1 KAROTENOIDET A5

Dr. Elisabeta SUSAJ: “Karotenoidet (biosinteza,bioteknologjia dhe përdorimi i tyre në dietën ushqimore)”

Dr. Elisabeta SUSAJ

KAROTENOIDET

(Biosinteza, bioteknologjia dhe përdorimi i tyre në dietën ushqimore)

85


TIRANË, 2010Titulli:

“Karotenoidet (Biosinteza, bioteknologjia dhe përdorimi i tyre në dietën ushqimore)”

Autore:

Dr. Elisabeta SUSAJ

E-mail: [email protected]

Recesentë: Prof.Dr. Rozana TrojaProf.Dr. Petrit Rama

Paraqitja Grafike: Grafika BLAR

© Autori

ISBN: 978-99956-47-82-7

Shtypur: Emal

85

mailto:[email protected]


PËRMBAJTJAI. Ç’JANË KAROTENOIDET? ……………………1. Struktura dhe emërtimi (nomeklatura) i karotenoideve 2. Burimet ushqimore të karotenoideve .....................3. Bioavailabiliteti (disponueshmëria biologjike) e karotenoideve nga dieta ushqimore dhe shpërndarja e tyre në indet e trupit të njeriut ......................................II. ROLI I KAROTENOIDEVE TEK NJERIU DHE TEK KAFSHËT ..........................................................1. Aktiviteti i provitaminës A (β-karotenit) ...................2. Roli i karotenoideve në parandalimin e sëmundjeve ...2.1. Karotenoidet dhe shëndeti i syrit ...............2.2. Sëmundjet kardiovaskulare (CDV) ..........2.3. Kanceri ...................................................2.3.1. Kanceri i mushkërive (Lung kancer) .......2.3.2. Kanceri i gjirit (Breast cancer) ...............2.3.3. Kanceri i prostatës (Prostate cancer) .........2.3.4. Kanceri kolorektal (kanceri i kolonës vertebrore) (Colorectal cancer) .......................................................2.4. Eritema e induktuar nga drita (Light-induced erythema) ........................................................................III. BIOSINTEZA E KAROTENIODEVE ..............1. Formimi i izopentenil difosfatit (IPP) .....................2. Formimi i fitoenit nga IPP (izopentenil difosfati) ....3. Reaksionet e desaturimit ..........................................4. Izomerizimi ...................................................5. Ciklimi i karotenoideve ..................................6. Formimi i ksantofilës .............................................6.1. Hidroksilimi ......................................6.2. Epoksidimi dhe de-epoksidimi ..............6.3. Sinteza e neoksantinës .....................................6.4. Sinteza e kapsantinës dhe kapsorubinës ..................7. Katabolizmi dhe degradimi i karotenoideve ..............

85


IV. RREGULLIMI I BIOSINTEZËS SË KAROTENOIDEVE NË BIMËT E LARTA ..........4.1. Rregullimi i transkriptimit (transcriptional regulation) ................................................................4.2. Rregullimi pas transkriptimit (post-transcriptional regulation) ....................................................................4.3. Izolimi (veçimi) i karotenoideve ..........................V. STRATEGJITË PËR RRITJEN E NIVELIT TË PËRMBAJTJES SË KAROTENOIDEVE NË BIMËT BUJQËSORE .............................................1. Përmirësimi konvencional/tradicional i bimëve ......2. Modifikimi gjenetik i biosintezës së karotenoideve në bimët bujqësore ...........................................................3. Shembuj të bimëve bujqësore të modifikuara gjenetikisht me nivele të ndryshme të karotenoideve ... 3.1. Domatja (Lycopersicon esculentum) …………........3.2. Karota (Daucus carota) …………………….............3.3. Patatja (Solanum tuberosum)…………..................3.4. Kanola (Brassica napus) ......................................3.5. Orizi (Oryza sativa) ………………………….........3.6. Sistemet e bimëve model ....................................VI. PERSPEKTIVAT PËR TË ARDHMEN ............VII. LITERATURA .................................................

I. Ç’JANË KAROTENOIDET?

85


Karotenoidet janë molekula izoprenoide shumë të përhapura në natyrë që përfaqsojnë grupin më të madh të pigmenteve në natyrë me mbi 600 struktura të përcaktuara dhe me një prodhim total të llogaritur në rreth 100 milionë ton në vit, me një tregëti botërore në rreth 950 milion $ në vitin 2007 (7).

Karotenoidet gjenden në të gjitha organizmat fotosintetike (disa bakterie, alga dhe bimë të larta) dhe janë përgjegjës për ngjyrën e verdhë apo të kuqe të shumicës së luleve dhe frutave. Ngjyra karakteristike e shumë zogjve, insekteve, jovertebrorëve të detit (krustaceve) është gjithashtu për shkak të prezencës së karotenoideve që e kanë origjinën nga dieta ushqimore.

Karotenoidet përdoren si ngjyrues dhe plotësues ushqimorë në industrinë agroushqimore. Meqenëse njeriu dhe kafshët nuk janë në gjendje të sintetizojnë karotenoidet “de novo” (në mënyrë natyrale), dieta ushqimore është burimi i këtyre komponimeve.

Karotenoidet konsiderohen me shumë interes në dietën e përditshme tek njeriu në aspektin potencial të tyre për lehtësimin e disa sëmundjeve të lidhura me moshën (me plakjen). Në vendet e zhvilluara perëndimore, vitet e fundit, po vërehet një interes të konsiderueshëm drejtim të përdorimit të karotenoideve në dietën e përditshme ushqimore të njerëzve për shkak të vetive të tyre antioksiduese dhe të aftësisë për të lehtësuar sëmundjet kronike.

Studimet shkencore janë fokusuar në zhvillimet e rëndësishme biogjenetike si në klonimin e shumicës së geneve të përfshira në karotenogjenezën (biosintezën e karotenoideve), në kuptimin më të plotë, të faktorëve që rregullojnë formimin dhe depozitimin e karotenoideve në bimë, ashtu dhe në manipulimet gjenetike të bimëve

85


bujqësore me qëllimin rritjen e nivelit të tyre në dietën ushqimore. Arritjet shkencore të deritanishme janë premtuese dhe kanë hapur rrugën për rritjen e nivelit të karotenoideve në bimët bujqësore dhe ushqimet me bazë bimore.

Në këtë material jepet në detaje rruga e biosintezës dhe të formimit të karotenoideve si dhe janë shpjeguar përfitimet e dukshme të përdorimit të karotenoideve në dietën ushqimore.

1. Struktura dhe emërtimi (nomeklatura) i karotenoideve

Karotenoidet janë izoprenoide dhe në përgjithësi konsistojnë në tetë njësi izoprene të lidhura së bashku në mënyrë të tillë që lidhja e njësive është përqëndruar në qendër të molekulës duke dhënë grupe metile (-CH3) 20 dhe 20’ me një lidhje pozicionale 1,6, ndërkohë që grupet metile të mbetura janë 1,5.

Tipari më i dukshëm i molekulës së karotenoideve është zinxhiri i gjatë polien, që mund të zgjatet nga 3 deri në 15 lidhje dyfishe të bashkuara. Gjatësia e kromoforit përcakton spektrin e absorbimit të molekulës dhe ngjyrën e tij në syrin tonë. Të gjithë molekulat karotenoide bazohen në shtatë grupe fundore të ndryshme nga të cilat vetëm 4 prej tyre (β, ε, κ, Ψ) janë gjetur në karotenoidet e bimëve të larta (50).

Ciklizimi i skeletit karbonik ndodh në njërin ose në të dy fundet e molekulës, ndërsa ksantofilat formohen nga karotenet hidrokarbone nëpërmjet hyrjes në funksion të O2. Përveç kësaj, mund të ndodhin edhe modifikime të tilla si zgjatje ose degradim të vargut të C. Shumë nga emrat e përdorur gjerësisht të karotenoideve lidhen me

85


burimin fillestar ku ato janë gjetur, psh β-karoteni është izoluar fillimisht nga karota, megjithatë për karotenoidet ekziston një emërtim i saktë dhe në këtë material janë përdorur emrat e njohur.

2. Burimet ushqimore të karotenoideve

Karotenoidet e përdorura në dietën e njeriut vijnë kryesisht nga bimët bujqësore dhe mund të gjenden në rrënjë, gjethe, fruta dhe lule. Në frutat dhe perimet që konsumohen çdo ditë nga njeriu janë identifikuar afërsisht 60 (gjashtëdhjetë) karotenoide të ndryshme (50).

Në një sasi më të vogël karotenoidet mund të merren edhe nga vezët, shpendë, dhe peshku, ku praktikisht produktet bimore ose algat janë përfshirë në të ushqyerit e shpendëve ose peshkut. Psh zeaksantina kalon nga misri në ushqimin e pulave dhe, nga këtu, nëpërmjet vezëve ose mishit të pulës, në dietën ushqimore të njeriut. Në tabelën 1 jepet përmbajtja e karotenoideve (43) në disa bimë bujqësore (perime të frskëta, fruta, farëra).

Tabela 1. Përmbajtja e karotenoideve të perimeve të gjelbra gjethore, frutave dhe farërave të papërpunuara

Specia Përmbajtja e karotenoideve (µg/g) peshë të freskëtTotali Zea Lutei

nëα-

karotenβ-

karotenLikopen

85


Lakër Brukseli 1163 - 610 - 553 -Barbunjë e gjelbër

940 - 494 70 376 -

Barbunjë e zakonshme

767 - 506 - 261 -

Brokol 2533 - 1614 - 919 -Lakër e gjelbër 139 - 80 - 59 -Sallatë jeshile 201 - 110 - 91 -Majdanoz 10.335 - 5812 - 4523 -Bizele 2091 - 1633 - 458 -Spinaq 9890 - 5869 - 4021 -Kajsi 2196 31 101 37 1766 -Banane 126 4 33 50 39 -Karotë (Maj) 11.427 - 170 2660 8597 -Karotë (Shtator) 14.693 - 283 3610 10.800 -Portokalle 211 50 64 Nd 14 -Spec 2784 1608 503 167 416 -Pjeshkë 309 42 78 Tr 103 -Misër i ëmbël 1978 437 522 60 59 -Domate 3454 - 78 - 439 2937

Vlerat përfshijnë trans dhe cis izomerët. Nd = nuk është gjetur; Tr = gjurmë; zea = zeaksantinë.

Vitet e fundit është publikuar një database për përmbajtjen e karotenoideve në frutat dhe perimet në Europë (32), ndërsa përmbajtja e tyre në vajrat bimore është publikuar nga Ong dhe Tee (33).

Në kontrast me shumicën e karotenoideve të dietës sonë ushqimore, burimet e likopenit janë të kufizuara, ku të paktën 85% të likopenit vjen nga frutat e domates dhe produktet me bazë domaten, dhe pjesa tjetër merret nga shalqini, qitroja rozë, guava, papaja, etj (Tabela 2).

85


Tabela 2. Përmbajtja e likopenit në frutat e ndryshme dhe në produktet me bazë domaten (32)

Nr Frutat ose produkti i domates

Përmbajtja e likopenit (µg/g masë të njomë)

1 Domate e freskët 8.8-42.02 Shalqin 23.0-72.03 Guava rozë 54.04 Geipfruti rozë 33.65 Papaja 20.0-53.06 Salcë domate 62.07 Pastë domate 54.0-1500.08 Lëng domate 50.0-116.09 Ketchup domate 99.0-134.410 Salcë picash 127.1

Produktet e përpunuara të domates si lëng, ketchup, salcat e ndryshme të suprave, picave dhe makaronave janë kontribuesit më të mëdhenj në dietën ushqimore përsa i takon likopenit. Një vështrim i përgjithshëm mbi marrjen e karotenoideve në vendet e Europës tregon për një ndryshim të konsiderueshëm midis tyre, jo vetëm për sa i takon sasisë, por edhe burimeve kryesore ushqimore të tyre.

3. Bioavailabiliteti (disponueshmëria biologjike) e karotenoideve nga dieta ushqimore dhe shpërndarja e tyre në indet e trupit të njeriut

Bioavailabiliteti përkufizohet si fraksion, si një pjesë, e një ushqimi të tretur që është i disponueshëm për

85


t’u përdorur në funksionet fiziologjike të trupit të njeriut ose për grumbullim (8).

Ekzistojnë të paktën 9 faktorë që influencojnë në bioavailabilitetin e karotenoideve, si: lloji i karotenoidit, lidhja molekulare, sasia e konsumuar në një vakt ushqimi, matrica në të cilën është lidhur, faktorët që ndikojnë në absorbimin, shkëmbimin dhe shndërrimin biologjik, statusi ushqimor i organizmit përkatës, faktorët gjenetikë, faktorët e lidhur me organizmin dhe bashkëveprimi ose ndërveprimi midis tyre (19).

Meqenëse karotenoidet janë të tretshme në yndyrna (lipidsoluble), ato merren më me lehtësi nga aparati tretës me një dietë të pasur me yndyrna, megjithëse sasia e yndyrës së kërkuar nga organizmi i njeriut është e ulët, rreth 3-5 gr/vakt (48).

Në drejtim të matricës ushqimore, është vënë re që luteina është më e disponueshme biologjikisht nga spinaqi pas shkatërrimit të murit qelizor të bimës nga yndyrnat (48).

Megjithëse përmbajtja e β-karotenit mund të jetë e lartë, marrja e β-karotenit nga perimet është e ulët (14 % për perimet e përziera) krahasuar me β-karotenin e pastër të shtuar në një matricë të thjeshtë (48). Cis izomerët e karotenoideve duket se janë më të disponueshëm se të gjitha format trans (48), ndoshta sepse ata janë më të tretshme në micelat e acidit bilirubik dhe kështu që lidhen në mënyrë preferenciale në kilomikronet.

Mendohet që karotenoide të veçanta kanë veprim antagonist në absorbimin e njëra tjetrës, psh; kantaksantina pengon marrjen e likopenit (48).

Likopeni gjendet në pothuaj të gjitha indet e njeriut, por ai nuk është i depozituar në mënyrë uniforme

85


(Tabela 3) (10, 41, 46, 47). Diferencat tregojnë që ekzistojnë mekanizma specifike për depozitimin preferencial të likopenit, veçanërisht në veshka dhe teste.

Tabela 3. Nivelet e përmbajtjes së likopenit në indet e trupit të njeriut

Nr Indet e trupit të njeiut Përmbajtja e likopenit(nmol/g masë të njomë)

1 Indi dhjamor 0.2-1.32 Veshka 1.9-21.63 Tru nuk është gjetur4 Gjoks 0.85 Kolona vertebrore 0.36 Mëlçi 1.3-5.77 Mushkëri 0.2-0.68 Vezore 0.39 Prostatë 0.810 Lëkurë 0.411 Stomak 0.212 Teste 4.3-21.4

II. ROLI I KAROTENOIDEVE TEK NJERIU DHE TEK KAFSHËT

Karotenoidet kanë një gamë të gjerë funksionesh, veçanërisht në lidhje me shëndetin e njeriut dhe rolin e tyre si antioksidantë biologjikë.

1. Aktiviteti i provitaminës A (β-karotenit)

85


Ky është funksioni më i mirëndërtuar i karotenoideve. Këtu futen rreth 50 karotenoide që kanë në përbërje të tyre një grup fundor unazor β, siç janë psh β-karoteni, zeaksantina dhe β-kriptoksantina. Më shumë se 40 vjet më parë është raportuar se kur këto karotenoide përdoren në dietën ushqimore, priten nga një 15-15’-dioxigjenazë intenstinale dhe formojnë retinën. Megjithatë, vetëm vitet e fundit është bërë i mundur klonimi i geneve të gjitarëve dhe realizimi i studimeve biokimike (21).

Tashmë është e njohur që prerja / çarja kryesore qendrore e β-karotenit është në fakt një reaksion tip mono-oksigjenazë. Enzima rekombinante e njeriut, e quajtur BCO, është karakterizuar dhe është e shprehur në shkallë shumë të lartë në sistemin tretës dhe në mëlçi (25). Megjithatë, ajo është shprehur gjithashtu edhe në indet jotretëse ku konverton karotenoidet provitamin A, të marrë lokalisht nga plazma, në retinalinë lokale (25).

Përveç prerjeve simetrike të karotenoideve β-ring, ata mund të priten gjithashtu në mënyrë josimetrike dhe prodhojnë një gamë të gjerë të apokarotenoideve. Psh, prerja e lidhjeve dyfishe 9’, 10’jep β-ionon dhe β-apo-10’-karotenal, që është prekursor (paraardhës) i acidit retinoik. Është interesante që kjo 9’, 10’-dioxigjenazë mund të presë gjithashtu karotenoidet jociklike (jounazore) siç është likopeni.

Eficienca e biokonvertimit të provitaminës A në vitaminë A (bioeficienca) është rivlerësuar vitet e fundit për rekomandimet që jepen lidhur me sasinë e nevojshme të karotenoideve në dietën ushqimore për të parandaluar mungesën e vitaminës A.

Në vendet e zhvilluara, 6 µg β-karoten në vaj ose 12 µg në ushqimet e përziera ka të njëjtin aktivitet të

85


vitaminës A sa ka 1 µg retinol. Bazuar në të dhënat e FAO/WHO-s për bilancin ushqimor ekzistues dhe shpejtësinë e konvertimit të karotenoideve β-ring, të gjithë njerëzit duhet të sigurojnë kërkesat e tyre për vitaminë A nga burimet e dietës ushqimore. Megjithatë, duke përdorur vlerësimin e ri të shpejtësisë së konvertimit të Institutit Amerikan të Mjekësisë, popullsia në vendet në zhvillim nuk mund të arrijë asnjë herë të sigurojë sasinë e mjaftueshme të vitaminës A.

Përveç kësaj, studimet e shumta sugjerojnë që nëse merren 21 µg β-karoten në vend të 12 µg β-karoten, ata shprehin të njëjtin aktivitet të vitaminës A sa 1 µg retinol, gjë që nënkupton që marrja efektive e vitaminës A është shumë e ulët. Prandaj kontrolli i mungesës së vitaminës A në vendet në zhvillim kërkon jo vetëm plotësimin dhe shtimin e vitaminës A në dietën ushqimore, por edhe përdorimin e ushqimeve të përmirësuara, dhe mundësisht futjen e llojeve dhe varieteteve të reja të bimëve me aktivitet të lartë të provitaminës A (β-karotenit).

2. Roli i karotenoideve në parandalimin e sëmundjeve

Për herë të parë lidhja midis marrjes së një sasie të lartë të karotenoideve dhe përfitimeve shëndetësore të tyre shfaqet në literaturë në vitet 1970. Dietat me përmbajtje të lartë në fruta dhe perime ishin të shoqëruara me një reduktim të shpejtësisë së zhvillimit të qelizave të kancerit dhe sëmundjeve koronare të zemrës, dhe e anasjellta ishte gjithashtu e vërtetë. Si rrjedhim, popullsia ishte inkurajuar të hante të paktën 5 racione

85


fruta dhe perime në ditë, që përmbajnë rreth 6 mg karotenoide.

Kërkimet e mëvonshme u fokusuan në karotenoidet e veçanta në dietën ushqimore dhe veçanërisht në β-karotenin, likopenin, luteinën dhe zeaksantinën. Në veçanti, roli i tyre si antioxidantë biologjikë dhe si rregullatorë të sistemit imunitar ka qenë subjekt i një shqyrtimi të hollësishëm dhe intensiv. Autorë të ndryshëm japin komente të plota në këtë drejtim (11, 20).

Shumë nga këto studime kanë spekuluar që aktivitetet antioxiduese të karotenoideve janë një faktor kyç në reduktimin e shkallës së prekshmërisë së shumë sëmundjeve, por duhet të sqarohet gjithashtu që në grupe të caktuara me rrezikshmëri të lartë (psh duhanpirësit) mund të ketë efekte të kundërta të dozave të larta të karotenoideve, ndoshta për shkak të vetive të tyre paraoksiduese.

Është raportuar gjithashtu që karotenoidet shkatojnë apoptazën në linjat e qelizave T-limfocite (7) dhe mund të mbrojnë stabilitetin dhe qëndrueshmërinë e genomës (7).

2.1. Karotenoidet dhe shëndeti i syrit

Mungesa e vitaminës A çon në kseroftalmi (“verbimi i natës”). Siç thamë më lart, karotenoidet provitaminë A në dietën ushqimore mund të parandalojnë pasoja të tilla për syrin (1). Sëmundjet e syrit të lidhura me moshën siç janë katarakti dhe degjenerimi makular (AMD) janë probleme të përgjithshme në gjithë botën. Në të gjitha rastet, evidencat tregojnë se karotenoidet e veçanta në dietën ushqimore ditore mund të zvogëlojnë prekshmërinë nga

85


këto sëmundje, që mendohet se ndodh nëpërmjet neutralizimit të specieve oksigjen aktive.

Studimet in-vitro në qelizat epiteliale të lenteve të njeriut (HLEC) kanë treguar se shtimi i likopenit në kulturat qelizore parandalon në një masë të konsiderueshme vakuolizimin në HLEC (29). Të dhënat epidemiologjike të studimeve mbi 8 vjet treguan një rrezik 19% më të ulët të kataraktit të syrit tek burrat që merrnin sasi të larta të luteinës dhe zeaksantinës (6). Një provë e kryer në persona të rastësishëm për mbi 12 vjet, e realizuar nga mjekët amerikanë me β-karotenin dhe kataraktin, treguan përfitime në të rëndësishme në shëndetin e burrave dhe, gjithashtu, zvogëluan rrezikun e kataraktit tek duhanpirësit në rreth ¼ e tyre ose 25% (6).

Makula e syrit përmban 2 karotenoide, luteinën dhe zeaksantinën, megjithëse akoma nuk dihet përse këto komponime të veçanta dhe jo karotenoide të tjera akumulohen në makul (3). Pigmente të ngjashme janë gjetur në primatët e tjerë dhe pikla vajore të pasura me karotenoide janë gjetur tek zogjtë, reptilët, peshqit dhe amfibët. Mendohet që këto karotenoide mbrojnë makulën nga dëmtimet e shkatuara nga drita dhe nga radikalet e lira dhe mbeturinat e formuara në fotoreceptorët e syrit. Marrja ditore e antioksidantëve dhe korelacioni i tyre me AMD (degjenerimin molekular) është shqyrtuar në studimet e NIH Eye Disease Case Control. Studimet treguan një tendencë lineare dhe të rëndësishme, të vërtetuar statistikisht, në reduktimin e rrezikut nga AMD me rritjen e sasisë së karotenoideve, duke treguar një lidhje shumë më të fortë në mes luteinës dhe zeaksantinës me rrezikun e reduktimit të AMD. Evidenca për efektin mbrojtës të

85


karotenoideve dhe vitaminave antioksidante janë përmbledhur nga Snodderly (45).

2.2. Sëmundjet kardiovaskulare (CDV)

Studimet e hershme epidemiologjike mbi rolin e karotenoideve, veçanërisht të β-karotenit, në zhvillimin e sëmundjeve kardiovaskulare (CVD) vërteton hipotezën se karotenoidet kanë aftësi parandaluese. Reduktimi i stresit oksidativ në formimin e plagëve është një nga sugjerimet për efektin e tyre. Konsumimi i produkteve të përpunuara të domates bën reduktimin e ndjeshmërisë së lipoproteinës ndaj dëmtimeve oksidative (17), ndërsa përdorimi i një sasie likopeni në serum shoqërohet me një zvogëlim të rrezikut të rasteve arterosklerotike vaskulare tek burrat e moshës së mesme.

Megjithëse, prova e parë e ndërhyrjes me β-karoten (α-Tokoferol, β-Caroten Cancer Prevention Study), e realizuar tek burrat që pinin duhan, tregoi se përdorimi vetëm i β-karotenit, pa u shoqëruar me karotenoide të tjera, nuk ndikoi në reduktimin e vdekshmërisë nga kanceri i mushkërive dhe nga CVD (50). Studime të tjera kanë treguar që një kombinim i karotenoideve nga frutat dhe perimet është më efektiv sesa plotësimi apo shtesa nga një komponent i vetëm.

2.3. Kanceri

Eksperimentet e kulturave qelizore in-vitro kanë treguar që karotenoidet pengojnë shumëzimin e qelizave, formimin dhe transformimin e mikrobërthamave po kështu edhe ndryshimin e shprehjes së geneve të caktuar. Këto veçori janë të gjitha në përputhje me efektin

85


mbrojtës kundër kancerogjenezës. Një nga zbulimet më të hershme në këtë drejtim ishte që karotenoide të caktuara, in-vitro, zvogëluan intervalin e komunikimit mes qelizave lidhëse, në varësi nga doza e përdorur (52). Që nga koha e këtij studimi janë realizuar një numër shumë i madh kërkimesh lidhur me rolin e karotenoideve të veçanta dhe efektin e tyre mbi sëmundjet kanceroze.

2.3.1. Kanceri i mushkërive (Lung kancer)

Studimet epidemiologjike në vitet 1960-1970 kanë treguar një lidhje të anasjelltë dhe të qëndrueshme midis marrjes së frutave dhe perimeve dhe zvogëlimit të rrezikut të kancerit të mushkërive dhe kancereve të tjera. Studimet kanë treguar se β-karoteni mund të jetë komponimi përgjegjës për këtë lidhje. Disa testime me β-karoten në vitet 1980-1990 e kanë vërtetuar këtë hipotezë (37). Këto testime treguan që përdorimi i β-karotenit në doza të caktuara shoqërohet me zvogëlimin e rrezikut të kancerit të mushkërive edhe në rastin e burrave duhanpirës. Mendohet se kjo ndodh sepse β-karoteni vepron si një paraoksidant dhe jo si antioksidant në këto kushte.

Kohët e fundit (2003) Wright et al (51) kanë raportuar se konsumimi i një shumëllojshmërie perimesh ka një efekt më të madh sesa marrja e ndonjë karotenoidi të veçantë apo karotenoideve totale.

2.3.2. Kanceri i gjirit (Breast cancer)

Një përmbledhje e literaturës epidemiologjike në vitin 1997 (9) ka treguar që β-karotenin ishte marrë në konsideratë në 16 raste studimi. Konsumimi i sasive të

85


mëdha të β-karotenit tek gratë e predispozuara për t’u prekur nga kanceri i gjirit ka treguar ulje të rrezikshmërisë së prekjes në 11 raste, rezultate të rëndësishme domethënëse në katër raste dhe në një rast nuk tregoi ndonjë lidhje. Studime të mëvonshme, Cooper et al (11) tregojnë një pikturë mixe (të përzier), megjithëse nivele të larta të likopenit ishin të shoqëruara me uljen e rrezikshmërisë në disa raste (9).

Mekanizimi i veprimit të likopenit në frenimin e kancerit të gjirit është e shoqëruar me frenimin e progresionit të ciklit qelizor në fazën G1 (30). Një studim i realizuar në Kanada në vitin 2002 ka treguar se ekziston një lidhje korelative midis sasisë së karotenoideve në dietën ushqimore ditore dhe rrezikshmërisë së kancerit të gjirit.

2.3.3. Kanceri i prostatës (Prostate cancer)

Interesimi i parë mbi hipotezën që një sasi likopeni e marrë nga dieta ushqimore e përditshme mbron kundër kancerit të prostatës ishte në vitin 1995 kur Giovannucci dhe bashkëpuntorët e tij raportuan që ushqimet me përmbajtje të lartë likopeni shoqëroheshin me një reduktim të rrezikshmërisë së kancerit të prostatës, në Health Professionals Follow-Up Study.

Marrja e likopenit e shoqëruar me një dietë yndyrore, psh salcë domatje ose pica, ishte shumë efektive (14). Është gjetur që shtimi i salcës së domates në dietën ushqimore çon në një rritje substanciale të përmbajtjes së likopenit total në serum dhe prostatë.

85


Numërohen rreth 72 studime, disa nga të cilët kohët e fundit, që kur Giovannucci bëri raportimin e parë (15). Në rreth 57 raste u gjet një lidhje e ndërsjelltë midis sasisë së domates ose nivelit të likopenit në gjak dhe uljes së rrezikshmërisë së kancerit në një sit anatomik të përcaktuar (35 raste vërtetoheshin statistikisht). Kohët e sotme të dhënat e grumbulluara sugjerojnë që marrja e domates së freskët apo produkteve të domates të përpunuara shoqërohet me uljen e rrezikshmërisë së prekjes nga kanceri i prostatës, megjithatë nuk është e sigurtë që likopeni është i vetmi komponim që përmban domatja që kontribuon në këtë efekt. Karotenoide të tjera dhe fitokimikatet që përmbajnë frutat gjithashtu mund të kontribuojnë në këtë drejtim.

Studimet kanë vërtetuar se një dietë e pasur me domate, mund të reduktojë dëmtimet ADN oksidative të leukociteve dhe dëmtimet oksidative të indit të prostatës në pacientët e diagnostikuar me kancer të prostatës (8) duke sugjeruar kështu që ushqime të tilla mund të përdoren me sukses në trajtimin e kancerit të prostatës dhe në parandalimin e tij. Studimet in-vitro me qeliza kanceroze LNCaP të prostatës tregojnë që likopeni i përdorur në substratin ushqyes të rritjes redukton shumëzimin e tyre (22).

2.3.4. Kanceri kolorektal (kanceri i kolonës vertebrore) (Colorectal cancer)

Marrja e β-karotenit ka qenë e lidhur në një mënyrë kontradiktore me kancerin kolorektal, por efektet e karotenoideve të tjera janë studiuar vetëm kohët e fundit. Slattery dhe bashkëpunëtorët e tij (43) përdorën të dhënat e dietës ushqimore ditore për të treguar që

85


luteina ishte e lidhur në mënyrë të anasjelltë me kancerin e kolonës vertebrore tek meshkujt dhe femrat, kurse karotenoidet e tjera si likopeni, zeaksantina dhe β-kriptoksantina ishin të padukshme. Në kundërshtim me këtë një studim i kohëve më të fundit konkludoi që nuk ka një lidhje midis marrjes ditore të karotenoideve dhe rrezikshmërisë së kancerit kolorektal (44).

2.2.4. Eritema e induktuar nga drita (Light-induced erythema)

Shtesat e β-karotenit, janë të përdorura gjerësisht si “një mbrojtës oral nga dielli”. Megjithatë janë realizuar pak studime të kontrolluara për efektin e tyre mbrojtës kundër rrezatimit UV. Në mesin e viteve 1990 dy studime të ndryshme dhanë konkluzione kontradiktore. Garmyn et alt (7) nuk gjetën efektet mbrojtës të β-karotenit, ndërkohë që Gollnik dhe bashkëpunëtorët arritën në konkulzionin se zhvillimi i eritemës ishte më i ulët në rastin e përdorimit të shtesës së β-karotenit. Një vëzhgim i mëvonshëm, duke përdorur në dietën ditore kombinimin e β-karotenit dhe vitaminës E, konkludoi që ky kombinim ishte më efektiv sesa përdorimi vetëm i β-karotenit dhe sugjeroi që ky efekt ndodh për shkak të vetive antioksiduese të këtyre komponimeve (47).

Në pamje të parë, kohëzgjatja e përdorimit të kësaj shtese në dietën ushqimore është shumë më e rëndësishme se doza e përdorimit. Në një studim tjetër të mëvonshëm, i njëjti grup përdori si shtesë në dietën ushqimore pastë domateje për më shumë se 10 javë dhe gjetën se eritema ishte shumë herë më e ulët. Po kështu, peroksidimi i lipideve, i induktuar nga rrezet UV, në

85


qelizat fibroplastike të lëkurës së njeriut në kushte in-vitro është më i ulët kur shtohet β-karoten, likopen dhe luteinë.

III. BIOSINTEZA E KAROTENIODEVE

Rrugët e biosintezës të përfshira në formimin e karotenoideve u sqaruan në vitet 1950-1960 duke përdorur mjetet biokimike klasike, duke përdorur parandalues (inhibitorë) specifikë dhe mutantë për të bllokuar në stade të veçanta të procesit.

Në fillim të viteve 1970, sistemet in-vitro u zhvilluan shumë (5) duke lejuar studimin e enzimave biosintetike. Fatkeqësisht, vështirësitë praktike të shoqëruara me këto enzima pengonin në shumë raste purifikimin e tyre. Zhvillimi i teknikave moderne molekulare gjenetike ka lehtësuar mjaft punën për izolimin e geneve duke çuar në plotësimin funksional in-vivo, karakterizimin e enzimave rekombinante dhe krijimin e bimëve transgjenike. Këto studime kanë çuar më tej njohuritë tona mbi biosintezën e karotenoideve,

85


“rregullimin” e kësaj biosinteze dhe enzimat që marrin pjesë në proces. Ky seksion fokusohet në ndikimin e sekuencave përgjegjëse për formimin e karotenoideve në bimët e larta. Megjithatë, do të bëhen krahasime, aty ku janë shfrytëzuar reaksione alternative të kryera nga organizma të tjera për të rritur përmbajtjen e karotenoideve ushqyese në bimët bujqësore.

1. Formimi i izopentenil difosfatit (IPP)

Në bimët e larta, karotenoidet sintetizohen dhe janë të lokalizuara në plastide, kryesisht në kromoplastet. Ata janë të lidhura biosintetikisht me izoprenoidet e tjera si giberelinat, tokoferoli (vitamina E), klorofilat dhe filokuinonet, nëpërmjet komponimit me 5 karbone (C5) izopentenil difosfat (IPP). Që në zbulimin e rrugës së sintezës së acidit mevalonik (MVA), në vitet 1950, është pranuar që IPP sintetizohet nga acetil CoA nëpërmjet acidit mevalonik (28). Megjithatë të dhënat eksperimentale të mëvonshme treguan në mënyrë konsekuente që rruga e sintezës përmes acidit mevalonik (MVA) nuk mund të shpjegojë ekskluzivisht formimin e izoprenoideve të prejardhura nga plastidet. Në fillim të viteve 1990, studimet mbi retro-biosintezën vërtetuan prezencën e një rruge alternative, rrugën e biosintezës së izoprenoideve të pavarur nga rruga e acidit mevalonik për formimin e IPP dhe dimetil alil difosfatit (DMAP) (13).

Përdorimi i gjenomikave funksionale kanë çuar në shpjegimin dhe sqarimin e rrugës së pavarur nga acidi mevalonik në bimët e larta dhe në shumë bakterie (38). Studimet e fundit tregojnë që formimi i izoprenoideve në

85


plastide në disa stade zhvillimi mund të arrihen pjesërisht nga rruga e sintezës së acidit mevalonik.

Reaksioni i parë i rrugës së sintezës së IPP të pavarur nga acidi mevalonik përfshin kondensimin kokë me kokë të (hidroksientil) tiaminës të prejardhur nga piruvati me grupin aldehide C1 të D-gliceraldehid-3-fosfatit (G3P) që japin 1-deoksi –D-ksilulozë 5-fosfat (DXP). Ky reaksion transformimi katalizohet nga enzima 1-deoksi-D-ksilulozë 5- fosfat sintazë (DXPS, EC 4.1.3.37, Figura 1).

Figura 1. Formimi i izopentenil difosfatit (IPP) nëpërmjet rrugës së pavarur nga acidi mevalonik

(MVA)

85


Shkurtimet: TPP = tiaminë pirofosfat (thiaminepyrophosphate); DXP = deoksiksilulozë fosfat (1-Deoxy–D–xylulose 5-phosphate); MEP = metil eritritol fosfat (2-C-methyl-D-erythritol 4-phosphate); CDP-ME = citidinë difosfo metil eritritol {4-(cytidine 5’-diphospho)-2-C-methyl-D-erythritol}; CDP-MEP = fosfo citidinë difosfo metil eritritol {2-phospho-4-(cytidine 5’-diphospho)-2-C-methyl-D-erythritol}; MEP-cPP = metil eritritol ciklo difosfat {2-C-methyl-D-erythritol-2,4-cyclodiphosphate}; HMBPP = hidroksi metil butenil fosfat {1-hydroksy-2–methyl-2-(E)-butenyl 4-phosphate}; IPP = izopentenil difosfat (isopentenyl diphosphate); DMAPP = dimetilalil difosfat (dimethylallyl diphosphate); DXPS (EC 4.1.3.37) = deoksi ksilulozë fosfat sintazë (1-Deoxy-D-xylulose 5-phosphate synthase); DXR (EC 1.1.1.267) = deoksi ksilulozë fosfat reduktoizomerazë (1-Deoxy-D-xylulose 5-phosphate reductoisomerase); MCT (EC 2.7.7.60) = metil eritritol fosfat citidil transferazë (2-C-methyl-D-erythritol 4-phosphate cytidyl transferase); CMK (EC 2.7.1.148) = citidinë difosfo metil eritritol kinazë {4-(cytidine 5’-diphospho)-2-C- methyl-D-erythritol kinase}; MCS (EC 4.6.1.12) = metil eritritol ciklo difosfat sintazë {2-C-methyl-D-erythritol-2,4-cyclodiphosphate synthase}; HDS = = hidroksi metil butenil fosfat sintazë {1-hydroxy-2–methyl-2-(E)-butenyl 4-phosphate synthase}; IPPi = izopentenil difosfat izomerazë (Isopentenyl diphosphate isomerase).

Genet Dxps (1-deoksi-D-ksilulozë 5-fosfat) janë izoluar, veçuar apo përftuar në gjendje të pastër nga një numër shumë i madh bimësh të larta dhe është demonstruar e vërtetuar në mënyrë funksionale si nëpërmjet aktiviteteve in-vitro ashtu dhe komplementare (plotësuese) (Tabela 4). Sekuencimi i genomës së Arabidopsit (Arabidopsis thaliana) ka zbuluar prezencën e tre Dxps ortologe, megjithatë deri kohët e fundit funksionaliteti është treguar vetëm për Dxps-2 dhe kërkimet vazhdojnë. Përveç rrugës së pavarur të sintezës së IPP nga acidi mevalonik, DXP shërben gjithashtu si një prekusor, paraardhës, për sintezën e vitaminës B1, (tiaminës) dhe vitaminës B6 (piroksidalit). Reaksioni i

85


parë i vetëm, unik, i rrugës së pavarur të sintezës nga MVA rezulton nga një rirregullim apo riorganizim intramolekular dhe reduktim i mëvonshëm i DXP në formën e 2-C-metil-D-eritritol 4-fosfat (MEP). Enzima përgjegjëse për këtë konvertim, DXP reduktoizomerazë (DXR, EC 1.1.1.267) kërkon NADPH dhe Mn2+ si kofaktor.

MEP (2-C-methyl-D-erythritol 4-phosphate) konvertohet në IPP (isopentenyl diphosphate) dhe DMAPP (dimethylallyl diphosphate) përmes 4-(cytidine 5’-diphospho)-2-C-methyl-D-erythritol (CDP-ME), 2-phospho-4-(cytidine 5’-diphospho)-2-C-methyl-D-erythritol (CDP-MEP), 2-C-methyl-D-erythritol-2,4-cyclodiphosphate (MEP-cPP) dhe 1-hydroxy-2–methyl-2-(E)-butenyl 4-phosphate (HMBPP).

Enzimat përgjegjëse për këto reaksione janë MCT (EC 2.7.7.60) = 2-C-methyl-D-erythritol 4-phosphate cytidyl transferase {2-c-metil-D-eritritol 4-fosfat citidil transferazë}, CMK (EC 2.7.1.148) = 4-(cytidine 5’-diphospho)-2-C- methyl-D-erythritol kinase {4-(citidinë 5’ difosfo)-2-C-metil-D-eritritol kinazë}, MCS (EC 4.6.1.12) = 2-C-methyl-D-erythritol-2,4-cyclodiphosphate syntase {2-C-metil-D-eritritol 2,4-ciklodifosfat}, HDS = 1-hydroxy-2–methyl-2-(E)-butenyl 4-phosphate syntase {1-hidroksi-2-metil-2-(E)-butenil 4-fosfat sintazë} dhe IPPi = Isopentenyl diphosphate isomerase {izopentenil difosfat izomerazë.

Megjithëse akoma nuk është realizuar karakterizimi funksional tek bimët e larta, krahasimi me genet dhe enzimat bakteriale sugjerojnë që një enzimë IPP/DMAPP sintazë (IDS) është përgjegjëse për konvertimin e 1-hidroksi-2–metil-2-(E)-butenil 4-fosfat

85


(HMBPP) në një përzierje 5:1 të izopentenil difosfat (IPP) dhe dimetilalil difosfat (DMAPP). Karakteristikat apo cilësitë e geneve dhe enzimave të përfshira në rrugën e pavarur të sintezës së izopentenil difosfatit nga acidi mevalonik (MVA) jepen të përmbledhura në tabelën 4 (7, 23, 38).

Tabela 4. Genet e koduara dhe vetitë e enzimave për formimin e IPP nga piruvati dhe gliceraldehid-3-fosfati

Hap

i

Enz

ima

Geni/speciaF

unks

ion

i

Vet

itë

e enzi

mav

e

MW

/k

Da

Kof

akt

ori i

ne

vojs

hëm

Km

(μM

)

1 1-Deoxy-D-xylulose 5-phosphate synthase (DXPS)

DXPS, Capsicum annum

Funksion E. coliShprehje

70a - pyruvate-500

G3P-750DXPS, Lycopersicon esculemtum


- - -

DXPS, Mentha pierita

Funksion - - - -

DXPS, (1) Arabidopsis thaliana

Homologji - - - -


- - - -


Funksion - - - -

DXPS, Tagetes erecta L.

HomologjiFunksion

- - - -

2 1-Deoxy-D-xylulose 5-phosphate reductoisomerase (DXR)

DXR, Lycopersicon esculentum

Funksion - 45a - -

DXR, Mentha pierita


43.5b NADPH -

DXR, Arabidopsis thaliana


Mn2+/NADPH -

3 2-C-methyl-D-erythritol 4-phosphate cytidyl transferase (MCT)

MCT, Arabidopsis thaliana Funksion

E. coliShprehje 29b CTP

CTP-114?M

4 4-(cytidine 5’-diphospho)-2-C- methyl-D-erythritol kinase (CMK)

CMK, Arabidopsis thaliana Homologji

- - Mg2+ MEP-500?M

CMK, Lycopersicon Funksion

E. coliShprehje 36.4b

ATP, Mg2+ -

85


esculentumCMK, Mentha pierita

FunksionE. coli

Shprehje31b - -

5 2-C-methyl-D-erythritol-2,4-cyclodiphosphate syntase (MCS)

MECPS, Arabidopsis thaliana

Homologji - - - -

6 1-hydroxy-2–methyl-2-(E)-butenyl 4-phosphate syntase (HDS)

GcpE, Arabidopsis thaliana

Funksion - - - -

7 Isopentenyl diphosphate/dimethylallyl diphosphate isomerase (IDS)

LytB, Arabidopsis thaliana

Homologji

a) është përcaktuar nëpërmjet metodës së imunobloteve b) është përcaktuar duke ndjekur shprehjen e geneve tek E.Coli

85


2. Formimi i fitoenit nga IPP (izopentenil difosfati)

Geranilgeranil pirofosfat (GGPP) është prekursori i drejtpërdrejtë i karotenoideve i cili është një komponim me 20 karbone, C20, i përftuar nga katër njësi izoprene me pesë karbone, C5. Me qëllim që të fillojë zgjatimi i zinxhirit, IPP (C5) izomerizohet në izomerin alilik të tij, dimetil alil difosfatit, DMAPP. Kondensimi apo bashkimi i IPP dhe DMAPP, sipas një modeli kokë - bisht gjeneron molekulën C10, geranil pirofosfat (GPP). Shtimi i IPP tek geranil pirofosfat, GPP, rezulton në formimin e farnesil pirofosfat (FPP, C15) dhe bashkimi me një molekul tjetër IPP jep geranilgeranil pirofosfat, GGPP, komponim me 20 karbone (Figura 2).

Këto reaksione kondensimi përfshijnë ngjitjen apo lidhjen e një joni karbon tek lidhja dyfishe C-3,4 e pasur me elektrone e molekulës së IPP që përkon me humbjen e njëkohshme të një fosfati inorganik (36). Më tej, dy molekula GGPP kondensohen në mënyrë kokë me kokë për të formuar komponimin ndërmjetës - prefitoen pirofosfat. Eleminimi pasardhës i grupit difosfat dhe shkëputja proton sterospecifike rezulton me formimin e fitoenit, komponim me dyzet karbone (C40). Fitoeni (7,8,11,12,7’,8’,11’,12’-oktahidro-Ψ-Ψ-karoten) është komponim hidrokarbon simetrik pa ngjyrë që përmban tre lidhje dyfishe të bashkuara.

Forma e tij strukturore, C40, përbën bazën nga e cila rrjedhin të gjitha karotenoidet. Tek bimët dhe tek shumica e organizmave karotenogjenike fitoeni akumulohet si izomer gjeometrik Cis-15. Me qëllim që të sintetizohet fitoeni nga izopentenil difosfati, IPP, kërkohen të realizohen tre reaksione të katalizuara nga enzimat. Enzima e parë IPP izomerazë (EC 5.3.3.2),

85


katalizon izomerizimin e kthyeshëm të IPP dhe izomerit alilik të tij DMAPP. Forma plastidike të pastra të IPP izomerazës janë përftuar nga domatja, speci dhe narçisi. Për një aktivitet normal të tyre, enzimat kërkojnë një jon tipik divalent si Mg2+ ose Mn2+. Cilësitë, vetitë e tyre Në tabelën 5 janë përmbledhur karakteristikat kryesore të enzimeve pjesëmarrëse në formimin e fitoenit nga izopentenil difosfati. Genet IPP/DMAPP izomerazë që kodojnë enzimat plastidike janë identifikuar tek Clarkia brewer (Ippi 2) dhe tek Arabidopsis (Ippi 2) (91), nëpërmjet ngjashmërisë dhe prezencës së një zgjatimi N-fundor.

GGPP sintazë është enzima përgjegjëse për konvertimin e IPP/DMAPP në geranilgeranil pirofosfat, GGPP. Kjo enzimë është izoluar si një homodimer funksional i tretshëm (74 kDa) nga kromoplastet e specit. Gjithashtu është identifikuar dhe sekuencuar ADN komplementare korresponduese e saj. Po kështu, është arritur purifikimi i pjesshëm nga kromoplastet dhe kloroplastet e domates. Në të gjitha rastet, për një aktivitet normal, enzima kërkon një jon divalent, Mg2+

(Tabela 5). Përveç se tek speci, është izoluar dhe ADN komplementare (cDNA) e domates. Genoma e Arabidopsit përmban një familje shumëgenëshe prej dymbëdhjetë anëtarësh të Ggpps. Dy nga këto gene është gjetur se kodojnë izoenzimat plastidike (105) dhe shtatë të tjerë besohet se kodojnë këto enzima, bazuar në sekuencat të supozuara (23).

Genet Ggpps janë identifikuar dhe izoluar gjithashtu edhe nga Catharanthus roseus (Ac no X92893) luledielli dhe lupini (Lupinus albus). Akoma nuk është e njohur plotësisht nëse të gjitha produktet e geneve marrin pjesë në formimin e karotenoideve. Kohët e

85


fundit është identifikuar një GPP sintazë e lokalizuar në plastide që konverton IPP dhe DMAPP në GPP. Besohet se kjo enzimë merr pjesë në biosintezën e monoterpeneve dhe jo në formimin e karotenoideve.

Enzima fitoen sintazë katalizon hapin e parë të kryer në formimin e karotenoideve. Genet që kodojnë enzimën fitoen sintazë janë identifikuar dhe veçuar nga Arabidopsis, misri, pjepri, karota (AB032797), Citrus paradisi (AF152892) dhe Citrus unshiu (AF220218), narçisi, orizi (D48697), speci dhe soja (Ac no. BF067862). Dy gene fitoen sintazë janë gjetur tek duhani dhe domatja, ndërkohë që bima Gentiana lutea përmban 4 gene fitoen sintazë (E15680-1, 2, 3).

85


Figura 2. Sinteza e fitoenit nga IPP dhe DMAPP

Shkurtimet: IPP = izopentenil difosfat (isopentenyl diphosphate); DMAPP = dimetilalil difosfat (dimethylallyl diphosphate); GPP = geranil difosfat (geranyl diphosphate); FPP = farnesil difosfat (farnesyl diphosphate); GGPP = geranil geranil difosfat (geranyl geranyl diphosphate); PPPP = prefitoen difosfat (prephytoene diphosphate); GPS = geranil difosfat sintazë (geranyl diphosphate synthase); dhe PSY = fitoen sintazë (phytoene synthase).

Karakterizimi biokimik i detajuar i fitoen sintazave është realizuar me kromoplastet e specit dhe domates (PSY-1) dhe kloroplastet e domates (PSY-2).

85


Përveç kësaj, PSY e narçisit është studiuar për të ndjekur shprehjen saj në qelizat e insekteve. Të gjitha enzimat fitoen sintazë janë të lidhura me membranën qelizore, por nuk janë proteina përbërëse të saj.

Enzimat fitoen sintazë 1 dhe 2 (PSY 1 dhe 2) të specit dhe domates janë aktive in-vitro si proteina të tretshme, pas çlirimit të tyre nëpërmjet bufereve jonikë të fuqishëm. PSY e narçisit ekziston në dy forma topologjike të dallueshme që kërkojnë riplotësim me galaktolipide për një aktivitet normal. Fitoen sintazat e bimëve in-vitro shfrytëzojnë të gjitha format trans-GGPP dhe japin kryesisht fitoene in-vitro cis-15.

Enzimat fitoen sintaza të specit dhe narçisit (in-vitro) kërkojnë vetëm Mn2+ për aktivitet normal. Fitoen sintazat e domates kërkojnë ATP dhe jone dyvalente, Mn2+ dhe Mg2+. Konkretisht, PSY-2 favorizon Mn2+ dhe ATP, ndërsa PSY-1 ka tolerancë më të madhe për Mg2+. Karakteristikat e tjera të enzimave tregohen në tabelën 5 (7).

85


Tabela 5. Karakteristikat kryesore të enzimave që marrin pjesë në formimin e fitoenit nga IPP, desaturimin dhe izomerizimin e karoteneve jociklike, ciklizimin e likopenit dhe formimin e ksantofilës (7)

Burimi Pesha molekulare

(kDa)

Nr i formave izomere

Km (μM)

Kofaktori(Cofactor)

pHoptimal

Pastërtia

IPP izomerazëFruta speci 33.5 1 6 Mg2+ 7-8 HomogjeneLule narçisi - 1 7.6 Mn2+ 6-8 E pjesshmeDomate e gjelbër 34 (>200)* 1 5.7 Mn2+/Mg2+ 8.2 E pjesshmeDomate e pjekur 34 (>200)* 1 5.7 Mn2+/Mg2+ 8.2 E pjesshmeGGPPSDomate >200a - - Mg2+/Mn2+ 6.5-7.5 E pjesshmeSinapis alba 38 (74) - 33-IPP,

2-DMAPP

Mn2+/Mg2+ 6.5-7.5 Homogjene

Fruta speci 37 (74)b 1 3-IPP, 0.95-

DMAPP1-GPP, 1.2-FPP

Mn2+ 6.5-7.5 E pjesshme

PSYDomate e pjekur 37 (>200)a 1 10-

GGPPDetergjent/ ATP/ Mn2+/Mg2+

7.5 E pjesshme

Domate e gjelbër 43 (>200)a 1 5-GGPP Detergjent/ ATP/ Mn2+/Mg2+

6.5 E pjesshme

Lule narçisi 42 1 - Galaktolipide/ Mn2+

6.5 Shprehje heterologe – qeliza të lira të gjalla

Spec i pjekur (maturuar)

47.5 1 0.3 GGPP0.27 PPPP

Mn2+ 7.6 Homogjene

PDS

Spec 57 1 - FAD 7.5Narçis 56 (>300)* 1 - FAD/ kuinone - Përzierje qelizash të lira

të gjallaDomate - - - - - Përzierje qelizash të lira

të gjallaZDSSpec 53 1 - O2 / kuinone - Homogjene që ndjek

shprehje heterologeLule narçisi - - - O2 / kuinone - Përzierje qelizash të lira

të gjallaLCYDomate - - - Detergjent - Përzierje qelizash të lira

të gjallaLule narçisi - - - NADPH -

85


Spec - - - Detergjent -HidroksilazatSpec CRTR-bland 2 25 2 - O2/ NADPH /

ferredoksinë /ferredoksinë oksidoreduktazë

- Homogjene që ndjek shprehje heterologe

EpoksidazaZEP speci 65 1 - O2, NADPH,

ferredoksinë e reduktuar

- Homogjene që ndjek shprehje heterologe

De-epoksidazëSallatë jeshile VDE 43 1 - Askorbate,

MGDG5.2 Homogjene

Spinaq VDE 43 1 - Askorbate, MGDG

5.2 E pjesshme

Kapsantinë/kapsorbinë sintazë

50 1 - FAD - Homogjene

Neoksantinë sintazë 56 1 - - - Homogjene

a) ka evidenca për ekzistencën e proteinave komplekseb) ekziston si një dimer në formën fillestare

85


3. Reaksionet e desaturimit

Një seri lidhjesh dyfishe karbon-karbon (C=C) përcaktojnë karakteristikat kromofore të pigmenteve karotenoide. Këto lidhje dyfishe janë futur tek fitoeni nëpërmjet një serie reaksionesh desaturimi (Figura 3). Ndodhin katër format vijuese të desaturimit, pikërisht, fitoen → fitofluen (7, 811, 12,7’, 8’- hekzahidro-ψ,ψ-karoten), fitofluen → ξ-karoten (7, 811, 12, 7’, 8’-tetrahidro-ψ,ψ-karoten), ξ-karoten → neurosporen (7,8-dihidro-ψ,ψ-karoten) dhe në fund neurosporen → likopen (ψ,ψ-karoten).

Nëpërmjet zgjatimit të kromoforit fitoeni pa ngjyrë konvertohet në likopen me ngjyrë të kuqe. Enzima përgjegjëse për desaturimin e fitoenit në ξ-karoten është fitoen desaturaza (PDS). Genet fitoen desaturazë janë identifikuar dhe izoluar nga speci, Arabidopsis, domatja, narçisi, orizi (Ac no. D23378), soja dhe duhani. Të gjithë genet përmbajnë një qendër lidhje dinukleotide (FAD/NADP) në fundin aminik të tyre. Aktiviteti desaturues in vitro është zbuluar në përgatitjet e plastideve nga domatja, speci dhe narçisi. Në të gjitha rastet aktiviteti i desaturazave është kryesisht i lidhur me membranën. Raporti i vetëm i fitoen desaturazës së përftuar të pastër është për specin.

Aktiviteti i fitoen desaturazës tek narçisi është studiuar duke përdorur mënyrën e shprehjes heterologe dhe është përcaktuar se ajo kërkon FAD dhe kuinone të oksiduara. Karakteristikat tjera të desaturazave jepen në tabelën 5.

Largimi i dy atomeve hidrogjen gjatë çdo hapi desaturimi sugjeron përfshirjen e një zinxhiri transporti elektronesh për rigjenerimin e reduktuesve.

85


Komponentët e këtij zinxhiri transporti elektronesh është sqaruar nëpërmjet karakterizimit të Arabidopsit dhe mutantëve të domates që akumulojnë fitoenin. Ky fenotip arrihet si rezultat i një oksidaze alternative (të ndryshuar) jofunksionale në zinxhirin redox që pengon desaturimin. Mutantët e Arabidopsit që përmbajnë një p-hidroksifenilpiruvat dioksigjenazë (HPPD) jo funksionale akumulojnë fitoen.

p-hidroksilpiruvatdeoksigjenaza (HPPD) është e domosdoshme për formimin e tokoferoleve dhe plastokuinoneve. Meqenëse ndodh akumulimi i fitoenit, desaturimi nuk mund të ndodhë pa plastokuinonet që veprojnë si reduktues. Ky fenotip Arabidopsi është përftuar nëpërmjet trajtimit me herbicide të tipit ciklohekzanedione, një klasë herbicidesh që pengojnë veprimin e hidroksifenil piruvat deoksigjenazës (HPPD).ξ-karoten desaturazë katalizon desaturimin e ξ-karotenit në likopen duke kaluar përmes formimit të neurosporenit. Genet koduese të hidroksifenil piruvat deoksigjenazës (HPPD) janë identifikuar tek speci, Arabidopsis thaliana, misri (AFO47490), soja (Ac no. AI495658), narçisi (Ac no. AJ224683) dhe domatja. Të gjitha genet përmbajnë sit (qendër) lidhje dinukleotide (FAD/NADP) në fundin aminik. Krahasimi i sekuencave të geneve fitoen desaturazë (Pds) dhe zeta-karoten desaturazë (Zds) tregon se ekziston 33-35% ngjashmëri mes tyre. Është për tu nënvizuar fakti se për enzimën zeta karoten desaturazë tek speci është publikuar vetëm një raport, duke ndjekur shprehjen tek E.coli. Për një aktivitet normal, enzima zeta karoten desaturazë (Zds) nuk kërkon një substrat specifik të izomerëve gjeometrikë, por kërkon detyrimisht një izomer dhe oksigjen e plastokuinone.

85


A) Renditja e reaksioneve të desaturimit dhe izomerizimit në bimët e larta

Shkurtimet: PDS = fitoen desaturazë, ZDS = ζ-karoten desaturazë dhe CRTISO = karoten izomerazë. Rrathët tregojnë pozicionin e

lidhjeve të reja dyfishe të formuara.

85


B) Renditja e reaksioneve të desaturimit dhe izomerizimit tek bakteret dhe kërpudhat

(fitoen desaturazat e tipit CRTI)

Figura 3. Desaturimi dhe izomerizimi i fitoenit

4. Izomerizimi

Në bimët e larta, fitoeni ekziston kryesisht si 15-cis izomer, ndërkohë që izomeri gjeometrik predominant i likopenit është all–trans, duke sugjeruar që izomerizimi

85


mund të ndodhë në disa faza. Karakterizimi i pigmenteve të pranishëm në domaten mutante tip ”mandarinë”, në fillim të viteve 1980, ka zbuluar prezencën e 7, 9, 7’, 9’-tetra-cis-likopenit (prolikopenin) dhe gjurmë të poli-cis prekursorëve (parardhësve) të tij. Kombinimi i fitoendesaturazë (PDS) dhe zeta-karotendesaturazë (ZDS) tek E.coli, ashtu si dhe në studimet in-vitro me kromoplastet e narçisit, zbuluan formimin e prolikopenit, në mungesë të dritës gjatë periudhës së inkubacionit. Këto dy linja evidencash të pavarura çojnë në sugjerimin që në bimët e larta ekziston një aktivitet izomerazë ndërmjetës në shndërrimin e formave nga cis në trans.

Klonimi pozicional i bazuar në hartën gjenetike të geneve përgjegjës për fenotipin e frutit të domates tip ”mandarinë” rezultoi në izolimin e Crtiso (karotenizomerazë). Kur tek E. coli bashkëshprehen Pds dhe Zds, njëkohësisht, vërehet një përqindje më e lartë e likopeneve të tipit all-trans. Njëkohësisht, tek Arabidopsis thaliana, është izoluar gjithashtu homologu Crtiso (karotenizomerazë), që është emërtuar Ccr-2 (34).

Nga ana fenotipike, mutantët Ccr-2 të Arabidopsit, përmbajnë nivele të reduktuara të luteinës dhe, në errësirë, akumulojnë prekursorë poli-cis karoteneve. Është interesante që indet e gjelbra të Arabidopsit Ccr-2 ose të domates tip ”mandarinë” nuk shfaqin diferenca fenotipike. Këto të dhëna sugjerojnë që drita dhe klorofila (apo parardhësit e klorofilës) ndihmojnë fotoizomerizimin dhe ”lehtësojnë” nevojën për aktivitetin cis-trans izomerazë. Genet Crtiso të Arabidopsit dhe domates, ashtu si dhe genet Pds dhe Zds, përmbajnë një bërthamë lidhje dinukleotide (FAD/NADP). Genet që kodojnë enzimat Crtiso (karotenizomerazë) shfaqin më shumë ngjashmëri me

85


fitoendesaturazat bakteriale (CrtI) se sa me desaturazat e bimëve të tjera (Pds dhe Zds).

Është interesant fakti që në speciet Erwinia dhe Rhodobacter, desaturazat bakteriale shndërrojnë respektivisht fitoenin 15-cis në likopen all-trans ose në all-trans neurosporen. Të dhënat shkencore më të fundit tregojnë që sekuenca desaturuese vepron në fitoenin 15-cis me futjen (introduktimin) e lidhjeve dyfishe trans në pozicionet 11, 11’ nga PDS (fitoen desaturaza) për të formuar 9,9’-di-cis ξ-karoten. Pastaj, ZDS (zeta karoten desaturazë) krijon lidhjet cis për të formuar 7,9,9’,7’-tetra-cis likopen. Nga paraqitja prekursor/produkt të Arabidopsit Ccr dhe të domates mutante tip ”mandarinë” duket që CRTISO (karotenizomeraza) vepron mbi prolikopenin për të formuar all-trans likopenin dhe bën të mundur ciklimin e mëtejshëm.

5. Ciklimi i karotenoideve

Ciklimi i karotenoideve është i kufizuar në formimin e një unaze 6-karbonëshe në njërin apo dy fundet e pararendësit/prekursorët/paraardhësit jo ciklikë. Pikërisht, likopeni është prekursori i ciklimit. Formimi i grupeve fundore ciklike fillon nga një goditje protoni në C-2 të lidhjes dyfishe fundore C-1,2 që është e veçuar nga zinxhiri polien. Ndodhin dy tipe grupesh ciklike fundore, unazat α dhe β-ionone. Këto grupe fundore ndryshojnë vetëm nga pozicioni i lidhjes dyfishe brenda unazës ciklohekzone (Figura 4).

Tipi i grupit fundor varet nga natyra e enzimës ciklazë. Fatkeqësisht rreth ciklimit të karotenoideve janë raportuar shumë pak studime in vitro. Studimi më i plotë me kromoplastet e narçisit, sugjeron që likopeni all-trans

85


është substrati specifik për ciklimin dhe NADPH është ko-faktori që kërkohet. Aktiviteti ciklazë in vitro është përcaktuar gjithashtu tek membranat kromoplastike tek domatja dhe speci (shih tabelën 5).

Izolimi / veçimi dhe plotësimi funksional tek E coli ka çuar në zbulimin e ekzistencës së dy enzimave kryesore ciklaza në bimët e larta. Ato janë likopen β-ciklazë (LCY-b), që bën introduktimin e unazave β dhe likopen –ε-ciklazë (LCY-e) që bën introduktimin e unazave ε.

Është interesante që LCY-b (likopen-β-ciklazë) mund të katalizojë futjen e dy unazave β tek likopeni për të formuar β-karotenin nga δ-karoteni, ndërsa LCY-ε (likopen-ε-ciklazë) mund të bashkojë vetëm një unazë ε për të formuar δ-karotenin. Për formimin e α-karotenit duhet të veprojnë të dyja ciklazat LCY-e dhe LCY-b. Mendohet që, pamundësia e ε-ciklazës për të shtuar më shumë se një unazë ε, siguron një mekanizëm për kontrollin e formimit të karotenoideve ciklike (35).Genet Lcy-b janë identifikuar tek Arabidopsis, narçisi (Ac. no. X98796), duhani (Ac. no. F13561) dhe speci. Tek domatja janë veçuar dy likopen-β-ciklaza, njëra nga të cilat ka shprehje kromoplast-specifike (Cyc-b). Proteina ka një sekuencë aminoacide që është 53% identike me LCY-b. Genet Lcy-e janë veçuar nga Arabidopsis dhe domatja. Të dy tipet e ciklazave, LCY-e dhe LCY-b (likopen-ε-ciklazë dhe likopen-β-ciklazë), kanë një ngjashmëri të rëndësishme në nivelin e aminoacideve,me rreth 30% ngjashmëri. Po kështu, të dy tipet e ciklazave zotërojnë gjithashtu një lidhje dinukleotide (FAD/NADP) karakteristike në fundin aminik.

85


Lloje të veçanta të sallatës jeshile (Lactuca sativa) formojnë karotenoidin ”lactucaksantinë” (ε, ε-karoten-3,3’-diol). LCY-e nga sallata jeshile tregon 80% ngjashmëri në nivel aminoacidesh me homologun e saj tek Arabidopsis. Megjithatë, plotësimi funksional në E.coli tregon që kjo enzimë mund të introduktojë dy unaza ε, ndryshe nga ekuivalenti i saj tek Arabidopsis (35).

Figura 4. Ciklimi i likopenitShkurtimet: LCY-e = likopen-ε-ciklazë; LCY-b / LCY-B = likopen-

β-ciklazë* Introduktimi i dy unazave ε ndodh vetëm tek sallata jeshile

85


6. Formimi i ksantofilës

6.1. Hidroksilimi

Në bimët e larta, ksantofilat janë produkte oksidimi të formuara nën veprimin e enzimave të α dhe β-karotenit. Hidroksilimi i pozicioneve C-3 dhe C-3’ të α-karotenit rezulton në formimin e α-kriptoksantinës dhe më pas, si produkt përfundimtar, luteinës, ndërsa hidroksilimi i pozicioneve C-3 dhe C-3’ të β-karotenit rezulton në formimin e β-ksantinës dhe më pas zeaksantinës, respektivisht (Figura 5).Hyrja apo introduktimi i grupit hidroksil (-OH-) në karotenet β-ring katalizohet nga enzimat e tipit hidroksilazë. Tek Arabidopsis janë identifikuar dy β-karoten hidroksilaza (23) dhe homologët e tyre janë gjetur gjithashtu tek domatja dhe speci. Shprehja heterologe tregon që hidroksilazat e specit janë të varura nga ferrodoksina dhe kërkojnë hekur për një aktivitet normal (shih tabelën 5). Sekuencat aminoacide të hidroksilazës, të deduktuara in-vitro, tregojnë prezencën e spiraleve transmembranore duke sugjeruar një lokalizim integral në membranë, in-vivo. Theksojmë që nuk është identifikuar ndonjë hidrolazë që të jetë në gjendje të shtojë një grup hidroksil në pozicionin 3 të unazës ε (ε-ring). Ky reaksion është i domosdoshëm për formimin e luteinës.

6.2. Epoksidimi dhe de-epoksidimi

Violaksantina formohet nga zeaksantina nëpërmjet hyrjes së grupeve epoksi - 5, 6 në unazat β-3-hidroksi. Ky reaksion kalon nëpërmjet formimit të produktit

85


ndërmjetës të monoepoksiduar të quajtur anteraksantinë. Kjo radhë reaksionesh është e kthyeshmm dhe de-epoksidimi mund të konvertojë violaksantinën mbrapsht në zeaksantinë (Figura 5). Këta reaksione njihen kolektivisht me një emër si cikli i violaksantinës. Sekuencat e genit zeaksantinë epoksidazë (Zep1) janë identifikuar tek Arabidopsi (23), kajsia (Ac no.AF159948), domatja (Ac no. Z83835), duhani dhe speci.Duke ndjekur shprehjen heterologe është realizuar funksionimi i produktit të genit zeaksantinë epoksidazë tek speci dhe është vërtetuar se reaksioni është i varur nga prania e ferredoksinës së reduktuar (shih tabelën 5).

Figura 5. Formimi i ksantofilës

85


Shkurtimet: CRTL-e = ε-ring hidroksilazë; CRTL-b = β-ring hidroksilazë; ZEP-1 = zeaksantinë epoksidazë; NXS = neoksantinë sintazë; VDE = violaksantinë de-epoksidazë dhe CCS = kapsantinë / kapsarubin sintazë.

Enzima violaksantinë de-epoksidazë (VDE) është veçuar dhe purifikuar nga sallata dhe spinaqi. Enzima ka një peshë molekulare 39 Kda dhe për një aktivitet normal kërkon një pH optimal 5 dhe askorbate. Genet Vde janë identifikuar tek sallata, duhani (U34817), spinaqi (AJ250433) dhe Arabidopsi. Sekuencat aminoacide të të dy geneve Zep dhe Vde tregojnë që ata janë pjestarë të një grupi proteinash të njohura si lipokalina që lidhin dhe transportojnë molekula të vogla hidrofobike.

6.3. Sinteza e neoksantinës

Neoksantina formohet nga violaksantina dhe përmban një grup fundor të vetëm alenik. Mendohet që ky grup fundor krijohet nga shkëputja e protoneve nga C-7 që është afër me unazat β 5,6-epoksi-5,6-dihidro të violaksantinës. Më tej realizohet rivendosja e grupit epoksi në 5 hidroksi (Figura 5). Deri tani është arritur të bëhet veçimi dhe studimi i funksionit të produkteve të geneve për pataten dhe domaten (shih tabelën 5).

Është interesant fakti që në genomën e Arabidopsit nuk është identifikuar geni Nxs. Sekuenca aminoacide e enzimës NXS (neoksantinë sintazë) tek domatja është identike me CYC-β gjë që na bën të dyshojmë se enzima është dyfunksionale në kushte të caktuara.

85


6.4. Sinteza e kapsantinës dhe kapsorubinës

Kapsantina dhe kapsorubina nuk janë gjetur në indet e bimëve të larta që përmbajnë klorofilë dhe janë relativisht specifike për frutat e pjekur të specit. Këto karotenoide përmbajnë një unazë jo të zakonshme, specifike ciklopentane (κ-ring) e cila formohet nga unazat β 3-hidroksi-5,6-epoksi të violaksantinës dhe anteraksantinës (shih figurën 5).

Enzima kapsantinë/kapsorubinë sintazë është veçuar nga kromoplastet e specit. Veçoritë e saj funksionale janë përmbledhur në tabelën 5. Sekuenca e genit ccs që kodon enzimën kapsantinë/kapsorubinë sintazë ka një qendër lidhje dinukleotide (FAD/NADP) aminofundore dhe tregon një ngjashmëri shumë të madhe me LCY-b (likopen-β-ciklazë). Kjo ka çuar në demonstrimin e aktivitetit enzimatik ciklik të kësaj enzime.

7. Katabolizmi dhe degradimi i karotenoideve

Izolimi dhe veçimi i mutantëve me pamjaftueshmëri të acidit absisik (ABA) dhe identifikimi i genit përkatës ka çuar në zbulimin e rolit të karotenoideve, veçanërisht violaksantinës dhe neoksantinës, si paraardhës të acidit absisik.

Tek misri është zbuluar enzima epoksi-karotenoid prerëse (ndarëse) (NC), e koduar nga geni VIP14, e cila është përacktuar se ndan (pret) izomerët 9-cis të violaksantinës dhe neoksantinës dhe formon cis-ksantoksinën (Figura 5). Në genomën e Arabidopsit, bazuar në homologjinë e geneve, është identifikuar një familje prej 7 genesh NC (epoksi-karotenoid ndarës).

85


Enzimat ndarëse janë identifikuar gjithashtu edhe tek domatja (23). Specifikimi i substratit të këtyre enzimave është vërtetuar nëpërmjet plotësimit funksional dhe provave in-vitro të realizuara gjerësisht. Produktet e vërteta in-vivo dhe roli i tyre biologjik kërkon studime të mëtejshme. Kohët e fundit, nga bima Crocus sativus, janë izoluar dhe janë karakterizuar nga ana funksionale genet e përfshira në çarjet oksidative të zeaksantinës në krocetinë (4).

IV. RREGULLIMI I BIOSINTEZËS SË KAROTENOIDEVE NË BIMËT E LARTA

Rregullimi i biosintezës së karotenoideve në nivel geni dhe enzime nuk është i kuptuar plotësisht pasi nuk janë veçuar shumë gene rregullatore të përfshira në formimin e karotenoideve, ndonëse geni Or, i identifikuar tek lulelakra, dhe geni Ap, i identifikuar tek domatja mutante “kajsi”, duken premtuese në këtë drejtim. Roli kryesor i karotenoideve në zhvillimin dhe përshtatshmërinë e bimëve tregon që sinteza e tyre është e bashkërenduar dhe e koordinuar me proceset e tjera të zhvillimit të bimëve siç janë proceset e formimit të plastideve, lulëzimi dhe zhvillimi i frutave.

Vështirësitë praktike të punës me karotenoidet dhe enzimat biosintetike të tyre bëjnë që njohuritë tona të rregullimit të rrugës së biosintezës të jenë të pjesshme.

Një rrugë biosinteze e degëzuar, siç është ajo e formimit të karotenoideve nga prekursorët izoprenoidë, është e pamundur të kontrollohet nga një proces rregullator i vetëm. Kështu që pikat e kontrollit duhet të

85


jenë në çdo pikë degëzimi dhe mundësisht të përfshijnë të gjitha rastet e transkriptimit dhe pastranskriptimit.

1. Rregullimi i transkriptimit (transcriptional regulation)

Pjekja e frutave të domates dhe specit, zhvillimi i lules së narçisit, domates, tagetesit (Tagetes erecta), janë të gjitha të shoqëruara me diferencimin e plastideve, zhvillimin e kromoplasteve dhe de novo (në mënyrë natyrale) formimin e karotenoideve. Biogjeneza e plastideve është e lidhur me rritjen dhe depozitimin e pigmenteve karotenoide. Shkencëtarët kanë zbuluar si genet e up- dhe ata down- rregullimit të transkriptimit të karotenoideve. Psh gjatë pjekjes së frutit të domates rritet shprehja e geneve fitoen-sintazë të pjekjes (Psy-1) dhe fitoendesaturazë, Pds. Në kundërshtim me këtë, mARN e geneve Lcy-b dhe Lcy-e ulet apo reduktohet. Përcaktimi i aktivitetit të enzimave në frutat e pjekura shpjegon ndryshimet në shprehjen geneve në nivel enzimatik. Llogaritja e koeficientëve të kontrollit të fluksit ka lejuar gjithashtu vlerësimin e kontrollit të ushtruar në çdo hap të rrugës biosintetike. Të dhënat tregojnë që fitoensintazë -1 ushtron kontrollin më të madh mbi fluksin e rrugës biosintetike. Bashkërisht, të dhënat tregojnë që në frutat e pjekura të domates akumulohen sasi të mëdha likopeni duke rritur sasinë e karoteneve jociklike të rrugës së sintezës dhe bllokimin e formimit të produkteve përfundimtare në rrugën e ciklimit. Varietetet mutante të domates për nga ngjyra dhe varietetet transgjenike janë përdorur dhe kanë shërbyer për sqarimin e mekanizmave rregullatore që veprojnë gjatë pjekjes së frutave. Analiza e pigmenteve

85


të varietetit të domates transgjenike crtI, mutantit Og likopen ciklazë b (Lcy-b), Ogc dhe high-beta, sugjerojnë që frenimi feedback mund të operojë brenda rrugës biosintetike ose nga vetë β-karoteni ose nga një produkt i β-karotenit (7).

Kjo evidencë është vërtetuar dhe përforcuar nga rritja e shprehjes së geneve Pds dhe Psy-1 që rezulton nga frenimi kimik i ciklimit të likopenit në gjethet e domates.

Kohët e fundit është vërtetuar që metaboliti DX, në rrugën e biosintezës së pavarur nga acidi mevalonik, mbirregullon procesin në drejtim të geneve biosintetikë të karotenoideve siç është fitoen sintetaza, Psy-1.

Rregullimi transkripsional, që rezulton me rritjen e aktivitetit enzimatik, është ilustruar gjithashtu në pjekjen e frutave tek speci. Përveç sa më lart, është vënë re që stresi oksidativ ndihmon sintezën e karotenoideve gjatë diferencimit të kromoplasteve dhe mbirregullon shprehjen e geneve përgjegjës për karotenoidet.

Mbirregullimi (up regulation) i shprehjes së geneve përgjegjës për karotenoidet është raportuar gjatë zhvillimit të lules tek narçisi, tek pjepri si dhe gjatë zhvillimit dhe pjekjes së frutave të agrumeve.

Intensiteti i dritës ndikon në ndryshimin e formimit të karotenoideve duke rritur shprehjen e geneve biosintetikë të karotenoideve të veçantë.

Psh në fidanët e zhvilluar në dritë të mustardit (Sinapsus alba) rritet sasia e mARN të genit fitoensaturazë (Psy), ndërkohë që mARN e genit fitoendesaturazë (Pds) dhe mARN e genit geranilgeranil fosfatazë (Ggpps) mbeten konstante, të pandryshuar. Ky efekt operon nëpërmjet një procesi fitokrom- ndërmjetësues.

85


Ndryshimet në sasinë e mARN të genit Lcy-b dhe Lcy-e janë gjithashtu të dukshme në intensitete drite të ndryshme. Karakterizimi funksional dhe struktural i promotorit të fitoen sintazës nga Arabidopsi ka bërë të mundur identifikimin e rajoneve që janë përgjegjës për dritë me frekuencë të ndryshme.

Megjithëse biosinteza e karotenoideve është e domosdoshme për zhvillimin e kloroplasteve, shprehja në grup e geneve përgjegjës për karotenoidet nuk është as e varur nga drita dhe as e kontrolluar nga një gen kriptokrom.

2. Rregullimi pas transkriptimit (post-transcriptional regulation)

Gjatë formimit të izoprenoideve, një problem rregullator kyç është se cilët mekanizma kontrollojnë pjesmarrjen e prekursorëve në degëzimet e rrugës biosintetike të karotenoideve. Koncepti i kanalizimit metabolik të çdo degëzimi të rrugës biosintetike është marrë si i mirëqenë. Ekzistenca e familjeve multigene ka shtuar mbështetjen e kësaj teorie dhe janë siguruar evidenca eksperimentale shoqëruese të enzimave për domaten, specin dhe narçisin. Përveç kësaj, ndryshimet relativisht të vogla të izoprenoideve në bimët transgjenike, pavarësisht aktiviteteve enzimatike të rritura (më intensive), mbështesin konceptin që këto degëzime të rrugës biosintetike janë relativisht të pavarura nga njëri-tjetri. Në kontrast me këtë, xhuxhëzimi, që rezulton nga shprehja konstruktive e Psy-1 tek domatja, sugjeron që GGPP (geranil geranil pirofosfati) mund të devijojë nga një degëzim (në formë

85


gazi) në një tjetër (karotenoide) në këtë stad të zhvillimit të bimës dhe kryqëzimi metabolik ekziston.

Në kromoplastet e bashkëshoqëruara me membranën tek narçisi duket se ka një mënyrë pas-transkriptimit e aktivitetit rregullues të PSY dhe PDS. Besohet se ky mekanizëm është i lidhur me gjendjen oksidoreduktuese (redox) të akseptorëve (kapësve) të elektroneve të lidhura me membranën në rastin e PDS. Përveç kësaj, shoqërimi me membranën i induktuar nga drita mendohet të rregullojë aktivitetin e fitoen sintazës gjatë fotomorfogjenezës.

Specificiteti i substratit të enzimave LCY është sugjeruar si një mekanizëm për rregullimin e pjesëmarrjes së karotenoideve β dhe ε-ring. Frenimi direkt i aktivitetit enzimatik nga produktet karotenoide të fundit është demostruar në një shkallë të caktuar (7)

3. Izolimi (veçimi) i karotenoideve

Izolimi i karotenoideve brenda qelizës bimore është një formë rregullimi. Kloroplastet dhe kromoplastet ndryshojnë mes tyre në mënyrën se si ata sekuestrojnë produktet karotenoide përfundimtare. Në kloroplaste, produktet karotenoide përfundimtare janë të lidhura me komplekset e varura nga drita. Karotenoidet e palidhura ka mundësi të shoqërohen me proteina specifike si plastoglobula të vogla.

Në kromoplastet e specit, produktet karotenoide përfundimtare esterifikohen në mënyrë të veçantë dhe shoqërohen me proteinën fibrilinë dhe shfaqen si fibrile. Kromoplastet e domates sekuestrojnë likopenin dhe shfaqen (duken) si kristale. Tek kanola dhe domatja

85


transgjenike është ndryshuar ultrastruktura e plastideve në përgjigje të ndryshimeve në përmbajtjen e karotenoideve.

Esterifikimi i karotenoideve do të ishte një mekanizëm efektiv i përdorur në shumë lule (luledielli, narçisi, etj) për të prodhuar nivele të larta të karotenoideve përkatëse.

V. STRATEGJITË PËR RRITJEN E NIVELIT TË PËRMBAJTJES SË KAROTENOIDEVE NË BIMËT BUJQËSORE

Përpara se të ndërmerret një program eksperimental për të rritur përmbajtjen e karotenoideve të rëndësishme nga ana ushqimore në bimët bujqësore duhet të merren në konsideratë disa kërkesa të domosdoshme. Një nga pyetjet e para për tu marrë në konsideratë është se cilat janë gjendjet e sëmundjeve që kanë lidhje me sasinë (marrjen) ditore të karotenoideve? Së dyti, a ekzistojnë evidenca eksperimentale të plota që mbështesin përfitimet shëndetsore që pretendohen? Psh siç është përshkruar më lart (në seksionin 2.1), mungesa e vitaminës A është një kontribues i qartë në verbërinë e fëmijëve në Azinë juglindore, ndërkohë që evidenca epidemiologjike të fuqishme tregojnë që marrja e sasive të mëdha ditore të likopenit (në formën e produkteve të domates) ka zvogëluar shpërthimin e kancerit të prostatës në shoqëritë perëndimore. Këta dy shembuj tregojnë se faktorët socialë, ekonomikë dhe gjeografikë duhet të merren në konsideratë për të menduar një strategji efektive që mund të përshtatet për të rritur përmbajtjen e një karotenoidi të veçantë.

Megjithatë, përfitimet shëndetësore të përzierjes së karotenoideve dhe sinergjizmi i tyre me fitokimikatet e

85


tjera në frutat dhe perimet nuk mund të mos merret në konsideratë. Këta faktorë kanë çuar në zgjedhjen e bimëve bujqësore për modifikimin e përmbajtjes së karotenoideve. Në mënyrë ideale, bimët bujqësore duhet të jenë të përshtatshme për mjetet e përmirësimit tradicional dhe/ose manipulimin gjenetik, të përmbajnë një rrugë biosintetike të brendshme të karotenoideve si dhe një profil bazë të njohur të tyre. Fakti që prodhimi i bimëve bujqësore ka një rol kryesor dhe të qëndrueshëm në dietën ushqimore të njeriut përbën një avantazh, megjithatë jo esencial. Në mënyrë alternative, prodhimi i karotenoideve në bimët që nuk përdoren direkt si ushqim, i ndjekur nga introduktimi (futja) në zinxhirin ushqimor si plotësues, do të simbolizonte një rrugë, një mënyrë të plotësimit të nevojave të konsumatorit me produkte të dëshiruara duke lehtësuar shqetësimet mbi konsumin e ushqimeve të modifikuara gjenetikisht. Njëkohësisht, karotenoidet e veçanta dhe bimët bujqësore janë objektiv i dy strategjive që kemi në dispozicion për rritjen e përmbajtjes së karotenoideve tek bimët:

1) përmirësimi tradicional (konvencional) i bimëve/diferencat varietore dhe

2) inxhinieria gjenetike (e quajtur shpesh inxhinieri metabolike ose manipulim gjenetik).

1. Përmirësimi konvencional/tradicional i bimëve

Në më shumë se 50 vitet e fundit, përmirësimi gjenetik modern i bimëve ka rritur me sukses prodhimin duke synuar rendimente më të larta dhe përshtatshmëri më të mirë ndaj streseve biotike dhe abiotike. Megjithatë, programet e përmirësimit me qëllim përmirësimin e

85


fitokimikateve që ndihmojnë shëndetin e njeriut (siç janë karotenoidet) nuk janë vrojtuar në shkallë të gjerë. Domatja është rasti ku është studiuar efekti i variacionit gjenetik në përmbajtjen e karotenoideve. Nga nëntë speciet e afërta të gjinisë Lycopersicon, gjashtë prej tyre kanë fruta me ngjyrë të gjelbër, me një profil të ngjashëm karotenoidesh dhe klorofile me atë të gjetur në indet gjethore. Frutat e pjekura të dy specieve, Lycopersicon cheesmanni dhe Lycopersicon pimpinellifolium, nuk përmbajnë klorofilë, por respektivisht β-karoten dhe likopen. Këto dy specie janë më të afërta filogjenetikisht me Lycopersicon esculentum frutat e pjekur të së cilës përmbajnë edhe likopen edhe β-karoten. Përmirësimi gjenetik i domates ka rezultuar në një numër të madh varietetesh me profile dhe përmbajtje të ndryshme karotenoidesh (Tabela 6) (1, 12, 16, 27), shumë nga të cilat presin të përdoren në dietën ushqimore. Varietetet e ndryshme të specit (Capsicum) kanë gjithashtu një ndryshim të madh në përmbajtjen e karotenoideve (42). Kohët e fundit është raportuar një varietet lulelakre (Brassica oleracea var botrytis) me kokë me ngjyrë intensive portokalli, në ndryshim me tipin e egër dhe atë të përhapur gjerësisht deri tani me kokë me ngjyrë të bardhë në krem (24).

85


Tabela 6. Varietetet mutante të domates me përmbajtje të ndryshme të karotenoideve

Genotipi Fenotipi Mutacioni/aktiviteti

Kromozomi

R Tul i gjelbër

Nuk përmban karotenoide

PSY-1/sintezë e fitoenit

3-29

hp-1

pigmentim i lartë-1

karotenoidet të shtuara

lidhje me dritën 12

hp-2

pigmentim i lartë-2

karotenoidet të shtuara

DET1/lidhje me dritën

12

t mandarinë poly-cis likopen i shtuar

CRTSO/karoten izomerazë

10-24

cr krimson i artë i vjetër

likopen i shtuar, β-karoten i ulët

CYC-B/ciklizim i likopenit

6-106

B Beta β-karoteni i lartë, shumë pak likopen

CYC-B/ciklizim i likopenit

?

Del

Delta δ-karoteni i shtuar, likopeni i reduktuar

LCY-e/ciklizim i likopenit

?

at kajsi karotenoidet të reduktuara

NIa 5

sh sheri Nuk përmban karotenoide

NI 10L

aNI = jo e identifikuar

85


2. Modifikimi gjenetik i biosintezës së karotenoideve në bimët bujqësore

Avantazhet e inxhinierisë gjenetike mbi metodat tradicionale të përmirësimit gjenetik përfshijnë aftësinë për të transferuar një gen ose disa gene në një mënyrë më të shpejtë dhe më të sukseshme. Përveç transferimit të geneve dhe ADN komplementare (cADN) nga specie të njëjta, teknologjitë rikombinante moderne përdorin introduktimin e materialit gjenetik nga specie të ndryshme bimore dhe nga specie jo të afërta, siç janë mikroorganizmat. Disavantazhi kryesor i breznisë së dytë të bimëve të modifikuara sot për sot lidhet me mospranimin nga konsumatori të ushqimeve të reja dhe të panjohura në treg.

Një pikë e mirë fillimi për të realizuar transformimet në bimë të ndryshme është përcaktimi i profilit dhe nivelit të karotenoideve prezente në bimën target, në bimën që synojmë të ndryshojmë dhe/ose indin që na intereson, dhe krahasimin e tyre me sasinë e kërkuar të karotenoideve. Më tej duhet të gjykohet mbi sasinë e tyre mesatare konsumuar në një vakt mesatar. Këto të dhëna na ndihmojnë në përcaktimin e mjetit modifikues më të përshtatshëm. Nëse kërkohet më shumë produkt karotenoid përfundimtar, atëherë është e përshtatshme një strategji e drejtuar në rritjen e fluksit që nga fillimi deri në fund të rrugës biosintetike, si psh inxhinieria sasiore (kuantitative) e rrugës biosintetike. Kështu, amplifikimi i enzimave me “shpejtësi të kufizuar” apo, shprehur në mënyrë më konkrete, me

85


enzima me koeficient kontrolli të fluksit më të lartë, është synimi kryesor për manipulimin gjenetik.

Në mënyrë alternative, mund të jetë e dëshirueshme që të ndryshojmë kompozimin e karotenoideve ose krijimin e një rruge biosintetike të karotenoideve në indin që na intereson (psh inxhinieria cilësore).

Një mjet tjetër i suksesshëm por që është e vështirë të skicohet në mënyrë racionale është inxhinieria pleiotrofike. Në këtë rast përmbajtja e karotenoideve ndryshohet si rezultat i manipulimeve në drejtim të një rruge tjetër biosinteze ose procesi biologjik i cili kryqëzohet me formimin e karotenoideve (shpesh normalisht e heshtur).Në përzgjedhjen dhe kombinimin e geneve dhe promotorëve të përshtashëm për të manipuluar rrugën e biosintezës së karotenoideve është e domosdoshme të njihet influenca e shumë faktorëve si madhësia (raporti) prekursor/metabolit, lokalizimi dhe aktiviteti i enzimave, profilet e shprehjes së genit apo geneve, katabolizmi i karotenoideve, ndërveprimi me rrugët e biosintezës së izoprenoideve të tjera dhe mekanizmat rregullatorë. Siç është përshkruar më lart (seksioni 3), shumica e geneve përgjegjës për biosintezën e karotenoideve janë izoluar (veçuar) dhe karakterizuar tek bakteret, kërpurdhat, algat dhe bimët e larta. Disa gene që kodojnë acidin retinoik (vitamina A) janë veçuar gjithashtu tek kafshët. Nga bimët është izoluar vetem një gen, fibrilina që është shoqëruar me sekuestrimin e karotenoideve dhe jo gene rregullatore që influencojnë formimin e karotenoideve. Seleksionimi i plotë i geneve biosintetikë ose ADN komplementare (cDNA) me homologët e ndryshëm por me identitet funksional të njëjtë, është avantazh për të

85


parandaluar efektet gjenetike siç është ko-supresioni (co-suppression), supresioni i drejtpërdrejtë dhe/ose neutralizimi i geneve.

Nëse genet bakteriale apo kërpurdhore janë përdorur për të modifikuar biosintezën në plastide janë përftuar nëpërmjet geneve kimerike, ata përmbajnë një sekuencë lider të shkrirë në fundin 5’ të transgenit. Zgjedhja e promotorit është shumë e rëndësishme pasi karakteristikat e tij kontrollojnë dinamikën, nivelin dhe indin specifik të shprehjes së genit që na intereson. Nga këndvështrimi komercial, është me rëndësi të jemi të vetëdijshëm për të drejtat e pronësisë reale dhe intelektuale. Njohja e së drejtës së pronësisë dhe marrëveshjeve të transferimit material mund të kursejë kohë në kuptimin më të gjerë dhe ndikon në drejtim të zhvillimit komercial.

Që me raportimin e parë të suksesshëm në transformimin e bimëve në vitin 1988 deri tani janë raportuar sisteme të ndryshme transformimi për pothuaj të gjitha bimët bujqësore (2). Megjithatë është e rëndësishme të jemi të sigurtë që sistemi është i zbatueshëm në varietetet brenda një gjinie dhe të krijohen linja të stabilizuara. Së fundi, metodologjitë ushqimore, biokimike, molekulare duhet të jenë në vend jo vetëm për të asistuar në shumëzimin e bimëve, por të drejtojë skicimin racional të mëtejshëm të inxhinierisë metabolike, të vlerësojë potencialin ushqyes dhe të përmbushin kërkesat e sigurisë ushqimore.

3. Shembuj të bimëve bujqësore të modifikuara gjenetikisht me nivele të ndryshme të karotenoideve

85


Më lart (seksioni 4.2) janë përshkruar kushtet paraprake që duhen marrë në konsideratë kur synojmë të ndryshojmë nivelin e karotenoideve në bimët bujqësore. Këtu do përmendim disa shembuj të bimëve bujqësore që kanë qenë objekt i inxhinierisë gjenetike metabolike (7, 12, 27, 39) (Tabela 7). Mjetet e përdorura janë ilustruar bashkë me ndonjë vështirësi që mund të ndeshim dhe si mund të kapërcehen këto vështirësi.

85


Tabela 7. Shembuj të inxhinierisë metabolike të biosintezës së karotenoideve

Geni i introduktuar /cDNA

Promotori Transformimi Varieteti Fenotipi (karotenoide μg/g FW), (pro Vit A RDA/porcion)

Zigociteti / fenotipi i trashëguar

OriziPsy cDNA nga narçisi

CaMV 35S

bombardim mikroprojektil

Japonica, taipei 309

akumulim i fitoenit në endospermë (0.3 μg/g FW)

Ho, i trashëguar në T2

Psy cDNA nga narçisi

Glutelinë bombardim mikroprojektil


akumulim i fitoenit në endospermë (0.6 μg/g FW)


crtI (E. uredovora) + Psy + Lcy-b (narçisi)

CaMV 35SGlutelinë

Agrobacteriumco-transformim


akumulim i β-karotenit në endospermë (1.6 μg/g FW), 8% RDA/300 g porcion

ND, ND

crtI (E. uredovora) + Psy + Lcy-b (narçisi)

CaMV 35SGlutelinë

Agrobacteriumco-transformim

Indica akumulim i β-karotenit në endospermë (1.6 μg/g FW), 8% RDA/300 g porcion

ND, i trashëguar në T2

DomatjaPsy-1 (domatje) antisens

CaMV 35S

Agrobacterium Ailsa Craig, tipi i egër

reduktim 100 herë i karotenoideve, rriten giberelinat 3-5 herë


E. uredovora, crtI

CaMV 35S

Agrobacterium Ailsa Craig,tipi i egër

rritet β-karoteni 2-4 herë (20-45 μg/g FW), 60% RDA/frut, ulet likopeni


E. uredovora, crtB

PG Agrobacterium Ailsa Craig,tipi i egër

fitoeni, likopeni, β-karoteni rriten 2-3 herë


Psy-1 (domatje) e drejtë (sens)

CaMV 35S

Agrobacterium Ailsa Craig, tipi i egër

Shtypje e sensit, akumulim i parakohshëm i likopenit, bimë xhuxhe (ulje e giberelinave dhe rritje e acidit absisik)


CYC-B domatje antisens

CaMV 35S

Agrobacterium CV VF36 ulje e përmbajtjes së β-karotenit

ND, ND

CYC-B domatje sens

CaMV 35S

Agrobacterium CV VF36 rritje e përmbajtjes së β-karotenit

ND, ND

ySAMdc CaMV Agrobacterium CV VF36 rritje 3 herë e ND, ND

85


majaje 35S likopenit (100 μg)Lcy-b domatje sens

E8 Agrobacterium Ailsa Craig, tipi i egër

rritje deri 7 herë e β-karotenit, 70% RDA/frut


Lcy-b domatje antisens

Pds Agrobacterium Moneymaker ND, ND

Lcy-b domatje + Lcy-b speci

Pds Agrobacterium Moneymaker rritje deri 30% e likopenit, prodhuar β-kriptoksantinë (5 μg/g FW) dhe zeaksantinë (13 μg/g FW)

ND, ND

CrtR-b Pds Agrobacterium Moneymaker ND, NDKanolaE. uredovora, crtB

Napin Agrobacterium Kultivari 212/86

Quantum

rritje deri 50 herë e përmbajtjes së karotenoideve (luteinës) (1400 μg/g FW, 12% RDA/g)

Ho, i trashëguar në T4 dhe në provat fushore

Karota E. herbicola, genet crt

CaMV 35S

Agrobacterium - rritje e përmbajtjes së karotenoideve 2-5 herë


Patatja Zep e duhanit, sens dhe antisens

GBSS Agrobacterium Freya Baltica rritje e përmbajtjes së zeaksantinës 130 herë (4 μg/g FW), rritje e karotenoideve në total 5.7 herë (6 μg/g FW), 1% RDA/patate

ND, ND

85


3. 1. Domatja (Lycopersicon esculentum)

Fruti i domates dhe produktet e saj përfaqësojnë burimin kryesor dietik të likopenit dhe burimin më të rëndësishëm të β-karotenit në dietat ushqimore të vendeve perëndimore. Prandaj nuk është suprizë që domatja është bima e studiuar në mënyrë shumë intensive në drejtim të manipulimit të karotenoideve. Gjatë pjekjes së frutave të domates ndodh një depozitim masiv i karotenoideve (400 herë) nga të cilat likopeni përfaqëson rreth 90% të totalit. Akumulimi i likopenit ndodh si rezultat i down-regullimit të ciklimit të likopenit dhe up-rregullimit të shprehjes së së fitoen sintaze (Psy-1) që nxit pjekjen e frutave. Fitoen sintaza shfaq koeficientin më të lartë të kontrollit të fluksit ndërmjet gjithë enzimave të rrugës së biosintezës së karotenoideve. Si rrjedhim ajo ka qenë dhe është targeti kryesor për amplifikim në objektivin për rritjen e përmbajtjes së likopenit dhe karotenit në frutat e domates. Megjithatë raporti i parë i një linje domatje transgjenike (Cv Ailsa Craig), prodhuar duke përdorur fitoen sintazën e domates, Psy-1 nën kontrollin konstituiv të promotorit të virusit të mozaikut të lulelakrës, Ca MV35S, tregon efekte pleiotrofike të dëmshme. Së pari, shumica e bimëve tregon një fenotip xhuxh. Xhuxhëzimi lidhet me shprehjen e rritur të fitoen sintazës, me përmbajtjen më të lartë të karotenoideve dhe acidit absisik (ABA) dhe nivele të reduktuara gibereline (GA). Të dhënat tregojnë që xhuxhëzimi vjen si pasojë e konkurimit metabolik për prekursorin geranilgeranilpirofosfat (GGPP) të karotenoideve dhe acidit giberelik, duke e drejtuar atë në drejtim të sintezës së karotenoideve dhe duke e larguar nga sinteza e acidit

85


giberelik. Gjatë zhvillimit të frutit është e domosdoshme vendosja e një ekuilibri të shkëlqyer mes këtyre komponimeve.

Në figurën 6 janë disa varitete domatesh me përmbajtje të ndryshme likopeni.

“Ailsa Craig” “Moneymaker” “Gardener’s Delight”

“Tumbling Tom Red” & Yellow” “Berry Garden”

Figura 6. Varietete domatesh me përmbajtje të ndryshme likopeni (karotenoidesh)

85


Së dyti, bimët shfaqin pigmentim intensiv të indeve që normalisht shoqërohen me përmbajtje të ulët karotenoidesh, psh farërat dhe rrënjët. Bimët e transformuara të mbijetuara që nuk shfaqin efektin e xhuxhëzimit, shfaqin akumulim të parakohshëm të likopenit në frutat e zhvilluara. Frutat e pjekur shfaqin shkallë të ndryshme të përmbajtjes së karotenoideve dhe në disa raste mungesë të plotë të tyre (karotenoideve), fenomen i ngjashëm me bimët antisens fitoensintazë (Psy-1). Në dukje, përdorimi i Psy-1 të brendshme në kombinimin me një promoter konstruktiv shkakton ko-supresion (neutralizim, heshtjen e geneve) të fitoensintazës së brendshme Psy-1. Neutralizimi i geneve si perspektivë e inxhinierisë metabolike ose përbën problem, siç shihet në linjat Psy-1, ose tregon një mundësi nëse kërkohet reduktimi i një metaboliti të caktuar. Me qëllim që të kapërcehen efektet e dëmshme të provuara me shprehjen e Psy-1, në eksperimentet e mëvonshme u përdorën një promotor specifik për indin (ind specifik) dhe një fitoen sintazë johomologe. Promotori i poligalakturouazës (PG) të domates është përdorur për të shprehur fitoensintazën bakteriale (crtB) nga Erwinia uredovora në mënyrë specifike në pjekjen e frutit. Ky mjet eviton efektet për shkak të ndryshimit të niveleve të geranilgeranilpirofosfatit (GGPP) në frutat e zhvilluar, ndërkohë që në frutat e pjekur sasia e GGPP është më e lartë se në indet e gjelbra dhe sinteza e acidit giberelik (GA) nuk kërkohet më tej (191). Përdorimi i një geni bakterial që ishte funksionalisht identik, por që ka homologji të vogël në nivel nukleotidesh (afërsisht 33% homologji) pengon neutralizimin e genit.

85


Një mjet alternativ që ka rezultuar mjaft i sukseshëm është përdorimi i Psy-1 të domates të ndryshuar në një kodon në çdo tre kodone duke krijuar një gen sintetik me homologji më pak se 60%. Bimët transgjenike që shprehin crtB në mënyrë specifike në frut shfaqin një rritje dy-tre herë në përmbajtjen totale të karotenoideve. Nivelet e fitoenit, likopenit dhe β-karotenit janë të gjitha më të larta. Analizat biokimike tregojnë që proteina aktive CRTB prodhohet dhe grumbullohet në plastide. Shprehja e fitoensintazës shtesë redukton influencën e këtij hapi mbi fluksin në rrugën biosintetike duke sugjeruar që rruga biosintetike endogjene mund të kompensojë luhatjet në ekuilibrin prekursor/produkt dhe rishpërndan balancën e kontrollit brenda rrugës biosintetike. Desaturimi i fitoenit është një hap që ka qenë subjekt i amplifikimit. Bimët e domates transgjenike (Cv Ailsa Craig) janë gjeneruar nga shprehja e fitoendesaturazës bakteriale (crtI) nga Erwinia uredovora me promotorin CaMV 35S (Cauliflower Mosaik Virus). Proteina CRTI është drejtuar (targetuar) në plastide me sekuencën tranzit të plastideve nga subnjësia e vogël e bizeles (SSU) e RuBisCo. Bimët e transformuara kanë fruta ngjyrë portokalli. Analizat e karotenoideve tregojnë ndryshime kompozicionale në indet vegjetative me përmbajtje më të lartë të β-karotenit dhe metabolitëve të tij. Në frutat e pjekura niveli i β-karotenit rritet dy deri katër herë, ndërkohë që niveli i provitaminës A ulet gati 50%. Përveç β-karotenit rritet dhe përmbajtja e neoksantinës, anteraksantinës, luteinës, zeaksantinës dhe komponimeve biosintetikalisht të lidhura me ta siç është tokoferoli (vitamina E). Në kontrast me këtë niveli i të gjitha karotenoideve përpara

85


β-karotenit në rrugën biosintetike janë të reduktuara. Si rrjedhim sasia totale e karotenoideve prezente është më e ulët se ajo në tipin e egër. Megjithëse aktiviteti i fitoendesaturazës në bimët transgjenike rritet, nuk vërehet rritje e likopenit. Nivelet e shprehjes së geneve dhe aktivitetet enzimatike mendohet se kryqëzohen brenda rrugës biosintetike, prandaj prezenca e crtI indukton ciklimin e likopenit endogjen dhe redukton përmbajtjen e komponimeve parardhëse të desaturimit të fitoenit. Është e rëndësishme të theksohet se megjithëse desaturazat bakteriale dhe bimore ndryshojnë në preferencën e tyre për izomeret karotene si substrat, bimët e transformuara crtI nuk kanë ndryshim në kompozimin e izomerëve karotenoide. Akumulimi i likopenit në frutat e pjekura të domates garanton një sasi të madhe të prekursorit për ciklimin në β-karoten. Bimët transgjenike të domates (var Moneymaker) janë prodhuar duke shprehur likopen β-ciklazën (β-Lcy) të Arabidopsis thaliana nën kontrollin e promoterit të fitoensaturazës (Pds) së domates. Frutat e pjekur të bimëve të transformuara janë me ngjyrë portokalli dhe dhe përmbajtja e β-karotenit rritet mbi 5 herë. Sasia e karotenoideve të tjera si në fruta ashtu edhe në indet gjethore mbetet e pandryshuar. Po kështu, nuk raportohen ndryshime të rëndësishme apo “heshtje” në shprehjen e geneve të brendshme përgjegjës për karotenoidet. Në kontrast me sa thamë më lart, kur β-Lcy e brendshme e domates introduktohet në drejtim antisens (drejtim të kundërt) nën kontrollin e promoterit Pds, bimët e transformuara shfaqin deri në 50% down-rregullim në shprehjen e β-Lcy në frutat e pjekura. Përmbajtja e likopenit rritet lehtësisht, ndërsa përmbajtja

85


e karotenoideve në gjetheve nuk ndryshon. Ndryshime kompozicionale të ngjashme vërehen kur β-geni që kodon një likopen β-ciklazë specifike për pjekjen e frutit të domates shprehet në domaten Cv VF 36 në orientim normal apo të kundërt nën kontrollin e promoterit të tij.Një nga kufizimet e frutit të pjekur të domates si burim i karotenoideve të lidhura me shëndetin është mungesa e niveleve të rëndësishme të ksantofilave siç janë luteina apo zeaksantina. Ekzistojnë varietete domateje me përmbajtje të lartë β-karoteni (Tabela 6). Inxhinieria metabolike për të metabolizuar zeaksantinën nga β-karoteni në këto varietete është provuar të bëhet nëpërmjet përdorimit të ADN komplementare (cDNA) që kodon hidroksilazën nga bimët dhe nga bakteriet, por, përveç prodhimit të një hidroksilaze aktive, nuk është arritur të prodhohet zeaksantinë, ndërkohë që studimet vazhdojnë. Vitet e fundit, formimi i zeaksantinës është realizuar nëpërmjet inxhinierisë gjenetike tek frutat e domates (cv Moneymaker) nëpërmjet ko-transformimit me konstrukte të ndara që përmbajnë β-Lcy të Arabidopsit dhe β-karoten hidroksilazë (β-Chy) të specit, të dyja nën kontrollin e promoterit Pds të domates. Frutat e pjekura nga këta bimë të transformuara përmbajnë edhe zeaksantinë edhe β-kriptoksantinë. Këto të dhëna tregojnë që me qëllim që të merret produkti i dëshiruar duhet të jenë prezent sasi të konsiderueshme të prekursorit për metabolizmin. Shembujt e inxhinierisë gjenetike të përshkrara më lart kanë patur si objektiv një hap ose disa hapa në rrugën e biosintezës. Vitet e fundit Mehta et al (27) kanë përshkruar bimët e domates transgjenike (Cv Ailsa Craig) me përmbajtje të lartë të likopenit. Objektivi i

85


studimit ishte të ndryshohej niveli i poliaminave me qëllim që të rritej jetëgjatësia e kërcellit të bimës dhe cilësia e lëngut. Në dukje, si rrjedhim i zgjatjes së jetëgjatësisë së kërcellit niveli i likopenit rritet. Një problem i rëndësishëm në krijimin e varieteteve të reja të domates nëpërmjet inxhinierisë gjenetike është trashëgimia e fenotipit. Gjatë breznive pasardhëse mund të ndodhë neutralizimi (heshtja) e geneve. Deri tani të dhënat janë raportuar vetëm për bimët transgjenike Psy-1, crtB dhe crtI, respektivisht në breznitë T2, T3 dhe T4. Në të gjitha rastet përfitohen linja homozigote të stabilizuara nga bimët e transformuara me futjen (insertimin) e një geni të vetëm. Zbërthimi i transgenit me fenotipin ndodh afërsisht sipas rregullit të Mendelit.

3.2. Karota (Daucus carota)

Grupi i parë që raportoi manipulimin gjenetik të sukseshëm në biosintezën e karotenoideve në një bimë bujqësore ishte Amoco Bioproducts. Genet crt të Erwinia herbicola u introduktuan tek karota duke rezultuar në një rritje 2-5 herë të β-karotenit në frutrrënjorin e karotës. Në figurën 7 jepen disa imazhe të varieteteve të ndryshme të karotës, ku përmbajtja e karotenoideve është e ndryshme.

85


portokalli e bardhë ngjyrë patëllxhan

e verdhë e kuqe ngjyra të ndryshme

Figura 7. Varietete të ndryshme karote me ngjyrë dhe përmbajtje të ndryshme karotenoidesh

3.3. Patatja (Solanum tuberosum)

Tek patatja, niveli i karotenoideve bazë, krahasuar me shumicën e frutave dhe perimeve, është i ulët. Patatja përmban karotenoide që gjenden kryesisht në indet kloroplastike, siç janë ksantofilat, luteina dhe violaksantina. Varitetet transgjenike të krijuara kanë përmbajtje më të lartë të zeaksantinës (5-130 herë) dhe karotenoideve në total (39). Për të rritur përmbajtjen e karotenoideve tek patatja janë përdorur introduktime në të dyja drejtimet, sens dhe antisens. Fillimisht u shfrytëzuan ndyshimet mes varieteteve për përzgjedhjen e genotipeve me përmbajtje të lartë të karotenoideve.

85


Pastaj, ADN komplementare e zeaksantinepoksidazës të brendshme (endogjene) u përdor në orientim të drejtë (normal) dhe të kundërt nën kontrollin e promoterit tuberspecifik që pengon shndërrimin e zeaksantinës në violaksantinë. Si rezultat, në tubere akumulohet zeaksantinë. Përveç sa më lart, gjithë rruga biosintetike e karotenoideve ndikohet dhe niveli i tyre në tuber rritet. Është interesant fakti se, përveç violaksantinës që është një ndërmjetës i rëndësishëm në sintezën e acidit absisik (ABA), nuk vërehen efekte të tjera për shkak të disbalancës së hormoneve bimore.

3.4. Kanola (Brassica napus)

Tek kanola janë shënuar arritjet më spektakolare në nivelin e karotenoideve të rezultuara nga inxhinieria metabolike. Tipi i egër i kanolës përmban nivele të ulta të luteinës në embrionin e saj. Transformimi i realizuar me introduktimin e një geni të vetëm të fitoensintazës së Erwinia uredovora (crtB), nën kontrollin e promoterit specifik për farën nga Brassica rapa, rezulton në një rritje 50 herë të karotenoideve. Embrionet transgjenike nga pamja e jashtme janë ngjyrë portokalli dhe përmbajnë kryesisht α dhe β-karoten, por është zbuluar gjithashtu edhe fitoen. Përveç kësaj, nivelet e klorofilës dhe tokoferolit ulen, ndërkohë që kompozimi i acideve acil yndyrore dhe ultrastruktura qelizore ndryshojnë. Në brezninë T4 krijohen linja homozigote dhe trashëgohet fenotip i stabilizuar. Provat fushore kanë demonstruar këtë fenotip në dy varietete Brassica napus L., Kultivar 212/86 dhe Quantum.

3.5. Orizi (Oryza sativa)

85


Përfitimet potenciale njerëzore në lehtësimin e mungesës së vitaminës A të ofruara nga krijimi i orizit transgjenik me endospermë që përmban β-karoten ka marrë publicitet masiv dhe ka çuar në termin ”Golden Rice”-orizi i artë. Normalisht në endospermën e orizit mungojnë provitamina A dhe karotenoidet e tjera. Megjithatë është zbuluar shprehja e disa geneve që përfshihen në formimin e karotenoideve (26) që formohen në endospermë. Studimet biokimike kanë treguar se në endospermë formohet geranilgeranil pirofosfat (GGPP). Prandaj me qëllim që të bëhet i mundur metabolizmi i GGPP në β-karoten, bëhet ko-transformimi i ADN komplementare (cDNA) të tre geneve biosintetikë nëpërmjet dy vektorëve. ADN komplementare e fitoensintazës dhe likopen β-ciklazës së narçisit (Narcissus pseudonarcissus) si dhe ADN komplementare e fitoendesaturazës crtI të Erwinia uredovora janë introduktuar nën kontrollin e promoterit endosperm-specifik (promoterin e gluteinës), nën kontrollin konstitutiv të CaMV 35S. Endosperma e orizit të transformuar përmban luteinë, zeaksantinë, β-karoten dhe α-karoten në raporte të ndryshme. Vërehet gjithashtu, në ngjashmëri me efektin e parë tek domatja se prezenca e vetëm crtI dhe Psy jep β-karoten dhe ksantofilat përkatëse. Kjo siç duket indukton genin likopenciklazë në përgjigje të formimit të likopenit. Trashëgimia e fenotipit dhe zbërthimi i transgeneve për krijimin e linjave homozigote nuk është raportuar akoma. Në figurën 8 jepen imazhe të orizit të zakonshëm dhe të ”orizit të artë”.

85


a) b) c)

Figura 8. a) orizi i zakonshëm dhe “orizi i artë“, b) fushë “oriz i artë“ dhe c) lulëri “oriz i artë“

Niveli i karotenoideve të formuara në endospermën e orizit transgjenik është rreth 1,6 μg/g endospermë. Llogaritet që për të plotësuar kërkesën për provitaminë A në një vakt ushqimor mesatar me oriz (300 g), duhet të jetë prezent në endospermë 2.0 μg/g, β-karoten. Këto nivele duket se janë të arritshme. Megjithatë llogaritjet nuk marrin në konsideratë aktivitetin e ndryshëm të provitaminës A, luteinës, zeaksantinës dhe α-karotenit krahasuar me β-karotenin. Forma ushqimore jo vajore e orizit ka mundësi gjithashtu që të reduktojë biovailabilitetin e karotenoideve dhe raportet e ndryshme sugjerojnë që në personat e kequshqyer, induktimi i enzimave që formojnë retinolin (vitaminën A) janë të ndrydhura (1).

3.6. Sistemet e bimëve model

Ndryshueshmëria sasiore dhe cilësore e karotenoideve në indet jo të gjelbra sugjeron që mund të tolerohen luhatje të mëdha. Indet jo të gjelbra, që nuk përmbajnë kloroplaste, të bimëve bujqësore janë komponentë të

85


rëndësishëm të dietës ushqimore të njeriut. Transformimi dhe krijimi i bimëve me përmbajtje të ndryshuar (më të lartë) të karotenoideve shpesh është i vështirë, i lodhshëm dhe kërkon shumë kohë. Më qëllim që të parashikohet ndikimi i faktorëve që duam të manipulojmë në një hap apo disa hapa në rrugën e biosintezës, do të ishte më i përdorshëm një sistem model, eficient dhe i besueshëm. Arabidopsis thaliana dhe duhani (Nicotiana tabaccum) (Figura 9) janë dy bimët që përdoren zakonisht si sisteme model, megjithëse ato kanë kryesisht inde të gjelbra.

Arabidopsi (Arabidopsis thaliana)

Duhani (Nicotiana tabacum)Figura 9. Bimët model për modifikime gjenetike

85


Ekzistojnë shembuj të shumtë që tregojnë rëndësinë e përdorimit të këtyre dy bimëve si sisteme model nga të cilët përfundimet apo rezultatet e inxhinierisë gjenetike mund të ekstrapolohen në bimët e tjera bujqësore. Në rastin kur fitoen saturaza e Erwinia uredovora introduktohet dhe shprehet tek duhani gjenden nivele më të larta të β-karotenit dhe metabolitëve të tij. Këto të dhëna lidhen mjaft mirë me ato të marra nga domatja dhe orizi. Informacion i dobishëm mund të merret gjithashtu nga sistemet model transgjenike duke shprehur β-karotenhidroksilazën, fitoensintazën dhe desaturazat (16). Vektorët viralë modernë përbëjnë një mjet tjetër që po përdoret për prodhimin e proteinave të vlefshme, si psh proteinat vaksina tek bimët, etj. Potenciali i këtij mjeti është demonstruar në shumë raste në ndryshimin apo alternimin e përmbajtjes së karotenoideve në bimë të ndryshme. Në një rast, një vektor viral ARN që përmban kapsantinë-kapsorubinë sintazë (Ccs) përdoret për të transformuar gjethet e Nicotiana benthamiana. Nga totali i karotenoideve të formuara, rreth 36% është kapsantinë. Është shumë e mundshme që një mjet i tillë të përdoret për të prodhuar karotenoidet e destinuara si plotësues i dietave ushqimore.

85


VI. PERSPEKTIVAT PËR TË ARDHMEN

Aplikimi i gjenetikës molekulare në përfitimin bioteknologjik të formimit të karotenoideve ka ndihmuar në avancime më të shpejta të të kuptuarit të biosintezës së karotenoideve dhe manipulimit të kësaj biosinteze në bimët e larta. Sekuencat bazë të reagimit dhe genet koduese të përfshira në biosintezën e karotenoideve tani janë të njohura me përjashtim të α-hidroksilazës e cila deri tani nuk është identifikuar dhe veçuar (izoluar). Nga autorë të ndryshëm në vende të ndryshme janë raportuar manipulime cilësore dhe sasiore. Megjithatë përveç

85


sukseseve të rëndësishme të arritura, disa aspekte të formimit dhe manipulimit të karotenoideve në bimët e larta nuk janë kuptuar plotësisht. Për të bërë një progres të mëtejshëm dhe për të arritur në një gjendje të ekspertizës që do të ndryshonte përmbajtjen e karotenoideve në bimët bujqësore në një nivel që të ndikonte në parandalimin e formave të ndryshme të sëmundjeve të njeriut, kërkimet duhet të vazhdohen në bashkëveprim me drejtimet themelore të aplikimit. Për këtë nevojitet të bashkëpunojnë disa disiplina shkencore të ndryshme me teknologjitë e tyre të domosdoshme të cilat në mënyrë skematike janë shprehur në figurën 6 (7).

85


Bimët transgjenike, speciet mutante dhe biodiverse me përmbajtje të ndryshuar të

karotenoideve

Bio

sin

teza

e k

arot

enoi

dev

e

Biologjia qelizore -Lidhja mes pjesëve përbërëse të qelizës

Bioinformatika -Analiza e promoterave

Proteomika - Proteinat

Analiza e metabolitëve-Rruga e biosintezës-Metabolomika e përgjithshme

Analiza e enzimave-Sistemet e lira nga qeliza-Karakteristikat e enzimave në mjedisin përkatës natyral

Aktivitet i përmirësuar i enzimave

Analiza e transkriptomeve-Rruga e biosintezës

Vlerësimi- Përcaktimi ekuivalent real

- Trashëgimia dhe stabiliteti i fenotipit në fushë

Vlera ushqimore të ndryshuara/më të larta të karotenoideve në bimët

bujqësore

85


Figura 6. Fushat e kërkimit që kontribuojnë në krijimin e bimëve bujqësore me përmbajtje të përmirësuar të

karotenoideve ushqimore

85


Manipulimi i biosintezës së karotenoideve ka lehtësuar të kuptuarit e rrugës së biosintezës dhe rregullimin e saj. Është shumë e rëndësishme që të mbahen breznitë dhe të bëhet karakterizimi i plotë i varieteteve në të cilët niveli i karotenoideve është i ndryshuar, qofshin këta transgjenike, mutantë natyralë apo nga biodiversiteti. Studimet e deritanishme kanë tentuar të fokusohen në një hap të veçantë në rrugën biosintetike në nivel geni apo enzime. Studime të tilla mbeten të vlefshme, por ekziston nevoja në rritje për të kryer një tërësi sistemesh për rrugën biosintetike nëpërmjet përcaktimit të ndryshimeve që ndodhin brenda gjithë rrugës së biosintezës në përgjigje të shqetësimeve që rrjedhin në përgjigje të proceseve biologjike dhe/ose manipulimeve. Sukseset në profilizimin e metabolitëve target, metabolomikës globale dhe vlerësimet matematike të flukseve të prekursorëve do të ndihmojnë dukshëm në vlerësimet e mëtejshme mbi biosintezën dhe lidhjen e saj në funksionin dhe metabolizmin e qelizës. Shpresojmë të ndodhë shpejt identifikimi i substrateve të kufizuara dhe njësive qelizore pjesëmarrëse për akumulimin e karotenoideve. Në nivelin e shprehjes së geneve, analiza e transkriptomeve do të siguronte një zbulim të vlefshëm të aspekteve rregullatore të rrugës biosintetike dhe vendndodhjeve të mundshme target për inxhinierinë pleiotropike, ndërsa studimet proteomike mund të vlerësojnë ndryshimet e përbërësve të proteinës që rezulton nga alternimet në përmbajtjen e karotenoideve në bimët e larta. Përveç sa më lart, proteina në komplekset biosintetike duhet të identifikohet duke siguruar zbulimin e mekanizmave të kanalizimit të metabolitëve,

85


një proces rregullator që duket se kufizon efektivitetin e ixhinierisë metabolike. Një karakteristikë e përbashkët e shumë studimeve për manipulimin e biosintezës së karotenoideve nëpërmjet amplifikimit të një enzime të vetme dhe, nisur nga kjo, për të gjykuar në kufizimin e shpejtësisë së biosintezës, ka qenë një farë inefektiviteti relativ, për shkak të aftësisë së komponentëve të tjerë të rrugës së biosintezës për të kompensuar paqëndrueshmëritë në rrugën e biosintezës. Këto studime kanë çuar në sugjerimet për manipulimim e disa geneve njëkohësisht ose përdorimin e faktorëve transkriptues për të lehtësuar dhe ndihmuar shprehjen e koordinuar të rrugës biosintetike. Një mjet i tillë është përdorur me sukses në krijimin e flavonoideve. Deri kohët e fundit nuk janë identifikuar faktorë transkriptimi që influencojnë në formimin e karotenoideve, por shpresojmë që teknika të tilla si njohja e aktivitetit dhe mbledhja e sinjaleve ORF të bimës model të Arabidopsit do të lejojnë identifikimin e këtyre faktorëve. Megjithëse ky material është fokusuar në biosintezën e karatenoideve dhe manipulimin e kësaj biosinteze në bimët e larta, është shumë e rëndësishme që të mos nënvlerësohet biosinteza e karotenoideve tek mikroorganizmat dhe diversiteti metabolik që ekziston ndërmjet bakterieve dhe kërpurdhave. Riorganizimi, zhvendosja e geneve dhe evoluimi direkt i geneve nga këto burime mund të sigurojë produkte të vlefshme me aktivitete katalitike të përmirësuara dhe/ose veçori rregullatore të ndryshuara.Përfundimisht, perceptimi i konsumatorit për bimët e modifikuara gjenetikisht do të thotë që është e

85


rëndësishme të shihet se alternimet në përmbajtjen e karotenoideve tek bimët të mos kenë efekte të kundërta dhe të përfaqësojnë një ekuivalent real dhe të rëndësishëm të dietës. Për vlerësimin e përfitimeve shëndetsore dhe qartësimin e evidencave konfuze të publikuara është e nevojshme të kryhen shumë studime të tjera epidemiologjike. Studimet dhe investigimet në drejtim të përfitimeve relative të plotësuesve karotenoide të pastër, krahasuar me ushqimet me përmbajtje të lartë karotenoidesh, janë në progres të vazhdueshëm. Në të gjitha rastet, ekstrapolimi i studimeve tek kafshët dhe tek njeriu duhet të shihet me shumë kujdes. Teknologjitë e fundit postgjenomike do të lejojnë studiuesit e biomarkerave të njeriut që të ndihmojnë në sqarimin e mënyrave të sakta të veprimit të këtyre komponimeve interesante.

VII. LITERATURA

1. Ackerman, J. (2002). National Geografic. 201:2-51.

85


2. Birch, R. G. (1997). Annual Review of Plant Physiology and Plant Molecular Biology. 48:297-326.

3. Bone, R. A. & alt. (1997). Experimental Eye Results. 64:211-8.

4. Bouvier, F. & alt. (2002). Plant Cell. 15:47-62.5. Bramely, P. M. (1985). Advanced Lipid Research.

21:671-9.6. Brown, L. & alt. (1999). Journal of Clinical

Nutrition. 70:517-24.7. Fraser, P. D. & P. M. Bramley. (2004). Progres in

Lipid Research. 43. The biosynthesis and nutritiona use of carotenoids. Elsevier Ltd. Pg 228-265.

8. Chen, L. & alt. (2001). Journal of National Cancer Institute. 93:1872-9.

9. Clavel-Chapelon, F. & alt. (1997). Cancer Detection Preview.21:426-40.

10. Clinton, S. K. & alt (1996). Cancer Epidemiological Biomarkers Preview. 5:823-33.

11. Cooper, D. A. & alt. (1999). Nutritional Review. 57:201-14.

12. Datta, K. & alt. (2003). Plant Biotechnology Journal. 1:81-90.

13. Eisenreich, W., F. Rohdich & A. Bacher. (2001). Trends of Plant Sciences. 6:78-84.

14. Giovannucci, E., A. Ascherio & alt. (1995). Journal of National Cancer Institute. 87:1767-76.

15. Giovannucci, E. (1999). Journal of National Cancer Institute. 91:317-31.

16. Gotz, T. & alt. (2002). Plant Molecular Biology. 50:129-42.

17. Hadley, C. W. & alt. (2003). Journal Nutrition. 133:727-32.

85


18. Harizaj, F., P. Laze & V. Vorpsi. (2004). Biokimia. Pg 406-410, 259-262.

19. Jackson, M. J. (1997). European Journal of Clinical Nutrition. 51: S1-2.

20. Johnson, E. J. (2002). Nutritional Clinical Care. 5: 56-65.

21. Keifer, C. & alt. (2002). Journal of Biology Chemistry. 276:14110-6.

22. Kim, L., A. V. Rao & alt. (2002). Journal of Medicinal Food. 5:181-7.

23. Lange, B. M., M. Ghassemian. (2003). Plant Molecular Biology. 51:925-48.

24. Li, L., J. P. Paolillo & alt. (2001). Plant Journal. 26:59-67.

25. Lindqvist, A. & alt. (2002). Journal of Biology Chemistry. 277:23942-8.

26. Matthews, P.D. & alt. (2002). Proceeds on 13th

international Carotenoid Symposium. 5227. Mehta et alt. (2002). Natyral Biotechnology. 20:613-

8.28. McGarvey, D. J. & R. Croteau. (1995). Plant Cell.

7:1015-26.29. Mohanty, I. & alt. (2002). British Journal Nutrition.

88:347-54.30. Nahum, A., K. Hirsch & alt. (2001). Oncogene.

20:3428-36.31. Okada, K. & alt. (2000). Plant Physiology. 122:1045-

56.32. O’Neill M.E et alt. (2001). Journal Nutrition; 85.Pg

499-507.33. Ong, A. H. J. & E. S. Tee (1992). Methods of

Enzimology. 213. Pg. 142-167.

85


34. Park, H., S. S. Kreunen & alt. (2002). Plant Cell. 14:321-32.

35. Pecker, I. & alt. (1996). Plant Molecular Biology. 30:807-19.

36. Poulter, C. D. & H. C. Rilling. (1981). Biosynthesis of isoprenoid compounds. Vol 1. New York: John Wiley and Sons. Pg 162-224.

37. Pryor, W. A. (2000). Nutritional Review. 58:39-53.38. Rodriguez-Concepcion, M., A. Boronat. (2002).

Plant Physiology. 130:1079-89.39. Romer, S. & alt. (2002). Metabolic Engineering.

4:263-72.40. Salillari, A., L. Susaj, S. Aliu. (2003).

Bioteknologjia. Pg 135-165. 41. Schmitz, H. H. & alt. (1991). Journal Nutrition.

121:1613-21.42. Schwekendiek, A. & alt. (2002). Proceeds on 13th

international Carotenoid Symposium. 5243. Scott, K.J & D.J. Hart (1994). The carotenoid

composition of vegetables and fruit commonly consumed in the UK. Norwich: IFR.

44. Slattery, M. L. J. Benson & alt. (2000). Journal of Clinical Nutrition. 71:575-82.

45. Snodderly, D. M. (1995). Journal of Clinical Nutrition. 62:1448S-61S.

46. Stahl, W. & alt. (1992). Archived Biochemistry Biophysiology. 294:173-7.

47. Stahl, W. & alt. (2000). Journal of Clinical Nutrition. 71:795-8.

48. Van het Hof, K. H. & al. (2000). Journal Nutrition. 130: 503-6.

85


49. 1994. North England Journal of Medicine (special issue). Alpha-tochopherol, β-carotene Cancer Prevention Study Group. 330:1029-35.

50. Weedon B.C.L. &G.P. Moss. (1995). Carotenoids. Basel: Birkhauser. Pg 27-44.

51. Wright, M. E. & alt. (2003). Cancer Causes Control.14:85-96.

52. Zhang, L. X. & alt. (1991). Carcinogenesis.12:2109-14.

85

Documents

1 KAROTENOIDET A5