PROPIEDADES QUÍMICAS Y FISICOQUÍMICAS DE LAS PROTEÍNAS

MANCILLA, C. G. E.; BLANCO, E. Z.; PÉREZ, S. L. J.; ROSAS, T. M. y CASTREJÓN, C. R.

Q.F.B.; V Semestre: Universidad del Valle de México, Campus Chapultepec(Av. Constituyentes No. 151 Col. San Miguel Chapultepec. C.P. 11850 México, DF.)

RESUMEN:

Las proteínas son compuestos orgánicos constituidos por aminoácidos unidos por enlaces peptídicos que intervienen en diversas funciones vitales esenciales, como el metabolismo, la contracción muscular o la respuesta inmunológica; sus moléculas van desde las largas fibras insolubles que forman el tejido conectivo y el pelo, hasta los glóbulos compactos solubles, capaces de atravesar la membrana celular y desencadenar reacciones metabólicas. Tienen un peso molecular elevado y son específicas de cada especie y de cada uno de sus órganos. Las proteínas sirven sobre todo para construir y mantener las células, aunque su descomposición química también proporciona energía, con un rendimiento de 4 kilocalorías por gramo, similar al de los hidratos de carbono.

En esta práctica se observan algunas reacciones características de las proteínas para la identificación ya sea de estas o de algunos de los residuos de aminoácidos que estas contengan ya sea su identificación por métodos colorimétricos o químicos, como lo es la prueba de biuret que da soluciones de color violeta o rosa dependiendo de la proteína o la xanproteíca que da precipitados amarillos al dar positivas las pruebas para aminoácidos o residuos aromáticos.

También se realizaron pruebas para reconocer proteínas por las características que estas presentan al ser desnaturalizadas como lo es la precipitación o turbidez que se observa como por ejemplo al ser desnaturalizadas por efecto del calor al estas formar coágulos al perder sus propiedades originales a más de 60ºC.; estas características son propiamente de tipo fisicoquímicas y las presentan la mayoría de las proteínas como por ejemplo la acción de los alcoholes o acetonas que son agentes desnaturalizantes típicos de las proteínas ya que estos las deshidratan y por lo tanto las precipitan, lo que da una prueba positiva a este efecto.

Por último se prepararon varias soluciones en tubos de ensaye de una solución de caseína en acetato de sodio y ácido acético, para que por medio de la ecuación de Hendersson - Hasselbalch se realizara la determinación del pH teórico de estas soluciones y observar sus propiedades de precipitación o turbidez, es decir, que tanto se desnaturalizaba la proteína a diferentes pHs.

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Resumen……………………………………………………………….1Introducción……………………………………………………………2I.- Proteínas…… ……..…………………………………………….…….……....3II.- Aminoácidos………………………………………………………….…….….6III. Identificación de proteínas y aminoácidos…………………………………9IV. Propiedades ácido-base de los aminoácidos……………………….…11Objetivo……………………………………………………………..…13Hipótesis……………………………………………………………….13Material………………………………………………………………...13Metodología y Resultados ……………………………………………..14Discusión de Resultados………………………………………… …….24Conclusiones……………………………………………………………24Referencias…………………………………………………………...…25

INTRODUCCIÓN:

Las proteínas son compuestos a base de carbono, hidrógeno, oxígeno, nitrógeno y generalmente azufre y fósforo. El elemento característico es el nitrógeno. Todas las enzimas, algunas hormonas y muchos componentes estructurales importantes de la célula son proteínas.

Las moléculas de proteína son muy grandes y contienen miles de átomos; su estructura es extremadamente compleja. Gran parte de las proteínas intracelulares son enzimas, sustancias que regulan la rapidez con que se han de tener numerosas reacciones celulares.

Las moléculas de proteína están formadas por componentes más simples llamados aminoácidos. Puesto que cada proteína puede tener cientos de aminoácidos combinados en ciertas proporciones y orden es posible una variedad prácticamente infinita de moléculas de proteína. Se han ideado métodos de análisis para reconocer la disposición exacta de aminoácidos en una molécula proteínica. La insulina, hormona secretada por el páncreas y utilizada en el tratamiento de la diabetes, fue la primera proteína cuya estructura se conoció. La ribononucleasa, secretada por el páncreas, fue la primera enzima de la cuál se conoció el orden exacto de aminoácidos.

Pueden distinguirse varios niveles de organización en la molécula de proteína. El primer nivel es la llamada estructura primaria, que depende de la serie de aminoácidos en la cadena de polipéptidos. Esta serie, está determinada a su vez, por la serie de nucleótidos de RNA y DNA del núcleo de la célula. Un segundo nivel de organización de las moléculas proteínicas supone la adopción de la forma de hélice u otra configuración regular por la cadena de polipéptidos. Estas cadenas ordinariamente no se encuentran planas en una molécula de proteína, sino que adoptan formas espiralazas para dar una estructura tridimensional. Una de las estructuras secundarias comunes de las moléculas proteínicas es el hélice en , que se supone una formación espiralaza de la cadena de polipéptidos básica. La hélice en es una estructura geométrica muy uniforme con 3.6 aminoácidos que ocupan cada vuelta de la hélice. La estructura helicoidal es determinada y mantenida por la formación de enlaces de hidrógeno entre residuos de aminoácidos en vueltas sucesivas de espiral.

Un tercer nivel de estructura de moléculas proteínicas es el desdoblamiento de la cadena de péptidos sobre sí misma para formar proteínas globulares. De nuevo enlaces débiles como enlaces de hidrógeno, iónicos e

hidrofóbicos se forman entre una parte de la cadena de péptidos y la otra parte, de modo que la cadena se desdobla de una manera específica para dar una estructura general específica de la molécula proteínica. Enlaces covalentes como los de disulfuro (-S-S-) son importantes en la estructura terciaria de muchas proteínas. La actividad biológica de una proteína depende en gran parte de la estructura primaria específica que es mantenida junta por esos enlaces.

Cuando una proteína se calienta o trata con cualquiera de una variedad de productos químicos, se pierde la estructura terciaria. Las cadenas de péptidos espiralazas se desdoblan para dar una configuración aleatoria acompañada por una pérdida de la actividad biológica de la proteína. Este cambio se llama “desnaturalización”.

Los 20 aminoácidos aminados que suelen encontrarse en las proteínas poseen todos un grupo amino (-NH2) y un grupo carboxílico (-COOH), pero sus cadenas laterales son distintas. El mas simple de todos, la glicina, tiene como cadena lateral un H; la alanita, un grupo –CH3. El grupo amino permite al aminoácido aminado actuar como base y combinarse con ácidos; el grupo ácido, le permite combinarse con las bases.

Los aminoácidos y las proteínas sirven de amortiguadores y pueden resistir a cambios de acidez y alcalinidad. Los aminoácidos se unen entre sí para formar proteínas mediante un enlace peptídico entre el grupo amino de una molécula y el grupo carboxilo de la otra.

Los aminoácidos puros obtenidos de las proteínas tienen sabor dulce. Cuando se ingieren proteínas son hidrolizadas a aminoácidos antes de ser absorbidas a la corriente sanguínea. Los aminoácidos son llevados a todas las regiones del organismo, donde sirven para la elaboración de nuevas proteínas, o son metabolizados para liberar energía. Las proteínas tienen importancia primordial como componentes estructurales de las células y como constituyentes funcionales de enzimas y algunas hormonas, pero pueden servir también como combustible para producción de energía. Los aminoácidos pierden primero su grupo amino por una reacción enzimática llamada desaminación. El grupo amino reacciona con otras sustancias para formar urea, que se excreta. El resto de la molécula puede transformarse por una serie de fases intermedias en glucosa, que se utiliza pronto como combustible, o almacenarse como glucógeno.

Las plantas pueden sintetizar todos los aminoácidos a partir de sustancias simples. Los aminoácidos que los animales no pueden sintetizar y que deben obtener en

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su alimentación se llaman aminoácidos esenciales. Debe comprenderse que estos aminoácidos no son más esenciales que otros; sólo lo son respecto a la alimentación, pues no es posible sintetizarlos. [1]

I.- PROTEÍNAS:

El nombre proteína proviene de la palabra griega proteios, que significa lo primero. Las proteínas constituyen gran parte del cuerpo animal: lo mantienen como unidad y lo hacen funcionar. Se las encuentra en toda la célula viva. Son el material principal de la piel, los músculos, tendones, nervios y la sangre, enzimas, anticuerpos y muchas hormonas. (Sólo los ácidos nucleicos que controlan la herencia pueden desafiar la posición de las proteínas, además aquellos desafían la síntesis de estas.)

Desde un punto de vista químico las proteínas son polímeros grandes. Son poliamidas, y los monómeros de los cuáles se derivan los ácidos -aminocarboxílicos. Una sola molécula proteínica contiene cientos, e incluso miles de unidades de aminoácidos, que pueden ser de unos 20 tipos diferentes. El número de moléculas proteínicas diferentes que pueden existir es casi infinito.

A) ESTRUCTURA DE LAS PROTEÍNAS:

A primera vista podría pensarse en las proteínas como polímeros lineales de aminoácidos unidos entre sí por medio de enlaces peptídicos. Sin embargo, la secuencia lineal de aminoácidos puede adoptar múltiples conformaciones en el espacio. La estructura primaria viene determinada por la secuencia de aminoácidos en la cadena proteica, es decir, el número de aminoácidos presentes y el orden en que están enlazados. La conformación espacial de una proteína se analiza en términos de estructura secundaria y estructura terciaria. La estructura secundaria es el plegamiento que la estructura primaria adopta gracias a la formación de puentes de hidrógeno entre los átomos que forman el enlace peptídico. La estructura terciaria, en cambio, se refiere a la disposición tridimensional de todos los átomos que componen la proteína. La asociación de varias cadenas polipeptídicas origina un nivel superior de organización, la llamada estructura cuaternaria. Por último, la asociación de proteínas con otros tipos de biomoléculas para formar asociaciones supramoleculares con carácter permanente da lugar a la estructura quinaria.

Las proteínas son polímeros de condensación de los aminoácidos, algunas proteínas contienen cientos de aminoácidos, y en algunos casos miles, en estructuras de cadenas altamente organizadas. La polimerización

de los aminoácidos se hace con la formación de enlaces peptídicos (amida), al unirse el grupo carboxilo del ácido de un aminoácido con el grupo amino del siguiente aminoácido y produciendo una molécula de agua. Por eso, la unión de varios aminoácidos origina los oligopéptidos y polipéptidos (proteínas de más de 50 aminoácidos).[2]

B) CLASIFICACIÓN DE LAS PROTEÍNAS

La clasificación de las proteínas se realiza desde varios puntos de vista, así:

1. SEGÚN SU COMPOSICIÓN

Proteínas simples u Holoproteínas: Las cuales están formadas exclusivamente o predominantemente por aminoácidos.

Proteínas conjugadas: Poseen un componente de proporción significativa no aminoacídico que recibe el nombre de grupo prostético. Según la naturaleza de este grupo consideramos:

Glicoproteínas: Se caracterizan por poseer en su estructura azúcares. Se pueden citar como ejemplo: las inmunoglobulinas, algunas proteínas de membrana, el colágeno y otras proteínas de tejidos conectivos (glucosaminoglicanos).

Lipoproteínas: Proteínas conjugadas con lípidos que se encuentran en las membranas celulares.

Nucleoproteínas: Se presentan unidas a un ácido nucleico, como en los cromosomas, ribosomas y en los virus.

Metaloproteínas: Contienen en su molécula uno o más iones metálicos que no constituyen un grupo hem. Por ejemplo algunas enzimas.

Hemoproteínas o Cromoproteínas: Proteínas que tienen en su estructura un grupo hem. Ejemplo: Hemoglobina, Mioglobina y ciertas enzimas como los citocromos.

2. DE ACUERDO CON SU MORFOLOGIA Y SOLUBILIDAD

Proteínas fibrosas: Son insolubles en agua, presentan formas moleculares alargadas, con un número variado de cadenas polipeptídicas que constituyen fibras resistentes, con cierto grado de elasticidad, fragilidad o

ductilidad. Funcionan como proteínas estructurales

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o de soporte. Las más comunes son: Elastina, Colágeno, Queratina, Fibrina, etc.

Proteínas Globulares: Tienden a ser más solubles en agua, debido a que su superficie es polar. Sin embargo, pueden presentar mayor solubilidad en otros solventes como soluciones salinas, ácidos o bases diluidas o alcohol. Su estructura es compacta con formas casi esféricas. La mayoría de las proteínas conocidas son globulares, dentro de las que se consideran todas las enzimas, las proteínas del plasma y las presentes en las membranas celulares. A su vez las proteínas globulares se pueden clasificar de acuerdo con su solubilidad:

Albúminas: Proteínas fácilmente solubles en agua, que coagulan con el calor y precipitan con las soluciones salinas saturadas. Por ejemplo la Lactoalbúmina, albúmina del suero, la ovoalbúmina (presente en la clara del huevo).

Globulinas: Escasamente solubles en agua pura, pero solubles en soluciones salinas diluidas como cloruro de sodio, entre ellas se encuentran las seroglobulinas (sangre), ovoglobulina, inmunoglobulinas, etc.

Glutelinas: Solubles en ácidos y bases diluidos, insolubles en solventes neutros. Ejemplo: La Glutenina del trigo.

Prolaminas: Solubles en alcohol del 70 al 80%, insolubles en agua, alcohol absoluto y otros solventes neutros, como la Zeína del maíz y la Gliadina del trigo.

3. DE ACUERDO CON SU FUNCIÓN BIOLÓGICA:

Proteínas estructurales: Forman parte de células y tejidos a los que confieren apoyo estructural. Dentro de estas podemos citar, el colágeno y la elastina presentes en el tejido conectivo de los vertebrados. La queratinas de la piel, pelo y uñas y la espectirna presente en la membrana de los eritrocitos.

Proteínas de transporte: Como su nombre lo indica, transportan sustancias como el oxígeno en el caso de la hemoglobina y la mioglobina, ácidos grasos en el caso de la albúmina de la sangre, o las que realizan un transporte transmembrana en ambos sentidos.

Proteínas de defensa: Protegen al organismo contra posibles ataques de agentes extraños, entre las que se consideran los anticuerpos (inmunoglobulinas) de la fracción gamma globulínica de la sangre, las proteínas denominadas interferones cuya función es inhibir la proliferación de virus en células infectadas e inducir resistencia a la infección viral

en otras células, el fibrinógeno de la sangre importante en el proceso de coagulación.

Proteínas hormonales: Se sintetizan en un tipo particular de células pero su acción la ejercen en otro tipo. Ejemplo, la insulina.

Proteínas como factores de crecimiento: Su función consiste en estimular la velocidad de crecimiento y la división celular. Como ejemplo se puede citar la hormona de crecimiento y el factor de crecimiento derivado de plaquetas.

Proteínas catalíticas o enzimas: Permiten aumentar la velocidad de las reacciones metabólicas. Dentro de las células son variadas y se encuentran en cantidad considerable para satisfacer adecuadamente sus necesidades. Entre otras se consideran las enzimas proteolíticas cuya función es la degradación de otras proteínas, lipasas, amilasas, fosfatasas, etc.

Proteínas contráctiles: Son proteínas capaces de modificar su forma, dando la posibilidad a las células o tejidos que estén constituyendo de desplazarse, contraerse, relajarse razón por la cual se encuentran implicadas en los diferentes mecanismos de motilidad. Las proteínas más conocidas de este grupo son la actina y la miosina.

Proteínas receptoras: Proteínas encargadas de combinarse con una sustancia específica. Si se encuentran en la membrana plasmática, son las encargadas de captar las señales externas o simplemente de inspeccionar el medio. Si encuentran en las membranas de los organelos, permiten su interacción. Sin embargo, no son proteínas exclusivas de membrana ya que algunas se encuentran en el citoplasma. El ejemplo más típico de éstas son los receptores de las hormonas esteroides. Casi todos los neurotransmisores, la mayoría de las hormonas y muchos medicamentos funcionan gracias a la presencia de estas proteínas.

Proteínas de transferencia de electrones: Son proteínas integrales de membrana, comunes en las mitocondrias y cloroplastos cuya función se basa en el transporte de electrones desde un donador inicial hasta un aceptor final con liberación y aprovechamiento de energía. Como ejemplo se citan a los Citocromos que hacen parte de la cadena respiratoria. [3]

C) FUNCIONES DE LAS PROTEÍNAS:

Función enzimática

Las proteínas con función enzimática son las más numerosas y especializadas.

Actúan como biocatalizadores de las reacciones químicas del metabolismo celular.

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Función hormonal

Algunas hormonas son de naturaleza proteica, como la insulina y el glucagón (que regulan los niveles de glucosa en sangre), o las hormonas segregadas por la hipófisis, como la del crecimiento o la adrenocorticotrópica (que regula la síntesis de corticosteroides) o la calcitonina (que regula el metabolismo del calcio).

Función reguladora

Algunas proteínas regulan la expresión de ciertos genes y otras regulan la división celular (como la ciclina).

Función homeostática

Algunas mantienen el equilibrio osmótico y actúan junto con otros sistemas amortiguadores para mantener constante el pH del medio interno.

Función defensiva

Las inmunoglobulinas actúan como anticuerpos frente a posibles antígenos.

La trombina y el fibrinógeno contribuyen a la formación de coágulos sanguíneos para evitar hemorragias.

Algunas toxinas bacterianas, venenos de serpientes, son proteínas fabricadas con funciones defensivas.

Función de transporte

La hemoglobina transporta oxígeno en la sangre de los vertebrados.

La hemocianina transporta oxígeno en la sangre de los invertebrados.

La mioglobina transporta oxígeno en los músculos. Las lipoproteínas transportan lípidos por la sangre. Los citocromos transportan electrones.

Función contráctil

· La actina y la miosina constituyen las miofibrillas responsables de la contracción muscular.

· La dineína está relacionada con el movimiento de cilios y flagelos.

Función de reserva

La ovoalbúmina de la clara de huevo, la gliadina del grano de trigo y la hordeína de la cebada,

constituyen la reserva de aminoácidos para el desarrollo del embrión.

La lactoalbúmina de la leche.

D) NIVELES DE ORGANIZACIÓN DE LAS PROTEÍNAS

En el estudio de la estructura de las cadenas polipeptídicas podemos distinguir hasta cuatro niveles de organización estructural.

La estructura primaria corresponde con la secuencia de aminoácidos que forman la cadena polipeptídica.La estructura secundaria es disposición espacial del esqueleto de la cadena polipeptídica, sin incluir las cadenas laterales de los aminoácidos.La estructura terciaria es la disposición tridimensional de la cadena polipeptídica completa.La estructura cuaternaria aparece en la proteínas formadas por más de una cadena polipeptídica, y decribe cómo están asociadas dichas cadenas para constituir la proteína activa.

E) PROTEÍNAS FIBROSAS Y GLOBULARES

Las proteínas pueden clasificarse en dos grandes grupos, el de las proteínas fibrosas y las proteínas globulares. Las proteínas fibrosas son generalmente proteínas estáticas, cuya función principal es la de proporcinar soporte mecánico a las células y los organismos, suelen ser insolubles y están formadas por una unidad repetitiva simple que se ensambla para formar fibras. Entre las proteínas fibrosas podemos encontrar la alfa-queratina, componente principal del pelo y las uñas; el colágeno, presente en la piel, los tendones, huesos y dientes.

Las proteínas fibrosas tienen misiones estructurales en los organismos y por tanto son muy abundantes y esenciales para el mismo. Sin embargo, la gran mayoría de las funciones celulares las llevan a cabo proteínas globulares. Su nombre se debe a que sus cadenas polipéptídicas se pliegan sobre si misma de manera compacta. La gran variedad de plegamientos diferentes que encontramos en las proteínas globulares refleja la variedad de funciones que realizan estas proteínas. A pesar de esta enorme variedad de plegamientos podemos encontrar una serie de motivos y principios comunes.

F) ENLACES

Los enlaces covalentes son el principal factor de estabilización de los compuestos orgánicos y también mantienen a los átomos unidos en conformaciones geométricas específicas. No obstante, a pesar de que

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las energías de los enlaces no covalentes son inferiores a las de los enlaces covalentes, las diversas fuerzas atractivas no covalentes tienen una gran importancia. Este tipo de interacciones son las responsables de mantener la estructura de las biomoléculas.

Los enlaces covalentes más importante en Bioquímica son los enlaces C–C, C–H, C–OH y C–NH2, cuya energía de enlace oscila entre 300 y 400 kJ/mol. Las interacciones no covalentes son de 10 a 100 veces más débiles. [5]

II.- AMINOÁCIDOS:

Los aminoácidos son las unidades constituyentes de las proteínas, biomoléculas estas últimas de interés en las organizaciones estructurales y funcionales de células y tejidos. Téngase en cuenta que todas las enzimas, fundamentales para las reacciones bioquímica, y todos los anticuerpos, esenciales en los procesos de inmunidad, son proteínas y se encuentran por tanto constituidos por aminoácidos.

La hidrólisis de proteínas por los diferentes métodos (ácida, básica o enzimática) proporciona 20 aminoácidos (alanina, prolina, lisina, ácido aspártico, ácido glutámico, asparagina, glutamina, histidina, glicina, serina, valina, tirosina, triptofano, fenilalanina, treonina, isoleucina, leucina, cisteína, metionina y arginina) como constituyentes universales de las proteínas. Éstos se distribuyen en esenciales (fenilalanina, leucina, lisina, metionina, isoleucina, treonina, triptófano y valina; aminoácidos esenciales en niños, arginina e histidina) que deben ser suministrados por la dieta, y los no esenciales.

Existen otros aminoácidos no proteicos que aparecen en ciclos pero no forman parte de la estructura proteica, como es el caso de la ornitina, citrulina, 3-metilhistidina, GABA, L-azaserina, homoserina, homocisteína, etc. Se conocen alrededor de 150.

Los aminoácidos desde el punto de vista químico son ácidos orgánicos (R-COOH), portadores de un grupo amino (-NH2) y un radical variable R. Según la

naturaleza del grupo R los aminoácidos pueden ser clasificados en cuatro grandes grupos: apolares, polares sin carga, aniónicos y catiónicos. [6]

A) ESTRUCTURA DE LOS AMINOÁCIDOS:

En la tabla se dan los nombres de los 20 aminoácidos naturales encontrados en las proteínas, de los cuáles algunos de ellos son esenciales y deben incluirse en la dieta de animales y jóvenes para que su desarrollo sea apropiado; estos son: (+)-Arginina, (-)-Histidina, (+)-Isoleucina, (-)-Leucina, (+)-Lisina, (-)-Metionina, (-)-Fenilalanina, (-)-Treonina, (-)-Triptofano y (+)-Valina. Evidentemente estos aminoácidos no los puede sintetizar el animal de otros materiales que forman parte de su alimentación.

Puede observarse que todos estos ácidos son alfa-aminocarboxílicos. En dos casos (prolina e hidroxiprolina), el grupo amino forma parte de un anillo pirrilidínico. Esta característica común les confiere propiedades químicas que también les son comunes, entre las que destaca su capacidad para formar largas cadenas poliamídicas, características de las proteínas.

En otros aspectos las estructuras de estos compuestos varían considerablemente. Además del grupo carboxilo y del grupo amino alfa con respecto a aquél, algunos de estos aminoácidos tienen un segundo grupo carboxilo (por ejemplo, los ácidos aspártico y glutámico) u otro potencial en forma de carboxamida (por ejemplo la asparagina). Estos se denominan aminoácidos ácidos. Otros contienen un segundo grupo básico que puede ser amono (lisina, por ejemplo), un guanidino (arginina), o el anillo del imidazol (histidina). Estos se denominan aminoácidos básicos. Algunos de los aminoácidos contienen sistemas bencénicos o heterocíclicos, grupos fenólicos o alcohólicos o átomos de halógenos o de azufre. Cada uno de estos sistemas anulares o grupos funcionales sufre su propio conjunto característico de reacciones. [7]

Tabla 1: Aminoácidos [8]

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B) METABOLISMO DE AMINOÁCIDOS Y AFECCIONES RELACIONADAS

Una enfermedad genética es una afección mórbida provocada por una variación del material genético humano. La enfermedad se produce cuando se lleva a cabo la mutación en un solo gen en forma espontánea o hereditaria. Si ésta se expresa, el gen mutante da lugar a la síntesis de una proteína anormal o altera el nivel de producción de una proteína.

Aplicaciones Clínicas

Por definición los errores congénitos del metabolismo incluyen defectos que se encuentran en enzimas y que interrumpen vías fisiológicas. Con esta interrupción, se siguen tres cursos:

• Exceso de precursores tóxicos

• Exceso de metabolitos tóxicos • Deficiencia de metabolitos esenciales

Los errores congénitos del metabolismo de aminoácidos provocan aminoaciduria o incremento de aminoácidos en la orina. Las aminoaciduras son renales o de desbordamiento:

* Aminoacidurias renales. Identificadas por tasas plasmáticas normales de aminoácidos y elevación de su presencia en orina. Este fenómeno se debe a una reducción en la capacidad de reabsorción de los túmulos renales * Aminoacidurias por desbordamiento. Elevación de aminoácidos en plasma y en orina

Cistinuria.

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Los individuos excretan mayores cantidades de cistina, lisina, arginina y ornitina. El defecto parece localizarse en la proteína de transporte que se encuentra en la membrana de ciertos tipos de células epiteliales.

La única manifestación de la enfermedad es la formación de cálculos renales que se produce durante la niñez y alcanza su máximo nivel en la tercera década de la vida. Se trata de una aminoaciduria renal.

Cistinosis.

Es la afectación del almacenamiento de lisosomas que generalmente se debe a un defecto en el proceso de transporte para el paso de cistina a través de las membranas del lisosoma. Se producen manifestaciones sistémicas graves debido a los precipitados, que afectan a diversos órganos (riñón, hígado y bazo) así como a los tejidos de la médula ósea, ganglios linfáticos y córnea ocular. Se trata de una aminoacidura renal. Esta suele ser una de las causas del síndrome de Fanconi.

Síndrome de Hartnup.

Se encuentra incrementada la excreción urinaria de alanina, treonina, glutamina, serina, asparagina, valina, leucina, isoleucina, fenilalanina, tirosina, triptofano, histidina y citrulina. Fenómeno que origina una aminoaciduria renal.

Estos pacientes manifiestan erupciones escamosas de color rojizo que aparecen durante la primera década de la vida. También presentan manifestaciones neurológicas como dolor de cabeza, falta de concentración, debilidad de los miembros y ataxia. Se caracteriza por una aminoaciduria renal.

Fenilcetonuria.

Grupo de afecciones caracterizadas por defectos en la conversión de fenilalanina a tirosina, debidos a la deficiencia de la enzima fenilalanina hidroxilasa. Lo anterior causa la acumulación de elevadas concentraciones de fenilalanina y sus metabolitos, los ácidos feniláctico, fenilpirúvico y fenilacético. Se trata de un trastorno hereditario de carácter autonómico recesivo. Se diagnostica durante la lactancia y produce (en caso de no recibir tratamiento a tiempo) retraso mental grave. Los síntomas tempranos que pueden ser observados: Dificultad para ingestión de alimento, Vómito, Retraso en el desarrollo e Hipopigmentación

Al tercer-cuarto día de vida extrauterina los niveles séricos de fenilalanina comienzan a incrementar. El aumento en fenilacético provoca que el sudor y la orina

tengan un olor a ratón o a rancio. Si la enfermedad no se trata a tiempo se manifiestan los trastornos neurológicos a los tres meses y alcanza su máxima expresión a los tres años de edad. La restricción dietética de fenilalanina evita el retraso mental. En general, los análisis neonatales se llevan a cabo mediante la prueba de Guthrie, que es un análisis microbiológico semicuantitativo. Esta prueba se basa en que la presencia de fenilalanina evita la inhibición de beta-2-tienilalanina en la bacteria Bacillus subtilis, fenómeno que permite el crecimiento de ésta. La sangre del recién nacido se obtiene del talón y se coloca sobre papel de filtro. El disco se pone en medio de cultivo que contiene beta-2-tienilalanina inoculada con esporas de B. subtilis. Tras una noche de incubación se comparan las zonas de crecimiento con discos control. Si la prueba de Guthrie indica un aumento de fenilalanina, se realiza una prueba de confirmación. La aminoaciduria provocada por este proceso es de desbordamiento.

Tirosinosis y Tirosinemia

Tirosinosis. Caracterizada por elevados niveles de tirosina en la sangre y en la orina. Los principales síntomas clínicos se encuentran relacionados con daño hepático y renal. La lesión hepática conduce a un fallo agudo o a un estado crónico que origina una cirrosis, por su parte, la disfunción renal ocasiona el síndrome de Fanconi.

Tirosinemia. Caracterizada por la precipitación de cristales de tirosina que conducen a la inflamación y posterior lesión a nivel ocular y cutáneo. En ciertos casos ha sido documento un retraso mental. En ambas situaciones se origina una aminoaciduria por desbordamiento. Alcaptonuria

Caracterizada por excreción urinaria de ácido homogentísico. La única manifestación de la alcaptonuria en niños pequeños es el fenómeno de que la orina se oscurece al contacto con el aire, incorporación de un álcali y exposición a la luz solar. Esta situación persiste durante toda la vida y en general no produce consecuencias aparentes. Induce una aminoacidura de desbordamiento.

Enfermedad de la orina color maple (olor a jarabe de arce, miel de maple) Se trata de una cetoacidura de α-cetoácidos e hidroxiácidos procedentes de aminoácidos con cadenas ramificadas (leucina, Isoleucina, valina). En caso de no ser detectada o no poner el tratamiento temprano

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produce daño cerebral grave y generalmente la muerte durante el curso del primer año de vida. Los síntomas que pueden observarse son entre otros: hipoglucemia, acidosis, letargo, falta de apetito, vómito y convulsiones. Conduce a una aminoacidura por desbordamiento.

Homocistinuria

Caracterizada por el aumento de homocistina en el organismo. Los síntomas se manifiestan tras el nacimiento, uno de los más frecuentes es la dislocación de la lente ocular. También, se presentan anormalidades mentales y en su conjunto los diferentes daños asociados a este tipo de trastorno conducen a la muerte. La aminoacidura observada en este trastorno es del tipo de desbordamiento.

Albinismo

Se debe a la ausencia de la enzima tirosinasa que permite el paso de tirosina a melanina. Induce una aminoacidura de desbordamiento. [9]

III.- IDENTIFICACIÓN DE AMINOÁCIDOS Y PROTEÍNAS

Reacción de Ninhidrina

Reacción para la detección de aminoácidos, actualmente acoplada a sistemas de valoración automática Tiene como objetivo detectar y cuantificar cantidades de aminoácidos libres. Los aminoácidos, en

general reaccionan con la ninhidrina cuando son calentados con un exceso de la misma. Todos los aminoácidos que poseen un grupo amino libre reaccionan y forman dióxido de carbono, amoníaco y un aldehído que contiene un átomo de carbono menos que el compuesto original. Esta reacción da lugar a la formación de un producto color azul o púrpura (que posteriormente puede ser utilizado para cuantificar el aminoácido). En el caso de la prolina, que estructuralmente no posee el grupo amino libre, sino un grupo imino, la coloración final es amarilla. El amoníaco, la mayoría de los polipéptidos y las proteínas pueden desarrollar coloración en esta reacción, pero a diferencia de los aminoácidos, no liberan CO2. La coloración azulada o violeta será proporcional a la concentración del aminoácido.

La ninhidrina (hidrato de tricetohidrindeno) es un oxidante energético que por una desaminación oxidativa de los aminoácidos conduce a la formación del aldehído correspondiente, con liberación de amoniaco y gas carbónico y formación de la ninhidrina reducida o hidrindrantina. La molécula de hidridantina, en presencia de otra de ninhidrina, condensa a través del amoniaco produciendo una estructura denominada indanona o púrpura de Ruhemann, manifestando un color rojizo, excepto para la prolina, hidroxiprolina y en menor medida para la histidina. Presenta su máximo de absorbancia a los 570 nm, exceptuando los tres aminoácidos reseñados anteriormente.

Reacción de Biuret

El nombre de la reacción procede del compuesto coloreado formado por la condensación de dos moléculas de urea con eliminación de amoníaco. Esta reacción está dada por aquellas sustancias cuyas moléculas contienen dos grupos carbamino (-CO.NH) unidos directamente o a través de un solo átomo de carbono o nitrógeno. El reactivo de Biuret contiene Cu2SO4 en solución acuosa alcalina (gracias a la presencia de NaOH o KOH). La reacción se basa en la formación de un complejo de coordinación entre los iones Cu2+ y los pares de electrones no compartidos del nitrógeno que forma parte de los enlaces peptídicos. Esta última reacción provoca un cambio de coloración: violeta púrpura o violeta rosado. Debe señalarse que el color depende de la naturaleza de las proteínas; proteínas y péptidos dan un color rosado; la gelatina da un color azul. Reacción de Millón

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La reacción del Millón se debe a la presencia del grupo hidroxifenilo en la molécula proteica. Cualquier compuesto fenólico que no esté sustituido en la posición 3,5 como la tirosina, el fenol y el timol producen resultados positivos en esta reacción. De estos compuestos, sólo la tirosina está presente en las proteínas, de manera que sólo las proteínas que tienen este aminoácido ofrecen resultados positivos.

En esta prueba los compuestos mercúricos en medio fuertemente ácido (ácido nítrico del reactivo) se condensan con el grupo fenólico formando un compuesto de color rojo ladrillo o rojizo. La prueba no es satisfactoria para soluciones que contienen sales inorgánicas en gran cantidad, ya que el mercurio del reactivo del Millón es precipitado y se vuelve negativo, razón por la cual este reactivo no se usa para medir albúmina en orina. Debe tomarse en cuenta que en el caso de que la solución a examinar sea muy alcalina, debe ser previamente neutralizada, ya que el álcali precipitaría al ion mercurio en forma de óxidos amarillos. Además, proteínas como la ovoalbúmina producen un precipitado blanco que progresivamente por acción del calor se torna rojo; pero las peptonas dan solamente una solución de color rojo.

Reacción de Xantoproteica

Esta prueba caracteriza a los aminoácidos aromáticos (tirosina, fenilalanina, triptófano. Esta reacción se debe la presencia de un grupo fenilo en la molécula proteica. Los complejos de la molécula proteica que son de importancia en esta reacción son la tirosina y el triptófano. La fenilalanina no reacciona en las condiciones que se realiza en el laboratorio. Para esta prueba se produce la nitración del anillo bencénico presente en los aminoácidos obteniéndose nitrocompuestos de color amarillo, que se vuelven anaranjado en medio fuertemente alcalino (formación de ácido picrámico o trinitrofenol). No puede realizarse esa reacción para identificar albúmina en orina, por el color anaranjado de la reacción final. Las proteínas que tienen en su composición estos aminoácidos también darán la reacción. La positividad se reconoce por la aparición de un color amarillo o verde debido a la formación de nitrocompuestos.

Prueba de los grupos SH:

Es una prueba para identificar aminoácidos azufrados y las proteínas que los contienen, se reconocen por la formación de una coloración negra o gris.

Prueba de Sakaguchi

Esta prueba es positiva para compuestos que contengan el grupo guanidinio como la arginina ya que casi todas las proteínas poseen ese aminoácido.El reactivo que se utiliza contiene α-naftol e hipoclorito sódico, en medio alcalino. La aparición de una coloración roja es indicativa de una reacción positiva. El desarrollo de un color rojo marca la reacción positiva y se debe a la presencia del grupo guanidina, que caracteriza la arginina.

Prueba de Hopkin-Cole

Implica la reacción del grupo indol del triptofano con el ácido glioxílico y las proteínas que lo contienen, en presencia de ácido sulfúrico concentrado. La positividad se reconoce por la aparición de un anillo color violeta-rojizo.

Prueba de Jaffé

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Si acontece la aparición de una coloración roja, se tratará de una prueba positiva para la creatinina. Puede ser leída a 520 nm, detectándose hasta 5 μg/mL.

Prueba de coagulación:

Es una prueba para identificar: albúminas, globulinas, glutelinas y prolaminas. La positividad se manifiesta por la formación de un coágulo. No se conoce exactamente el mecanismo de reacción, se cree que ocurre cierta deshidratación de la molécula proteica.

Prueba de Sulfato de amonio:

Las proteínas, como otros coloides son precipitadas por soluciones concentradas de sales de amonio [NaCl. (NH4)2SO4 y NaSO4 ]. Aparentemente la precipitación se debe a la neutralización y deshidratación de la molécula, seguida de agregación y precipitación.

Reacción de Ehrlich

La presencia de anillos aromáticos fenólicos o nitrogenados en la cadena lateral de los Aminoácidos se puede identificar mediante la reacción con ácido sulfanílico y nitrito de Sodio por formación de sales de Diazonio fuertemente coloreadas permitiendo así detectar la presencia de Tirosina e Histidina libres o formando péptidos y proteínas.

Reacción con acetato de Plomo alcalino

Los Aminoácidos azufrados como Metionina, Cisteina y Cistina se reconocen por la formación de precipitados de Sulfuro de Plomo de color gris oscuro o negro que se forman cuando reacciona con Acetato de Plomo en medio alcalino. [10, 11, 12, 13]

IV.- PROPIEDADES ÁCIDO-BASE DE LOS AMINOÁCIDOS:

En el interior celular los aminoácidos predominan en forma de ion dipolar o zwitterion (del alemán ion híbrido). En la forma dipolar el grupo carboxilo se encuentra disociado (-COO-) y el grupo amino protonado (-N+H3), pero la carga de la molécula es neutra. Un zwitterion puede actuar como un ácido o como una base cediendo o aceptando protones.

La protonación o desprotonación de los grupo amino y carboxilo depende del pH. Para la glicina el pKa para el grupo carboxilo y amino es respectivamente 2,3 y 9,6. esto significa que a pH inferiores a 2,3 los grupos carboxilo y amino estarán protonados, la carga neta de la molécula será positiva. A pH entre 2,3 y 9,6 el grupo

carboxilo esta desprotonado y el grupo amino protonado, siendo la carga neta del aminoácido cero. A pH superiores a 9,6 ambos grupos estarán desprotonados, siendo la carga neta negativa.

Dado que los grupos ionizables de los aminoácidos son ácidos relativamente débiles podemos aplicar la ecuación de Henderson-Hasselbalch para calcular la fracción de cada grupo que se encueltra ionizada a un determinado pH.

El grupo a-carboxilo tiene un pKa entre 1,8 y 2.5, mucho más bajo que el pKa del ácido acético (pKa = 4.8). Esto se debe al efecto inductivo que ejerce el grupo amino que al estar protonado atrae hacia si los electrones del grupo carboxilo favoreciendo la desprotonación del mismo. Para un grupo carboxilo que tenga un pKa de 2.0 la proporción de forma desprototonada a forma protonada a pH 7 será de 100.000 a 1, es decir, a pH fisiológico la forma predominante es la de anión carboxilato

Para el grupo amino el valor de pKa varia entre 8,7 y 10,7. Así para un grupo amino cuyo pKa sea de 10,0 la razón base/ácido será de 1/1000 a pH 7. Esto datos confirman el hecho de que la forma predominante a pH neutro para los aminoácidos es la forma de zwitterion neutro. [5]

V. CONSTITUYENTES DE LA CASEÍNA

Caseína (del latín caseus, "queso"). Fosfoproteína predominante de la leche y el queso. En la leche, se encuentra en forma soluble asociada a calcio (sal de calcio) o caseinógeno.

A diferencia de muchas otras proteínas, la caseína no precipita al calor. Precipita bajo la acción de la renina (enzima proteolítica presente en el estómago de terneros) para formar la paracaseína. Al precipitar por acción de ácidos se le llama caseína ácida. Este precipitado blanco forma la base para la elaboración de todo tipo de quesos.

La enzima tripsina reduce la caseína a un hidrolizado fosfatado llamado peptona.

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La secuencia peptídica de la caseína contiene un número inusual de residuos de prolina (ca. 15%). Como resultado, es relativamente hidrofóbica (poco soluble en agua) y carece de estructura secundaria o terciaria definidas. En la leche se encuentra como suspensión de partículas que asemeja a las micelas de surfactantes (pequeñas esferas hidrofílicas en el exterior e hidrófobicas en el interior). Estas micelas de caseína se estabilizan por iones de calcio e interacciones hidrofóbicas.

La caseína se emplea en la fabricación de pinturas, plásticos y preparados farmacéuticos, en el apresto de tejidos, la clarificación de vinos y la elaboración de fórmulas hospitalarias. Representa cerca del 77% al 82% de las proteínas de la leche.

El punto isoeléctrico (pI) de la caseína es 4.6. A este pH, la caseína se encuentra en su punto de menos solubilidad, debido a la reducción de repulsiones intermoleculares, por lo que precipita.[14]

VI. PROTEÍNAS DEL HUEVO

El huevo está constituido por 10.5% de cáscara, 58.5% de albumen o clara y 31.0% de yema; los sólidos de su parte comestible, es decir albumen más yema, están integrados básicamente por proteínas y lípidos y entre ambos suman aproximadamente 95% de la materia seca.

La clara contiene más de 13 polipéptidos con características de glucoproteínas que integran una estructura bien organizada, gelatinosa y espesa y que representan 10.9% de esta fracción del huevo; además de su alto valor nutritivo, muchos de estos polímeros presentan actividades biológicas cuya finalidad es proteger e embrión (cuando el huevo está fecundado), ya que actúan como enzimas, inhibidores, anticuerpos, etc., evitando que los microorganismos se desarrollen. En el cuadro se muestra la concentración, el peso molecular y el punto isoeléctrico de las principales fracciones proteínicas que la componen.

Composición global del huevo (excluyendo la cáscara)

Componente Huevo entero (%)

Yema (%)

Clara (%)

Agua 74.0 49.0 87.8Proteínas 12.9 16.0 10.9Carbohidratos 0.4 0.6 0.2Lípidos 11.5 30.6 0.2Cenizas 0.7 2.0 0.3

De todas estas la ovoalbumina es la más abundante, se clasifica como fosfoglucoproteína por contener hidratos de carbono y fósforo que esterifican a las serinas de acuerdo con el contenido de estos 2 constituyentes, se separa en tres fracciones: A1, A2, A3. Una de sus principales características es que tiene grupos sulfhidrilo que la hacen muy reactiva y fácilmente desnaturalizable, además durante el almacenamiento por un mecanismo de intercambio de disulfuros y sulhidrilos se convierte en una forma más estable, la S-ovoalbúmina, a la que se le atribuyen las reacciones de hipersensibilidad que presentan algunas personas después de consumir huevos. [15]

CASEÍNA: GENERALIDADES.

Color: Blanco a crema.Sabor/Aroma: Limpio, suave.Textura: Polvo fluido, granular.Solubilidad en H2O: baja, casi nula.

Se encuentra en la leche en forma de un complejo soluble de calcio y fósforo. Representa un 80% de la proteína presente en la leche de bovinos, mientras que dicho porcentaje es sensiblemente menor (50%) en la leche de cerda. La caseína se obtiene por un proceso de precipitación a partir de la leche previamente desnatada, mediante el uso de fermentos (quimosina en queserías) o de ácidos fuertes (H2SO4 ó HCl). El producto final es el caseinato sódico o cálcico, después de neutralizar la caseína con hidróxido sódico o cálcico.

Relación entre punto isoeléctrico y absorbancia por turbidimetría:

El punto isoeléctrico de una proteína es básicamente el pH al cual esta no migra en un campo eléctrico. Ocurre esto pues la concentración de protones es tal que se produce una compensación de las cargas positivas y negativas, dando como resultado una molécula sin carga neta.

Supóngase una proteína solubilizada en un solvente polar a un pH distinto del punto isoeléctrico. Sus moléculas tienen una carga neta definida y pueden interaccionar con el solvente, obteniéndose una suspensión coloidal. Luego dicho coloide es llevado al pH del punto isoeléctrico. Las moléculas de proteína pierden su carga neta y ya no son efectivamente solvatadas, sino que interaccionan entre ellas formando aglomerados cada vez más grandes, produciéndose la eventual precipitación.

La caseína, por contener grupos fosfato, tiene carácter ácido, y un punto isoeléctrico menor que "7". Su punto

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isoeléctrico (en el que la carga de las moléculas es nula y por tanto las fuerzas de repulsión mínimas), puede determinarse mediante estimación de la turbidez de la solución. El método turbidimetríco empleado se basa en la medida de la turbidez de una solución o suspensión en la que la cantidad de luz transmitida se cuantifica con un espectrofotómetro o se estima mediante comparación visual con soluciones de turbidez conocida. Se sabe que la absorbancia de un analito solubilizado es proporcional a su concentración (Ley de Beer). Por lo tanto, es de esperar que no se registren valores de absorbancia de una proteína en su punto isoeléctrico, pues no se encontraría como soluto. Por el contrario es posible analizar la absorbancia de la misma en soluciones de pH superiores o inferiores al isoeléctrico, obteniéndose dos posibles relaciones lineales respectivas tal como se indica en los siguientes gráficos:

Efectivamente el punto isoeléctrico de una proteína puede determinarse registrándose experimentalmente valores de absorbancia de soluciones de la misma a distintos pHs. Podrán utilizarse soluciones de mayor pH que el isoeléctrico o de menor pH, pero nunca un rango en el cual el pH isoeléctrico sea intermedio, pues se perdería la relación lineal buscada para realizar el posterior cálculo. Además deberá tenerse en cuenta que la linealidad mencionada se cumple hasta cierto punto, pues a pHs extremos las proteínas pueden desnaturalizase, o también pueden obtenerse soluciones muy concentradas en las que no se cumpla

la Ley de Beer (se cumple para soluciones muy diluidas).

Dependiendo de su estructura, posee diferentes puntos isoeléctricos; existen tres tipos de caseína: α (pI = 4,6), β (pI = 5) y γ (pI entre 5,8 y 6 unidades de pH). [16]

OBJETIVO:

Determinar algunas de las propiedades químicas de las proteínas (utilizando métodos coloridos), como lo son los grupos funcionales que las constituyen, así como algunas propiedades fisicoquímicas que las caracterizan.

HIPÓTESIS:

Si a las proteínas que se utilizarán para esta práctica, se les aplican agentes físicos y químicos (desnaturalizantes) para hacerlas reaccionar químicamente, así como técnicas para reconocer sus propiedades fisicoquímicas; podremos reconocer algunos grupos funcionales que estas contengan así como identificar sus propiedades teóricas según su estructura.

MATERIAL:

5 pipetas graduadas 5ml 5 pipetas graduadas 10ml 2 pipetas volumétricas 2ml 3 pipetas pasteur 7 vasos de precipitados 50ml 5 vasos de precipitados 100ml 1 vaso de precipitado de 400ml 1 probeta 100ml 1 espátula 1 piseta 3 vidrios de reloj 20 tubos de ensayo 1 Gradilla Pinzas para tubos de ensayo Agitador de vidrio Papel pH

REACTIVOS:

Glicina al 0.5% Peptona al 0.5% y 2% Gelatina al 0.5% y 2% Caseína al 0.5% y 2% Albúmina al 0.5% y 2% Hidróxido de sodio (NaOH) al 10% Acetato de plomo (Pb(CH3COO)2) al 2 y 10% Ácido acético (CH3COOH) 0.01N, 0.1N y 1N Sulfato de amonio ((NH4)2SO4) (35g/100ml)

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pH

[proteína]

punto isoeléctrico

pH

absorbancia

punto isoeléctrico

Cloruro Férrico (FeCl3) al 3% Acetato de sodio (CH3COONa)0.1N Caseína al 5% en acetato de sodio 0.1N Ácido Tricloroacético (CCl3COOH) al 5% Cloruro de sodio (NaCl) al 5% 1 clara de huevo Reactivo de Biuret Ácido Nítrico concentrado (HNO3) Hidróxido de amonio (NH4OH) Reactivo de Hopkins – Cole Ácido sulfúrico concentrado (H2SO4) Ácido sulfhídrico (H2S) Nitrato de plata (AgNO3) al 2% Cloruro mercúrico (HgCl2) al 2% Sulfato de cobre (CuSO4) al 1% Etanol (CH3CH2OH) Agua destilada

EQUIPO:

Parrilla de calentamiento Campana Centrifugadora Balanza analítica

PROCEDIMIENTOS Y RESULTADOS:

1.- Algunas propiedades químicas de las proteínas:

Las proteínas están formadas por aminoácidos, unidos por enlaces peptídicos y aunque presentan propiedades fisicoquímicas y biológicas características éstas son reflejo de las de los aminoácidos que las constituyen. Muchas de las reacciones coloridas que se utilizan para el análisis de las proteínas en realidad se deben a la presencia de un aminoácido específico.

A) REACCIÓN DE MILLON

La reacción de Millon es especifica para el grupo fenolito y por tanto, la dan positiva todas las sustancias que posen esta función, como el fenol, ácido salicílico, timol, tirosina y todas aquellas proteínas que contengan tirosina.

EXPERIMENTO 1

Prepare una serie de 4 tubos de ensaye numerados, coloque en cada uno, 2ml de una de las soluciones siguientes: Peptona, Caseína, Gelatina, Albúmina y Glicina.

Posteriormente añade 5 gotas del reactivo de Millón. Caliente ligeramente hasta que la solución hierva. ¡PRECAUCION!. La presencia de tirosina se pone de manifiesto por la aparición de un precipitado blanco el

cual por acción del calor se vuelve rojo. La presencia de sales así como soluciones muy alcalinas pueden interferir en esta reacción.

- Anote sus resultados en la tabla que se encuentra al final del capitulo

- Explique en que consiste el reactivo de Millón y cual es el mecanismo que se ha propuesto para esta reacción: Esta reacción se debe a la presencia de grupos hidroxifenilos (C6H5OH) en la molécula proteica. Cualquier compuesto fenólico que no esté sustituido en la posición 3, 5, como la tirosina, fenol y timol, dan lugar a la reacción. De estos compuestos, solamente la tirosina o tirosina halogenada se encuentran presentes en las proteínas, de manera que la reacción de Millon tiene lugar únicamente con las proteínas que tienen tirosina; La prueba no es satisfactoria para soluciones que contienen sales inorgánicas en gran cantidad, ya que el mercurio del reactivo de Millon es precipitado y se vuelve inactivo, razón por la que este reactivo no se usa para medir albúmina en la orina. Si la solución a examinarse es muy alcalina debe ser previamente neutralizada, ya que el álcali precipita también el mercurio en forma de óxidos amarillos.

Observaciones:

TUBOS PROTEINAS1 PEPTONA- resulto positiva, se observo

en una sola capa y se puso de color rojo2 CASEINA- resulto positiva con leche, y

se observaron dos capas, una blanca por la leche y la otra roja

3 GELATINA- resulto positiva, pero fue muy ligero su color rojo.

4 ALBUMINA- resulto positiva, aquí existió la formación de un coagulo, el cual se acento en el tubo (color rojo)

5 GLICINA- aquí no resulto positivo, quedo incoloro

Como se observa cada una de las proteínas en estado normal, sin ninguna alteración

- Gelatina- Peptona- Albumina- Glicina- Caseína

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Ligero calentamiento, hasta que hierva. Cada una de las proteínas, para observar si dan positivas o no

Resulto de cada una de las proteínas después de haber hervido, se muestra la forma en que quedo cada una de ella. LA mayoría fue positiva, con una de ella (caseína), se utilizo otra técnica. (Con leche)

- gelatina- caseína- albúmina- peptona- glicina

B) REACCIÓN DE BIURET

Todas las moléculas que contengas 2 o más uniones peptídicas, por lo tanto todas las proteínas y todos los péptidos no menores de 3 unidades, dan positiva a la reacción de Biuret. El nombre se debe al compuesto biurea (NH2-CO-NH-CO-NH2) el cual da positiva la prueba.

Cuando una proteína o un polipéptido se hacen reaccionar con sulfato de cobre en solución alcalina se produce un color característico púrpura o violeta; el color se debe a un complejo que resulta al unirse el cobre con los átomos de nitrógeno de los enlaces peptídicos. Esta reacción nos sirve para diferenciar las proteínas y péptidos de los aminoácidos y su utilidad principal es la de seguir el proceso de hidrólisis proteica, la reacción será negativa cuando la hidrólisis sea completa.

EXPERIMENTO 2

Prepare una serie de tubos de ensaye numerados, coloque en cada uno 1ml de las siguientes proteínas: peptona, caseína, gelatina, albúmina y glicina. Añada 2ml de solución de Biuret. Agite los tubos y observe la reacción que se produce en cada caso. Calentar a baño maría. La aparición de una coloración violeta o rosa, en no más de 20 minutos debe considerarse como prueba positiva.

- Anote sus resultados en la tabla que se encuentra al final del capítulo.

- ¿Se puede considerar al biuret como una reacción característica para todas las proteínas? No, esta reacción está dada solo por aquellas sustancias cuyas moléculas contienen dos grupos carbamino (-CO.NH) unidos directamente o a través de un solo átomo de carbono o nitrógeno

- Escriba la reacción

Observaciones:

Tubo PROTEÍNA Color1 Peptona rosa2 Caseína Lila3 Gelatina Lila4 Albúmina morado5 Glicina verde

Reacción con leche

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C) REACCIÓN XANPROTÉICA

Esta reacción se debe a la formación de nitroderivados aromáticos por reacción del ácido nítrico sobre los grupos bencénicos que poseen algunos aminoácidos como la fenilalanina, la tirosina, y el triptófano. Por lo tanto, la dan positiva todas aquellas proteínas que tengan aminoácidos aromáticos en su molécula.

EXPERIMENTO 3

Prepare una serie de 4 tubos de ensaye, numerados, agregue en cada uno 2mL de una de las siguientes soluciones:

Tubo No. Proteína 1 Peptona 2 Caseína 3 Gelatina 4 Albúmina 5 Glicina

Añada 1mL de ácido nítrico concentrado (HNO3), caliente ligeramente y observe una coloración amarilla característica. Se deja enfriar esta solución y se añaden unas gotas de hidróxido de amonio (NH4OH) concentrado cuidadosamente, inclinando el tubo y despacio, para estratificar. En la interfase se observara un anillo naranja.

Observaciones:

Tubo No.

Proteína Observaciones

1 Peptona Anillo amarilla mas fuerte 2 Caseína Anillo amarillo tenue3 Gelatina Anillo amarillo ligero

4Albúmina Anillo amarillo con

precipitado amarillo

5Glicina No presento anillo ni

precipitado

Como se puede observar en la imagen el anillo amarillo mas fuerte pertenece a la peptona, y posteriormente le sigue la albúmina, solo que esta presento también un precipitado amarillo. Las otras proteínas como la caseína y la gelatina su anillo no era tan apreciable como las otras dos anteriores. La proteína que dio negativa esta prueba fue la glicina.

- ¿Se puede considerar esta reacción general para todas las proteínas? No, ya que es debida a la formación de un compuesto aromático nitrado de color amarillo, cuando las proteínas son tratadas con ácido nítrico concentrado. La prueba da resultado positivo en aquellas proteínas con aminoácidos portadores de grupos bencénicos, especialmente en presencia de tirosina. Si una vez realizada la prueba se neutraliza con un álcali vira a un color anaranjado oscuro.

- Explique por que se tiñe de amarillo la piel al contacto con el HNO3: Por el colágeno, ya que esta proteína contiene grupos bencénicos

D) REACCIÓN DE HOPKINS-COLE

La reacción Hopkins-Cole es especifica para aminoácido triptofano y el color violeta que se produce se debe a la concentración del anillo indólico del triptofano con el aldehído presente en el reactivo de Hopkins-Cole. Esta reacción darán positiva los pépticos y proteínas que contengan triptofano en su molécula.

EXPERIMENTO 4

Prepare una serie de 4 tubos de ensaye numerados, coloque en cada una 2ml de una de las siguientes soluciones de proteínas: peptona, caseína, gelatina, albúmina y glicina.

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Agregue 3ml del reactivo de Hopkins-Cole y mezcle vigorosamente. Añada cuidadosamente resbalando por las paredes 1ml de acido sulfúrico (H2SO4) concentrado procurando que se formen dos capas. Introduzca los tubos en un vaso de agua caliente y si la reacción es positiva a los 2 minutos aparecerá un anillo violeta en la interfase.

- Anote sus resultados en la tabla que se encuentra al final del capitulo.

- Escriba la reacción que se ha producido.

Observaciones:

Tubo PROTEÍNA Observaciones1 Peptona Aro morado2 Caseína Aro violeta separado por 2

capas3 Gelatina Aro morado tenue en la parte

baja4 Albúmina precipitado5 Glicina negativa

E) REACCIÓN DE AMINOÁCIDOS AZUFRADOS

Los aminoácidos cistina, cisteína y las proteínas que los contengan, cuando se tratan con álcalis concentrados desprenden ácido sulfhídrico, el cual se puede reconocer por su olor fuertemente desagradable y característico, o bien, por la formación de un precipitado negruzco (PbS). Esta reacción se basa en la separación mediante un álcali, del azufre de los aminoácidos, el cual al reaccionar con una solución de acetato de plomo, forma el sulfuro de plomo.

[17]

EXPERIMENTO 5

Prepare una serie de 4 tubos de ensaye numerados, coloque en cada uno 2 ml de una de las siguientes soluciones:

1 Peptona

2 Caseína

3 Gelatina

4 Albúmina

5 Glicina

Agregue 2 ml de solución de hidróxido de sodio (NaOH) al 10% ¡PRECAUCIÓN! Caliente ligeramente. Añada a todos 0.5 ml de solución de acetato de plomo (Pb (CH3-COO)2). Coloque los tubos en baño maría a ebullición por 5 min.

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El oscurecimiento de la solución o la formación de un precipitado negro indica la presencia de aminoácidos azufrados.

- Anote sus resultados en la tabla que se encuentra al final.

- Escriba la reacción química que se ha efectuado.

Observaciones:

En el caso de la peptona se puede observar un ligero oscurecimiento lo que nos indica que hay presencia de proteínas.

En la gelatina no se observo la formación de un precipitado negruzco, ni se obtuvo ningún cambio en su coloración.

La glicina presentó un ligero oscurecimiento al igual que en el caso de la peptona.

La albúmina dio como resultado positivo ya que presentó un oscurecimiento intenso sin la presencia de un precipitado oscuro.

Al realizar la prueba con la caseína no se obtuvo el resultado esperado por lo que se utilizó leche, el resultado que se obtuvo fue un oscurecimiento bastante intenso con el cual se pudo comprobar la presencia de proteínas.

TABLA DE RESULTADOS DE ALGUNAS PROPIEDADES QUÍMICAS DE LAS PROTEÍNAS:

REACCIÓN

MILLON BIURET XANPROTÉICA HOPKINS-COLE AMINOÁCIDOS AZUFRADOS

SUSTANCIAGELATINA + + + + -PEPTONA + + + + +

Tubo No. Proteína Observaciones1 Peptona + Al calor cambia de

coloración a café claro2 Caseína + Al agregar el acetato

cambia a negro3 Gelatina - No cambio4 Albúmina + Cambia a negro5 Glicina - Negativa

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CASEÍNA + + + + -ALBÚMINA + + + + +

2.- Propiedades físico-químicas de las proteínas

Muchas de las propiedades químicas de las proteínas son comunes a varias especies debido a que contienen el mismo tipo de aminoácidos, por lo que es necesario estudiar sus propiedades físicas y biológicas si se desea caracterizar una proteína. Las propiedades físico-químicas de las proteínas dependen fundamentalmente del peso molecular, de su carga eléctrica neta y de la conformación que adopte la molécula (estructura 1ª, 2ª, 3ª y 4ª)

A) DESNATURALIZACIÓN DE LAS PROTEÍNAS:

Las propiedades físico-químicas y biológicas de las proteínas se alteran profundamente cuando se someten a la acción de agentes físico-químicos capaces de romper los diferentes enlaces que estabilizan las estructuras 1ª, 2ª, 3ª y 4ª de las proteínas. Detal forma que la estructura altamente ordenada de una proteína queda reducida al llamado polímero estadístico formado por la cadena de aminoácidos. Estos agentes pueden ser muy diversos y se denominan en general, agentes desnaturalizantes. En esta práctica se estudian algunos de los más importantes.

EFECTO DEL CALOR

El calor es uno de los agentes primordiales de desnaturalización, la mayor parte de las proteínas en solución son inestables a temperaturas superiores a 60ºC. Las alteraciones que sufre la molécula disminuyen su solubilidad y generalmente precipitan en forma de agregados insolubles. Esta propiedad de las proteínas se denomina coagulación.

EXPERIMENTO 6

Prepare una serie de 4 tubos de ensaye, numerados, coloque en cada uno 3ml de una de las siguientes soluciones

TUBOS PROTEINAS1 Peptona2 Caseína3 Gelatina4 Albúmina

Añádales 2ml de NaCl al 5%. Calienta todos los tubos en baño Maria a ebullición por 5min. Observe

cuidadosamente lo que ha ocurrido en cada tubo y escriba:

TUBOS CON SU RESPECTIVA PROTEINA

Observaciones:

En todos los tubos anteriores resulto una prueba positiva, ya que existe turbidez en todas, ya que la proteína precipito

TUBOS CUANDO REACCIONAN POSITIVAMENTE

- ¿Qué papel desempeña el agua en el fenómeno de la coagulación?

La impureza liofoba es más fácil de precipitar que una liofílica. En cuanto al número de impurezas se obtiene una mejor coagulación con un número mayor de impurezas.

Respecto al tipo de coagulante se pueden encontrar además de las sales de aluminio, las de hierro y los polielectrolitos. En general los coagulantes con mayor valencia actúan mejor debido a su mayor capacidad de intercambio de carga. El Al+3 es muy efectivo.

Según el tipo de agua que se tenga es tipo de mecanismo de coagulación que más influye. En aguas poco turbias, la coagulación es principalmente por hidróxidos metálicos. Su efecto es el del barrido. En aguas muy turbias en cambio se tiene gran participación también de los otros mecanismos y las relaciones de dosis de coagulante y coloides son prácticamente estequiométricas.

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Otros coagulantes comerciales son el sulfato de aluminio, aluminato de sodio, sales de fierro, cloruro férrico y el sulfato ferroso.

Los coagulantes metálicos se polimerizan en solución. Los polielectrolitos (poliacrilamida, algianato de sodio) son polímeros en sí. Actúan ambos de igual forma.

La carga de las partículas coloidales se produce por la ionización de grupos hidroxilo, carboxilos, fosfatos o sulfatos, los cuales pueden estar presentes en la superficie de los coloides. Estos grupos reaccionan con los iones metálicos de los coagulantes lo que genera la posterior precipitación. Así la desestabilización de los sistemas coloidales se ve mejor bajo el punto de vista químico.

La teoría del puente químico formulada por La Mer supone una molécula polimérica unida a la superficie del coloide en uno o más sitios mientras el resto de los sitios de adsorción están vacantes los que pueden ser ocupados por otros coloides generando así un puente químico. Esto genera un aumento de tamaño y consigo, precipitación.

El color indica la presencia de materia disuelta, ya sea orgánica o inorgánica, que puede ser nociva; el olor se debe a la materia orgánica. Uno y otro pueden y deben eliminarse por completo. Relacionada con estos parámetros está la turbidez o medida de la cantidad de partículas sólidas disueltas; un contenido de sólidos totales disueltos mayor que 500 mg/l, especialmente de cloruros y de sulfatos, da un sabor desagradable y hace aguas corrosivas.

- Explique la diferencia entre coagulación y desnaturalización

LA DESNATURALIZACIÓN es un cambio estructural de las proteínas o ácidos nucleicos, donde pierden su estructura nativa, y de esta forma su óptimo funcionamiento y a veces también cambian sus propiedades físico-químicas.

Las proteínas se desnaturalizan cuando pierden su estructura tridimensional (conformación química) y así su característico plegamiento de su estructura.

Las proteínas son filamentos largos de aminoácidos unidos en una secuencia específica. Son creadas por los ribosomas que "leen" codones de los genes y ensamblan la combinación requerida de aminoácidos por la instrucción genética. Las proteínas recién creadas experimentan una modificación en la que se agregan átomos o moléculas adicionales, como el

cobre, zinc e hierro. Una vez que finaliza este proceso, la proteína comienza a plegarse sin alterar su secuencia (espontáneamente, y a veces con asistencia de enzimas) de forma tal que los elementos hidrofobitos

de la proteína son encerrados dentro de su estructura y los elementos hidrofilitos son llevados al exterior. La forma final de la proteína determina cómo interaccionará con el entorno.Si la forma de la proteína es alterada por algún factor externo (por ejemplo, aplicándole calor, ácidos o álcalis), no es capaz de cumplir su función celular.

LA COAGULACIÓN se refiere al proceso de desestabilización de las partículas suspendidas de modo que se reduzcan las fuerzas de separación entre ellas Para la coagulación existen también dos modelos. El primero es llamado ortocinético, el cual es promovido por agitación externa principalmente. Influyen partículas de tamaño superior al micrón y tiene relación con los gradientes de velocidad del líquido.

El segundo modelo se llama pericinético y se diferencia del primero en que su fuente deagitación es interna. Principalmente importarán el movimiento browniano y la sedimentación. Su efecto es principalmente sobre partículas de tamaño inferior a 1 micrón.

Modelos Físicos de la Coagulación:

a) Modelo de Helmholtz: Su fundamento se basa en dos superficies cargadas eléctricamente y separadas por una distancia ‘d’ constante.

b) Modelo de Gouy Chapman: Introduce el concepto de capa difusa. Para esto usa la ecuación de Poisson, lo que permite calcular las posiciones de equilibrio de los iones de la doble capa. [18, 20]

B) PRECIPITACIÓN DE LAS PROTEÍNAS POR METALES PESADOS:

Las proteínas cuando se encuentran en solución a pH superiores a su punto isoeléctrico son capaces de reaccionar con diferentes metales pesados formando los correspondientes proteinados insolubles.

EXPERIMENTO 7

20

Coloque en tubos de ensayo numerados, 1mL de las siguientes soluciones: peptona al 2%. Añada 2 gotas de solución de cloruro ferrico (FeCl3) al 3%. Observe lo que sucede en cada caso y a continuación añada un exceso de FeCl3 (si no ocurre precipitado compruebe el pH). Repita este experimento utilizando nitrato de plata (AgNO3) cloruro de mercúrico (HgCl2) y acetato básico de plomo (Pb(CH3-COO)2)) todos al 2%

En la imagen podemos ver el proteinado insoluble que se formó con la peptona y el cloruro férrico, el pH tenia que ser alcalino para que la proteína estuviera mas allá de su pI, nombre de este proteinado es peptanoato de fierro

- ¿Tiene alguna influencia el pH en el efecto de los metales pesados sobre las proteínas? Si, ya que dependiendo de que proteína se este tratando, el pH influirá para que las proteínas estén mas allá de si punto isolectrico, ya que así son capaces de reaccionar con diferentes metales.

- ¿Tienen todos los metales pesados el mismo efecto precipitante sobre las proteínas? Si ya que estos se fijan mejor a la proteína formando así los diferentes proteínados, los cuales son insolubles.

C) PRECIPITACIÓN DE LAS PROTEÍNAS POR EFECTO DE ÁCIDOS FUERTES

Los ácidos fuertes son capaces de desnaturalizar a las proteínas formando de desnaturalización insolubles conocidos como metaloproteínas.

EXPERIMENTO 8

Coloque en tubos de ensaye numerados, 3ml de las siguientes soluciones; peptona, gelatina, caseína y albúmina al 2% y añada un volumen igual de acido tricloroacetico (CCl3COOH) al 5%

- Anote sus resultados al final del capitulo

- ¿Cómo puede explicar el efecto desnaturalizante del acido tricloroacético y, en general de cualquier acido? La desnaturalización por solventes se debe

a que las moléculas del solventes interfieren con las interacciones hidrofóbicas en el interior de las proteínas. Este proceso se ve favorecido a temperaturas mayores a 0°C.

Cuando las proteínas se mezclan con bajas concentraciones de ácido tricloroacético o ferrocianida de potasio en ácido acético, se obtienen resultados de turbidez. En condiciones controladas de temperatura, concentración y tiempo de exposición a agentes precipitantes, la densidad óptica resultantes a 600mm ofrece un método rápido y semicuantitativo para la determinación de proteína. Este método tiene grandes desventajas: no todas las proteínas tienen precipitados parecidos y la precipitación ácida de materiales no proteicos interfiere.[20]

Observaciones:

Caseína; hubo un intenso precipitado, color blanco. Gelatina; hubo un poco de turbidez. Peptona; no hubo reacción Albúmina; aquí hubo también un intenso

precipitado, pero fue menor a la de la caseína.

D) PRECIPITACIÓN DE PROTEÍNAS POR EFECTO DE SALES

La precipitación salina es uno de los métodos de separación de proteínas de estado natural (actividad biológica).

El sulfato de amonio es una de las sales más utilizadas para la precipitación salina de proteínas. Es muy soluble (760 g de sulfato de amonio/1000 de agua a una temperatura de 20 ºC) y el ión sulfato divalente permite alcanzar altas fuerzas iónicas.[21]

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Las proteínas en solución son menos solubles cuando se aumenta la fuerza iónica y esto se puede lograr adicionando sales solubles como el sulfato de amonio ((NH4)2SO4). Sin embargo, la concentración para precipitar diferentes proteínas es variable. Esta diferencia en sensibilidad se ha utilizado para separar y purificar proteínas, por ejemplo las albúminas y globulinas a, b, g de la clara de huevo. En esta determinación la proteína blanca del huevo (clara) será separada en fracciones de globulina y albúmina.

EXPERIMENTO 9

Coloque en tubos de ensaye numerados, 2 ml de las siguientes soluciones:

Peptona 2%

Clara de huevo fresca diluida 1:2

Añada a cada tubo 2 ml de solución saturada de sulfato de amonio, agitar y centrifugar a 3000 rpm durante 5 min.

Peptona: No se formo precipitado.Clara: Se formo precipitado.

Disolver el precipitado en 2 ml de agua destilada y hacer la prueba del Biuret (utilizando NaOH al 10% y CuSO4 al 1%).

- ¿Es negativa o positiva la prueba del Biuret? Clara: Da positivo con la prueba de Biuret, se le agrego unas gotas de NaOH al 10% para que se pudiera observar de manera clara el color rosado o morado de que la prueba era positiva.

Repita la prueba con un mililitro del sobrenadante.

- ¿Qué resultado obtuvo? El resultado que se obtuvo con 1 ml de sobrenadante fue positivo.

Al resto del sobrenadante agréguele poco a poco sulfato de amonio sólido agitando para disolverlo en cada caso hasta que la solución se sature.

Centrifugar a 3000 rpm por 5 min repetir la prueba del Biuret en el precipitado y la solución disolviendo el precipitado en 1 ml de agua destilada.

- ¿Cuál es la interpretación y la conclusión final con los resultados? Al comparar el sobrenadante con el tubo que contiene 1 ml, se puede observar que la coloración es más intensa en el tubo y por tanto se puede decir que hay mayor concentración de proteínas en el mismo y en el sobrenadante la coloración es mínima por lo que se puede decir que hay menor concentración de proteínas.

Nota: No fue necesario realizar todo el procedimiento a partir del paso en el que se le tiene que agregar el sulfato de amonio ya que la prueba resultó positiva antes de llegar a ese punto.

E) PRECIPITACIÓN POR ALCOHOL

Los alcoholes y la acetona son agentes desnaturalizantes de las proteínas ya que las deshidratan al competir por el agua de solvatación y por lo tanto las precipitan.

EXPERIMENTO 10

Coloque los tubos de ensayo 2ml de las siguientes soluciones: peptona, caseína, gelatina, albúmina al 2%, estratificando cuidadosamente agregue 3ml de alcohol de 96% y observe lo que ocurre en la interfase.

- ¿Observa turbidez o precipitación en todos los tubos? En la caseína se observa turbidez al fondo del tubo, en la gelatina se observa un precipitado de gel al fondo, en la albúmina y peptona se observa turbidez.

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- Anote sus resultados en la tabla

- ¿Qué entiende por fuerza iónica de una solución? La fuerza iónica es una propiedad de la disolución en la que se encuentre el ión que se esté considerando

- Mencione otras sales que se puedan utilizar para precipitar las proteínas: NaCl, NH4Cl y KCl

TABLA DE RESULTADOS DE PROPIEDADES FISICOQUÍMICAS DE LAS PROTEÍNAS:

AGENTES CALOR Fe Hg Pb ÁCIDO TRICLOROACÉTICO

SULFATO DE AMONIO

ALCOHOLSUSTANCIASPeptona + + + + - - +Albúmina + --- --- --- + + +Gelatina + --- --- --- + --- +Caseína + --- --- --- + --- +

F) DETERMINACIÓN DEL PUNTO ISOELÉCTRICO

Prepare una serie de 9 tubos de ensayo siguiendo las instrucciones de la siguiente tabla:

Añada primero caseína, posteriormente el agua y al final el ácido acético (pka=4.75). Agite los tubos y observe el grado de precipitación o turbidez o la precipitación que se produce en cada tubo inmediatamente después de 15´y 30´.

- Anote sus observaciones en la tabla, valorando con cruces.

- Calcule el ph teórico de cada tubo y anótelo en la tabla, aplicando la ecuación de Hendersson-Hasselbalch

Ej:

No. Tubo 1 2 3 4 5 6 7 8 9Sustancias CASEÍNA 5% en ACETATO DE SODIO 0.1N 1 1 1 1 1 1 1 1 1AGUA DESTILADA 8.4 7.8 8.8 8.5 8.0 7.0 5.0 1.0 7.4ÁCIDO ACÉTICO 1N - - - - - - - - 1.6ÁCIDO ACÉTICO 0.1N - - 0.2 0.5 1.0 2.0 4.0 8.0 -ÁCIDO ACÉTICO0.01N 0.6 1.2 - - - - - - -pH EXPERIMENTAL 6 5 5 5 4 4 4 4 3pH TEÓRICO 5.97 5.67 5.44 5.05 4.75 4.45 4.15 3.85 3.55Observación 15 min. xxx xxx

xxxxx

x xx xxxxxx

xxxxxxx

xxxxxxxxx

xxxxx

xxxx

Observación 30 min. xxx xxxxxx

x xx xxxxxxx

xxxxxxxx

xxxxxxxxx

xxxxx

xxxx

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DISCUSIÓN DE RESULTADOS:

Se realizó el primer experimento con la reacción de Millon, en todas las proteínas dio positiva, lo que indicó la presencia de un grupo hidroxifenilo en la molécula proteica excepto en la glicina debido a que este es un aminoácido. Se formaron soluciones rojas debido a que los compuestos mercúricos del reactivo se condensaron con el grupo fenólico de las proteínas.

En el segundo experimento (Biuret) también dio positivo para todas indicando que todas poseían 2 grupos carbamino unidos directamente o a través de un solo átomo de carbono o nitrógeno formando un complejo de coordinación entre los iones Cu2+ y los pares de electrones no compartidos del nitrógeno que forma parte de los enlaces peptídicos provocando el cambio de coloración ya fuera violeta o rosado. La glicina dio verde debido a que es un aminoácido.

Para el tercer experimento (Xanproteico), dio negativo para el aminoácido ya que no es aromático y positivo para las proteínas por su grupo fenólico por la nitración del anillo bencénico presente en los residuos de aminoácidos de las proteínas obteniéndose nitrocompuestos de color amarillo.

En la reacción de Hopkins-Cole dio positiva a las proteínas por la reacción del grupo indol del triptofano con el ácido glioxílico en presencia de ácido sulfúrico concentrado, dando así positivo al observarse el anillo violeta y negativo para la glicina.

La prueba para los aminoácidos azufrados dio negativa para la gelatina, glicina y para la caseína (aunque al realizarlo con leche dio positivo), aunque debieron de dar positivos excepto la glicina y positiva para peptona y albúmina dando una coloración negra indicando así la presencia de aminoácidos azufrados.

En el experimento 6 todas las proteínas dieron positivas al observarse la coagulación, esto debido a la desnaturalización de las proteínas por el efecto del calor debido a que la mayor parte de las proteínas en solución son inestables a temperaturas superiores a 60ºC observándose así al coagularse las alteraciones que sufre la molécula disminuyendo su solubilidad y precipitando en forma de agregados insolubles.

En la precipitación de las proteínas por metales pesados sólo se realizó el experimento con la albúmina ya que teóricamente para las demás proteínas también debería de dar positivo ya que las proteínas cuando se encuentran en solución a pH superiores a su punto isoeléctrico son capaces de reaccionar con diferentes metales pesados formando los correspondientes proteinados insolubles, como se observó en la peptona formando así el peptonato de fierro.

En el experimento 8 dieron positivas todas menos en la peptona (tal vez debido a la solución o a que faltaba agregar un poco más de ácido), aunque de diferente intensidad los resultados para cada proteína ya que se desnaturalizaron en diferente medida por el ácido tricloroacético que es un ácido fuerte y forma metaloproteínas.

Para el experimento 9 no se realizó ni para la gelatina ni caseína y sólo dio positivo para la albúmina separando a la proteína en su estado natural, es decir las globulinas a, b, y g de la clara del huevo precipitándolas.

En el experimento 10, todas dieron positivas debido a que el alcohol es un agente desnaturalizante de las proteínas al deshidratarlas al competir por el agua de solvatación, por lo cuál se precipitan.

Por último se determinó el pH teórico de la caseína en soluciones de ácido acético a diferentes concentraciones por medio de la ecuación de Hendersson-Hasselbalch observándose así que a mayor concentración de ácido acético, el pH disminuía y la turbidez y/o precipitación de las soluciones variaba, observándose así que cercano al punto isoeléctrico de la caseína (investigado teóricamente =4.6) y isoeléctrico (=5) se observaba mayor turbidez que en los demás pHs.

CONCLUSIONES:

Se observaron algunas de las propiedades de las proteínas tanto físicas como fisicoquímicas, así como también las reacciones específicas para cada aminoácido que las constituye.

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Las reacciones coloridas como por ejemplo la reacción de millón son sirve para identificar las proteínas formadas por grupos fenólicos y también proteínas que contengan tirosina (ejemplo: albúmina, caseína, gelatina, y peptona). Otra reacción colorida es la xantoproteíca en la cual las proteínas que contengan grupos bencénicos darán positiva. En general las reacciones coloridas nos ayudan a saber con que grupo funcional esta formada la proteína y así también de que aminoácido esta formado.

Las propiedades fisicoquímicas dependieron fundamentalmente del peso molecular de su carga eléctrica y de la conformación que adopte la molécula, por lo cuál se pueden interpretar los resultados de acuerdo a las características que se observen como por ejemplo la precipitación o turbidez que experimente la proteína en la reacción.

REFERENCIAS:

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[7] Morrison, R. T. Y Boyd, R. N.: Aminoácidos y Proteínas. En: Química Orgánica. 5ª ED. Pearson Educación, México, 1998. 1323 -1327[8] www.monografias.com[9] Anderson SC, Cockayne: Metabolismo de aminoácidos y afecciones relacionadas. En “Química Clínica”, 1ª ED. Interamericana McGraw-Hill, México D.F., 1995. 213– 221.[10]Cabanes J (1988): Propiedades químicas y separación de los aminoácidos. En Lozano JA, Tudela J (eds): “Prácticas de Bioquímica. Experimentación y Simulación”, 1ª Ed. Editorial Síntesis (Madrid, España), . 87–92.[11] Holde, M. V.: Bioquímica. 3ª ED. Pearson, España, 2004. 556-568[12] BOHINSKI. Bioquímica. 5ed., Pearson. México.1991. 1220-1232[13] http://www.pucmmsti.edu.do/ (7/09/07:12:52a.m.)[14] http://es.wikipedia.org/wiki/Case%C3%ADna (30/Ago/07: 1:16PM)[15] Badui, S. D.: Química de los alimentos 3ªed. Alambra Mexicana, México D.F: 2004.188-189[16] http://quimica.unp.edu.ar/grado/qa2/2003/caseina.htm(20/09/07:12:22p.m.)[17] http://ellaboratorio.275mb.com/practicas/bioquimica/reconocimiento_proteinas.doc[18] Causa E. y Pinto C. Floculación de aguas en plantas de Tratamiento En Investigación sobre procesos de coagulación”. Santiago, Chile, 1974.[19] Kemmer, F. y McCallion J. Manual del Agua. Su naturaleza, tratamiento y aplicaciones. Mc Graw Hill, USA, 1979. 24[20] Orten, M. J: Liquidos Organicos. En: Bioquímica Humana. Panamericana, Argentina, 1998. 405,407 [21] Murray, K. R; Granner, K. D: Nutricion. En: Bioquímica de Harper. Manual Moderno, Mexico DF, 1990. 750

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