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Sophie LEDRU
Relation formulation / propriétés Relation formulation / propriétés électrochimiques dans le développement d’un électrochimiques dans le développement d’un
biocapteur sérigraphié basé sur le transfert direct biocapteur sérigraphié basé sur le transfert direct d’électronsd’électrons
Travail réalisé sous la direction de
Mohammed BOUJTITA
28 Octobre 2005
2
Objectifs de cette étudeObjectifs de cette étude
Préparation de biocapteurs sérigraphiés adaptés à l’analyse par injection en flux continu
Introduction
Projet global:
Questions préliminaires:
Caractéristiques des encres conductrices ?
Transfert direct possible?
Utilisation en AIFC ?
3
Analyse par injection en flux continuAnalyse par injection en flux continu
Introduction
4
Analyse par injection en flux continuAnalyse par injection en flux continu
Introduction
Contraintes
Mise au point d’une cellule d’analyse adaptée
Optimisation des méthodes d’immobilisation des composants
Avantages
Analyse rapide et automatisable
Appareillage simple et peu coûteux
Technique dynamique
Détection ampérométrique
5
1. Les électrodes sérigraphiées
2. Caractérisation électrochimique du transducteur
3. Modification de l’encre par la HRP
4. Application à la détection du L-lactate
Plan de la présentationPlan de la présentation
1.1. Les électrodes sérigraphiéesLes électrodes sérigraphiées
2. Caractérisation électrochimique du transducteurCaractérisation électrochimique du transducteur
3. Modification de l’encre par la HRPModification de l’encre par la HRP
4. Application à la détection du Application à la détection du LL-lactate-lactate
6
La sérigraphie: principe généralLa sérigraphie: principe général
raclette
écran
substrat
Porte-substrat
Film imprimé
cadre
encre
1. Les électrodes sérigraphiées
7
DEK 245: Machine semi-automatiqueDEK 245: Machine semi-automatique
Pompe
Porte-substrat
Support écran
Raclette
1. Les électrodes sérigraphiées
8
Les électrodes sérigraphiéesLes électrodes sérigraphiées
Support
Contre Électrode
Électrode de Référence
Électrode Indicatrice
Couche Diélectrique
Électrodes prêtes à l’emploi jetables
Facilité d’utilisation
Production à grande échelle rapide et peu coûteuse
1. Les électrodes sérigraphiées
9
La cellule de détectionLa cellule de détection
1. Les électrodes sérigraphiées
Cellule de type « wall-jet »
entrée
sortie
10
Différentes configurations possiblesDifférentes configurations possibles
I II III
C
E
S
L
Albareda-Sirvent M., Merkoçi A., Alegret S. Sensors and Actuators B 69 (2000) 153-163
1. Les électrodes sérigraphiées
11
Encre biocompositeEncre biocomposite
Impression de l’électrode en une seule étape
Optimisation indispensable de la composition
Encre biocomposite
Particules conductrices Graphite
Enzyme
Peroxydase de raifort (HRP)
SolvantCyclohexanone
Polymère Acétate de cellulose
1. Les électrodes sérigraphiées
12
Plan de la présentationPlan de la présentation
1. Les électrodes sérigraphiéesLes électrodes sérigraphiées
2.2. Caractérisation électrochimique du transducteurCaractérisation électrochimique du transducteur
3. Modification de l’encre par la HRPModification de l’encre par la HRP
4. Application à la détection du Application à la détection du LL-lactate-lactate
13
Préparation de l’encre conductricePréparation de l’encre conductrice
Homogénéisation par malaxage mécanique
Vérification de la rhéologie (viscosité, stabilité,…)
Poudre de graphite + Liant = Encre
(27 %) (73 %)
2. Caractérisation électrochimique du transducteur
14
Conditions expérimentalesConditions expérimentales
• Voltampérométrie cyclique
• Spectroscopie d’impédance électrochimique
• Couple Fe(CN)63-/Fe(CN)6
4-
• Solution 1 ou 2 mM dans KCl 1 mol.L-1
• Encres de différentes compositions: 14, 23 ou 30 % de polymère
Acétate de cellulose (AC)
PVC
2. Caractérisation électrochimique du transducteur
15
Étude par voltampérométrie cyclique
AC 14% 23% 30%
103*k°(cm.s-1)
1,4 ± 0, 3 0,7 ± 0,1 0,4 ± 0,1
« Méthode de Nicholson »
Nicholson R. S. Analytical Chemistry 37 (1955) 1351-1355
ΔEp
vk°
Ψ = γα k° (πaDo)-1/2
γ = (Do/Dr)1/2 et a = nFv/RT
ΔEp > 60mV
-0,2 0,0 0,2 0,4 0,6
E/V vs. Ag/AgCl
Étude des cinétiques de transfert électroniqueÉtude des cinétiques de transfert électronique
2. Caractérisation électrochimique du transducteur
16
« Équation de Butler-Volmer »
0,24±0,060,38±0,10,55±0,09α
1,4 ± 0,31,3 ± 0,21,3 ± 0,3103*k°Butler-Volmer
Nicholson
30%23%14%AC
0,4 ± 0,10,7 ± 0,11,4 ± 0,3103*k°
Ipc = -0.027nFk°AC exp(- (αnF/RT).(Ep - Eθ’
c )
Ipc = -(3,01*105)n3/2 α1/2 ADo1/2v1/2C
α
Ak°
2. Caractérisation électrochimique du transducteur
Étude des cinétiques de transfert électroniqueÉtude des cinétiques de transfert électronique
17
« Équation de Butler-Volmer »
Ipc = -0.027nFk°AC exp(- (αnF/RT).(Ep - Eθ’
c )
Ipc = -(3,01*105)n3/2 α1/2 ADo1/2v1/2C
α
Ak°
2. Caractérisation électrochimique du transducteur
Étude des cinétiques de transfert électroniqueÉtude des cinétiques de transfert électronique
α 14% 23% 30%
AC 0,55±0,09 0,38±0,10 0,24±0,06
PVC 0,23±0,08 0,24±0,06 0,13±0,05
Limitation du transfert électronique par le polymère
A = 2,0 ± 0,4.10-2 cm2
k° = 1,5 ± 0,4.10-3 cm.s-1
18
Étude morphologique de la surface de l’électrodeÉtude morphologique de la surface de l’électrode
MEBÉlectrode sérigraphiée (AC 14%)
x 200Rugosité de la surface
CPE
n
1Z =Q jω
dcQ
Qjg
Rjg
Rm Qdc
Re(Z)/
0 10000 20000 30000 40000 50000
-Im
(Z)/
0
20000
40000
60000
80000
100000
120000
CA 14%CA 23%CA 30%
2. Caractérisation électrochimique du transducteur
19
Modélisation du comportement électrochimique de la surfaceModélisation du comportement électrochimique de la surface
χ² < 10-4
Qdc
Rtc Qdif
Circuit de Randles
Circuit proposé :
Qjg
Rjg
Rm
Qdc
Rtc
Qdif
Rdif
Masse de l’électrode
Surface et solution
2. Caractérisation électrochimique du transducteur
Re(Z) / k
0 2 4 6 8 10 12 14
-Im
(Z)
/ k
0
2
4
6
8
10
14% AC
20
Modélisation du comportement électrochimique de la surfaceModélisation du comportement électrochimique de la surface
Circuit proposé :
Qjg
Rjg
Rm
Qdc
Rtc
Qdif
Rdif
Masse de l’électrode
Surface et solution
2. Caractérisation électrochimique du transducteurRe(Z)/
0 5000 10000 15000 20000 25000 30000 35000
-Im
(Z)/
0
10000
20000
30000
40000
50000
0,25V0,2V0,1V
Re(Z)/
2000 2500 3000 3500 4000 4500 5000
-Im
(Z)/
0
1000
2000
3000
4000
5000
0,25V0,2V0,1V
21
1. Les électrodes sérigraphiéesLes électrodes sérigraphiées
2. Caractérisation électrochimique du transducteurCaractérisation électrochimique du transducteur
3.3. Modification de l’encre par la HRPModification de l’encre par la HRP
4. Application à la détection du Application à la détection du LL-lactate-lactate
Plan de la présentationPlan de la présentation
22
Système étudiéSystème étudié
HRP(red)H202
H20 HRP(ox)
I (nA)
Biocapteur de troisième génération
Transfert direct d’électrons
3. Modification de l’encre par la HRP
23
Préparation de l’encre modifiéePréparation de l’encre modifiée
Encre modifiée
Matériau conducteur: Carbone/graphite
=
Récepteur(s) biologique(s): Enzyme(s) (HRP, LOD,…)+Liant polymère +
« Encre standard »
3. Modification de l’encre par la HRP
0
100
200
300
400
500
600
700
800
0 200 400 600 800 1000
[H2O2]/µM
I/nA
Mode1
Mode2
0,5
0,6
0,7
0,8
0,9
1,0
0 5 10 15 20
Nombre d'injections
I/I0
Mode1
Mode20
100
200
300
400
500
600
700
800
0 200 400 600 800 1000
[H2O2]/µM
I/nA
Mode1
Mode2
0,5
0,6
0,7
0,8
0,9
1,0
0 5 10 15 20
Nombre d'injections
I/I0
Mode1
Mode2
« Poudre modifiée »
24
25 nA
5 min
60
Détection de H2O2 (µmol.L-1) à 0 V vs. Ag/AgCl
30
Utilisation en AIFC Utilisation en AIFC
3. Modification de l’encre par la HRP
20012,5 nA
5 min
50
100
20012,5 nA
5 min
12,5 nA
5 min
50
100
25
Fonctionnement de l’électrode enzymatique
3. Modification de l’encre par la HRP
26
Transfert direct HRP / graphiteTransfert direct HRP / graphite
Vitesse de balayage 20 mV/s
Tampon Phosphate 0,1M pH 7,2
+ 0,1M KCl
3. Modification de l’encre par la HRP
E / V vs. Ag/AgCl
-0,8 -0,6 -0,4 -0,2 0,0 0,2 0,4
I / µ
A
-10
-8
-6
-4
-2
0
2
4
6
8
Ledru S., Boujtita M. Bioelectrochem. 2004 64 71-78 E°’= -0,17 ± 0,05 V vs. Ag/AgCl
Étude similaire pour la pâte de carbone:
Couple de la HRP
Hème- Fe(III) / Hème-Fe(II)
E°’= -0,16 ± 0,04 V vs. Ag/AgCl
27
E / V vs. Ag/AgCl
-0,3 -0,2 -0,1 0,0 0,1 0,2 0,3 0,40
100
200
300
400
Mécanismes électrocatalytiquesMécanismes électrocatalytiques
Voltamogramme hydrodynamique
H2O2
H2O
2e-
ks
k1
3+ 4+12 2 2
4+ + - 4+2
4+ + - 3+32
HRP native (Fe ) + H O Composé-I (Fe =O; )+ H O
Composé-I (Fe =O; ) + H + Composé-II (Fe =O; )
Composé-II (Fe =O; ) + H + HRP native (Fe ) + H O
k
k
k
e
e
3. Modification de l’encre par la HRP
283. Modification de l’encre par la HRP
Mécanismes électrocatalytiquesMécanismes électrocatalytiques
Vitesse de balayage: 20 mV/s
Tampon phosphate désoxygéné 0,1M pH 7,2 + 0,1M KCl
E/V vs. Ag/AgCl
-0.8 -0.6 -0.4 -0.2 0.0 0.2 0.4
I/µA
-60
-50
-40
-30
-20
-10
0
10
H2O2
TPE / V vs. Ag/AgCl
-0,3 -0,2 -0,1 0,0 0,1 0,2 0,3 0,4
-I / n
A
0
100
200
300
400
29
E/V vs. Ag/AgCl
-0,8 -0,6 -0,4 -0,2 0,0 0,2 0,4
I/µA
-30
-25
-20
-15
-10
-5
0
5
10
Mécanisme proposé
2 2 2
2 2 2
-
2 2
- +2 2 2
HRP-Fe(III) + H O Composé I + H O
Composé I + H O HRP-Fe(III) + O
HRP-Fe(III) + HRP-Fe(II)
HRP-Fe(II) + O HRP-Fe(II)-O
HRP-Fe(II)-O + 2 + 2H HRP-Fe(II) + H O
e
e
R. Huang et N. Hu Bioelectrochem., 2001, 54 75-81
3. Modification de l’encre par la HRP
Mécanismes électrocatalytiquesMécanismes électrocatalytiques
E/V vs. Ag/AgCl
-0.8 -0.6 -0.4 -0.2 0.0 0.2 0.4
I/µA
-60
-50
-40
-30
-20
-10
0
10
O2
TP
H2O2
TP
30
Optimisation de l’encre biocomposite
3. Modification de l’encre par la HRP
31
Influence du polymèreInfluence du polymère
Acétate de cellulose (AC) ou PVC
14%, 23% ou 30%
[H2O2] / µmol.L-1
0 200 400 600 800 1000 1200I/
nA
0
200
400
600
800 AC
PVC
[H2O2] / µmol.L-1
0 200 400 600 800 1000 1200
I/n
A
0
200
400
600
80014%
23%
30%
sensibilité
linéarité
Limitation de la diffusion
3. Modification de l’encre par la HRP
AC
32
Influence du solvant organiqueInfluence du solvant organique
Influence du solvant sur l’adsorption
HRP
Mélange au solvantSéchage
Électrode de référence
Mélange au solvantSéchage
Adsorption sur le graphite
Électrode “ avant adsorption”
Électrode“après adsorption”
Malaxage avec l’huile de paraffine
81,8 8,6% 46,5 5,8 %
Électrodes à pâte de carbone
100 %
/nm
250 300 350 400 450 500 550
DC
-6
-4
-2
0
2
4
6
8
10
12
14
HRP native HRP-CH
3. Modification de l’encre par la HRP
33
Modification chimique de la HRPModification chimique de la HRP
• Comment ? Oxydation par le NaIO4
(Formation de fonctions aldéhydes par oxydation des résidus glucidiques)
• Pourquoi ? Couplage avec la LOD (lactate oxydase)
• Diminution de l’activité enzymatique en solution
[H2O2]/µmol.L-1
0 200 400 600 800 1000 1200
I/n
A
0
200
400
600
800
1000
Nombre d'injections
0 20 40 60 80 100
100*
(I/I
0)
50
60
70
80
90
100
HRP native
HRP oxydée
3. Modification de l’encre par la HRP
34
Étude quantitative du transfert direct d’électrons Étude quantitative du transfert direct d’électrons
Théorie de « Koutecky-Levich » adaptée à l’AIFC
[H2O2]-1 / µM-1
0.00 0.05 0.10 0.15 0.20 0.25 0.30
I cin
-1 /
nA
-1
0.00
0.01
0.02
0.03
0.04
0.05
0.06
Pente (Med)
Pente (TDE)=
HRP en TDE
HRP totale
TDE
Médiateur
A. Lindgren, F.-D. Munteanu, I. G. Gazaryan, T. Ruzgas, L. Gorton, J. Electroanal. Chem., 1998, 458 113-120
Ordonnée à l’origine
1/Ilim = f (V-3/4)
1/Icin
TDE 1 11 1
1 2 2k H O kI nFE skin DET
Med 1 11 1
2 1 2 2 3 21 k H O k AHI n FEkin
2 /3 5/12 3/ 4 1/ 2 3/ 41.38lim 2 2I nF H O D V a R
3. Modification de l’encre par la HRP
35
47 ± 119 ± 1ΓHRP totale (pmol.cm-2)
17 ± 111 ± 1ΓHRP TDE (pmol.cm-2)
36 ± 558 ± 5% de HRP en TDE
HRP oxydéeHRP native
Constante de vitesse relative au TDE:
ks ≈ 3 s-1
*A. M. Azevedo, V. Vojinovic, J. M. S. Cabral, T. D. Gibson, L. P. Fonseca, J. Mol. Cat. B, 2004, 28 121-128
Formation de dimères* de la HRP avant l’adsorption
3. Modification de l’encre par la HRP
Modification chimique de la HRPModification chimique de la HRP
Hypothèses: k1(nat) = 1,3.105 s-1.mol-1.L ; k1(ox) = 0,8 . k1(nat) = 1,04.105 s-1.mol-1.L
A = 0,0314 cm2
S. Ledru, N. Ruillé, M. Boujtita, Biosens. Bioelectron., 2005, sous presse
36
Plan de la présentationPlan de la présentation
1. Les électrodes sérigraphiéesLes électrodes sérigraphiées
2. Caractérisation électrochimique du transducteurCaractérisation électrochimique du transducteur
3. Modification de l’encre par la HRPModification de l’encre par la HRP
4.4. Application à la détection du Application à la détection du LL-lactate-lactate
37
Système étudiéSystème étudié
Électrode sérigraphiée bienzymatique
4. Application à la détection du L-lactate
L-lactate
Pyruvate
LODox
LODred
H2O2
O2+ 2H+
2H2O HRPox
HRPred2e-L-lactate
Pyruvate
LODox
LODred
H2O2
O2+ 2H+
2H2O HRPox
HRPred2e-
38
Plan d’expériencesPlan d’expériences
Choix des paramètres à étudier:
Critères d’optimisation:
Sensibilité
Zone de linéarité
4. Application à la détection du L-lactate
OuiNonOxydation de la HRP
2314AC (% )
3,52,4LOD (U/mg)
Niveau haut (+)Niveau bas (-)Paramètre
OuiNonOxydation de la HRP
2314AC (% )
3,52,4LOD (U/mg)
Niveau haut (+)Niveau bas (-)Paramètre
39
Plan d’expériencesPlan d’expériences
Essais1
LOD2
AC3
Oxydation1-2 1-3 2-3 1-2-3
Sensibilité(nA.mol.L-1)
Linéarité (µmol.L-1)
1 - - - + + + - 1,30 (0,46) 8 - 76 68 (26)
2 + - - - - + + 0,70 (0,24) 5 - 40 35 (17)
3 - + - - + - + 0,73 (0,23) 5 - 73 68 (68)
4 + + - + - - - 0,62 (0,21) 7 - 117 110 (56)
5 - - + + - - + 0,87 (0,07) 10 - 180 170 (28)
6 + - + - + - - 0,88 (0,01) 17 - 147 130 (51)
7 - + + - - + - 0,27 (0,01) 30 - 195 165 (21)
8 + + + + + + + 0,37 (0,01) 20 - 250 230 (71)
Effets E1 E2 E3 E12 E13 E23 E123
4. Application à la détection du L-lactate
2,4 U de LOD / mg ; 14 % d’AC;
Oxydation de la HRP
négatif positif
40
ValidationValidation
Courbe de corrélation (UV = Méthode de référence)
4. Application à la détection du L-lactate
[lactate] par UV / mmol.L-1
0,00 0,05 0,10 0,15 0,20 0,25
[lac
tate
] p
ar A
IFC
/ m
mo
l.L-1
0,00
0,05
0,10
0,15
0,20
0,25
y = 1,10x + 0,005
Solutions standards
41
ValidationValidation
Echantillons réels (UV = Méthode de référence)
4. Application à la détection du L-lactate
Produits laitiers(riches en lactate)
Yaourt fruits
Crême café
Yaourt rhubarbe
Fromage blanc
Yaourt nature
Yaourt aux fruitsYaourt noix
[L-l
ac
tate
] /
mm
ol.
L-1
0
20
40
60
80
100
120
140
160
UVAIFC
42
ValidationValidation
Echantillons réels (UV = Méthode de référence)
4. Application à la détection du L-lactate
Produits à base de tomates(pauvres en lactate)
[L-lactate] ajoutée /µM
0 20 40 60 80 100 120 140 160 180 200 220
[L-la
ctat
e] r
etro
uvée
/µM
0
20
40
60
80
100
120
140
160
180
200
220
soupe à la tomatecoulis de tomates
43
E/V vs. Ag/AgCl
-0,2 0,0 0,2 0,4 0,6 0,8
I/ nA
0
200
400
600
800
1000
ES nueHRP-ES LOD/HRP-ES
Interférences à la détection du lactateInterférences à la détection du lactate
Interférent modèle: l’acide ascorbique
4. Application à la détection du L-lactate
Voltamogramme hydrodynamique
(Acide ascorbique ) )
Réduction
AL 1:0
AA 0:1
1:0,5
1:2
1:1
44
Mécanisme des interférencesMécanisme des interférences
4. Application à la détection du L-lactate
E / V vs. Ag/AgCl
-0,8 -0,6 -0,4 -0,2 0,0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0
I / µ
A
-40
-20
0
20
40
60
Oxydation catalytique
P. Ugo, V. Zangrando, L. M. Moretto, B. Brunetti, Biosens. Bioelectron., 2002, 17 479-487
S. Ledru, M. Boujtita, Bioelectrochem., 2004, 64 71-78
Mécanisme EC’
[HRP-Fe(II)](n-1)+ → [HRP-Fe(III)]n+ + e-
[HRP-Fe(III)]n+ + Asc- → [HRP-Fe(II)](n-1)+ + P
AA / ES nue
AA / HRP-ES
TP / HRP-ES
45
ConclusionsConclusions
• Cinétiques de transfert électronique influencées par le liant polymère
• Transfert direct d’électrons entre le graphite et la HRP immobilisée– Mise en évidence du couple hème-Fe(III) / hème-Fe(II)
– Augmentation de la quantité de HRP en TDE par oxydation
• Influence des composants de l’encre sur les propriétés du biocapteur– Limitation de la diffusion du substrat par le polymère
– Désorption de la HRP due à la présence d’un solvant organique
• Application à la préparation d’une électrode bienzymatique– Méthode validée pour les produits laitiers
– Problème d’interférences avec l’acide ascorbique pour les produits pauvres en L-lactate
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PerspectivesPerspectives
• Poursuivre les études en impédance
• Caractériser la rhéologie des encres
• Etudier l’effet de l’oxydation sur l’activité de la HRP
• Comprendre l’influence du solvant
• Augmenter la stabilité de stockage des électrodes modifiées par la HRP
• Résoudre le problème des interférences
• Adapter le procédé à la détection d’autres analytes
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RemerciementsRemerciements
• Dr F. Fleury (Université de Nantes)
• Dr C. Cougnon (Université du Maine)
• N. Ruillé
• F. Ghamouss
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Merci pour votre attention