga, e outra do tipo tóxico, onde a droga
causadora e/ou seus metabólitos suprimem a produção de célula na medula
(PATTON e DUFFUL, 1994).
47
No que diz respeito às pirazolonas analisadas no trabalho atual, a aminopirina
por muito tempo tem sido associado com uma incidência elevada de agranulocitose
(UETRECHT et al.1995) e é a droga melhor caracterizada no que diz respeito a sua
reatividade química e biológica. Certamente, diversos estudos encontraram fortes
evidências, indicando que o mecanismo da aminopirina induzindo agranulocitose
envolve um anticorpo anti-neutrófilo droga-dependente que exige ligação covalente
da droga, ou, o mais provavelmente, um derivado reativo da droga interagindo no
neutrófilo (UETRECHT et al. 1995). Conseqüentemente, a geração de um derivado
aminopirina-reativo pode ser realizado pela sua oxidação. Isto é possível por causa
de seus mais baixos valores de HOMO e de PI. De fato, no estudo atual, observou-
se que a aminopirina e a dipirona são altamente reativas com HO•, ROO• e HOCl
porcausa de seus altos valores de HOMO e baixos valores de PI.
O HOMO (Figura 15) e o LUMO (Figura 16) são os principais orbitais usados
em um estudo de reatividade química.
P15 P16
P17 DIP
FIGURA 15: Gráfico da distribuição de elétrons no HOMO de derivados da pirazolona.
48
A energia de HOMO que caracteriza a capacidade de doação de elétron é
apropriada para representar a eficiência das pirazolonas em seqüestrar os radicais
livres porque o processo para inibir a oxidação do radical pode incluir a transferência
de elétron. O HOMO e LUMO são orbitais do tipo π, cujos elétrons estão
deslocalizados nos anéis fenil ou pirazolona. Considerando a disposição do HOMO,
as moléculas tóxicas mostraram sua contribuição no anel pirazolona por causa do
grupo amino, enquanto que as moléculas não-tóxicas mostraram sua contribuição no
anel fenil.
P15 P16
P17 DIP FIGURA 16: Gráfico da distribuição de elétrons no LUMO de derivados da pirazolona.
Ao contrário, considerando a disposição do LUMO, as moléculas tóxicas
mostraram a contribuição principal no anel fenil por causa do grupo amino, enquanto
que as moléculas não-tóxicas mostraram sua contribuição no anel pirazolona. Estes
resultados mostraram que o grupo nitrogênio da posição 4 pode ser atacado
49
facilmente por qualquer um dos agentes eletrofílicos, tais como radicais livres ou
íons metálicos, gerando intermediários reativos na agranulocitose.
De fato, a oxidação da aminopirina ou dipirona por HOCl gerado por MPO de
neutrófilo foi previamente relatado, conduzindo à formação de um cátion radical de
pirazolona (CRP+), a que foi atribuída a potencial toxidade fatal da medula,
conduzindo à agranulocitose (KALYANARAMAN e SOHNLE,1985; SAYO e SAITO,
1990). Foi proposto que o mecanismo pelo qual aminopirina oxida HOCl para um
cátion radical envolve a N-cloração seguida pela perda de um radical cloreto (SAYO
e SAITO,1990). Outro mecanismo possível é a formação de um dicátion pela perda
de íon cloreto de N-cloroaminopirina (UETRECHT et al. 1995). Este intermediário é
muito reativo, com uma meia vida de aproximadamente 15ms.
Adicionalmente, sendo o precursor do cátion radical, parece reagir igualmente
com duas moléculas de água para formar diversos outros produtos que são
consistentes com o intermediário dicátion proposto (UETRECHT et al. 1995). Assim,
de acordo com Uetrecht e col. (1995), o dicátion reativo formado por HOCl de
neutrófilo pode igualmente ser responsável pela agranulocitose induzida por
aminopirina. A formação de CRP+ foi mostrada da mesma forma, como mediadora
de outros sistemas enzimáticos, tais como a prostaglandina endoperóxido-sintase
(ELING et al. 1985), lipoxigenase (PÉREZ-GILABERT et al. 1997) e peroxidase
(GRIFFIN, 1977; GRIFFIN e TING, 1978).
Portanto, a reatividade química das pirazolonas pode ser relacionada com
contribuições da densidade de spin do seu cátion radical de pirazolona (CRP+), pois
as estruturas de ressonância do cátion radical livre produzido pela abstração dos
elétrons podem ser observadas pela distribuição das densidades de spin para os
derivados da pirazolona.
A figura 17 mostra a distribuição das densidades de spin para o cátion radical
livre dos derivados das pirazolonas. O cálculo da densidade de spin para a
abstração inicial do elétron para antipirina (P15) mostrou sua contribuição no anel
pirazolona (56%), oxigênio carbonílico (27%) e no anel fenila (36%). Entretanto, no
grupo isopropil na propilfenazona (P16) pode ser observada uma contribuição de
38%, com redução da contribuição no anel pirazolona (26%), oxigênio (7%) e
nenhuma contribuição no anel fenila. Algumas contribuições do propilfenazona (P16)
foram observadas para a aminopirina (P17) e dipirona (DIP). Não obstante, a
dipirona mostrou uma contribuição adicional no grupo sulfonato (SO3) de 24%. As
50
contribuições de 36% (P17) e 38% (DIP) dos nitrogênios das posições são
significativamente expressivas, quando comparadas com o valor de 1% de T16.
Conseqüentemente, os substituintes elétron-doadores ligados ao carbono C4,
(-C(CH3)2, -N(CH3)2 e -N(CH3)CH2SO3 diminuíram a contribuição dos anéis
pirazolona e fenila, assim como do oxigênio carbonílico.
0.01
0.17
0.27
0.27
0.12
0.060.09
0.19
0.08
0.00
T15
0.16
0.220.00
0.01
0.280.21
0.050.060.07
0.00
T16
0.09
0.04
0.01
0.36
0.160.16
0.020.020.02
0.04
T16
0.030.000.01
0.38
0.07
0.07
0.00
0.000.00
0.16
0.080.09
0.06
0.01
T17
0.15
0.05
FIGURA 17: Distribuição da densidade de spin para derivados de pirazolonas.
Estes resultados explicaram a ocorrência do cátion radical livre, como um
possível radical intermediário na agranulocitose. Muitas evidências têm sido
acumuladas para o envolvimento de intermediário radical livre na toxidade usando
os métodos teóricos (SILVA et al. 2009; ALVES et al. 2006; DINIZ et al. 2004).
Finalmente, os valores de densidade de spin são plenamente compatíveis
com os mapas do potencial eletrostático. O MEPs da densidade total de elétrons são
apresentados na figura 18, para os exemplos que pertencem a cada um das duas
classes (tóxico e não tóxicos). Todos os derivados das pirazolonas mostram um
potencial negativo de cor vermelha, localizados na carbonila do anel pirazolona,
enquanto que o potencial positivo, de cor azul, está situado em todos os grupos
metílicos. A presença de pontos adicionais negativos do potencial eletrostático no
P
P
P
P
51
grupo dimetilamina conectado ao grupo sulfonato da posição 4, pode conduzir a uma
maior nucleofilia ou atividade antioxidante melhor, mas possivelmente, aumenta a
suscetibilidade à agranulocitose. Portanto, os perfis do potencial eletrostático para
compostos com o grupo amino são significativamente diferentes.
Este fato indica o grupo amino unido diretamente no anel pirazolona como
determinante na definição do comportamento eletrônico. É importante frisar que
apenas usamos MEPs para postular diferentes formas de interação entre estas
moléculas e radicais livres. Entretanto, o MEPs não é uma entidade estática, isto é,
o potencial muda quando o ligante se aproxima do sítio receptor apenas como faz a
respectiva densidade de elétron. Não obstante, a análise dos MEPs isolados é útil
para sugerir a maneira que a reação aproxima o radical livre, e conseqüentemente
prever o retrato total de uma interação bem sucedida entre os fármacos e o radical
livre.
T15 T16
T17 DIP
FIGURA 18: Distribuição do MEPs para derivados de pirazolonas.
P
P
P
52
5.3 REA e Uso Racional de Medicamentos
Os medicamentos modernos ocupam um papel importante nos
sistemas sanitários, pois salvam vidas e melhoram a saúde. No entanto, existem
milhões de pessoas com doenças comuns, como pneumonia, malária, tuberculose,
hipertensão e outras tantas enfermidades, sujeitas a vicissitudes freqüentemente
relacionadas aos tratamentos medicamentosos. Como exemplos, temos: falta de
acesso a um tratamento adequado ou a recursos para sua aquisição; uso de
medicamentos de baixa qualidade, resultando em processos falhos de seleção,
abastecimento e controle da qualidade; erros de medicação – tais como dose
errada, medicamento errado, posologia errada, duração errada etc.; falta de
orientação quanto ao tratamento, resultando em baixa adesão, mau uso,
inefetividade. No entanto, há maior falta de informação quanto às propriedades
moleculares dos fármacos empregados atualmente na terapêutica, relacionadas com
os efeitos colaterais e reações adversas.
Os estudos de REA obtidos com os descritores moleculares apresentaram
uma boa capacidade de predição das atividades biológicas, relacionando resposta
biológica com parâmetros eletrônicos, estéricos e de solubilidade. Isso representa
um grande avanço no estudo teórico de fármacos e na previsão e auxílio dos
problemas relacionados ao uso de medicamentos.
A importância da modelagem molecular de fármacos e do estudo de REA no
que se refere à segurança, potência e baixa toxidade se tornaram bastante
relevante, haja vista o crescente aumento da quantidade de medicamentos no
mercado exposto à população e a baixa segurança que estes produtos oferecem.
Além disso, as informações sobre os estudos de REA podem ser utilizados com
maior racionalidade pela equipe de saúde a fim de se obter um melhor entendimento
a cerca da atividade biológica, dos riscos associados ao medicamento, das
interações medicamentosas e reações adversas.
Os estudos de modelagem molecular e REA permitem criar grandes banco de
dados genômicos, celulares e moleculares que, associados a informações clínicas,
possibilitam apontar características estruturais importantes para a atividade biológica
e reações adversas, permitindo desta forma uma conduta terapêutica personalizada
com base no risco genético individual o que conduzirá a otimização da eficácia e
minimização dos efeitos colaterais dos medicamentos. Estes estudos também
53
podem permitir realizar ensaio virtual (virtual screening) para prever a capacidade do
medicamento sobre as propriedades de ADMET.
Os medicamentos são considerados a principal ferramenta terapêutica para
recuperação ou manutenção das condições de saúde da população, assim, a
promoção do uso racional dos medicamentos juntamente com a modelagem
molecular são ferramentas importantes de atuação junto à sociedade, para senão
eliminar, mas minimizar os problemas relacionados ao medicamento. Desta maneira,
faz-se necessário atentar para o uso racional dos medicamentos, de forma que os
pacientes recebam os medicamentos para a indicação apropriada, nas doses, via de
administração e duração apropriadas; que não existam contra-indicações; que a
probabilidade de ocorrência de reações adversas seja mínima; que a dispensação
seja correta e que haja aderência ao tratamento (SOBRAVIME, 2001).
O uso apropriado e inteligente dos medicamentos como tecnologia altamente
custo-efetiva, uma vez que pode influenciar, de modo substantivo, a utilização do
restante do cuidado médico. Por outro lado, podem aumentar os custos da atenção
à saúde se utilizados inadequadamente e ou levar à ocorrência de reações adversas
a medicamentos (PEPE e CASTRO, 2000). Fica evidente que os riscos relativos ao
mau uso de medicamentos estão diretamente relacionados com a má qualidade da
oferta dos medicamentos e dos serviços de saúde.
A qualidade da oferta do medicamento na atenção farmacêutica e a
segurança deste produto, proposto pela modelagem molecular, são um papel de
grande relevância que podem contribuir para, a diminuição dos agravos provocados
por medicamentos, e consequentemente, para o uso racional dos mesmos através
da adequada prescrição, dispensação e utilização.
Segundo Arrais, 1997, uma “prescrição errônea” pode ter como
conseqüência efeitos indesejáveis, enfermidades iatrogênicas e mascaramento de
doenças evolutivas, onde é evidente que o risco dessa prática está correlacionado
com a qualidade da informação sobre medicamento utilizada pelos profissionais.
Estudos desta natureza devem ser encorajados, principalmente aqueles
relacionados com politerapia, onde os riscos potenciais estão aumentados. Com
estudos de propriedades eletrônicas relacionados com a toxicidade, o profissional
pode certificar-se de estar dispensando um medicamento seguro. Contudo é um
trabalho árduo, mas que pode contribuir de maneira substancial para a promoção do
uso racional de medicamentos.
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6 CONCLUSÕES
• A base B3LYP/6-31G(d) mostrou a relação entre os descritores teóricos com a
atividade e toxidade dos análogos 3,5 disubstituídos acil-éter do paracetamol e
derivados de pirazolonas, respectivamente.
• O potencial de ionização (PI) mostrou maior correlação com atividade anti-
inflamatória, onde substituintes elétron-doadores diminuem o valor do PI obtendo
melhor inibição inflamatória e substituintes elétron-retiradores aumentam o valor do
PI e diminuem a capacidade de inibição inflamatória.
• As moléculas mais ativas mostraram maior valor do HOMO e o menor de LUMO.
Estes valores, juntamente com o PI indicam que estas moléculas agem por um
mecanismo de transferência de elétrons.
• Grupos alquil ou aril aumentam o ClogP e diminuem valores da energia de
hidratação pelo tamanho e hidrofobicidade, pois o maior impedimento estérico, pelo
aumento do volume, superfície, refratividade e a polarizabilidade, diminui a atividade
anti-inflamatória.
• A menor ou maior contribuição do elétron desemparelhado nas posições fenoxi, N-
acilamina e O-carbonil explicam a maior ou menor atividade anti-inflamatória,
respectivamente.
• Estudos de REA usando métodos in vivo apresentam mais baixos valores de
correlação quando comparado com métodos in vitro, indicando que os métodos in
vivo são dependentes das propriedades de ADME.
• Os métodos teóricos selecionaram os parâmetros relacionados ao risco de
agranulocitose associado ao uso das pirazolonas.
• Os valores de HOMO e de PI estão de acordo com atividade sequestrante das
pirazolonas, e explicam uma possível associação entre sua reatividade com ERO e
a possível formação de intermediários reativos capazes de induzir a agranulocitose.
• A aminopirina e dipirona mostram um perfil de HOMO, LUMO e potenciais
eletrostáticos diferentes da antipirina e isopropilantipirina, explicando as diferenças
estruturais de derivados da pirazolona na agranulocitose.
• Os estudo da REA e modelagem molecular podem contribuir para adequada
prescrição, dispensação e utilização de medicamentos pela equipe de saúde.