1 La proteína de estrés calórico Hsp70 funciona como un indicador

Revista Electrónica de Veterinaria REDVET - ISSN 1695-7504 http://www.veterinaria.org/revistas/redvet Vol. VI, Nº 3, Marzo 2005 – http://www.veterinaria.org/revistas/redvet/n030305.html

Bañuelos-Valenzuela, Rómulo 1., Sánchez-Rodríguez, Sergio H. La proteína de estrés calórico Hsp70 funciona como un indicador de adaptación de los bovinos a las zonas áridas - Revista Electrónica de Veterinaria REDVET ®, ISSN 1695-7504, Vol. VI, nº 03, Marzo/2005. Veterinaria.org ® - Comunidad

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La proteína de estrés calórico Hsp70 funciona como un indicador de adaptación de los bovinos a las zonas áridas

Bañuelos-Valenzuela, Rómulo 1., Sánchez-Rodríguez, Sergio H. 2. 1) Departamento de Bioquímica. Facultad de Medicina Veterinaria y Zootecnia. Universidad Autónoma de Zacatecas. El Cordobel Enrique Estrada, Km 36.5. carretera Zacatecas-Fresnillo, México. Tel/FAX: (478) 985-02-02. 2) Departamento de Biología Celular y Microbiología. Centro de Biología Experimental. Universidad Autónoma de Zacatecas. Guadalupe, Zacatecas, México. Calzada de la Revolución s/n, Col. Tierra y Libertad. Guadalupe, Zacatecas, México. C.P. 98600. Tel/Fax (492) 921-13-26. Correspondencia: Dr. Sergio Hugo Sánchez Rodríguez. Departamento de Biología Celular y Microbiología. Unidad Académica de Biología Experimental. Universidad Autónoma de Zacatecas. Apartado postal 12. Guadalupe, Zacatecas, México. C.P. 98600. Tel/Fax (492) 921-13-26. E-mail: [email protected] http://www.veterinaria.org/revistas/redvet/smdck

RESUMEN El propósito del presente estudio fue seleccionar genotipos de ganado bovino que estén mas adaptados al estrés calórico en las zonas áridas, a través de la expresión de las proteínas de choque calórico (Hsp), las cuales, son constituyentes normales de las células y su síntesis se incrementa con la exposición a varias formas de estrés. Nuestro objetivo fue establecer, si la expresión de las Hsp de los linfocitos del ganado bovino explotado en la región, muestra diferencias raciales en respuesta al estés calórico. De los bovinos, se obtuvieron linfocitos de sangre periférica por gradientes de Ficoll-histopaque, después se cultivaron en medio RPMI a temperaturas de 38, 40, 42 y 44°C, durante 4 horas, posteriormente se lisaron, se obtuvieron extractos que se caracterizaron por PAGE-SDS 10%, se transfirieron a papel de nitrocelulosa y se probaron con anticuerpos monoclonales anti-Hsp 25, 60,70 y 90. Se encontró: El calor es un agente estresante en los linfocitos del ganado bovino explotado en la región, cuya respuesta es a través de la expresión de la proteína Hsp70. La cantidad de proteína Hsp70 expresada en los linfocitos esta en función al estrés calórico recibido. El nivel de adaptación de un organismo ante un estresor, esta en función a la cantidad de Hsp expresada, por lo tanto, las razas bovinas más adaptadas a la región en orden decreciente es: Holstein-Australiano, Criollo, Pardo Suizo, Holstein y Limousin. Palabras clave: Proteínas de Estrés Calórico (Hsp), Estrés Calórico, Adaptación, Bovinos.





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SUMMARY Purpose of study present was bovine animals selected to heat shock in the arid zones through to expression heat shock proteins (Hsp), which, are normal components in the cells and their synthesis rise with the exposition to different ways of stress. Our goal was to know if the expression of Hsp in cattle bovine lymphocytes exploitation in the region show different behavior according with to the race. We obtain lymphocytes from venous blood. After purification in hystopaque, they were cultured in RMPI at 38, 40, 42 and 44°C during 4 hours; after that, the cells were lysed, the extracts were characterized by PAGE-SDS 10%, and then, they were transferred into nitrocellulose paper, then they were tested using monoclonal antibodies against 25, 60, 70 and 90 Hsp.

In our results we found that the heat is an stress agent in the cattle bovine exploitation in this region. The lymphocyte’s response to stress by heat is trough the expression of protein Hsp70. The amount of Hsp70 expressed in lymphocytes is in function of the amount of heat stress received. The level adaptation of an organism to an stressor is in function to the Hsp amount expressed, therefore, the better adapted animals are whom express more protein Hsp70. For this reason we found that the races more adapted to this region in decreasing order are: Holstein-Australian, Creole, Holstein, and Limousine. Key Words: Heat Shock Protein (Hsp), Caloric Stress, Adaptation, Bovine.

INTRODUCCIÓN Las variables climáticas tienen importancia en determinar los limites de la distribución de las especies, en ausencia de barreras geográficas abruptas (Hoffman and Parson, 1991). Así, determinar si una zona geográfica particular, o si un país tiene un clima limitante, requiere un análisis cuidadoso del bioclima, lo que incluye la evaluación de la meteorología, los forrajes nativos, las enfermedades y la medida de la adaptabilidad de los animales (Johnson, 1987). El estrés calórico se define como cualquier combinación de condiciones ambientales, que puedan causar que la temperatura de la zona termoneutral de los animales sea superior, y éstas condiciones existen casi todo el año en las zonas tropicales. El forraje de baja calidad, la disponibilidad limitada del agua, las altas temperaturas ambientales y del aire, los altos niveles de radiación solar directa e indirecta, son los factores que más influencian la productividad de los rumiantes en el desierto y las zonas tropicales (Ghosal and Matur, 1992; Mousa and Elkalifa, 1992; Silanikove, 1992). Se conoce, que las células de todos los organismos parecen emplear medios comunes y mecanismos de defensa, cuando ocurren cambios abruptos físicos y químicos en su medio ambiente local, que favorecen el replegado inapropiado de sus proteínas. Esta respuesta referida como choque calórico o respuesta al estrés, vincula el cambio de las condiciones ambientales con la expresión de un grupo de proteínas conocidas como





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proteínas de choque calórico (Hsp). Las Hsp, incluidas las chaperonas moleculares, se expresan de manera constitutiva y ubicua en las células eucariotas y procariotas (Morimoto and Milaski, 1990; Welch, 1990; Lindquist and Craig,1988). En condiciones adversas, la función de éstas proteínas es proteger a la célula del daño producido por el estrés, mediante la unión a proteínas parcialmente desnaturalizadas, disociando agregados de proteínas y regulando el doblez correcto y la traslocación intracelular de proteínas sintetizadas de novo (Goodman and Blank, 1998). Las proteínas del estrés son inducidas a sobreexpresarse por varios agentes estresantes (Lin et al., 1998), entre los que están: la hipoglucemia, la anoxia, el calor, el etanol, el peróxido de hidrogeno, iones de metales pesados, arsenicales, infecciones con ciertos virus (Guerreiro and Raynes, 1990), la radiación ultravioleta, la radiación electromagnética de baja frecuencia, los campos intensos de radiación gamma (Feder and Hoffmann, 1999; Saran and Bors, 1997) y la radiación gamma de baja intensidad (Vega-Carrillo et al., 2001).

La finalidad de presente estudio fue seleccionar las razas de ganado bovino productor de carne y leche que mejor se adapten a nuestra región a través de la expresión de las Hsp, las que funciona como un indicador de adaptación ambiental al agente estresor temperatura. Nuestra hipótesis fue, que los linfocitos del ganado bovino del biotipo regional (criollo) respecto a los del biotipo europeo (Holstein, Holstein –Australiano, Pardo-Suizo y Limousine), muestran diferencias en respuesta al estrés calórico por la vía de la expresión de las hsp. Nuestro objetivo fue establecer, si la expresión de las proteínas de choque calórico de los linfocitos del ganado bovino explotado en la región, muestra diferencias en respuesta al estrés calórico.

MATERIAL Y MÉTODOS

Lugar y condiciones climáticas

Los sujetos experimentales, se mantuvieron en la Facultad de Medicina Veterinaria y Zootecnia de la Universidad Autónoma de Zacatecas, localizada en el Km. 36.5 de la carretera Panamericana, tramo Zacatecas-Fresnillo, a 22º 52´ de latitud norte y 102º de longitud Oeste, a una altitud de 2,153 msnm. El clima de esta zona es semiseco templado, presenta lluvias en verano cuya precipitación medio anual es entre 400 y 700 mm y un porcentaje de lluvia invernal de 10.2 mm. La temperatura media anual es de 18°C, y la máxima temperatura corresponde a mayo, con un valor que oscila entre 18 y 28.5°C; la mínima se presenta en enero, con –10 °C (INEGI and SPP, 1981).





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Animales y condiciones de alojamiento Las muestras de sangre de 5 genotipos bovinos fueron utilizados para aislar sus linfocitos. Se utilizaron 20 vacas (Bos taurus), cuatro individuos de cada uno de los siguientes grupos raciales: Limousin, Holstein, Holstein-Australiano, Suiza y Criolla, considerada esta última como el genotipo regional (Montaldo et al., 1994), no gestantes, con una edad promedio de 36 meses, sometidas a las mismas condiciones de alojamiento (corral abierto y sobra disponible durante el día) y una alimentación constituida por heno de alfalfa y alimento balanceado para vacas lecheras de una mezcla comercial con 16% de proteína cruda y agua ad libitum. Los animales se mantuvieron en los corrales de la posta de la Facultad de Medicina Veterinaria y Zootecnia de la Universidad Autónoma de Zacatecas. Obtención de linfocitos Se obtuvieron de cada animal 10 ml de sangre por venipuntura anocaudal en tubos vacutainer con heparina de 10 ml (Beckton-Dickinson N.J., U.S.A.), entre las 8:00 y 9:00 A.M., durante un periodo de un año, en total 8 muestras. De la sangre obtenida, los linfocitos fueron aislados por gradiente de Ficoll Histopaque (Sigma Chemical Co, St Louis MO, USA, 1077-1) siguiendo la técnica descrita por Boyum (1968). Los linfocitos de cada animal, fueron cultivados en medio RPMI 1640 (Gibco BRL, Grand Island NY, USA, 11876-026), suplementado con 100 U/ml de penicilina, 100 ng/ml de estreptomicina (In Vitro, México, D.F.), 0.08 U/ml de insulina (Eli Lilly México, D.F.), y 5% de Suero Fetal Bovino (Gibco BRL, Grand Island NY, USA, 16000-044). De cada bovino, la viabilidad de los linfocitos fue determinada al momento de obtenerlos y después del estrés calórico, mediante la técnica de exclusión con azul de tripano (Sigma Chemical Co, St Louis MO, USA, T-6146). Marcaje metabólico y estrés celular Los linfocitos de cada animal, se dividieron en 5 alícuotas. Una alícuotas fue tomada como control para determinar el nivel basal de Hsp. Con el fin de determinar si durante el estrés por calor se sintetizan nuevas hsp, las otras 4 alícuotas se les aplicó un pulso con 35S-metionina (Amersham Laboratories, Buckinghamshire, England, UB2688), cuya actividad específica fue de 5 �Ci/ml; seguido de esto, los linfocitos fueron sometidos a estrés calórico durante 3 h. en estufas de cultivo bajo las siguientes temperaturas: 38ºC, 40ºC, 42ºC, y 44ºC. Después del estrés calórico, la viabilidad de los linfocitos se volvió a determinar.





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Lisis Celular Después del estrés calórico, los linfocitos para todas las alícuotas fueron centrifugados a 326 g por 10 minutos, se lavaron 2 veces con 1 ml de solución amortiguadora de fosfatos (PBS; pH de 7.2)( (Gibco BRL, Grand Island NY, USA, 21300-058). Los linfocitos fueron homogeneizados con buffer de lisis que contiene: Triton X-100 al 1%, NaCl 140 mM, EDTA 1 mM, Tris-HCl 10 mM pH 7.6 e inhibidor de proteasas 1 mM, PMSF (Sigma Chemical Co, St Louis MO, USA, P-7626). El lisado se centrifugo por 10 min. a 1600 g y el sobrenadante fue recuperado (fracción soluble) (Harlow and Lane, 1988). SDS-PAGE y Western Blot La cuantificación de proteína se realizó mediante la técnica descrita por Bradford (1976). De cada condición experimental, 30 �g de proteína se caracterizaron en geles de poliacrilamida (PAGE-SDS al 10%) de acuerdo a la técnica descrita por Laemmli (1970). Para el Western Blot, las proteínas se transfirieron a papel de nitrocelulosa (Amersham Laboratories, Buckinghamshire, England, RPN303C), como describió Towbin et al. (1979). Después, el papel conteniendo las proteínas fue bloqueado con leche descremada al 3%/PBS (Compañía Nestle, S.A. de C.V., México, D.F.) por 12 horas. Los blots fueron probados con anticuerpos monoclonales específicos contra las proteínas hsp 25, 60, 70 y 90 (Sigma Chemical Co, St Louis MO, USA, H-0148, H-4149, H-5147, H-1775) con una dilución 1:1000 en leche descremada al 3%/PBS por 1 hora. La unión de los anticuerpos fue visualizada utilizando un anti-IgG-ratón conjugado a peroxidasa de rábano (Sigma Chemical Co, St Louis MO, USA, A-9044) dilución 1:1500 en leche descremada al 3%/PBS por 1 hora. La peroxidasa fue catalizada por quimioluminiscencia (Enhanced Chemiluminescence Western Blotting Detection Reagent, ECL) (Amersham Laboratories, Buckinghamshire, England, RPN2106), la cual emite luz que fue detectada en una película radiográfica BioMax (Eastman Kodak Co, Rochester, NY, USA, 870-1302) en un tiempo de 10 segundos. Autoradiografía y Densitometría La membrana de nitrocelulosa con las proteínas marcadas con 35S, fue expuesta a una película radiográfica BioMax (Eastman Kodak Co, Rochester, NY, USA, 870-1302) por 45 días. Las placas reveladas para 35S e ECL se analizaron mediante densitometría (Eagle Eye, Estratagene Mitsubishi). Con el fin de cuantificar la cantidad especifica de proteína sintetizada de nuevo, se dividieron los valores densitométricos de 35S/ECL, y se le resto el efecto respectivo del control de 35S, a través de la siguiente expresión: 35S/ECL - 35S control/Tiempo de exposición.





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Análisis estadístico

Los datos obtenidos se analizaron utilizando el modelo lineal general GLM (SAS/STAT, 1990), para un diseño de tratamientos factorial que incluyó: (A)= raza y (B)= temperatura, con cinco niveles del factor raza y cuatro niveles del factor temperatura, con un diseño experimental completamente al azar, mediante la siguiente ecuación:

Yijk = m + Ai + Bj + ABij + Eijk.

Donde: Y = la respuesta variable (expresión de las Hsp70). m = la media general. Gi = el efecto fijado de la itésima raza (1, 2,...5). Tj = el efecto de la jotaésima temperatura (1, 2, 3, 4). ABij = el error fijado de la itésima raza y la jotaésima temperatura. Eij = el error aleatorio residual. Posteriormente, para determinar el efecto de la temperaturas sobre la variable dependiente en cada uno de los grupos raciales del experimento, se corrió un análisis de medias con la prueba de Duncan.





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RESULTADOS En el presente estudio, se obtuvo una viabilidad elevada (>98%) de los linfocitos bovinos pertenecientes a los distintos grupos raciales (Cuadro 1). Con la finalidad de determinar la expresión constitutiva (38°C) e inducida (40°C) de algunos miembros de la familia de proteínas de choque calórico de los linfocitos de cada uno de los grupos raciales recién obtenidos, se les caracterizaron las proteínas por PAGE-SDS al 10% y Western Blot, en donde la membrana de nitrocelulosa se incubo con anticuerpos específicos contra las proteínas hsp 25, 60, 70 y 90, encontrándose únicamente en los cinco grupos raciales a la proteína hsp70 (Figura 1). Al evaluar el incremento en la síntesis de la hsp70 en los linfocitos bovinos en función de la temperatura a que fueron expuestos (38, 40, 42 y 44°C) , y utilizando como trazador 35S-metionina (Figura 2), tales resultados obtenidos se analizaron en un densitómetro para cuantificar la síntesis de nuevas proteínas, donde el valor obtenido de la lectura densitomértrica a una temperatura de 38°C fue normalizado a la unidad (i.e., =1) por considerarse la temperatura homeotérmica del ganado bovino. Se encontró, un incremento de la Hsp70 a temperatura de 40 semejante para los cinco grupos raciales sin mostrar diferencias significativas. Para el tratamiento de 42ºC, el estrés calórico afecta de manera significativa a los linfocitos de los cinco grupos raciales al identificar la máxima expresión de la Hsp70. Para el tratamiento a 44ºC se encontró una disminución de la Hsp70 (Figura 3). El promedio general de mayor expresión de la hsp70 para todos los grupos raciales fue a los 40 y 42°C (Figura 4). Para determinar el grado significativo de adaptación de los grupos raciales con base en el incremento de la Hsp70, se realizo el análisis de varianza con una (P < .05). La expresión de la proteína hsp70 inducida por calor en cada grupo racial en orden decreciente fue: Holstein-Australiano, Criollo, Pardo-Suizo, Holstein y Limousine (Figura 5). Para determinar el grado significativo de adaptación de los diferentes grupos raciales explotados en la región con base en el incremento de la síntesis de hsp70, se realizo un análisis de varianza, el cual indico, que la temperatura induce la expresión de la hsp70 (p >.05). La expresión de hsp70 a 38, 40, 42 y 44 °C fue de 1.00 ± 0.00, 1.01 ± 0.31, 2.13 ± 1.22 y 1.68 ± 0.70 respectivamente. La máxima expresión se dio a los 40 y 42 °C. De acuerdo a los resultados obtenidos en el presente estudio, la raza Holstein-Australiana y el biotipo regional (Criollo) presentaron una tendencia mayor en la expresión y síntesis de la Hsp70, lo que nos indica una mayor capacidad de adaptación, (Figura 6). La prueba de Duncan, permitió observar que en lo general, existe una mayor producción de hsp70 a los 42 °C (p > 0.05).





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Cuadro 1. Viabilidad de los Linfocitos en los 5 Grupos Raciales

Viabilidad de los Linfocitos en los

5 Grupos Raciales

Raza % Viabilidad

Holstein 99.6 ± 0.6 (8)

Holstein A 99.4 ± 0.6 (8)

Suiza 99.0 ± 0.3 (8)

Limousine 98.2 ± 0.6 (8)

Criolla 98.9 ± 0.2 (8)





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Figura 1. Inmunodetección de la proteína Hsp70 constitutiva en linfocitos de

ganado bovino. L= Limousine, H= Holstein, S= Suizo, H-A= Holstein-Australiano, C= Criollo.

Expresión constitutiva de Hsp70 en Linfocitos de

Raza L H S H-A

70 kD





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Figura 2. Expresión de la proteína Hsp70 constitutiva (38°C) e inducida a diferente temperatura en linfocitos del ganado bovino.

Inducción de Hsp70 en Linfocitos de Ganado Bovino Genotipo 38 40 42 44 38 40 42 44°C

Limousin

Holstein

Holstein-A

Suizo

Criollo

35S-Metionina ECL





11

0

0.5

1

1.5

2

2.5

38°C 40°C 42°C 44°CTemperatura (°C)

Den

siad

opt

ica

HolsteinH-ASuizoLimousineCriollo

Figura 3. Expresión de la proteína Hsp70 constitutiva (38°C) e inducida por estrés calórico (40, 42, 44°C) en los linfocitos del ganado bovino.

Figura 4. Cantidad de proteína Hsp70 inducida por la temperatura para todos los grupos raciales. Constitutiva (38°C) e inducida por calor (40, 42, 44°C).





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Figura 5. Efecto de la temperatura sobre la producción de Hsp70 en los distintos grupos raciales. H= Holstein, H-A= Holstein-Australiana, S= Suiza, L= Limousine, C= Criolla.

Figura 6. Producción de Hsp70 en linfocitos bovinos (p > 0.05), a distintas temperaturas para los diferentes grupos raciales.





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DISCUSIÓN El objetivo del presente estudio fue establecer, si la expresión de las proteínas de choque calórico (hsp) de los linfocitos del ganado bovino explotado en la región, muestra diferencias raciales en respuesta al estrés calórico. Los grupos raciales estudiados fueron Limousin, Holstein, Holstein-Australiano, Suiza y Criollo (germoplasma local).

El presente estudio utilizó los niveles de expresión de la Hsp70 en los linfocitos bovinos, como un indicador de adaptación ambiental al agente estresor temperatura, y que puede funcionar como un indicador de adaptabilidad, rusticidada y/o habilidad de supervivencia entre los distintos grupos raciales de bovinos. Estudios previos han mostrado que la tolerancia que presentan los organismos al agente estresante calor, puede ser natural o inducida (Parsell and Lindquist, 1994), donde participa la síntesis de las proteínas de choque calórico como un mecanismo de respuesta celular (Morimoto et al., 1994).

En el presente estudio, los linfocitos bovinos pertenecientes a los distintos grupos raciales presentaron una viabilidad elevada (>98%). Dicha viabilidad fue superior a la reportada en estudios similares (Kamwanja et al., 1994), debido posiblemente a un mejor manejo y traslado más rápido de las muestras al laboratorio. Al determinar la expresión constitutiva (38°C) e inducida por calor (42°C) de las Hsp (25, 60, 70 y 90) en los linfocitos obtenidos de los cinco grupos raciales, únicamente se encontró a la proteína Hsp70. Los otros miembros de las hsp estudiadas, no se identificaron debido a que probablemente son expresadas a otro rango de temperatura o por otro tipo de agentes estresores (Rutherford and Lindquist, 1998; Loo et al., 1988; Csemerly et al., 1988). Así, podemos decir que la hsp70 es la que se expresa de manera constitutiva e inducida en los linfocitos bovinos estudiados. Al evaluar el incremento en la síntesis de las Hsp70 inducidas por calor en los linfocitos de los distintos grupos raciales en función de la temperatura a que fueron expuestos (38, 40, 42, 44 ºC), se encontró un incremento en la síntesis de la hsp70 a temperatura de 40 y 42°C y una disminución a los 44°C. La disminución de la hsp70 a los 44 ºC se debe probablemente a que a esa temperatura, existe una gran cantidad de proteínas desnaturalizadas a las cuales, se une la hsp70, pero que pasan de ser solubles a insolubles, y en nuestro trabajo solamente se analizaron las proteínas de las fracciones solubles, siendo necesario estudiar si realmente esta hsp70 unida a proteínas insolubles se encuentra en dicha fracción. El comportamiento en la expresión de la hsp70 de cada grupo racial en orden decreciente Fue: Holstein Australiano, Criollo, Pardo-Suizo, Holstein y Limousine, indicándonos cierto grado de adaptabilidad. Esto coincide con las observaciones realizadas tanto en animales homeotermos como en diferentes tipos de células, en los cuales, al incrementarse la temperatura ambiental, aumenta la expresión de las proteínas de choque calórico como un mecanismo para su protección (Kamwanja et al., 1994; Franci et al., 1996; Kiang et al., 1998). Así mismo, se a observado que el miembro de la familia de Hsp que





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participa activamente durante el estrés producido por el calor, es la Hsp70, cuyas funciones están en el auxilio a la unión de proteínas desplegadas, el plegamiento inadecuado y el transporte intracelular de las proteínas (Lindquist and Criag, 1988; Morimoto and Milaski, 1990; Gething and Sambrook, 1992). Estudios anteriores demuestran que los organismos expuestos a un factor de estrés como son las temperaturas superiores a las óptimas, presentan un comportamiento de respuesta en sus procesos metabólicos, entre los que se encuentra los mecanismos hídricos, hormonales, homeostáticos, entre otros (Hoffman and Parson, 1991). Dentro de los homeostáticos se llevas a cabo la síntesis de un grupo específico de proteínas de estrés calórico (hsp). Estas proteínas tienen como función principal proteger a la célula del daño ocasionado por el calor y participan en la normalización de funciones durante la recuperación por el estrés (Parsell and Lindquist, 1994; Morimoto et al., 1994; Nover and Scharf, 1997). Otros estudios demuestran que la hsp70 puede indicar un grado de evolución y/o adaptación (Guerreiro and Raynes, 1990).

El incremento de la temperatura a 44ºC resulto dañino para los linfocitos, observándose una disminución de la hsp70 (>P 0.05), lo cual coincide con lo reportado por Malayer et al. (1992) y Lin et al. (1998) en donde sometieron linfocitos a temperatura de 45ºC por espacio de 2 horas y encontraron una supervivencia del 27 %. La habilidad de un animal para adaptarse a los cambios del medio ambiente, dependen de la evolución (Guerreiro and Raynes, 1990). Es decir, se espera que los cambios extremos en el medio ambiente a que estuvieron expuestos sus antecesores van a influir sobre la adaptabilidad del animal. Por lo tanto, se considera que las razas o biotipos explotados durante años en los sistemas de producción semidesierto, deberán poseer mayores habilidades adaptativas que aquellos de reciente introducción al escenario ganadero de la región Centro-Norte de la República Mexicana. Observando desde esa perspectiva, se esperaría que las razas con mayor capacidad de adaptación, tendrían una mayor capacidad de responder a diferentes estresores y por lo tanto, una mayor capacidad de síntesis de hsp. De acuerdo a los resultados obtenidos en el presente estudio, la raza Holstein-Australiana presentó una tendencia a una mayor capacidad de expresión y síntesis de hsp70, al igual que el biotipo regional (criollo), ambas razas probablemente sean las que han sido explotadas bajo sistemas de mayor exposición al medio ambiente y/o ambientes menos controlados (estabulados) y quizá a eso se deba su mayor habilidad de sintetizar la hsp70 en respuesta al estrés térmico. Al respecto, Krebs and Feder (1998), mencionan que un organismo con tolerancia al calor expresa mayor cantidad de Hsp que un organismo menos tolerante. Además la síntesis de nuevas proteínas hsp es requerida de acuerdo al grado de temperatura, la cual varia de una especie a otra (Lindquist, 1986; Lindquis and Craig, 1988).

Es interesante el hecho que las vacas con una mayor tendencia a sintetizar la hsp70 sea la Holstein-Australiana y la criolla, es decir, una raza seleccionada intencionalmente para la producción de leche en pastoreo y una raza seleccionada naturalmente por supervivencia en un medio ambiente definido y destinada a la producción cárnica. En el campo de la ecología y la genética evolutiva existe un





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enorme interés por entender la forma en que la selección natural interactúa con el genoma para determinar una respuesta que habilite una población ante diferentes gradientes de factores (Lynch and Gabriel, 1987). De manera general, la distribución de las especies indica una mayor capacidad de adaptación (Boza, 1989). Bajo este criterio, esperaríamos que la raza Pardo-Suizo y Holstein tuvieran una mayor capacidad de adaptación, ya que han sido las mas explotadas en el semidesierto Zacatecano desde 1865 y se encuentran diseminados en distintas latitudes de la República Mexicana. Así mismo, se esperaría que las razas de la misma función zootécnica tuvieran patrones similares de síntesis de hsp70. Por ejemplo la raza Holstein y Holstein-Australiana (producción de leche), Pardo-Suizo (doble propósito: carne y leche) y Limousine y Criollo (producción de carne). Sin embargo de acuerdo a los datos obtenidos, las razas sobresalientes en la inducción de la hsp70 son la Holstein-Australiana y la Criolla, posiblemente, la única afinidad que exista entre éstas razas sea la de explotarse en sistemas de producción que dependen de una gran exposición al medio ambiente. En tal caso, la pregunta que surge es, si las razas Holstein-Australiana y Criolla son más resistentes y con una mayor adaptabilidad o es solamente un fenómeno coincidente a una tendencia mayor de síntesis de hsp70.

La intención de identificar indicadores de adaptación en los distintos grupos raciales tiene como finalidad determinar cuales de ellos reflejan una mayor capacidad de adaptación a un ecosistema específico. Al introducirse las razas occidentales de animales domésticos a los países tropicales y subtropicales, los animales padecen una serie de alteraciones en respuesta al clima caluroso. Estas alteraciones son causadas por el estrés calórico, observándose además, trastornos en el metabolismo del agua, de energía y de minerales (balances negativos de nitrógeno, energía y minerales). Estos trastornos también ocurren en las reacciones enzimáticas, por ejemplo, un incremento en la actividad de las enzimas transaminasas, y en la secreción de las hormonas, una disminución de la insulina, aldosterona y T3 y T4, e incremento en el cortisol. Tales trastornos acarrean la disminución de algunos metabolitos sanguíneos, como la glucosa, proteínas y lípidos totales y colesterol (Alnaimy et al., 1992; Elvinger et al., 1992). Estos cambios pudieran explicar el porque la raza Holstein-Australiana mostró niveles mayores de expresión de hsp70, ya que su introducción a la región centro norte de la República Mexicana ha sido muy reciente.

Los linfocitos bovinos responden a agentes estresores como la temperatura de manera consistente hasta un choque calórico de 42 ºC. La síntesis de las hsp pudiera depender en un momento dado de la presencia de otros agentes que participan confiriendo termoresistencia, como sería el caso de antioxidantes como la vitamina E/Se beta caroteno o glutatión, los cuales, han incrementado la viabilidad embrionaria in vitro e in vivo (Ealy et al., 1992; Ealy et al., 1994; Aréchiga et al., 1995; Aréchiga et al., 1997) e incrementaron los porcentajes de preñez del ganado bovino lechero e incluso la producción de leche del ganado expuesto a estés calórico (Aréchiga et al., 1997).

En el presente estudio, no existieron diferencias raciales en la expresión de la hsp70 en las razas bovinas. Sin embargo, existió cierta tendencia a una mayor producción de hsp70 en las razas bovinas que en orden decreciente fue: Holstein-Australiano, Criollo,





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Pardo Suizo, Holstein y Limousin. Así, podemos sugerir que la hsp70 puede utilizarse como un indicador de adaptación de los bovinos al medio ambiente, no obstante, se requiere de una mayor investigación para dilucidar la posible relación que existe entre adaptación y expresión de la hsp70, correlacionándola con otros parámetros de adaptación.

AGRADECIMIENTOS

Proyecto apoyado por CONACYT-SIVILLA al Dr. Sergio Hugo Sánchez Rodríguez. Contrato: 9601172. Literatura citada 1. Hoffman AA, Parson PA (1991) Evolutionary genetics and environmental stress.

Oxford University Press, New York. pp-284 2. Johnson HD (1987) Bioclimates and livestock. In, Johnson HD, (eds).

Bioclimatology and adaptation of livestock. B5. , Amsterdam: Elsevier. pp:3-16. 3. Ghosal AK, Matur GN (1992) Zinc copper and iron contents of blood serum of cattle

sheep in semi-arid tract of Rajasthan Indian. J Anim. Sci 62:441.442. 4. Mousa HH, Elkalifa MY (1992) Effects of water deprivation on dry matter intake, dry

matter digestibility, and nitrogen in Sudan desert lambs and kids. Small Ruminant Res 6:311-316.

5. Silanikove N (1992) Effects of water scarcity and hot environments on appetite and digestion in ruminants: A review. Livest. Prod. Sci 30:175-194.

6. Morimoto RI, Milaski KL (1990) Stress Proteins in Biology and Medicine. Pp:1-36. Morimoto RI, Tissieres A, Georgopoulos C (eds). Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York. pp:332-359.

7. Welch WJ (1990) Stress Proteins in Biology and Medicine, Morimoto RI, et al., (eds). Cold Spring Harbor Lab. Cold spring Harbor, New York pp:223-278.

8. Lindquist S, Craig EA (1988) The heat shock proteins. Annu Rev Genet 22:631-637. 9. Goodman R, Blank M (1998) Magnetic field stress induces expression of hsp 70.

Cell Stress & Chaperones 3:79-88. 10. Lin H, Li H, Blank M, Head M, Goodman R (1998) Magnetic field activation of

protein-DNA Binding. J Cellular Biochemistry 70:279-303. 11. Guerreiro VJr, Raynes DA (1990) Synthesis of heat stress proteins in lymphocytes

from livestock. J Anim Sci 68:2779-2783. 12. Feder EM, Hoffmann EG (1999) Heat-Shock proteins, molecular Chaperones, and

the stress response: Evolutionary and Ecological physiology. Annu Rev Physiol 61:243-282.

13. Saran M, Bors W (1997) Radiation chemistry of physiological saline reinvestigated: evidence that chloride-derived intermediates play a key role in cytotoxicity. Radiation Research 147:70-77.

14. Vega-Carrillo HR, Bañuelos-Valenzuela R, Manzanares-Acuña E, Sánchez-Rodríguez SH (2001). Response of human lymphocytes to low gamma ray doses. Alasbimn Journal 3(12)





17

15. INEGI (1981) Síntesis Geográfica de Zacatecas. “Climatología”. INEGI, SPP. México. D.F.

16. Montaldo H, Juárez A, Berruecos JM, Sánchez F (1994) Performance of local goats and their backcrosses with several breeds in Mexico. Small Ruminant Research 16:97-105

17. Boyum A (1968) Separation of leukocytes from blood and bone marrow. Scand J Clin Lab Ivest 21;(Supple.97):77

18. Harlow E, Lane D (1988) Antibodies a laboratory manual. Cold Spring Harbor Laboratory. Cold Spring Harbor, New York.

19. Bradford MM (1976) A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Analytical Biochemistry 72:248-254.

20. Laemmli UK (1970) Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature ( London ) 227:680-685.

21. Towbin H, Staehelin T, Gordon J (1979). Electrophoretic transfer o proteins from polyacrilamide gels to nitrocellulose sheets: Procedure and some applications. Proc Nat Acad Sci 76(9):4350-4354.

22. SAS/STAT (1990) User´s Guide, Released 6.03 Edition. SAS Inst. Inc. Cary, NC., U.S.A.

23. Parsell DA, Linquist S (1994) Heat shock proteins and stress tolerance. En: The biology of heat shock proteins and molecular chaperones. Eds. R.I. Morimoto. A. Tissieres, C. Georgopoulos. Cold Spring Harbor Laboratory Press. pp:457-493.

24. Morimoto RI, Tissieres A, Georgopoulos C (1994) The biology of the heat shock proteins and molecular chaperones. New York. Cold Spring Harbor Laboratory Press. pp:610.

25. Kamwanja LA, Chase CC, Jr Guerreiro AJ, Gerreiro VJr, Olson AT, Hammond AC, Hansen J (1994) Responses of bovine to heat shock as modified by breed and antioxidant status. J Anim Sci 72:438-444.

26. Rutherford SL, Lindquist S (1998) Hsp90 as a capacitor for morphological evolution. Nature 396:336-342.

27. Loo MA, Jensen JT, Cui L, Hou Y, Chang X, Riordan RJ (1988). Perturbation of Hsp90 interaction with nascent CFTR prevents its maturation and accelerates its degradation by proteasomas. EMBO Journal 23:6879-6887.

28. Csemerly P, Schnaider T, Szántó (1998) Possible nuclear functions of the major molecular chaperones of the eukaryotic cytoplasm, Hsp90. Current Science 5:442-445.

29. Franci O, Amici A, Margarit R, Merendino N, Piccolella E (1996) Influence of thermal and dietary stress on immune response of rabbits. J Anim Sci 74:1523-1529.

30. Kiang GJ, Gist DI, Tsokos CG (1998) Cytoprotection and regulation of heat shock proteins induced by heat shock in human cancer T47-D cells: Role (Ca+2)I and protein kinases. FASEB Journal 12:1571-1579.

31. Gething MJ, Sambrook J (1992) Protein folding in the cell. Nature 355:33-45. 32. Nover L, Scharf K.D (1987) Heat stress protein and transcription factors. Cellular

and Molecular Life Science 53:80-103.





18

33. Malayer JR, Pollar JW, Hansen PJ (1992) Modulation of thermal killing of bovine lymphocytes and preimplantation mouse embryos by alanine and taurine. Am J Vet Rest 53:689-694.

34. Krebs RA, Feder ME (1998) Hsp70 and larval thermotolerance in Drosophila melanogaster: how much is enough and when is more too much? Journal of Insect Physiology 44:1091-1101.

35. Lindquist S (1986) The heat shock response. Annual Review of Biochemistry 55:1151-1191.

36. Lynch M, Gabriel W (1987) Environmental tolerance. Am Nat 129:283-303. 37. Boza J (1989) Goat production systems in arid lands of Iberian southeast. Terra

Arida 10:23-35. 38. Alnaimy A, Habeeb M, Fayaz I, Marain M, Kamal TH (1992) Heat stress En, Phillips

C, Piggins D, (Ed). Farm Animals and the Environment. UK: CAB. pp 27-47 39. Elvinger F, Natzke RP, Hansen PJ (1992) Interactions of heat stress and bovine

somatrotopin affecting physiology and immunology of lactating cow. J Dairy Sci 75:449-462

40. Ealy AD, Drost M, Barros CM, Hansen PJ (1992) Thermoprotection of preimplantation bovine embryos from heat shock by glutathione and taurine. Cell Biol Int. Rept 16:125-131.

41. Ealy AD, Aréchiga CF, Bray DR, Risco CA, Hansen PJ (1994) Effectiveness of short-term cooling and vitamin E for alleviation of infertility induced by heat stress in diary cows. J Dairy Sci 77;3601-3607.

42. Aréchiga CF, Ealy AD, Hansen PJ (1995) Evidence that glutathiones is involved in thermotolerance of preimplantation murine embryos. Biology of Reproduction 53:1296-1301.

43. Aréchiga CF, Staples CR, McDowell LR, Hansen PJ (1997) Effectiveness of a timed artificial insemination (TAI) program and supplemental feeding of a-carotene on reproductive function of heat-stressed dairy cows. J Dairy Sci 80 (suppl. 1):239 (abstr.).

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1 La proteína de estrés calórico Hsp70 funciona como un indicador