1

La diagnostica mediante NMR

Raffaele Lamanna CR Trisaia – Biotec-AgroRaffaele Lamanna CR Trisaia – Biotec-Agro

2

La NMR è una tecnica spettroscopica in cui le transizioni osservate sono quelle fra i livelli energetici creati per effetto Zeeman quando il campione è sottoposto ad un forte campo magnetico.

Iom mBE Condizione di risonanza

Eo

1H

1,4 T 60 MHz

9.4 T 400 MHz

13C

1 T 10.7 MHz

oo B mI = ± 1

Mz

Effetto ZeemanEffetto Zeeman: In presenza di un campo magnetico esterno la degenerazione sui livelli si spin è rimossa e la magnetizzazione nucleare è diversa da zero.

Nella moderna NMR l’insieme di spin è eccitato mediante impulsi a r.f. e il segnale rivelato è nel dominio del tempo.

Solo dopo una Trasformata di Fourier è possibile ottenere lo spettro in frequenza.

3

Esistono essenzialmente quattro tipi di interazione:

• Zeeman e chemical sheilding

• Interazione indiretta mediata dagli elettroni.

• Interazione diretta (dipolare)

• Interazione di quadrupoloLe interazioni fra gli spin nucleare hanno intensità dell’ordine di KT. Ciò ci permette di modificare tali interazioni mediante delle perturbazioni esterne facendo in modo da evidenziare in un determinato esperimento solo alcuni tipi di interazione piuttosto che altri.La potenza è la versatilità dell’NMR sta proprio in questa capacità.

4

Differenze fra solidi, liquidi e semisolidi (soft matter)

• I liquidi sono caratterizzati da moti browniani traslazionali e rotazionali veloci che mediano tutte le anisotropie delle interazioni.

•La conseguenza è che lo spettro NMR è composto da righe generalmente strette e ben risolte.

• In un solido gli atomi assumomo posizioni fisse così piccole differenze nelle loro posizioni ed orientazioni o nell’ambiente che li circonda modulano le interazioni fra nuclei che risultano eseere così leggermente diverse da atomo ad atomo.

•Questa distribuzione anisotropa delle interazioni induce una distribuzione delle frequenze NMR, che essendo molto vicine le une alle altre si sovrappongono dando origine ad una riga molto larga.

5

Informazioni Strutturali

• Struttura stereochimica di molecole in soluzione

Informazioni Dinamiche

• Moti intramolecolari

• Rotazioni di gruppi chimici

• Moti intermolecolari

• Processi diffusivi

Informazioni Chimiche

• Analisi qualitativa e quantitativa di miscele

• Reazioni chimiche : cinetica e rivelazione di specie transienti

• Transizioni di fase

Chemical fingerprinting

6

Spettro 1H NMR a 600 MHz di succo di pomodoro

• In uno spettro 1H di succo di pomodoro ci sono diverse centinaia di righe di cui alcune sovrapposte.

7

Spettro Homonuclear 2D J-resolved di succo di pomodoro

L’analisi dello spettro 2D J-resolved permette di assegnare le componenti dei multipletti e permette di

misurare le costanti di accoppiamento 1H-1H J-couplings.

8

Spettro 1H-1H COSY di succo di pomodoro

Thr

Ala

Asp

Asn

GlnGlu

9

ppm

3.43.63.84.04.24.4 ppm

4.8

5.0

5.2

5.4

5.6

-glucose

-glucose

O OH

HH

OH

OH

H

H

OH

H

H HOH

Spettro 1H-1H TOCSY di succo di pomodoro

10

Spettro di correlazione 1H-13C di succo di pomodoro

13C

1H

11

•In un liquido a causa dell’energia termica le molecole sono sottoposte ad un moto casuale (Moto Browniano).

•Le caratteristiche di questo moto diffusivo sono funzione della forma della perticella diffondente e dell’interazione con il solvente e con le altre particelle.

FickdileggeIIPDt

P 2

•I moti diffusivi possono essere misurati mediante NMR facendo uso di gradienti di campo magnetico

• Ciascun nucleo emette O.E.M. a frequenza proporzionale al campo magnetico che esso sente.

•Un gradiente lineare di campo fa si che nuclei aventi posizioni differenti sentano campi magnetici differenti e quindi risuonino a frequenza diversa. Ciò equivale a fare una codifica fra la frequenza e la posizione dei nuclei..

12

Gli spin raggiungono insieme la linea di partenza solo se non cambiano la loro posizione.

Ripetendo l’esperimento a diversi tempi di diffusione o con diverse intensità di gradiente è possibile contare gli spin che hanno rifocalizzato e quindi determinare il loro coefficiente di diffusione.

La Diffusion Ordered Spectroscopy (DOSY) permette di individuare le righe NMR associate con i nuclei della medesima molecola attraverso il suo coefficiente di diffusione.

13

Spetto DOSY di succo di pomodoro

14

Importanza dell’algoritmo di analisi

R. Lamanna “NMR Data Processing:The TNMR SoftwarePackage”

XXXII National Congress on Magnetic Resonance Pavia 18-21 settembre 2002

Sof

twar

e co

mm

erci

ale

TN

MR

15

List of components of tomato juice fully assigned in 1H NMR spectra

Sugars-D-Glucose, -D-Glucose,-D-Fructopyranose, -D-Fructofyranose

Organic acidsCitric acid, Malic acid, Acetic acid, Formic acid

Amino acidsAlanine, Threonine, Glutamic acid, Glutammin, Aspartic acid, Asparagin, Phenylalanine, Triptophane, Tyrosine, Valine, Ileucine, -Aminobutyric acid

AlcoholsEthanol, Methanol.

16

Monitoraggio della maturazione del pomodoro mediante NMR

Contenuto molare relativo dei componenti principali del pomodoro a tre diversi gradi di

maturazione.

17

Idrolisi Enzimatica dell’amido in miscele acqua-farina

-maltose-glucose

A30 min

B270 min

“B-A”

18

tka

aia

ik

a

i

i

eEE

Ekdt

dE

EE

0

M

tkG

tkM

K

MeVtMg

eVtMSf

iG

iM

0

0

.

,,

t

M

G eK

V

G

MM

G

MM eMV

KV

V

KVtM

1

00

0

0

00

)(

t

M

G eK

V

G

MMtM eMV

KVe

VGtG

1

00

000

0

11)(

Il Modello Cinetico

),(

),(,,

tMgdt

dG

tMgtMSfdt

dM

M

G

SM

KM

MVMg

KS

SVMSf

,

La forma delle funzioni f e g dipende dal tipo di reazioni coinvolteNel caso di una cinetica di tipo Michaelis-Menten si ha:

se

M

G

M

K

MVMg

VMSf

,

M<<KM.

S>>KS

acat EkV

Iniattivazione enzimatica del primo ordine

19

Int

(a.u

.)

0

50

Chey

Int

(a.u

.)

0

100

AL1

Int

(a.u

.)

0

100 AL2

Int

(a.u

.)

0

5

10

ChSp

Int

(a.u

.)

0

20

40

AX

Int

(a.u

.)

0

20DxDy

Int

(a.u

.)

0

100

CAP

Int

(a.u

.)

0

50 SIM

Int

(a.u

.)0

50

Lb45

Int

(a.u

.)

0

100LAT

Int

(a.u

.)

0

100

BxBy

Int

(a.u

.)

0

50

Lb42

Time, 104 s2 4

Time, 104 s 2 4

[1]

t

M

G ek

V

G

MM

G

MM eMV

kV

V

kVtM

1

00

0

0

00

)(

t

M

G ek

V

G

MMtM eMV

kVe

VGtG

1

00

000

0

11)(

20

(ppm)

D (cm2 s –1)

Maltose

Glucose

long chain polysaccharides

21

Lin

kag

e D

ista

nce

0

10

20

30

40

50

60

AL1 SIM

LAT CAP

BXBY Lb42

Lb45 ChSp

AL2 Chey

AX DXDY

S

H

ROOT

M0

Chey

DxDy

AL2

ChSp

AX

SIMLb42

LATLb45CAP

BxBy

-10

-5

0

5

10

15

20

25

30

-4 -3 -2 -1 0 1 2 3 4

Pattern Recognition

PCA, Cluster Analysis, LDA, Anova, Logica Fuzzy, Reti neurali, teniche Bayesiane etc.

Cluster Analysis

LDA