10 Corre Laci on Hetero Nuclear

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ESPECTROSCOPA 2D DE CORRELACIN HETERONUCLEARJos Adrian Gavn Sazatornil Instituto Universitario de Bio-Orgnica IUBO Antonio Gonzlez Departamento Qumica Orgnica, Universidad de La Laguna Avda. Astrofsico F. Sanchez 2, 38296 La Laguna (Tenerife),jgavin@ull.es

1. INTRODUCCION Debido a la mayor dispersin en sus desplazamientos qumicos, los espectros de 13C y N presentan en general una mejor dispersin que los correspondientes espectros de 1H. Este hecho puede ser explotado a travs de la realizacin de experimentos 2D de correlacin heteronuclear. Aunque en este captulo estudiaremos fundamentalmente la espectroscopia 2D heteronuclear 1H-13C, podramos hacerla extensiva a correlaciones 1H-15N, 31P-13C y otros.15

Existe una amplia variedad de mtodos, como los basados en eco de espn o en transferencia de polarizacin, que permiten editar un espectro 1D del espn heteronuclear X, y que suministran informacin sobre el nmero de H unidos al heterotomo (INEPT, DEPT). Sin embargo estos mtodos no aportan evidencias directas, por ejemplo, de qu protones estn unidos a cada carbono en una molcula. El problema de la asignacin ha sido simplificado de manera importante gracias a la espectroscopia de correlacin heteronuclear 2D, en la cual las dos coordenadas de cada resonancia son los desplazamientos qumicos de un protn y del carbono enlazado directamente a l (o a 2,3 enlaces). Histricamente los primeros experimentos de correlacin heteronuclear que se desarrollaron fueron los llamados de deteccin directa del heterotomo [1-4] y fue slo a principios de los 80 cuando se empezaron a realizar los llamados de deteccin inversa [5-8] que van a constituir el objeto de esta leccin.

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2. SENSIBILIDAD Como indicamos ms arriba, los mtodos originales para determinar las correlaciones heteronucleares, estaban basados en la observacin del ncleo X ( ms pequea), mientras el 1 H era detectado indirectamente y apareca en la dimensin f1 del experimento 2D. Esta aproximacin fue adoptada porque, las secuencias originales 2D eran derivadas de experimentos anteriores, del tipo de transferencia de polarizacin, como el INEPT, que haban sido diseados a su vez para aumentar la sensibilidad en la observacin de los ncleos de ms baja. Adems, los primeros instrumentos de RMN de pulsos fueron diseados con este modelo. Durante los ltimos aos, la aproximacin a la recogida de datos ha cambiado en el sentido de que el ncleo de mayor valor de , frecuentemente 1H, es el observado, mientras X es detectado indirectamente. Es lo que se conoce con el nombre de experimentos de deteccin inversa. La motivacin de este cambio ha sido el aumento de sensibilidad asociado a l. La dependencia de la fuerza de una seal con su relacin giromagntica, , es bien conocida y el concepto de transferencia de polarizacin fue introducido como un medio de aumentar la sensibilidad. La expresin formal siguiente, para la relacin S/N de un experimento 1D que implica ncleos con espn =1/2, cuantifica este hecho. S/N N A T-1 B 0 3/2 exc obs 3/2 T*2 (ns)1/2 N es el nmero de molculas en el volumen de muestra analizada, A es un trmino que representa la abundancia de los espines activos en RMN presentes en el experimento, T es la temperatura, B0 es el campo magntico esttico, exc y obs representan las relaciones giromagnticas de los espines inicialmente excitados y observados, respectivamente, T*2 es el tiempo de relajacin transversal efectivo y ns el nmero total de escanes acumulados. De una manera aproximada y para un experimento concreto: S/N exc obs 3/2 Cuando elegimos cmo llevar a cabo un experimento de correlacin heteronuclear, podemos contemplar las siguientes opciones, ver figura 1, teniendo en cuenta cul sea el ncleo excitado y cul el observado.1

H X

P

E t1

M

D t2

Sensibilidad relativa1

H-31P

1

H-13C

1

H-15N

a) b)

1 2.5 Tradicional

1 4

1 10

1

H X

t1 t2 t2 t1 t2 t1

1

H X

c) d)

4 10 Inverso

8 32

30 300

1

H X

Figura 1. Esquemas generales para la obtencin de espectros 2D de correlacin heteronuclear P= preparacin E= evolucin M= mezcla D= deteccin

Espectroscopa 2D de correlacin heteronuclear

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El esquema 1b representa la aproximacin adoptada en los experimentos tradicionales de correlacin (deteccin directa), en los cuales la magnetizacin inicial de protn es marcada con su frecuencia durante t1 y luego es transferida a X para su deteccin. El esquema 1d representa la aproximacin moderna (deteccin inversa) en la cual el ncleo de protn es usado como origen y como detectado. Claramente se observa que la sensibilidad predicha es bastante ms grande que la del mtodo tradicional, y la dependencia con la relacin giromagntica del ncleo de menor , ha sido completamente eliminada, aunque la abundancia natural de dicho ncleo sigue siendo un factor importante en dicha opcin (trmino A de la ecuacin anterior). Cuanto ms bajo es el valor de de X, mayor es la ganancia obtenida con la deteccin de 1H. Ganancias adicionales con un factor de 2 3 pueden ser anticipadas para grupos CH2 o CH3 respectivamente. Los aumentos de sensibilidad mostrados para los mtodos inversos frente a los directos, pueden no ser alcanzados en la prctica cuando se consideran los detalles de cada secuencia en particular. Sin embargo, y teniendo en cuenta que una ganancia por un factor de 4 en un experimento de correlacin 1H-13C corresponde a una ganancia en tiempo por un factor de 16, experimentos que necesitaban 1 noche con deteccin directa de X, pueden realizarse en alrededor de 1 hora con deteccin de 1H . Tales consideraciones han conducido a la adopcin casi generalizada de experimentos de deteccin inversa de protn siempre que sea posible. La eleccin de esta aproximacin ha tenido consecuencias en el diseo de los equipos de RMN. Las sondas convencionales eran construidas para optimizar la sensibilidad en la observacin del ncleo de ms baja, lo que implicaba colocar la bobina de dicho ncleo ms cerca de la muestra y colocar la bobina de protn ms alejada. Las sondas de deteccin inversa presentan la disposicin opuesta proporcionando un mayor factor de llenado. Sin embargo, incluso con sondas convencionales, podemos realizar experimentos con deteccin de 1H, aunque no con una sensibilidad ptima, pero siempre mayor que la que corresponde a los experimentos de deteccin de X. 3. ESPECTROSCOPIA DE DETECCION INVERSA. CORRELACIONES A UN ENLACE Hay dos tcnicas de amplio uso que proporcionan correlaciones heteronucleares a un enlace y que son conocidas coloquialmente como HMQC y HSQC. Los datos de correlacin proporcionados por los dos mtodos son esencialmente equivalentes y para la espectroscopia de rutina son poco relevantes. Debido a esto, los dos aparecen con una frecuencia parecida en la literatura qumica. A nivel prctico, el experimento HMQC tiende a ser ms robusto con respecto a imperfecciones experimentales o a fallos de calibracin, mientras que el HSQC tiene caractersticas ms favorables para trabajos en los que se requiere una alta resolucin y es ms flexible con respecto a modificaciones de la secuencia, lo que ha extendido su uso en los laboratorios qumicos. Las dos tcnicas emplean la aproximacin de establecer las correlaciones va deteccin de 1H como se indica en la figura 1d. Sin embargo, esta aproximacin plantea una serie de dificultades tcnicas relacionadas con la supresin de las seales principales correspondientes a los protones unidos a heterotomos de I 1/2 como 12C y 14N. Estas seales son las dominantes en un espectro de protn 1D pero constituyen una fuente de interferencias en las correlaciones heteronucleares, ya que slo los satlites de baja intensidad pueden dar origen a dichas correlaciones, esto es, 1H-13C y 1H-15N en nuestro caso. La necesaria supresin es actualmente realizada con gran efectividad mediante la aplicacin

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de gradientes de campo magntico (PFG), que tienen un impacto enorme en particular en la espectroscopia de correlacin heteronuclear. 3.1. Correlacin heteronuclear mltiple cuntica (HMQC) El experimento HMQC en uno de los ms utilizados en los experimentos de correlacin heteronuclear a un enlace con deteccin de protn. Aunque fue sugerido hace muchos aos [6,8], su uso no se hizo extensivo hasta que se present un esquema [9] que resolva las dificultades tcnicas asociadas a la observacin de protn. Desde entonces, y en particular desde la llegada de los gradientes [10], la tcnica de la deteccin inversa ha pasado a dominar la espectroscopia RMN orgnica. 3.1.1. La secuencia HMQC La secuencia bsica HMQC es bastante sencilla y slo consta de 4 pulsos de radiofrecuencia, rf, que aparecen representados en la figura 2. La secuencia comienza con la excitacin del protn seguida de la evolucin de su magnetizacin bajo la influencia del acoplamiento 1JCH. Durante un perodo , de aproximadamente 3.3 ms, se desarrolla una magnetizacin en antifase de 1H con respecto a 1JCH. Como en el caso del INEPT, esta magnetizacin en antifase puede ser transferida al carbono unido a l gracias a la accin de un pulso de 13C cuyo objetivo es adems el de generar coherencia mltiple-cuntica protncarbono (de aqu el nombre del experimento).X X

1

X t1X

X

HDesacoplar

X+11

H p=

0 -1

+1

X

p= 0 -1

Esta coherencia es una mezcla de magnetizacin transversal de los espines acoplados, en este caso un protn y el carbono directamente unido a l, que evoluciona coherentemente pero que no puede ser observada directamente. Si uno quisiera comenzar a recoger datos en ese instante no aparecera seal, siempre que fuera igual a 1/2 JCH.

Figura 2. Secuencia HMQC y camino de transferencia de coherencia (CTC) asociado. El perodo =1/2JCH provoca el desfase y reenfoque p