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1. Prinzip und wichtige Termini
2. RNA Präparation und Qualitätskontrolle
3. Datenauswertung
4. Kosten
5. Protokolle
6. Informationen für Kooperationspartner
7. Downloads
Einführung in die Genexpressionsplattform des IVM
1. Prinzip und wichtige Termini
Die humanen, murinen u.a. Genomprojekte und die Verfügbarkeit robuster Hardware- und Software-Plattformen zur Herstellung und Auswertung von Microarrays ermöglichen genomweite Genexpressionanalysen, d.h. die Quantifizierung aller mRNAs (> 30 000) eines RNA Extrakts relativ zu einem zweiten RNA Extrakt, in 48 Stunden. Die Plattform des IVM (Firma Affymetrix) ist mit einem Hybridisierungsofen, einer Waschstation, einem Scanner und Software ausgerüstet. Letztere erlaubt die mathematischen, statistischen und informationstechnologischen Auswertungen der Arrays.
1.Prinzip und wichtige Termini
Affymetrix bietet für mehrere Organismen Expressionsarrays an.
Diese werden in verschiedenen Formaten angeboten.
Je nach Format und Protokoll werden 0,5 - 5 µg RNA für einen Array benötigt.
1. Prinzip und wichtige Termini
Verschiedene Spezies können untersucht werden
1. Prinzip und wichtige Termini
Grundlage der Arraytechnologie sind die Sequenzinformationen der verschiedenen Genomprojekte. Mittels Photolithographie werden auf einer Glasoberfläche 25mer - sogenannte „Perfect Match“ Oligonukleotide (ON) synthetisiert. Neben jedem Perfect Match ON wird ein sogenanntes „Miss Match“ ON, das gegenüber dem Perfect Match ON einen Nukleotidaustausch in Position 13 enthält, synthetisiert. Daraus ergeben sich Perfect Match - Miss Match ON Paare, die sogenannten „Probe Pairs“. Die Signale des Miss Match ONs werden vom Perfect Match ON abgezogen. Hierdurch werden Sensitivität und Spezifität erhöht. Jede RNA Sequenz ist durch ein „Probe Set“, bestehend aus 11 solcher Probe Pairs, repräsentiert. Dies ermöglicht eine statistische Aussage über die Qualität des Messwertes.
Die Herstellung der Arrays
1. Prinzip und wichtige Termini
Probe Set
Probe Pair Feature
Miss Match (MM)Perfect Match (PM)
Nucleotidaustausch an Pos. 13
Das Prinzip „Probe Set“
Synthese der Sonden oder „Proben“
1. Prinzip und wichtige Termini
Fluidics Station
1. Das Prinzip und wichtige Termini
Der Waschvorgang und das Scannen
Interne Kontrollen der Arrays
•Background und NoiseScanner Elektrik und Hybridisierung
•Percent presentProbenqualität und Reproduzierbarkeit
•Spiked oligo controlsHybridisierung, Färbung (Effizienz und Linearität)
•3‘ - 5‘ Verhältnis verschiedener Housekeeping GeneQualität der cRNA insgesamt
•poly(A)-RNA spikesQualität der cRNA Synthese
1. Das Prinzip und wichtige Termini
2. RNA Präparation und Qualitätskontrolle
Wichtigste Voraussetzung für einen Array hoher Qualität ist eine hochwertige RNA. Degradation und Verunreinigungen müssen vermieden werden.
Wir empfehlen den Qiagen RNeasy Lipid Tissue Mini Kit.
Zusätzlich kommt bei Geweben der Probengewinnung, Lagerung und Homogenisation eine besondere Bedeutung zu.
Dies muß für jedes Gewebe gesondert evaluiert werden.
2. RNA Präparation und Qualitätskontrolle
Schema der RNA Präparation
Agilent Lab on a Chip
18
S
28
S
Fluo
resc
ence
Time (seconds)
0
5
10
15
20
25
30
19 24 29 34 39 44 49 54 59
18
S
28
S
Fluo
resc
ence
Time (seconds)
0.0
2.5
5.0
7.5
10.0
12.5
15.0
17.5
19 24 29 34 39 44 49 54 59
18
S
28
S
Fluo
resc
ence
Time (seconds)
0.0
2.5
5.0
7.5
10.0
12.5
19 24 29 34 39 44 49 54 59
Fluo
resc
ence
Time (seconds)
0.0
0.5
1.0
1.5
2.0
2.5
3.0
3.5
4.0
19 24 29 34 39 44 49 54 59
GAPDHTranscripts / ng RNA
9180 2474 971 145
Die Stadien der RNA Degradation
18S
28S
Fluo
resc
ence
Time (seconds)
0.0
2.5
5.0
7.5
10.0
12.5
15.0
17.5
20.0
22.5
19 24 29 34 39 44 49 54 59
RNA Integrität mit dem Agilent System
28s - 18s ratio >1.8
2. RNA Präparation und Qualitätskontrolle
Es sollten keine kurzen RNA Fragmente sichtbar werden
3. Datenauswertung
Es gibt eine unüberschaubare Anzahl an Ansätzen. Welche man wählt, hängt von der experimentellen Fragestellung ab.
Grundsätzlich unterteilt sich die Auswertung in 3 Stufen:
Rohdatenauswertung mit Report zur Qualitätskontrolle
Die statistische Auswertung und Filterung
Die Annotation und funktionelle Auswertung.
RohdatenanalyseGCOS
StatistikExcel, GeneSpring
Funktionelle BewertungGeneSpring, NetAffx, Gene
Ontology, GenMapp, RefSeq, Unigene Clustering
GeneSpring,
Bezug zu den Rohdaten herstellen Access, GeneSpring, Excel
ErgebnisdarstellungGeneSpring, Excel, Fatigo
Qualitäts-kontrolle
GCOS (Report)
DatenbankGCOS Manager
3. Datenauswertung
Datenauswertung und verfügbare Tools
3. Datenauswertung
Die Rohdatenanalyse mit der GCOS
DAT-File
CEL-File
7 x 7 Pixel pro Feature
Eine Zahl pro Feature
Ein Signal Wert mit Detection p-Wert pro Probeset
CHP-File
Zusätzlich wird ein Report erstellt, der alle relevanten Qualitätsparameter enthält
Der „Call“
3. Datenauswertung
Die Analyse der Probe Pairs eines Probe Sets, d.h. eines Gens oder mRNA, führt durch die GCOS Software zum „Call“.
„Absent“ Call (nicht exprimiert): Detection p-Wert > 0,065 „Marginal“ Call (eventuell exprimiert): Detection p-Wert 0,065 - 0,05„Present“ Call (exprimiert): Detection p-Wert < 0,05.
Absent, present und marginal „Calls“ ergeben sich aus Signalintensitäten von Hybridisierungssignalen, die mit Fehlern behaftet sein können. Calls sind deshalb nur vorläufige Beurteilungen, insbesondere müssen die „marginal“ und „absent“ Calls mit Vorsicht interpretiert werden und, bei Bedarf, durch RT-PCR überprüft werden.
Die „Normalisierung“
Um die Daten verschiedener Arrays vergleichbar zu machen, müssendie Daten normalisiert werden.
Hierzu gibt es viele verschiedene Möglichkeiten.
Wir benutzen:
Standard: Skalierung auf einen Zielwert von 500 am Mittelwert
Bei Sättigung: Skalierung auf einen Zielwert 500 am Median
Für Tests allgemein: Logarithmierung und Skalierung per Gen an der 50ten Perzentile
3. Datenauswertung
Der Scatter Plot
Die einfachste Auswertung eines 2 Array Experiments (Kontrolle gegen Probe) ist der Scatter Plot, bei dem die Ergebnisse der beiden Arrays logarithmisch gegeneinander aufgetragen werden.
Rot: Present - Present; Gelb: Absent - Absent; Blau: Absent - Present
FoldChange Linien, 2x, 3x, 10x und 30x
Mehr als 30 fach differentiell exprimiertes Gen
3. Datenauswertung
Statistische Auswertung und Filterung
Eine statistische Auswertung setzt wenigstens 3, besser 5, Wiederholungsmessungen voraus. Sie liefert ein zusätzliches Filterkriterium in Form des p-Wertes. Die Filterung reduziert die Datenflut. Die Schwellenwerte sind willkürlich. .
Filter: 1. Signalwert 2. Detection p-Wert 3. Fold Change 4. p-Wert des Tests
.
Das Ergebnis ist eine Liste von Kandidatengenen, die mit erhöhter Wahrscheinlichkeit tatsächlich differentiell exprimiert sind.Durch die Stringenz der Schwellenwerte kann die Qualität der Kandidatenliste erhöht werden.
3. Datenauswertung
Reduzierte Streuung durch Mittelwertbildung
3. Datenauswertung
3. Datenauswertung
Filter
3. Datenauswertung
Kombination der Filter: Ergebnisliste
Die Annotation
Liste mit Affymetrix Nummernvia Access, GeneSpring, NetAffx
Bezug zu Datenbank Termini- Pubmed- UniGene- LocusLink / Entrez Gene- OMIM- Ensembl- ...
Problem: Der Experimentator erhält eine Genliste, die unbekannte Gene enthält und ungeordnet ist:
Ein schnelles Verfahren zur Informationsbeschaffung wird nötig. Datenbanken können weitere Informationen bereitstellen:
3. Datenauswertung
4. Die Kosten
Die Kosten pro Array betragen 800.- € bis 1250.- €.
Die exakten Kosten hängen vom Leistungsumfang und dem Arraytyp ab.
5. Die verschiedenen Protokolle
Es kommen 6 verschiedene Protokolle zum Einsatz. Standard (S), Midi (M) und Small Scale (X), jeweils für die Arrayformate Standard (1) und Midi (2). Nachfolgende Übersicht zeigt, worin sich die Protokolle im wesentlichen unterscheiden:
Protokoll: MA-S1 MA-S2 MA-M1 MA-M2 MA-X1 MA-X2
Eingesetzte RNA Menge 5 µg 3 µg 2 µg 1 µg 0,7 µg 0,5 µg
IVT-Zeit 4 h 4 h 16 h 16 h 16+8 h 16+8 h
Benötigte Menge an cRNA 14 µg 8,5 µg 12 µg 8 µg 12 µg 8 µg
Hybridisierungsvolumen 200 µl 130 µl 200 µl 130 µl 200 µl 130 µl
6. Information für Kooperationspartner
Vorgehen:
•Kontaktaufnahme per Mail: [email protected]
•Besprechung und Beratung
•Übergabe der Proben mit Projektblatt (Vordruck aus IVM)
•Durchführung der Microarrays
•Übergabe der Daten als Rohdatenfiles und als Excelfiles
(Eine Excel Vorlage zur Auswertung wird bereitgestellt)
7. Downloads
•Vertrag
•Excelvorlage zur Auswertung
•Manual zur Excelvorlage
•Vordruck „Projektblatt“
