Click here to load reader

· PDF file 1 Mikroskopije Zoran Arsov Laboratorijska biomedicina, Osnove slikovnih tehnik v biomedicini Zoran Arsov Laboratorijska biomedicina, Osnove slikovnih tehnik v biomedicini

  • View
    0

  • Download
    0

Embed Size (px)

Text of · PDF file 1 Mikroskopije Zoran Arsov Laboratorijska biomedicina, Osnove slikovnih tehnik v...

  • 1

    Mikroskopije

    Zoran Arsov Laboratorijska biomedicina, Osnove slikovnih tehnik v biomedicini

    Zoran Arsov Laboratorijska biomedicina, Osnove slikovnih tehnik v biomedicini

    Sestava aparature za slikanje

    Interakcija med snovjo in valovanjem (delci)

    OPAZOVANA SNOV / PRIPRAVA VZORCA

    IZVOR valovanja (delcev)

    „OPTIKA“

    „OPTIKA“

    DETEKTOR

  • 2

    Zoran Arsov Laboratorijska biomedicina, Osnove slikovnih tehnik v biomedicini

    Primerjaj med metodami!!

    • občutljivost

    • razmerje signal/šum

    • dinamični razpon

    • prostorska ločljivost

    • časovna ločljivost

    • osnovni princip nastanka slike

    • pogoji priprave opazovanega sistema

    • komponente aparatur oz. opreme

    Kontrast – zaznavanje robov/mej!!!

    Zoran Arsov Laboratorijska biomedicina, Osnove slikovnih tehnik v biomedicini

    Mikroskopija

    • Pred očesom potrebujemo vmesnik, ki poveča sliko ! Slednja pomeni povečane razdalje med deli slike oz. povečanimi koti !

    • Še vedno gledamo krajevno odvisno absorbcijo svetlobe !

    • V vsaki točki slike zbiramo svetlobo – iz vseh optičnih ravnin in – različnih valovnih dolžin !

    • Kontrast pomeni razliko v inteziteti v dveh točkah slike !

  • 3

    Zoran Arsov Laboratorijska biomedicina, Osnove slikovnih tehnik v biomedicini

    okular kot povečevalno steklo

    Povečava mikroskopa

    Zoran Arsov Laboratorijska biomedicina, Osnove slikovnih tehnik v biomedicini

    Primeri slik optične mikroskopije

    majhni organizmi, organi (6x, ~ 100 m)

    1 mm = 1000 m

    posamezne celice (1000x, ~ 1 m)

    tkiva (600x, ~ 10 m)

  • 4

    Zoran Arsov Laboratorijska biomedicina, Osnove slikovnih tehnik v biomedicini

    Poljubno velika povečava nam ne da poljubno velike ločljivosti!!

    GEOMETRIJSKA OPTIKA VALOVNA OPTIKA

    Povečava vs. ločljivost

    Zoran Arsov Laboratorijska biomedicina, Osnove slikovnih tehnik v biomedicini

    *

    točkast izvor svetlobe

    ....

    Airyjev disk

    Uklon na eni reži in interferenčni vzorec

  • 5

    Zoran Arsov Laboratorijska biomedicina, Osnove slikovnih tehnik v biomedicini

    dva točkasta izvora (S1, S2)

    S1 max. S2 (1.) min.

    y … lateralna ločljivost

    Rayleighjev kriterij

    Zoran Arsov Laboratorijska biomedicina, Osnove slikovnih tehnik v biomedicini

    Meja ločljivosti pri optičnem mikroskopu

    kot zajema  (kotna apertura)

    y ≈ 0.61  / sin y bo manjši za nižje 

    in večje 

  • 6

    Zoran Arsov Laboratorijska biomedicina, Osnove slikovnih tehnik v biomedicini

    y = 0.61  / (n sin) = = 0.61  / NA

    NA ... numerična apertura

    imerzijska mikroskopija   /n

    (n ... lomni količnik)

    y ≈ 200 nm ≈ /2

     = 450 nm n = 1.5  = 70°

    Kako lahko povečamo ločljivost

    Zoran Arsov Laboratorijska biomedicina, Osnove slikovnih tehnik v biomedicini

    z ≈ 2 y

    3D Airyjev vzorec 2D Airyjev vzorec

    Lateralna vs. aksialna ločljivost

  • 7

    Zoran Arsov Laboratorijska biomedicina, Osnove slikovnih tehnik v biomedicini

    Različni načini izvedbe presevne optične mikroskopije

    Metode za neobarvane vzorce!!

    Svetlobna mikroskopija eritrocitov

    Zoran Arsov Laboratorijska biomedicina, Osnove slikovnih tehnik v biomedicini

    Mikroskopija s svetlim poljem

  • 8

    Zoran Arsov Laboratorijska biomedicina, Osnove slikovnih tehnik v biomedicini

    Mikroskopija s temnim poljem

    Zoran Arsov Laboratorijska biomedicina, Osnove slikovnih tehnik v biomedicini

    Fluorescenčna mikroskopija

    • Ne gledamo absorpcije vse svetlobe, temveč le tisto, ki se absorbira na fluorescenčnih označevalcih, ki svetlobo absorbirajo ter jo nato emitirajo pri višji valovni dolžini (nižji energiji) !

    svetlo polje fluorescenca

  • 9

    Fluorescenčna mikroskopija celic; sestavljena slika iz slik citoskeleta, jedra in membran

    Zoran Arsov Laboratorijska biomedicina, Osnove slikovnih tehnik v biomedicini

    Zoran Arsov Laboratorijska biomedicina, Osnove slikovnih tehnik v biomedicini

    10 µm

    0 s 5 s 10 s 15 s

    dinamika membranskih domen na orjaških lipidnih vesiklih

    Časovna ločljivost

  • 10

    Zoran Arsov Laboratorijska biomedicina, Osnove slikovnih tehnik v biomedicini

    Konfokalna mikroskopija

    • Dodatna drobna zaslonka zbira svetlobo le iz izbrane optične ravnine !

    • V vsaki točki slike zbiramo svetlobo

    – iz ene same izbrane optične ravnine in

    – različnih valovnih dolžin !

    • Kontrast pomeni razliko v inteziteti v dveh točkah slike v eni optični ravnini !

    Zoran Arsov Laboratorijska biomedicina, Osnove slikovnih tehnik v biomedicini

    fluorescenca konfokalna fluor.

    z 6 m

  • 11

    Spektroskopija

    • Ne zanima nas, od kje prihaja svetloba, temveč kakšna je !

    • Gledamo spekter ! Iz celotne slike zbiramo svetlobo in jo analiziramo pri različnih valovnih dolžinah !

    • Kontrast pomeni razliko spektralne gostote pri dveh podobnih valovnih dolžinah !

    Zoran Arsov Laboratorijska biomedicina, Osnove slikovnih tehnik v biomedicini

    Zoran Arsov Laboratorijska biomedicina, Osnove slikovnih tehnik v biomedicini

    Konfokalna mikrospektroskopija

    • Na detektorju zmoremo ločiti svetlobo različnih valovnih dolžin !

    • Gledamo krajevno odvisno absorbcijo spektra svetlobe ! Ne zanima nas le intenziteta spektra, temveč posamezni deli spektra oz. spektralna gostota, ki se s krajem spreminja !

    • Kontrast pomeni katerikoli razliko v spektru v dveh točkah slike !

  • 12

    Zoran Arsov Laboratorijska biomedicina, Osnove slikovnih tehnik v biomedicini

    konfokalno mikrospektroskopija

    500 550 600

    Fl uo

    re sc en

    ce  in te ns ity

     (a .u .)

    Wavelength (nm)

    Membrane probe Nanoparticles

    IR in ramanska mikrospektroskopija

    • Na detektorju zmoremo ločiti svetlobo različnih valovnih dolžin v IR področju!

    • Gledamo krajevno odvisno absorbcijo IR ali Ramanskega spektra! Zanimajo nas posamezni deli spektra, npr. slika v izbranem vibracijskem načinu določene kemijske skupine !

    • Kontrast pomeni katerikoli razliko v spektru v dveh točkah slike !

    Zoran Arsov Laboratorijska biomedicina, Osnove slikovnih tehnik v biomedicini

    y = 0.61  / (n sin) = = 0.61  / NA

    NA ... numerična apertura

    IR vs. Raman

  • 13

    Zoran Arsov Laboratorijska biomedicina, Osnove slikovnih tehnik v biomedicini

    KONCEPT vibracijske MIKROSPEKTROSKOPIJE!!! V vsaki točki slike zajamemo celoten vibracijski spekter. To pomeni, da lahko kontrastiramo sliko preko lokalizacije različnih molekulskih skupin (kemično mapiranje). Intenziteta barve lahko pomeni lokalno koncentracijo neke snovi.

    Pri SPEKTROSKOPIJI posnamemo povprečen vibracijski spekter vzorca. NI KRAJEVNE INFORMACIJE o razporeditvi komponent v vzorcu!!!

    Zoran Arsov Laboratorijska biomedicina, Osnove slikovnih tehnik v biomedicini

    Sklopitev FTIR spektrometra in mikroskopa

  • 14

    Zoran Arsov Laboratorijska biomedicina, Osnove slikovnih tehnik v biomedicini

    Shema FTIR mikroskopa

    Zoran Arsov Laboratorijska biomedicina, Osnove slikovnih tehnik v biomedicini

    vrstični mikroskop (zajem slike točko po točko)

    mikroskop s FPA detektorjem (zajem celotne slike hkrati)

    Možnosti za zajem slike

  • 15

    Zoran Arsov Laboratorijska biomedicina, Osnove slikovnih tehnik v biomedicini

    monokromatski izvor STABILNOST!!!prostor za vzorce

    posebni optični filtri!!! notch – (anti)Stokes edge - Stokes

    spektrometer z detektorjem

    Shema Ramanskega mikroskopa

    Zoran Arsov Laboratorijska biomedicina, Osnove slikovnih tehnik v biomedicini

    odvisnost od disperzijskih lastnosti uklonske mrežice

    odvisnost od goriščne razdalje zrcal v spektrometru

    Spektralna ločljivost - Raman

  • 16

    Zoran Arsov Laboratorijska biomedicina, Osnove slikovnih tehnik v biomedicini

    Stimulated Raman Scattering Microscopy – Mikroskopija s stimuliranim ramanskim sipanjem

    Zoran Arsov Laboratorijska biomedicina, Osnove slikovnih tehnik v biomedicini

  • 17

    Ko svetlobo zamenjajo hitri delci

    Zelo hitri delci se namreč obnašajo kot svetloba !

    Zoran Arsov Laboratorijska biomedicina, Osnove slikovnih tehnik v biomedicini

    Presevna elektronska mikroskopija (TEM)

    • Gledamo krajevno odvisno (ne)sipanje hitrih elektronov !

    • V vsaki točki slike zbiramo elektrone, ki se niso sipali na vzorcu, ki mora biti v vakuumu in na prevodnem nosilcu (da se vzorec ne nabija) !

    • Kontrast pomeni razliko v sipanju elektronov v dveh točkah slike, ki je odvisna od mase sipalcev (jeder) !

    leča elektromagnetna

    leča (tuljava,

    kondenzator)

    fosforna plošča

    Zoran Arsov

Search related