ESPECTROSCOPÍA 2D DE CORRELACIÓN

HETERONUCLEAR

José Adrian Gavín Sazatornil Instituto Universitario de Bio-Orgánica IUBO “Antonio González”

Departamento Química Orgánica, Universidad de La Laguna Avda. Astrofísico F. Sanchez 2, 38296 La Laguna (Tenerife),

jgavin@ull.es

1. INTRODUCCION

Debido a la mayor dispersión en sus desplazamientos químicos, los espectros de 13C y

15N presentan en general una mejor dispersión que los correspondientes espectros de 1H. Este hecho puede ser explotado a través de la realización de experimentos 2D de correlación heteronuclear. Aunque en este capítulo estudiaremos fundamentalmente la espectroscopia 2D heteronuclear 1H-13C, podríamos hacerla extensiva a correlaciones 1H-15N, 31P-13C y otros.

Existe una amplia variedad de métodos, como los basados en eco de espín o en

transferencia de polarización, que permiten editar un espectro 1D del espín heteronuclear X, y que suministran información sobre el número de H unidos al heteroátomo (INEPT, DEPT). Sin embargo estos métodos no aportan evidencias directas, por ejemplo, de qué protones están unidos a cada carbono en una molécula.

El problema de la asignación ha sido simplificado de manera importante gracias a la

espectroscopia de correlación heteronuclear 2D, en la cual las dos coordenadas de cada resonancia son los desplazamientos químicos de un protón y del carbono enlazado directamente a él (o a 2,3 enlaces).

Históricamente los primeros experimentos de correlación heteronuclear que se

desarrollaron fueron los llamados de detección directa del heteroátomo [1-4] y fue sólo a principios de los 80 cuando se empezaron a realizar los llamados de detección inversa [5-8] que van a constituir el objeto de esta lección.

156 José A. Gavin

2. SENSIBILIDAD

Como indicamos más arriba, los métodos originales para determinar las correlaciones heteronucleares, estaban basados en la observación del núcleo X (γ más pequeña), mientras el 1H era detectado indirectamente y aparecía en la dimensión f1 del experimento 2D. Esta aproximación fue adoptada porque, las secuencias originales 2D eran derivadas de experimentos anteriores, del tipo de transferencia de polarización, como el INEPT, que habían sido diseñados a su vez para aumentar la sensibilidad en la observación de los núcleos de γ más baja. Además, los primeros instrumentos de RMN de pulsos fueron diseñados con este modelo. Durante los últimos años, la aproximación a la recogida de datos ha cambiado en el sentido de que el núcleo de mayor valor de γ, frecuentemente 1H, es el observado, mientras X es detectado indirectamente. Es lo que se conoce con el nombre de experimentos de “detección inversa”. La motivación de este cambio ha sido el aumento de sensibilidad asociado a él.

La dependencia de la fuerza de una señal con su relación giromagnética, γ, es bien conocida y el concepto de transferencia de polarización fue introducido como un medio de aumentar la sensibilidad. La expresión formal siguiente, para la relación S/N de un experimento 1D que implica núcleos con espín =1/2, cuantifica este hecho.

S/N ∝ N A T-1 B 0 3/2 γexc γobs 3/2 T*

2 (ns)1/2

N es el número de moléculas en el volumen de muestra analizada, A es un término que representa la abundancia de los espines activos en RMN presentes en el experimento, T es la temperatura, B0 es el campo magnético estático, γexc y γobs representan las relaciones giromagnéticas de los espines inicialmente excitados y observados, respectivamente, T*

2 es el tiempo de relajación transversal efectivo y ns el número total de escanes acumulados. De una manera aproximada y para un experimento concreto: S/N ∝ γexc γobs 3/2

Cuando elegimos cómo llevar a cabo un experimento de correlación heteronuclear, podemos contemplar las siguientes opciones, ver figura 1, teniendo en cuenta cuál sea el núcleo “excitado” y cuál el “observado”.

Sensibilidad relativa

1H-31P 1H-13C 1H-15N

1 1 1

a) b) 2.5 4 10

Tradicional

c) 4 8 30

10 32 300

1H

X

1H

X

X

X

1H

1H

t1

t1

t1

t1

t2

t2

t2

t2

P E M D

d)

Inverso

Figura 1. Esquemas generales para la obtención de espectros 2D de correlación heteronuclear P= preparación E= evolución M= mezcla D= detección

Espectroscopía 2D de correlación heteronuclear 157

El esquema 1b representa la aproximación adoptada en los experimentos tradicionales

de correlación (detección directa), en los cuales la magnetización inicial de protón es “marcada con su frecuencia” durante t1 y luego es transferida a X para su detección. El esquema 1d representa la aproximación moderna (detección inversa) en la cual el núcleo de protón es usado como “origen” y como “detectado”. Claramente se observa que la sensibilidad predicha es bastante más grande que la del método tradicional, y la dependencia con la relación giromagnética del núcleo de menor γ, ha sido completamente eliminada, aunque la abundancia natural de dicho núcleo sigue siendo un factor importante en dicha opción (término A de la ecuación anterior). Cuanto más bajo es el valor de γ de X, mayor es la ganancia obtenida con la detección de 1H. Ganancias adicionales con un factor de 2 ó 3 pueden ser anticipadas para grupos CH2 o CH3 respectivamente.

Los aumentos de sensibilidad mostrados para los métodos inversos frente a los

directos, pueden no ser alcanzados en la práctica cuando se consideran los detalles de cada secuencia en particular. Sin embargo, y teniendo en cuenta que una ganancia por un factor de 4 en un experimento de correlación 1H-13C corresponde a una ganancia en tiempo por un factor de 16, experimentos que necesitaban 1 noche con detección directa de X, pueden realizarse en alrededor de 1 hora con detección de 1H . Tales consideraciones han conducido a la adopción casi generalizada de experimentos de detección inversa de protón siempre que sea posible.

La elección de esta aproximación ha tenido consecuencias en el diseño de los equipos de RMN. Las sondas convencionales eran construidas para optimizar la sensibilidad en la observación del núcleo de γ más baja, lo que implicaba colocar la bobina de dicho núcleo más cerca de la muestra y colocar la bobina de protón más alejada. Las sondas de detección inversa presentan la disposición opuesta proporcionando un mayor “factor de llenado”. Sin embargo, incluso con sondas convencionales, podemos realizar experimentos con detección de 1H, aunque no con una sensibilidad óptima, pero siempre mayor que la que corresponde a los experimentos de detección de X.

3. ESPECTROSCOPIA DE DETECCION INVERSA. CORRELACIONES A UN ENLACE

Hay dos técnicas de amplio uso que proporcionan correlaciones heteronucleares a un

enlace y que son conocidas coloquialmente como HMQC y HSQC. Los datos de correlación proporcionados por los dos métodos son esencialmente equivalentes y para la espectroscopia de rutina son poco relevantes. Debido a esto, los dos aparecen con una frecuencia parecida en la literatura química. A nivel práctico, el experimento HMQC tiende a ser más robusto con respecto a imperfecciones experimentales o a fallos de calibración, mientras que el HSQC tiene características más favorables para trabajos en los que se requiere una alta resolución y es más flexible con respecto a modificaciones de la secuencia, lo que ha extendido su uso en los laboratorios químicos. Las dos técnicas emplean la aproximación de establecer las correlaciones vía detección de 1H como se indica en la figura 1d. Sin embargo, esta aproximación plantea una serie de dificultades técnicas relacionadas con la supresión de las señales principales correspondientes a los protones unidos a heteroátomos de I ≠ 1/2 como 12C y 14N. Estas señales son las dominantes en un espectro de protón 1D pero constituyen una fuente de interferencias en las correlaciones heteronucleares, ya que sólo los satélites de baja intensidad pueden dar origen a dichas correlaciones, esto es, 1H-13C y 1H-15N en nuestro caso. La necesaria supresión es actualmente realizada con gran efectividad mediante la aplicación

158 José A. Gavin

de gradientes de campo magnético (PFG), que tienen un impacto enorme en particular en la espectroscopia de correlación heteronuclear. 3.1. Correlación heteronuclear múltiple cuántica (HMQC)

El experimento HMQC en uno de los más utilizados en los experimentos de correlación

heteronuclear a un enlace con detección de protón. Aunque fue sugerido hace muchos años [6,8], su uso no se hizo extensivo hasta que se presentó un esquema [9] que resolvía las dificultades técnicas asociadas a la observación de protón. Desde entonces, y en particular desde la llegada de los gradientes [10], la técnica de la detección inversa ha pasado a dominar la espectroscopia RMN orgánica. 3.1.1. La secuencia HMQC

La secuencia básica HMQC es bastante sencilla y sólo consta de 4 pulsos de

radiofrecuencia, rf, que aparecen representados en la figura 2. La secuencia comienza con la excitación del protón seguida de la evolución de su magnetización bajo la influencia del acoplamiento 1JCH. Durante un período ∆, de aproximadamente 3.3 ms, se desarrolla una magnetización en antifase de 1H con respecto a 1JCH. Como en el caso del INEPT, esta magnetización en antifase puede ser transferida al carbono unido a él gracias a la acción de un pulso de 13C cuyo objetivo es además el de generar coherencia múltiple-cuántica protón-carbono (de aquí el nombre del experimento).

+1

-1

0

+1

-1

0

+1

-1

0

+1

-1

0

+1

0

-1

Desacoplar

1H

X

1H

X

p=

p=

X X

XX±

∆ ∆

t1

X±

Esta coherencia es una mezcla de magnetización transversal de los espines acoplados, en este caso un protón y el carbono directamente unido a él, que evoluciona coherentemente pero que no puede ser observada directamente. Si uno quisiera comenzar a recoger datos en ese instante no aparecería señal, siempre que ∆ fuera igual a 1/2 JCH.

Figura 2. Secuencia HMQC y camino de transferencia de coherencia (CTC) asociado. El período ∆=1/2JCH provoca el desfase y reenfoque posterior del acoplamiento heteronuclear.

Esta coherencia es, de hecho, una combinación de coherencias de orden cero y orden dos, como aparece representado en la ruta de transferencia de coherencia de la figura 2. Así, por ejemplo, 1Hp = +1 y 13Cp = +1 corresponde a una coherencia de orden dos (Σp=2), mientras que 1Hp = +1 y 13Cp = -1 es una coherencia de orden cero (Σp=0). El punto importante en este estadio es cómo evoluciona la coherencia durante el período t1. Ya que contiene términos de magnetización transversal de los dos núcleos, evolucionará bajo la influencia de los desplazamientos químicos de ambos (aunque un rasgo importante de la

Espectroscopía 2D de correlación heteronuclear 159

coherencia múltiple cuántica es que no evoluciona bajo el acoplamiento activo, de tal forma que no lo consideraremos en este punto). Lo que se requiere es que la frecuencia esté “marcada” solamente con el desplazamiento de 13C, ya que esto es lo que se quiere caracterizar en la dimensión indirecta f1. Para eliminar el efecto del desplazamiento de protón durante t1, se incorpora un eco de espín colocando una impulsión de 180º de 1H en el centro de t1. De esta forma al final del período de evolución los desplazamientos de 1H son reenfocados y por tanto no tienen influencia en f1. La evolución de los δ del 13C no se ve afectada por dicha impulsión de 1H con lo que se mantiene el “marcaje” reseñado. La impulsión final de 13C convierte la coherencia múltiple-cuántica en magnetización observable simple cuanto de protón que aparece de nuevo en antifase respecto a 1JCH. Cuando detectamos la FID del protón es aconsejable aplicar un desacoplamiento de los espines de 13C para eliminar la estructura fina del doblete de 1JCH, aumentando de esa forma la relación señal/ruido. Para evitar la cancelación de los satélites de protón en antifase, se inserta un 2º período ∆ para reenfocar el acoplamiento 1H-13C, después de lo cual se detecta la señal de 1H. La detección convencional en cuadratura en f1 es implementada incrementando la fase de la impulsión de 13C anterior a t1, de acuerdo con los métodos States o TPPI para obtener un espectro sensible a la fase. El resultado es un espectro bidimensional con los δde protón representado en f2, los de 13C en f1 y los picos cruzados indicando las conectividades a un enlace. Aunque la secuencia HMQC (y HSQC) detecta nominalmente las correlaciones a un enlace, en circunstancias excepcionales algunas de estas puede desaparecer y aparecer las correlaciones a mayor distancia. Esto ocurre cuando la J implicada en ese caso está lejos del valor asumido cuando se calcula ∆, una situación probable en alquinos donde las J a uno y dos enlaces son inusualmente grandes. Un acoplamiento a dos enlaces (>50Hz) puede ser suficiente para producir un pico de correlación, y hay que tener cuidado para no confundirlo con una correlación a un enlace. 3.1.2. Influencia del acoplamiento homonuclear de protón

Como se indica más arriba, evolucionará con su desplazamiento químico durante el

período ∆ que sigue al primer pulso. Sin embargo, se produce el reenfoque durante el segundo período ∆ debido a la presencia de un eco de espín, lo que evita la aparición de errores de fase en la dimensión f2. Más importante es la evolución de la magnetización de protón en los dos períodos señalados y de la coherencia múltiple cuántica heteronuclear durante t1, bajo la influencia del acoplamiento H, H. Ya que dichos acoplamientos no son reenfocados por el eco de espín, evolucionarán durante ambos períodos y potencialmente contribuirán a la presencia de errores de fase no deseados en la dimensión protón. Sin embargo, ∆ es fijado de acuerdo con 1JCH que es al menos un orden de magnitud mayor que JHH, de tal forma que en la práctica el grado de evolución debido al acoplamiento H, H es muy pequeño. En otras palabras ∆ es demasiado pequeña para que pueda producirse una evolución significativa y los errores de fase que puedan originarse son de poca importancia (como veremos más adelante, no ocurre lo mismo en los experimentos de correlación heteronuclear a larga distancia, HMBC, donde los valores de las constantes de acoplamiento 3JCH y 3JHH son parecidas). Por el contrario, la coherencia múltiple cuántica evoluciona durante t1 bajo el acoplamiento “pasivo” JHH que no es reenfocado lo que hace que la resonancia final de carbono se ve ensanchada por el acoplamiento protón-protón a lo largo de f1. Esto puede parecer raro, pero es una consecuencia del hecho que durante t1 evolucionan las coherencias de 1H y 13C; el eco de espín elimina la evolución con el desplazamiento químico pero no con J. De hecho, debido a la baja resolución digital utilizada en la dimensión 13C, estos acoplamientos de protón raramente se resuelven, pero contribuyen a un ensanchamiento no deseado de la resonancia a

160 José A. Gavin

lo largo de f1. Estos acoplamientos homonucleares no aparecen en la dimensión f1 del HSQC siendo este rasgo la principal diferencia entre ambos experimentos. 3.1.3. Utilización del formalismo del operador producto

El primer pulso de 1H crea magnetización transversal de 1H, -Iy, como en la ecuación (1). Durante el período ∆ se crea magnetización en antifase 2IxSz. Ya que ∆ = 1/2JCH el término coseno se anula y el seno se hace igual a 1. El término 2 hace referencia a la existencia de un sistema acoplado (1) y puede ser suprimido para simplificar la representación. El primer pulso de 90º de 13C transforma la magnetización en antifase en magnetización de orden dos, –IxSy, como en la ecuación (2). Durante el período t1 este término evoluciona con el desplazamiento químico de 13C como en (3). El δ de protón y la JHH también evolucionan durante t1. El primero es eliminado por el pulso de 180º. Además dicho pulso intercambia los términos doble cuanta y cero cuanta.

El último pulso de 13C transforma la magnetización de orden dos en magnetización de

orden uno en antifase. El período siguiente ∆=1/21JCH es insertado para reenfocar el acoplamiento 1H-13C (4). Durante la adquisición, y puesto que el desacoplador está encendido, dicha magnetización evoluciona con el δ del protón, dando lugar a una señal modulada por Ωs durante t1 y por ΩI durante t2. Iz → Ix90 -Iy → ∆Π IzSzJ 2IxSz (1) IxSz → Sx90 -IxSy (2) -IxSy →Ω Szst1 -IxSy cos Ωs t1 + IxSx sen Ωs t1 (3) -IxSy cos Ωs t1 + IxSx sen Ωs t1 → Sx90 -IxSz cos Ωs t1 + IxSx sen Ωs t1 → ∆Π IzSzJ -Iy cos Ωs t1 (4) 3.1.4. Eliminación de las señales de 1H-12C y 1H-14N

Cuando se registra la FID del HMQC, todos los protones inducirán señal en el receptor en cada escan y las señales no deseadas, que son las mayoritarias, deben ser eliminadas con un ciclado de fase adecuado si queremos observar los picos de correlación (con excepción del caso en el que se usan los gradientes para realizar tal selección). Invirtiendo el primer pulso de 13C en escanes alternos, la fase de los satélites de 13C es también invertida, mientras que la de los protones enlazados a 12C no varía. La inversión simultánea de la fase del receptor conducirá a la cancelación de las señales no deseadas con la correspondiente suma de los satélites deseados. Este proceso en dos etapas es el ciclado de fase fundamental del HMQC. Secuencia BIRD-HMQC En el caso de los espectrómetros de RMN que carecen de unidad de gradientes, es posible también eliminar las señales antes citadas. En dichos casos se utiliza un esquema alternativo para conseguir dichos fines. La secuencia BIRD (bilinear rotation decoupling) permite la eliminación de las señales 1H-12C antes de la aplicación de la secuencia HMQC, mediante un ingenioso esquema de presaturación [11]. Además, el desacoplamiento durante la adquisición de los núcleos de 13C con la técnica GARP mejora la relación S/N (figura 3).

Espectroscopía 2D de correlación heteronuclear 161

Desacoplar

1H

X

X X

X Xt1

X

X∆ ∆ ∆∆ ∆ τ

El período τ del bloque BIRD tiene que ser optimizado (minimizando la FID obtenida) y suele ser de alrededor de 1s.

Figura 3. Secuencia HMQC precedida del bloque BIRD ∆ = 1/2JCH Selección mediante la utilización de gradientes La aproximación más reciente y además la más efectiva consiste en la incorporación de gradientes de campo magnético (PFG) en las secuencias correspondientes [10,12]. Con un sólo escan es posible obtener fácilmente relaciones de atenuación de 1000:1. Esto implica la supresión de las señales 1H-12C ó 1H-14N.

+1

-1

0

+1

-1

0

+1

-1

0

+1

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0

+1

0

-1

Desacoplar

1H

X

1H

X

p=

p=

X X

XX

∆ ∆

t1

G1 G2 G3

Gz

Figura 4. Secuencia del experimento HMQC, con gradientes, en modo absoluto

El ciclado de fases no es esencial ya que la selección de la señal se obtiene gracias al reenfoque de ésta mediante el uso de gradientes. La secuencia con gradientes opera empleando una combinación adecuada de gradientes que reenfoca sólo aquellas respuestas que han seguido el camino de transferencia de coherencia (CTC) deseado. El esquema de la figura 4 es deseable para la obtención de un espectro en modo absoluto ya que selecciona únicamente un CTC de 13C durante t1 (preferentemente el eco o tipo-N), y por tanto proporciona detección en cuadratura en f1 directamente.

Para seleccionar esta ruta, la fase total inducida por los gradientes debe ser igual a

cero: G1 (γH + γC) + G2 (- γH + γC) + G3 (-γH) = 0

Teniendo en cuenta que la relación (γH / γC) = 4 la ecuación anterior queda simplificada a: G1 x (5) + G2 x (-3) + G3 x (-4) = 0

Existen toda una serie de relaciones de gradientes que satisfacen esta expresión y conducen a la selección de la señal deseada 2:2:1, 5:3:4, ó 3:5:0.

162 José A. Gavin

La elección óptima, en presencia de varias imperfecciones experimentales, ha sido considerada en detalle [13] y los autores recomiendan el uso de gradientes en la proporción 3:5:0 (sólo dos gradientes). Esta aproximación en valor absoluto, requiere un procesado en magnitud lo que lo convierte en experimento estándar para la obtención de espectros de rutina cuando la resolución y la sensibilidad no son críticas.

Para obtener un espectro sensible a la fase, es necesario conservar los dos caminos N y

P de X durante t1. Esto es imposible con un sólo escan si se aplican gradientes durante t1, ya que no hay ninguna combinación de gradientes que pueda reenfocar simultáneamente señales de los dos caminos +1 y –1. Hay dos aproximaciones básicas para superar esta limitación que consiste en evitar el uso de gradientes durante t1 [14,15] permitiendo usar los métodos convencionales de detección en cuadratura SHR o TPPI, o recoger las señales de tipo-P y N en escanes alternativos, combinando esto con el método de procesado eco-antieco [16-18].

+1

-1

0

+1

-1

0

+1

-1

0

+1

-1

0

+1

0

-1

Desacoplar

1H

X

1H

X

p=

p=

X X

XX

∆ ∆

t1

G1 G2 G3

Gz

XX

δ δ δδ

P

N

P

N

Figura 5. Secuencia HMQC, con gradientes, sensible a la fase, vía el método eco-antieco

Para obtener espectros en fase pura es necesario reenfocar la evolución con el desplazamiento químico de X durante la aplicación de los gradientes. Para ello se adicionan dos ecos de espín enmarcando el período t1. La selección de los dos caminos se realiza invirtiendo el signo del último gradiente y por ejemplo, la señal de tipo-N es reenfocada con 2:2:-1 y la de tipo-P con 2:2:1.

3.2. Correlación heteronuclear simple cuanto HSQC

El experimento de correlación heteronuclear HSQC [7] sigue el esquema general del HMQC pero se diferencia de éste en que durante t1 sólo hay evolución de magnetización trasversal de orden uno de X, en lugar de la coherencia múltiple-cuántica 1H-X. Esta magnetización heteronuclear trasversal es generada por transferencia de polarización desde el protón unido al carbono vía INEPT, como sucede en la secuencia 1D. La magnetización del núcleo X evoluciona durante t1, mientras que el pulso de 180º de protón reenfoca la evolución con el acoplamiento 1H-X lo que hace que sólo haya evolución del desplazamiento químico de X durante t1. Después del período de evolución variable t1 la magnetización transversal de 13C es transferida de nuevo al protón vía un bloque retroINEPT, lo que produce magnetización de protón en fase que puede ser detectada en presencia de un desacoplamiento de carbono.

Espectroscopía 2D de correlación heteronuclear 163

+1

-1

0

+1

-1

0

+1

-1

0

+1

-1

0

+1

0

-1

Desacoplar

1H

X

1H

X

p=

p=

X X

XX± t1

X± Y

X

X

X

X X∆/2∆/2 ∆/2 ∆/2

Figura 6. Experimento HSQC y CTC asociado. El período ∆/2 =1/41JCH

El ciclado de fase básico en dos etapas es análogo al del HMQC que requiere inversión del primer pulso de 90º de X con inversión simultánea del receptor. El resultado final es la aparición de correlaciones protón-carbono como las del HMQC. Los picos de correlación no contienen sin embargo la evolución del acoplamiento homonuclear H-H a lo largo de t1. Estos resultados aumentan la resolución en la dimensión f1 que es la principal ventaja del HSQC sobre el HMQC en moléculas pequeñas.

En general y en este tipo de moléculas no suele haber problemas de poca dispersión en

las señales de 13C y cualquiera de las dos aproximaciones es buena. La principal desventaja del HSQC frente al HMQC es el mayor número de pulsos que utiliza, especialmente pulsos de 180º del heteroátomo, lo que provoca pérdidas de intensidad debido a inhomogeneidades en rf, mala calibración de los pulsos o excitación off-resonance. Esto tiene mayor importancia para 13C que para 15N debido a la mayor frecuencia de trabajo, así como cuando se trabaja con equipos de alto campo (500 MHz ó más), en cuyo caso es aconsejable el uso de pulsos compuestos o adiabáticos del heteroátomo. 3.2.1. Utilización del formalismo del operador producto

La secuencia consiste en una transferencia de polarización INEPT desde el protón al heteroátomo, un período t1 con un pulso de 180º de protón en el centro y una transferencia tipo retroINEPT desde X al protón. El primer bloque INEPT genera magnetización en antifase de X con respecto a 1H, IzSy, como se indica en (1). Durante t1 hay una evolución con el desplazamiento químico de X. El pulso de 180º de protón en el centro de t1 reenfoca la evolución con el acoplamiento 1JCH y por simplicidad no aparece en la ecuación (2). El último pulso de 90º de X junto al de protón transfiere la magnetización al protón en antifase, IySz, como en (3). Durante el período posterior de reenfoque dicha magnetización se convierte en magnetización en fase detectable (4)

Es esencial que el primer y segundo pulso de 1H estén desfasados 90º. El espectro puede ser obtenido en modo sensible a la fase usando SHR o TPPI; las rutas de transferencia de coherencia no deseadas son eliminadas aplicando un ciclado de fase adecuado, gradientes PFG como veremos más adelante o una combinación de ambos. Iz → Ix90 -Iy → ∆Π IzSzJ -Iy cos Π J ∆ + IxSz sen Π J ∆ ∆ = 1/2J cos = 0 sen = 1 IxSz → Iy90 → Sx90 IzSy (1) IzSy →Ω Szst1 IzSy cos Ωs t1 – IzSx sen Ωs t1 (2) → Ix90 → Sx90 -IySz cos Ωs t1 + IySx sen Ωs t1 (3) -IySz cos Ωs t1 → ∆Π IzSzJ

-IySz cos Ωs t1 cos Π J ∆ + Ix cos Ωs t1 sen Π J ∆ (4)

164 José A. Gavin

para ∆ = 1/2J cos = 0 y sen = 1, por lo que se obtiene Ix cos Ωs t1 3.2.2. Eliminación de las señales 1H-12C Y 1H-14N

Una lógica similar a la empleada en el HMQC hay que aplicar a la secuencia HSQC de la cual existe una variedad de aproximaciones [12]. En la figura 7 se muestra la secuencia que emplea el método eco-antieco y que requiere sólo dos gradientes en proporción de las relaciones giromagnéticas de H y X ya que actúa sobre una magnetización simple cuanto.

+1

-1

0

+1

-1

0

+1

-1

0

+1

-1

0

+1

0

-1

Desacoplar

1H

X

1H

X

p=

p=

X X

XXt1

Y

X

X

X

X X∆/2∆/2 ∆/2 ∆/2

X

δ δ

G1 G2

NP

Gz

N

PFigura 7. Secuencia HSQC sensible a la fase, usando el método eco-antieco

Para un experimento de correlación 1H-13C se utilizan relaciones 4:1 y 4:-1 que seleccionarán las coherencias tipo N y P en escanes alternos. De nuevo el primer gradiente se aplica dentro de un eco de espín para reenfocar la evolución con el desplazamiento químico de X durante la duración del gradiente, mientras que el segundo puede ser aplicado durante el período de reenfoque del retroINEPT. La capacidad para suprimir completamente las señales 1H-12C o 1H-14N produce espectros con supresión casi total del ruido t1

3.3. Variantes de la secuencia HSQC: PEP-HSQC (SE-HSQC), CT-HSQC

Secuencia PEP-HSQC Ciertos experimentos pueden ser realizados usando la

metodología conocida como de “conservación de los caminos equivalentes” (preservation of equivalent pathways, PEP, o sensitivity enhancement, SE) que conduce a espectros con aumento de sensibilidad PEP-HSQC [19-21]. La señal originada está modulada en fase y con un aumento de sensibilidad de √2 en la relación S/N con respecto al caso de la modulación de amplitud. La figura 8 muestra dicha secuencia.

Desacoplar

1H

X

X X

X X± t1

Y

X

X

X

X X X

XY

Y X∆1 ∆2 ∆1 ∆1∆1 ∆2

Figura 8. Secuencia PEP-HSQC ∆1 = ¼ JCH ∆2 = ¼ JCH (1/8 JCH)

Comienza con un experimento HSQC convencional, con una etapa INEPT que crea coherencia en antifase y que está marcada con la frecuencia de X durante t1 (1). Si registramos

Espectroscopía 2D de correlación heteronuclear 165

un HSQC con el modo SHR o TPPI, se adquiere alternativamente una señal modulada por un seno o coseno en la dimensión t1. La finalidad de la secuencia es asegurar que ambos tipos de modulación sean observados simultáneamente. Requerimos por tanto una ruta de transferencia de coherencia que convierta IzSy e IzSx en los observables Ix y/o Iy. El primer retroINEPT aplicado después de t1 produce lo siguiente (2). La finalidad de la alternancia en la fase del primer pulso de X del retroINEPT es clara. Normalmente detectaríamos la señal de Ix (2). Sin embargo, en el experimento PEP-HSQC “aparcamos” esta señal como Iz, y convertimos el término IySx en coherencia en antifase, que es reenfocada posteriormente. Finalmente colocamos la señal Iz en el plano transversal mediante el pulso de 90º de protón del 2º retroINEPT (3). Iz → Ix90 →Π IzSzJτ → Iy90 → Sx90 IzSy →Ω Szst1 IzSy cos Ωs t1 + IzSx sen Ωs t1 (1) IzSy → Ix90 → xSm90 m IySz → ∆Π IzSzJ ±Ix (2) IzSx → Ix90 → xSm90 IySx → ∆Π IzSzJ IySz ± Ix → Iy90 → Sy90 ± Iz → ∆Π IzSzJ m Iz → Ix90 m Iy (3) IySx → Iy90 → Sy90 -IySz → ∆Π IzSzJ Ix → Ix90 Ix La coherencia presente al comienzo de la detección es: m Iy cos Ωs t1 + Ix sen Ωs t1

Las dos señales obtenidas + Iy cos Ωs t1 + Ix sen Ωs t1 y -Iy cos Ωs t1 + Ix sen Ωs t1 están moduladas en fase. Sin embargo la adición y sustracción de ambas: 2 Ix sen Ωs t1 y 2 Iy cos Ωs t1 respectivamente, están moduladas en amplitud, lo que permite obtener espectros sensibles a la fase. Con el ciclado de la fase del pulso X después de t1, controlamos la adquisición de datos tipo-N o P. Hay que recordar que necesitamos ambos para tener un espectro sensible a la fase. La ganancia de sensibilidad teórica √2 no es, en general, alcanzada en la práctica. Hay más pulsos de radiofrecuencia que en un experimento convencional HSQC, lo que provoca pérdida de señal debido a la inhomogeneidad de dichos pulsos, y además los períodos extras que aparecen en la secuencia generan pérdidas por relajación transversal de la señal. A pesar de esto, el efecto neto es un aumento de sensibilidad importante.

Para un sistema de dos espines IS, los períodos ∆1 y ∆2 son fijados a 1/4 JCH. Para un sistema I2S, si colocamos esos mismos valores, perdemos la coherencia IySx, ya que es convertida cuantitativamente en coherencia en antifase debido al acoplamiento del otro espín I’: IySx → ∆Π IzSzJ IySx IySx → ∆Π zSzIJ ' IyI’zSy

Podemos acortar ∆2 para retener algo de IySx, pero entonces hay que tener en cuenta que las dos ramas, que conducen a Iy e Ix, deben ser compensadas lo que significa que debemos hacer sen 2Π J ∆2 = cos 2Π J ∆2 y por tanto ∆2=1/8 J. Sin embargo, la sensibilidad obtenida en este caso no se ve aumentada por un factor de √2, sino de 2 ¼ , que corresponde a un aumento máximo de 19%.

La secuencia PEP-HSQC puede ser combinada con la utilización de gradientes [22], que realizan la selección de las señales tipo P o N, y que se sitúan al final de t1 y justo antes

166 José A. Gavin

de la adquisición. Este experimento presenta un incremento de sensibilidad de √2 en el caso de grupos CH [23,24] y algo menor para los CH2 y CH3 [25,26]. Experimento IS I2S I3S ∆1 Eco-antieco 0.707 1.414 2.12 Ciclado de fase 1 2 3 PEP 1.414

1.20 1.06

1.414 2 1.92

2.12 2.54 2.65

1/2J 1/4J 1/6J

Tabla 1. Incrementos teóricos obtenidos en una serie de experimentos HSQC con gradientes, en función de la multiplicidad de los carbonos Secuencia HSQC a tiempo constante (CT-HSQC)

Eco de espín X Eco de espín H

No evolución δ X Evolución JXX No evolución JHX Evolución JHH

Evolución δ X Evolución JXX No evolución JXH Evolución JHH

Figura 9. Secuencia CT-HSQC Evolución δ X durante t1 Evolución JXX 2T=cte no modulación f1

La realización de experimentos HSQC con moléculas marcadas, por ejemplo 13C, hace aparecer el acoplamiento C, C en la dimensión f1 lo que va en detrimento de la sensibilidad del experimento. La modificación conocida como CT-HSQC [27,29], introduce el período variable t1 dentro de otro fijo, 2T. Este hecho elimina la evolución con el acoplamiento C, C mientras que mantiene la evolución con el desplazamiento químico de 13C. 3.4. Experimentos híbridos

Los espectros de correlación HMQC o HSQC pueden ser mejorados si los combinamos con otras secuencias que alteran sus características o mejoran la información obtenida. Los ejemplos citados a continuación son sólo una muestra de dichas posibilidades.

3.4.1. Experimentos con editado de la multiplicidad

Si exceptuamos la habilidad para identificar grupos de CH2 diasterotópicos, los experimentos de correlación heteronuclear descritos hasta aquí no aportan evidencias directas sobre la multiplicidad de los grupos CHn que dan origen a cada correlación. Existen en la actualidad varios métodos que permiten dicho “editado” dentro del propio experimento de correlación. Esto proporciona una información añadida en el espectro y requiere menos tiempo que los experimentos 1D de editado convencional (por ejemplo DEPT). Este hecho es particularmente importante en el caso de muestras con pequeña cantidad, donde la realización de los DEPT y 13C requiere la mayor parte del tiempo de máquina. La incorporación de la secuencia DEPT en un HMQC ofrece un método para realizar dicho editado en el espectro de correlación [30].

Espectroscopía 2D de correlación heteronuclear 167

El editado puede ser fácilmente introducido en la secuencia HSQC [14, 31, 32], mediante la simple adición de un eco de espín (∆- 180º (1H,X) -∆) después de t1. Durante dicho período sólo evoluciona el acoplamiento heteronuclear, de la misma manera que en la secuencia 1D J-modulado. Por tanto, fijando ∆= 1/2J obtenemos un espectro de correlación donde las respuestas de CH2 aparecen invertidas respecto a las de CH y CH3. En una reciente aproximación [33] de Parella, el eco de espín aparece concatenado con el t1 variable. Un problema potencial en este tipo de aproximación es la cancelación de señales de correlación superpuestas y que presentan fases opuestas en regiones del espectro muy apiñadas. Existen también secuencias alternativas basadas en el editado mediante filtración múltiple-cuántica produciendo espectros que contienen sólo correlaciones de CH, CH2 ó CH3 eliminando el problema de la cancelación [34,35]. 3.4.2. HSQC-TOCSY, HSQC-NOESY

Cuando se analizan moléculas que presentan espectros de protón muy solapados, los experimentos de correlación homonuclear pueden mostrar espectros que siguen presentando mucho solapamiento para una buena interpretación. En tales casos, se puede aprovechar la dispersión, potencialmente mayor, de los desplazamientos químicos del heteroátomo como un medio para separar las correlaciones protón-protón. Además, en los casos donde es completo el solapamiento de las señales de 1H, las correlaciones a un enlace 1H-X no permiten identificar sin ambigüedad el heteroátomo y una aproximación para resolver este problema consiste en transferir la información sobre la correlación heteronuclear, a los protones vecinos. Así, si adicionamos un período de mezcla de un spin-lock del TOCSY después de la secuencia HMQC/HSQC e inmediatamente antes de la detección, la transferencia de magnetización que había vuelto al protón se reparte con otros protones vía TOCSY [36,37]. Modificaciones posteriores de la secuencia HSQC-TOCSY que incorporan la metodología PEP así como la utilización de gradientes han sido descritas [38,39].

Figura 10. Espectros 2D HSQC-TOCSY con PEP de estricnina en CDCl3 : A) espectro convencional B) con editado de respuestas directas C) con editado de multiplicidad D) doble editado; picos positivos(negro) negativos(vacío)

Las correlaciones directas pueden ser diferenciadas de las indirectas (generadas por el TOCSY) incluyendo un bloque de editado justo antes de la adquisición; además la multiplicidad de los picos directos puede ser codificada [33] (ver figura 10). Otro experimento interesante es el HSQC-NOESY [40] a partir del cual pueden observarse NOEs entre protones químicamente equivalentes o accidentalmente solapados, lo que lo convierte en una herramienta útil para el estudio de moléculas simétricas.

168 José A. Gavin

3.4.3. Experimentos INEPT-INADEQUATE, ADEQUATE

Existe todo un número de modificaciones a partir de la secuencia básica del INADEQUATE [41-44] cuya finalidad es mejorar la sensibilidad de dicha técnica. Un experimento reciente, llamado INEPT-INADEQUATE [45] resuelve el problema de la sensibilidad utilizando la transferencia inicial de polarización protón-carbono y con detección final de protón. Además la supresión de las señales de los protones unidos a un sólo 13C y de los 1H-12C se consigue mediante la utilización de PFG para la selección de la señal. En principio, esto conduce a un aumento en la sensibilidad por un factor de 32, ((γH/γC)5/2), aunque un factor entre 8 y 16 parece más realista si se tienen en cuenta las pérdidas experimentales. El espectro resultante presenta una correlación paso a paso de los protones con sus carbonos vecinos lo que permite reconstruir el esqueleto molecular.

La secuencia original es la de la figura 11 y puede ser formalmente diseccionada en sus partes principales.

Figura 11. Secuencia INEPT-INADEQUATE con gradientes ∆=1/4JH,C ∆3=1/4JC,C

La secuencia conocida como ADEQUATE presenta mejoras en la sensibilidad por la inclusión de la metodología PEP. El experimento 1,1-ADEQUATE [46] es un HSQC-PEP en el cual el período de evolución usual es sustituido por otro en el que se crea y evoluciona coherencia de orden dos, DQ 13C-13C, como en el experimento INADEQUATE. Una versión reenfocada de este experimento permitiría discriminar entre picos cruzados provenientes de 2JCH y 3JCH en un HMBC [47].

Figura 12. Secuencia 1,1-ADEQUATE con PEP y selección mediante eco-antieco

Espectroscopía 2D de correlación heteronuclear 169

Por otra parte, si el período de evolución se optimiza para nJCC, obtendríamos el experimento 1,n-ADEQUATE que muestra correlaciones a 3 y 4 enlaces [48]. Resultados similares pueden ser obtenidos a partir de un experimento n,1-ADEQUATE ( nJCH + 1JCC ). Finalmente, a partir de un experimento n,n-ADEQUATE ( nJCH + nJCC ) podemos obtener correlaciones a 6 enlaces en un único experimento. También como en ejemplos anteriores puede incluirse la multiplicidad de los carbonos en dichos experimentos. 4. ESPECTROSCOPIA DE DETECCIÓN INVERSA. CORRELACIONES A

LARGA DISTANCIA

Los métodos de correlación heteronuclear 1H-X presentados hasta ahora (HMQC, HSQC) dependen de la presencia de un protón, al menos, unido al heteroátomo y no son capaces de asignar los carbonos no protonados. Un método alternativo en dichos casos consiste en establecer correlaciones entre carbonos y protones vecinos a más de un enlace, llamadas correlaciones a larga distancia o a varios enlaces, y es conocido comúnmente como HMBC.

4.1. La secuencia HMBC

El experimento HMBC [49,50] establece correlaciones a larga distancia haciendo uso de la mayor sensibilidad asociada a la detección de protón y es en esencia un HMQC “optimizado” para detectar correlaciones vía acoplamientos pequeños. Debido a su gran similitud, sólo presentaremos las diferencias existentes entre ambos.

La optimización del HMQC se obtiene fijando el período de preparación ∆ lo suficientemente largo para permitir que los pequeños acoplamientos 1H-13C a larga distancia, evolucionen para producir magnetización en antifase que generará luego coherencia heteronuclear múltiple-cuántica. Ya que dichos acoplamientos son al menos un orden de magnitud más pequeño que los acoplamientos a un enlace (generalmente <5 Hz.), ∆ sería en principio al menos de 100ms. (1/2 nJCH), aunque se suelen usar valores más pequeños para evitar pérdidas por relajación. Durante este largo período, los acoplamientos homonucleares 1H-1H, que son de una magnitud similar, también evolucionan e introducen distorsiones en la fase de los picos de correlación observados (estas distorsiones son mucho más pequeñas en el HMQC debido al valor de ∆ mucho menor). Esto hace que las presentaciones más frecuentes usadas para los espectros HMBC sean en valor absoluto para enmascarar tales distorsiones. Por razones de sensibilidad, el período de reenfoque final del HMQC es omitido, de tal forma que la magnetización aparece en antifase al principio de t2, lo que explica el no desacoplamiento durante la adquisición. Aunque ∆ es elegido de acuerdo a los valores de los acoplamientos a larga distancia, puede ocurrir que sea múltiplo de los valores apropiados para la correlación a un enlace, lo que originaría su aparición. Ya que la FID es adquirida sin desacoplamiento de 13C, estos poseen distintas estructuras dobletes en f2 lo que facilita su identificación.

La supresión de dichas señales es conseguida al menos parcialmente mediante la adición de un filtro de tipo “low-pass J filter” [50,51] ( llamado así porque retiene o deja pasar sólo los picos que se originan a partir de acoplamientos más pequeños que un valor determinado, en este caso la constante de acoplamiento a 1 enlace). Aquí, el período ∆1 es fijado de acuerdo a 1JCH, mientras que ∆2 lo es de acuerdo al acoplamiento a larga distancia. Alternando la fase del primer pulso de 13C sin cambiar la fase del receptor, se consigue cancelar la señal proveniente de la correlación a 1 enlace en escanes sucesivos. En la práctica, la supresión es a menudo incompleta, en particular cuando hay un rango amplio de valores de

170 José A. Gavin

1JCH. En estos casos la adición de un esquema de purga mejora dicha supresión [52]. En estudios de rutina se pueden suprimir dichos filtros y aceptar la presencia de restos de acoplamiento a 1 enlace.

Sin lugar a dudas, el problema principal asociado con la secuencia HMBC consiste en la eliminación de las señales padre 1H-12C, que pueden llegar a enmascarar los satélites de los acoplamientos a larga distancia. La introducción de PFG [15,53] ha revolucionado la aplicabilidad del HMBC, ya que se consigue una perfecta supresión de las señales padre, con una reducción muy grande del ruido t1 asociado a ellas.

1H

X

X X

Xt1

G1 G2G3

Gz

X± X± ∆2

∆1

Figura 13. Secuencia HMBC con “low pass filter” en modo magnitud

.La utilización de la secuencia HSQC, adaptada para la obtención de correlaciones a

larga distancia, no es aconsejable. Además de los problemas de relajación asociados a la utilización de ∆2 grandes (60-70 ms), aparece una evolución significativa de los acoplamientos 1H-1H durante dichos períodos lo que conduce a transferencias tipo COSY no deseadas que son producidas por el 2º pulso de protón del INEPT. Este problema no aparece en la secuencia HMBC.

4.2. Aspectos experimentales

Los acoplamientos a dos o tres enlaces protón-carbono raramente sobrepasan 25 Hz, y en ausencia de insaturaciones son generalmente inferiores a 5 Hz [54,55]. Hay que tener presente que los acoplamientos a tres enlaces pueden ser, y frecuentemente lo son, de magnitud mayor que los correspondientes a dos enlaces, y además presentan una relación tipo Karplus con el ángulo diedro [56]. Realmente, una de las limitaciones en el uso de los datos HMBC es la falta de diferenciación entre las conectividades a dos y tres enlaces. Debido al rango relativamente grande en que se mueven los acoplamientos a larga distancia existen distintas alternativas para obtener el mayor número de correlaciones posibles. La más sencilla consiste en la realización de 2 ó 3 experimentos con distintos valores de ∆ (por ejemplo 60, 90, 120ms). Otra alternativa más reciente lleva el nombre de ACCORD-HMBC (ver más adelante). 4.3. Variantes de los experimentos HMBC: ACCORD-HMBC, CIGAR-HMBC,

IMPEACH-MBC, HSQMBC

Un hito en el desarrollo de nuevos experimentos de correlación heteronuclear a larga distancia fue la introducción del experimento HMBC propuesto por Bax y Summers en 1986 [9]. Recientemente se ha producido un resurgimiento en el interés por este tipo de experimento, que ha llevado a la aparición de una serie de secuencias relacionadas.

Espectroscopía 2D de correlación heteronuclear 171

Quizás la modificación más creativa del HMBC ha sido el experimento ACCORD-HMBC desarrollado por Berger [57] que utiliza el “principio del acordeón” [58] para muestrear un amplio rango de constantes de acoplamiento heteronucleares a larga distancia en un único experimento. Este experimento usa el principio del acordeón reemplazando el período estático ∆2 durante el cual evolucionaba el acoplamiento nJCH, por un período que va disminuyendo sistemáticamente. Este “período acordeón” permite muestrear un rango de potenciales acoplamientos a larga distancia, ya que su duración varía entre τmax y τmin, mientras que la duración del correspondiente tiempo de evolución t1 es aumentada. En principio, el experimento ACCORD-HMBC resuelve el problema de la optimización del período ∆2. Sin embargo, un inconveniente que aparece usando este principio es la modulación del acoplamiento homonuclear en f1 (ver figura 17c).

Desacoplar

1H

X

X

t1∆

G4 G8

Gz

G2

G3 G6G5

G7

G1

∆∆∆

Φ1 Φ2

Φ3

Φ4 Φ1

ΦR

FiltroLow Pass

Delayvariable

Delayvariable

FiltroLow Pass

Figura 15. Secuencia ACCORD-HMBC

El experimento IMPEACH-MBC (IMproved PErfomance ACcordion Heteronuclear Multiple Bond Correlation) descrito por Martin [59] elimina este problema. La diferencia consiste en la utilización de un período variable a tiempo constante en lugar del período variable simple del ACCORD. Esto suprime la modulación debido al acoplamiento homonuclear en f1. (ver figuras 15 y 16)

Desacoplar

1H

X

X

t1

G4 G8

Gz

G3

G6

G5

G1

∆∆Φ1 Φ2

ΦR

Filtro JLow Pass

Tiempo constanteDelay variable

D/2 D/2

X

XXX

G2

G7

Delaysimétrico

dv

Figura 16. Secuencia IMPEACH-MBC

172 José A. Gavin

Recientemente ha aparecido una nueva variante denominada CIGAR-HMBC (Constant time Inverse-detected Gradient Accordion Rescaled long-range Heteronuclear Multiple Bond Correlation) [60]. Este nuevo experimento modifica el período variable a tiempo constante “constant time variable delay” del IMPEACH lo que permite escalar la modulación en f1.

Figura17. Comparación de la región alifática de la estricnina. A) CIGAR-HMBC B) IMPEACH y C) ACCORD-HMBC

También han aparecido una serie de experimentos como el GSQMBC (Gradient-enhanced-Single-Quantum-Multiple-Bond-Correlation) [61] y una modificación de éste conocida como HSQMBC (Heteronuclear-Single-Quantum-Multiple-Bond-Correlation) [62] que no sólo tienen la misma sensibilidad que el HMBC, sino que además permiten una medida fácil de las J heteronucleares a larga distancia. Estos experimentos reducen el efecto no deseado del acoplamiento homonuclear mediante el uso de la secuencia HSQC como bloque fundamental. La transferencia inicial INEPT permite crear magnetización simple cuanto en X, lo que elimina la evolución del acoplamiento homonuclear durante t1.

Figura 18. Secuencia HSQMBC sensible a la fase. ∆2=1/4 nJCH

El experimento puede incorporar un “trim pulse” antes del 2º pulso de 1H y además un filtro zz en el retroINEPT con lo que se elimina la magnetización no deseada (que genera contribuciones dispersivas en la forma de línea) antes de transferir la magnetización al protón para su detección después de la aplicación del correspondiente gradiente de descodificación.

Espectroscopía 2D de correlación heteronuclear 173

5. ESPECTROSCOPIA 15N

La baja abundancia natural del 15N (0.37%) unida a su también baja relación magnetogírica (γN), aproximadamente el 10% de γH, lo convierten en un núcleo “difícil” para trabajar en espectroscopia de rutina. El desarrollo de los métodos de detección inversa ha aumentado grandemente sus posibilidades como se pone de manifiesto en el creciente número de trabajos aparecidos en los últimos años [63-66]. BIBLIOGRAFIA General - F.J.M. van den Ven “Multidimensional NMR in liquids. Basic principles and experimental methods” Ed. John Wiley & Sons, New York, (1995) - J. Cavanagh, W.J. Fairbrother, A.G. Palmer III, N.J. Skelton, “Protein NMR spectroscopy. Principles and practice “ Ed. Academic Press, San Diego, (1996) - T.D.W. Claridge, “High resolution NMR techniques in Organic Chemistry” Ed. Elsevier, Oxford (1999) - S. Braun, H.O. Kalinowski, S. Berger, “150 and more basic NMR experiments. A practical course” Ed. John Wiley & Sons and Verlag Chemie, Weinheim, (1998) - S. Berger, S. Braun, H.O. Kalinowski, “ NMR spectroscopy of the non-metallic elements” Ed. John Wiley & Sons, Chichester (1997) Específica 1. A.A. Maudsley, R.R. Ernst, Chem. Phys. Lett. 50, 368 (1977) 2. A.A. Maudsley, L. Müller, R.R. Ernst, J. Magn. Reson. 28, 463 (1977) 3. G. Bodenhausen, R. Freeman, J. Magn. Reson. 28, 471 (1977) 4. A. Bax, G.A. Morris, J. Magn. Reson. 42, 501 (1981) 5. L. Müller, R.R. Ernst, Mol. Phys. 38, 963 (1979) 6. L. Müller, J. Am. Chem. Soc. 101, 4481 (1979) 7. G. Bodenhausen, D.J. Ruben, Chem. Phys. Lett. 69, 185 (1980) 8. A. Bax, R.H. Griffey, B.L. Hawkins, J. Magn. Reson. 55, 301 (1983) 9. A. Bax, S. Subramanian, J. Magn. Reson. 67, 565 (1986) 10. R.E. Hurd, B.K. John, J. Magn. Reson. 91, 648 (1991) 11. J.R. Garbow, D.P. Weitekamp, A. Pines, Chem. Phys. Lett. 93, 504 (1982) 12. T. Parella, Magn. Reson. Chem. 36, 467 (1998) 13. J. Ruiz-Cabello, G.W. Vuister, C.T.W. Moonen, P. Van Gelderen, J.S. Cohen, P.C.M. van Zilj, J. Magn.

Reson. 100, 282 (1992) 14. G.W. Vuister, J. Ruiz-Cabello, P.C.M. van Zilj, J. Magn. Reson. 100, 215 (1992) 15. W. Wilker, D. Leibfritz, R. Kerssebaum, W. Bermel, Magn. Reson. Chem. 31, 287 (1993) 16. J.R. Tolman, J. Chung, J.H. Prestegaard, J. Magn. Reson. 98, 462 (1992) 17. A.L. Davis, J. Keeler, E.D. Laue, D. Moskau, J. Magn. Reson. 98, 207 (1992) 18. J. Boyd, N. Soffe, B. John, D. Plant, R. Hard, J. Magn. Reson. 98, 660 (1992) 19. A.G. Palmer III, J. Cavanagh, P.E. Wright, M. Rance, J. Magn. Reson. 93, 151 (1991) 20. J. Cavanagh, A.G. Palmer III, P.E. Wright, M. Rance, J. Magn. Reson. 91, 429 (1991) 21. J. Cavanagh, M. Rance, Annu. Rep. NMR Spectrosc. 27, 1 (1993) 22. L.E. Kay, P. Keifer, T. Saarinen, J. Am. Chem. Soc. 114, 10663 (1992) 23. G. Kontaxis, J. Stonehouse, E.D. Laue, J. Keeler, J. Magn. Reson. A 111, 70 (1994) 24. J.A. Gavín, J.L. Pons, M.A. Delsuc, J. Magn. Reson. A 112, 64 (1996) 25. J. Schleuser, M.G. Schwendinger, M. Sattler, P. Schmidt, O. Schedletzky, S.J. Glaser, O.W. Sorensen, C.

Griesinger, J. Biomol. NMR 4, 301 (1994) 26. M. Sattler, J. Schleuser, O. Schedletzky, S.J. Glaser, C. Griesinger, N.C. Nirelsen, O.W. Sorensen, J. Magn.

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174 José A. Gavin

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Chichester (1996) 65. S.Berger, Magn. Reson. Chem. 34, 4 (1996) 66. G. Martín, J. Nat. Prod. 63, 543 (2000) Agradecimientos: Quiero agradecer la inestimable ayuda prestada por el Dr. Antonio Hernández-Daranas en la preparación de este texto, así como de los Dres Teo Parella y Francesc Sánchez-Ferrando por las sugerencias realizadas y la revisión del manuscrito.