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28/03/14

Ci occuperemo della diagnostica virologica, l’altra volta abbiamo parlato di quella batteriologica. Ve la ricordate? Vediamo ora le metodologie che vengono usate nella diagnosi delle infezioni virali. Perché fare diagnosi? Perché abbiamo bisogno di sapere con quale agente eziologico abbiamo a che fare per un’eventuale terapia con tanto di punto esclamativo perché, come sapete, per quanto riguarda la virologia la terapia è molto relativa. La terapia per la virologia si limita a un gruppo di virus che appartengono alla famiglia del ____?____, dell’HIV e qualcosa abbiamo pure per qualche virus epatitico, il virus dell’epatite C. Non hanno la stessa efficacia che hanno gli antibiotici per i batteri, lasciano sempre il tempo che trovano, infatti sono a volte accompagnati ad altre sostanze che sono delle immunomodulatori per potere sopperire alle carenze che hanno questi antivirali. Quindi un antivirale come, per esempio, la molecola antesignana contro gli Herpes è l’Aciclovir ma già i ceppi di virus herpetico all’Aciclovir sono più che resistenti, se non lo sono pensate che dopo un paio di… ehm, se facciamo in vitro un esperimento e mettiamo questi virus insieme alla dose, che poi dovrebbe dare delle indicazioni terapeutiche in vivo di Aciclovir, dopo due cicli replicativi si selezionano dei mutanti che sono resistenti all’Aciclovir. Infatti ci sono tutti i derivati, così come per gli antibiotici si cerca di modificare le molecole aggiungendo dei radicali più o meno complessi, dei gruppi organici più o meno complessi anche per quanto riguarda gli antivirali esiste questa problematica che viene risolta in qualche maniera modificando la molecola base che sarebbe questo Aciclovir, infatti c’è il Penciclovir, il Vanciclovir e così via… Ma questo non toglie che questi virus, ripeto, acquisiscono facilmente questa capacità di resistere all’attacco di queste molecole. Per esempio un’altra terapia usata contro l’epatite C è data dall’associazione tra la Ribavirina che è una molecola dall’attività antivirale sempre molto limitata insieme alla somministrazione di Interferon, che è una molecola biologica per eccellenza antivirale, quella che le nostre cellule formano per combattere le infezioni virali. Quindi si deve associare sempre qualcosa per potere potenziare quest’effetto. Di solito questi antivirali sono associati o con degli immunomodulatori, come l’Interferon, oppure il bel cocktail che si da contro l’infezione da HIV nei sieropositivi, non si da soltanto l’AZT ma un’associazione di altri farmaci che sempre hanno la potenziale capacità di stimolare il potenziale ad effetto dell’antivirale stesso mentre per l’antibiotico non è così, l’antibiotico, di solito, se è un buon antibiotico, è capace di distruggere completamente la replicazione dei batteri, la moltiplicazione batterica, meglio parlare di moltiplicazione batterica. Anche là c’è il problema delle resistenze che non è da sottovalutare, infatti già nei laboratori si selezionano, dicevamo l’altra volta, dei ceppi che sono multiresistenti perché anche i batteri si organizzano in tal senso per cercare di sopravvivere, quindi si trasferiscono queste resistenze, questi meccanismi li avete fatti in microbiologia e li sapete sicuramente meglio di me. Quindi fare diagnosi formulazione di ____?_____ eziologica per esempio __________?____________ ma di quale epatite? Di un epatite C, di un epatite B o di un’epatite A? Quindi è importante sapere con quale tipo di agente infettante _______?______. Se fosse un’epatite A è un’infezione acuta che si risolve da se, dove non c’è neanche l’antivirale. Il problema può sussistere se è un’epatite di tipo C, perché come sapete e vi ricordate sicuramente dalla virologia, questo è un virus che tende a cronicizzare la malattia e quindi l’evoluzione della malattia può portare alla cirrosi e al carcinoma epatocellulare e quindi è importante a questo punto che i soggetti che sono affetti da questo tipo di infezione abbiano una terapia mirata. Hanno fatto un nuovo farmaco in America che per adesso non è in commercio neanche in Europa, ogni somministrazione costa mille euro credo se ne facciano non so ogni quanti mesi una somministrazione al giorno, ci vuole una bella cifra. Quanto prima sarà più diffuso e non solo per una nicchia di persone che se lo può permettere. Non tutti possono permettersi una terapia di questo genere. Ve lo cercate su internet, vedete pure il nome di questa nuova molecola contro l’epatite C. Adesso mi sfugge il nome però quello che mi ha sconvolta è che ogni somministrazione costasse mille euro, mille dollari. Ad ogni modo qui in Europa ancora non è arrivato.

E poi vediamo ancora l’adozione della terapia virale, avevamo detto _________?_________, in occasione di epidemie. Ogni tanto non solo in occasione di epidemie ma, come sapete, ogni tanto c’è qualche microrganismo che prima era silente e che diventa di nuovo emergente, me ne viene uno in mente il ________?___________che non è un virus ma un batterio ma è la stessa cosa, il concetto è uguale. Il concetto è quello di andare a vedere se compare in una popolazione che per qualche motivo, perché per molti motivi si era liberato un certo agente infettante, ad un certo punto si ritrova l’agente infettante. Quindi questo agente infettante

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riprende la sua azione patogena. Vi faccio un esempio di virus è il West Nile Virus che ha fatto diversi… nel nord Italia, in Lombardia, in Emilia, nel Veneto ci sono state addirittura delle piccole epidemie locali di questo virus. Virus che fino a qualche anno fa non era stato isolato, quindi ci sono sempre delle infezioni emergenti e sono i cosiddetti casi sentinella sia per quanto riguarda i batteri che per quanto riguarda i virus e se ne ripropongono sempre di nuove.

Allora, andiamo avanti. Parliamo un poco delle tecniche, io quest’anno ho voluto cominciare con le tecniche perché pensavo che queste fossero già nel possesso… che avevate già acquisito nel corso di studio di microbiologia ma poi io mi rendo conto agli esami che poi non è così e allora ho voluto iniziare con queste tecniche prima batteriologice e ora virologiche giusto per chiarirci le idee. Poi man mano che parleremo delle infezioni del sistema nervoso centrale andremo a vedere dove si fa, su che materiale si fa, che tecnica si usa ma adesso facciamo un quadro generale di tutte le tecniche che abbiamo a disposizione, va bene? Allora diagnostica diretta e diagnostica indiretta, sapete bene che significa è lo stesso concetto che abbiamo già affrontato in batteriologia. La diagnostica diretta è quella che si prefigge di andare a diagnosticare quale tipo di agente eziologico c’è in quel dato materiale, quindi va a cercare direttamente il virus nello specifico. La diagnostica indiretta che cosa cerca? Non cerca direttamente l’agente eziologico, quindi quel dato virus, ma cerca gli anticorpi presenti nel siero del paziente contro quel dato virus, quindi è indiretta. Questa è la differenza tra diretta e indiretta.

Allora dimostrazione dell’organismo infettato di una risposta anticorpale specifica. Però voi lo sapete bene che la risposta anticorpale specifica quando compare? L’avete fatta l’immunologia no? L’immunologia vi insegna che se io ho un’infezione acuta, facciamo l’epatite A, mi sono beccata un’infezione da epatite A e allora vengo da te e ti dico ho questi sintomi, tu sospetti… io ti dico che ho mangiato dei mitili crudi e allora tu dici che potrebbe essere un’epatite A. Ci siamo? Mi state seguendo nell’excursus? Allora che cosa mi richiedete al laboratorio? Potete chiedere gli anticorpi? No, perché ancora non si sono formati. Quanto ci vuole perché si formino gli anticorpi? Ci vogliono da due a quattro settimane. Quindi io poi la mia epatite me la sono risolta e tu non hai concluso niente e allora che cosa fai? Visto che non mi puoi cercare gli anticorpi perché ancora il mio organismo non li ha formati e poi vediamo come e quanti e quali si formano. Mi fai un’indagine diretta, quindi mi cerchi questo virus, per esempio, nelle feci. Perché nelle feci? È un’infezione oro – fecale, che io ho assunto mangiando dei mitili crudi che erano infetti o delle ostriche crude o un qualunque crostaceo crudo o una verdura, un’insalata mal lavata a contatto con materiale che conteneva questo virus. Quindi è un’infezione che si assume per via orale e quindi dove lo posso cercare? Certo non lo cerco nel liquor questo virus. Quindi dove lo posso cercare? Nelle feci. Pensando alla patogenesi, pensando a come penetra, come si moltiplica ecc, lo puoi cercare solo lì o nel vomito se c’è il vomito ma è più facile nelle feci e quindi tu devi discernere. Se invece si presenta da te un signore che ha un’epatite B che ha assunto, che già ce l’ha, che vuole sapere com’è il suo stato e l’epatite l’ha avuta dieci anni prima tu cosa gli cerchi? Gli cerchi solo gli anticorpi? Gli cerchi anticorpi e antigeni. Gli antigeni non dovrebbe averli ma se ce li ha e quale ha? L’HBsAg. E quindi se ha l’HBsAg e gli anticorpi li avrà sicuramente se ha anche gli antigeni allora qui siamo in un’infezione cronica non acuta. Una volta che cronicizza non si riacutizza, è cronica sta lì, può evolvere in cirrosi e carcinoma epatocellulare. Se ci sono gli antigeni ci sono sempre stati, una volta che c’è e non guarisce ma il virus continua a replicarsi, gli antigeni sono sempre presenti, non scompaiono mai forse non gliel’hanno mai cercati prima e allora tu devi vedere, ti riporterà le analisi di prima. Se prima non gliel’hanno mai cercate sicuramente ce le aveva e non gliel’hanno mai cercate, hanno cercato solo gli anticorpi quindi ha avuto a che fare con un medico ignorante, arrivi tu e gli risolvi il problema. Perché se c’era c’è sempre stato, se l’antigene non c’è più vuol dire che il virus non si sta replicando e se non si sta replicando non si può dare un’epatite cronica, te la da solamente se resta li e continua a replicare in forma non così violenta come quando c’è la forma acuta ma si continua a replicare, certo se poi si continuerà a replicare è provato che da l’epatite fulminante e non viene più da te perché è già morto, va bene questo concetto?

Allora andiamo avanti, diagnosi indiretta. C’è qualche peculiarità rispetto alla diagnosi indiretta che abbiamo visto in batteriologia perché abbiamo a che fare con altri microrganismi che hanno caratteri ben diversi da quelli dei batteri, giusto? E quindi vediamo un po’, quindi abbiamo detto che la diagnosi diretta va a dosare gli anticorpi. Le prime a comparire sono le

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IgM, i primi ma quanto primi? Ci vogliono sempre due – quattro settimane perché compaiano. Dopodichè che cosa succede? Le IgM rimangono presenti circa fino al secondo mese da un’infezione ma questo vale sia per le batteriche che per le virali, dopodichè vanno calando ma a quattro settimane dall’infezione già mi compaiono le IgG, quindi il potere capire se è in fase acuta se è in fase di remissione è importante l’andamento di questi due anticorpi, è chiaro? Quindi prima compaiono le IgM però ci vogliono sempre quelle due settimane, due – una, a volte un po’ prima… In media, diciamo in media. Poi queste qua vanno calando, in due mesi si levano davanti, circa in due mesi. Può essere anche in tre, un mese e mezzo, dipende. Ognuno risponde in maniera diversa. Dopodichè se la situazione si risolve le IgG rimangono per un bel po’, le IgM scompaiono, però le IgG rimangono per un bel po’ presenti. A volte in alcune infezioni rimangono presenti per tutta la vita, per esempio, nella maggior parte delle infezioni virali. Per esempio se io ho avuto il morbillo e non mi sono fatta la vaccinazione perché ai miei tempi non c’era la vaccinazione antimorbillosa e mi sono beccata l’infezione in quanto tale, è ovvio che se io oggi mi vado a dosare gli anticorpi qualche residuo di anticorpi IgG ce l’ho. Quindi ce l’ho ancora gli anticorpi, nonostante siano passati decenni da quando ho avuto il morbillo. Perché c’è una sorta di memoria immunologica, giusto?

Allora ecco qua c’è il quadro della situazione, le IgG permangono per anni, a volte permangono le IgG per tutta la vita. Diagnosi indiretta quindi dimostrazione di anticorpi specifici della classe IgM in ogni singolo campione di siero però se la dimostrazione di una sieroconversione, cioè c’è il siero che prima era negativo e non aveva gli anticorpi (questo significa sieroconversione) e ora ha gli anticorpi hanno avuto un incremento del titolo anticorpale di almeno quattro volte in campioni prelevati uno in fase acuta e uno in fase di convalescenza, questo dimostra che cosa? Dimostra che la malattia, intanto che a questa malattia puoi dare un nome perché l’anticorpo che vai a dosare è un anticorpo specifico, giusto? E poi questo è quello che avviene nelle prime fasi che poi dovrei seguire nel tempo e dipende dall’agente eziologico che hai davanti se è un virus epatitico o un HIV è chiaro che lo devi seguire nel tempo ma se stiamo parlando invece di un’infezione abbiamo detto per esempio dell’epatite A e allora quella è un’infezione acuta che si risolve nell’arco di venti giorni o anche di meno, dipende dalla risposta cellulomediata soprattutto e poi anticorpale del soggetto che l’ha acquisita e quindi vedrai che per un bel po’ rimarranno presenti soltanto le IgG ma poi andranno a scemare nel tempo. Se permangono le altre è un campanello d’allarme. Vediamo la diagnosi diretta.

La diagnosi diretta si avvale di alcuni metodi che sono strettamente legati alla diagnostica virologica che non trovate nella diagnostica batteriologica e uno di questi è la neutralizzazione, ma neutralizzazione di che cosa? Allora io cerco degli anticorpi neutralizzanti ma che neutralizzino che cosa? Dipende dal virus. Se io voglio fare, per esempio, una diagnosi per un virus respiratorio sinciziale e allora questi virus voi lo sapete a quale tipo di famiglia di virus appartengono i virus respiratori? È l’RSB, appartiene ai Paramixovirus. Vi ricordate come sono fatti i Paramixovirus all’esterno del capside e del pericapside? Hanno delle agglutinine, vi ricordate? L’emagglutinina e la neuraminidasi, ve le ricordate queste strutture? Sono degli antigeni strettamente virali che appartengono sia agli Orthomyxovirus, sia ai Paramixovirus quindi tutti dall’influenza, all’RSB, al Parainfluenza a tutto quello che c’è in queste due famiglie e in più al Parvovirus. Il Parvovirus c’è uno importante e patogeno per l’uomo che è il Parvovirus B19, ve lo ricordate? L’avete fatto in virologia? Anche questo ha questa emagglutinina e allora se io devo fare una reazione di inibizione dell’emagglutinazione lo posso fare solo per quei virus che hanno questa capacità e questa capacità di agglutinare le emazia (questa è l’emagglutinzione) è appannaggio di quei virus che hanno questi antigeni. Perché se io cerco di emagglutinare un Rinovirus, il Rinovirus appartiene ai Picornaviridae, quindi è un virus nudo e non ha emagglutinine. Vi ricordate qual è il recettore che usa per penetrare all’interno delle cellule? È il virus del raffreddore comune il Rinovirus. Non ha né emagglutinina né neuraminidasi… Li avete fatti? No… Il Poliovirus, nessuno vi ha fatto un cenno? L’Enterovirus 71, no? Niente? E come faccio? Lasciamo perdere… Allora ritorniamo a quelli che hanno l’emagglutinina, quindi una diagnostica possibile è quella di andare a neutralizzare questa capacità che hanno questi virus. Quindi dobbiamo mettere il virus in i globuli rossi, se il virus agglutina i globuli rossi, bene e questo è un dato di fatto perché ha l’emagglutinina che agglutina i globuli rossi ma a questo punto non ho capito niente. Per cui se è una reazione indiretta, giusto? Io devo avere il siero del paziente. Il siero del paziente potrebbe avere gli anticorpi anti-emagglutinina perché, vi ripeto, questi antigeni,

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emagglutinina e neuraminidasi, si trovano in delle ______?____ di questi virus che ci sono all’esterno del pericapside e quindi sono le prime cose a contatto con il sistema immunitario competente e che cerca di neutralizzare questo virus, quindi formerà anticorpi neutralizzanti. Io cerco questi anticorpi neutralizzanti nel siero del paziente, come? Sfruttando la capacità che hanno questi… io c’ho già il virus in laboratorio, c’ho le mie emazie, non le mie, c’ho le emazie ___?___ il virus, faccio questa miscela virus emazia e aggiungo il siero del paziente ovviamente farò delle ________?_________ .

Se il siero del paziente contiene anticorpi neutralizzanti mi dovrà _____?______ agglutinazione, è chiaro? Ora vi farò vedere delle immagini, magari ci torneremo sopra. Allora ora lo vediamo qui in dettaglio questo meccanismo e poi ci sono anche delle immagini che vi possono aiutare, non vi preoccupate. Ma oltre a neutralizzare… e allora questa reazione è appannaggio solo di alcune classi di virus ma ce ne sono altre, ad esempio, ci sono dei virus che a contatto con delle cellule in coltura, perché voi sapete che il virus si moltiplica esclusivamente nelle cellule perché è un parassita intracellulare obbligato e quindi è chiaro che non lo posso coltivare nei terreni che si usano in batteriologia che sono dei veleni amorfi senza cellule, giusto? Perché c’è agar, sostanze nutrienti e così via… devo usare un substrato di cellule viventi, in perfetta salute tra l’altro. Quindi queste cellule coltivate in vitro se io metto un virus che ha una capacità di formare un effetto citopatico, si chiama. ECP, è un effetto citopatico e significa che se il virus penetra in questa cellula in qualche maniera la modifica anche morfologicamente. Quindi se era una cellula, per esempio, fibroblastica, sono delle cellule allungate e io le infetto con un virus citomegalico, vi faccio quest’esempio perché sicuramente mi seguite meglio. Vi ricordate che il virus citomegalico che si chiama in questa maniera perché “cito” vuol dire cellula e “megalo” grosso e virus, ok? Significa che questo nome gli è stato dato proprio dall’effetto citopatico che provoca sulle cellule in coltura, vi ricordate le cellule a occhio di civetta? Da qualche parte c’è scritto così, a occhio di gufo, a occhio di civetta. Perché queste cellule si ingrossano, si formano delle grosse inclusioni. Quindi questi virus, tipo l’Herpes, per esempio, l’HSB può formare dei sincizi bellissimi, lo stesso virus respiratorio sinciziale può formare dei sincizi. Quindi diciamo che ogni virus crea un danno alle cellule in coltura che se non fossero state infettate allora avrebbero un aspetto e che se invece sono infettate cambiano completamente morfologia. Intanto si vanno arrotondando e poi siccome queste cellule che si usano per fare questa diagnosi sono delle cellule in linea continua, queste cellule vengono coltivate in delle fiacche particolari per colture cellulari e si possono osservare al microscopio che è un invertoscopio. L’avete sentito sicuramente in biologia, in microbiologia. L’invertoscopio è un microscopio al contrario dove la luce non viene dal basso ma viene dall’alto.

Allora voi potete addirittura mettere l’intera fiacca, sono delle fiacche di plastica con un tappo dove c’è un terreno liquido ricco di nutrienti per coprire questo strato di cellule che poi se noi dobbiamo inoculare con un Herpes, il liquido di una vescicola che è stata presa o dal volto o dai genitali dobbiamo vedere se c’è in effetti questo virus, lo aggiungiamo a queste cellule, se la morfologia di queste cellule cambia, e ora vi faccio vedere degli esempi che ho delle belle immagini, quella è la presenza dell’effetto citopatico del virus ma non è sufficiente che io possa dire è tale virus perché vedo solo una diversa morfologia cellulare. Per potere dire è, intanto mi da un’indicazione, mi dice che c’è il virus. Poi io queste cellule le posso anche trattare con degli anticorpi monoclonali fluorescenti, per esempio. E allora metti che l’anticorpo monoclonare è contro il citomegalo virus, questa cellula infettata dal citomegalo virus assume una colorazione particolare che allora io dico è… mentre se io metto il monoclonale per l’Herpes, l’Herpes di tipo 1 o di tipo 2 o 3, quello che volete, non succede nulla quindi non c’è fluorescenza. E allora io dico bene, allora sicuramente siamo di fronte a un’infezione citomegalica. Quindi già ho avuto l’indicazione della morfologia particolare di queste cellule, citomegacellule, va bene? Grosse, sembra che abbiano due occhioni, poi in più gli aggiungo l’anticorpo monoclonale che può essere fluorescente e allora vedo la fluorescenza o che mi da un’altra… di solito è un’immunofluorescenza.Quindi vedete la neutralizzazione deve essere quell’anticorpo che io cerco che mi va a neutralizzare o quest’effetto, perché ovviamente io farò dei controlli. Controllo con il virus sicuramente di cellule sicuramente infette, controllo delle mie cellule che ho coltivato con la vescicola e poi vedo la differenza. È chiaro che uno sarà negativo e l’altro sarà positivo, giusto? Se c’è il virus, se non c’è sono tutt’e due negative. Perché facciamo sempre dei

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controlli positivi e controlli negativi. I controlli sicuramente _____?_____ ma quelli servono per comparare il risultato ed essere certi del dato che si dà.

Ritorniamo a noi, quindi è inibizione dell’emoagglituinazione per quei virus che hanno l’emagglutinina, inibizione per effetto citopatico, ECP sta per effetto citopatico, per quei virus che danno _________?_______ . __________?___________ localizzazione ma poi per essere certi dell’inibizione dell’effetto citopatico devo ulteriormente rifarmi a un’immunofluorescenza o un test… sono poco usati per evitare di usare radioattivi si tende oggi a non fare più un test RIA in nessun settore dell’analitica per evitare di ulteriormente inquinare l’ambiente con radioisotopi. E poi per esempio i test immunoenzimatici ELISA di cui abbiamo parlato ampiamente l’altra volta ed è l’immunoblot, di cui abbiamo parlato anche l’altra volta, vi ricordate? Allora ora vediamo più nel dettaglio, ecco l’emagglutinazione è l’agglutinazione dei globuli rossi da parte di virus, ma da quali virus? Quelli che hanno l’emagglutinina altrimenti non possono agglutinare. E allora vedete, che cosa c’è? Redblood quelli sono gli anticorpi, quello è il virus, si formano questi ponti di legame fra gli anticorpi e il virus e avviene un’agglutinazione che _____?_____.

Diamo per scontato il fatto che il virus e i globuli rossi e che quei dati virus con i globuli rossi agglutinano. Nella nostra miscela quindi dobbiamo avere le diluizioni scalari del siero in esame che non sappiamo se ha questi fattori, questi anticorpi inibenti l’emagglutinazione. Abbiamo una quantità standard di virus che emagglutinano. Cioè il virus non è del paziente, il virus ce l’ho io in laboratorio e so che ne devo mettere un tot e poi abbiamo… quindi mettiamo una quantità standard di virus e la sospensione di globuli rossi. Ovviamente nel siero abbiamo detto diluizioni scalari me se guardate sotto anche se l’immagine è un po’… nella parte, se guardate in questa parte della diapositiva, vedete qua ci sono le varie diluizioni del siero e in particolare qui c’è una diluizione 2 4 8 16 64 128. Queste sono diluizioni a raddoppio del siero che vogliamo esaminare. E allora vedete un po’ alla fine io devo dire a te medico che vieni da me in laboratorio ti devo dire quanti anticorpi ha questo e come lo esprimo? Devo dare un titolo, il titolo significa che corrisponde alla quantità di quella cosa. Un titolo di anticorpi corrisponde a un valore che si dice è alto, è basso. Questo è il titolo, non è il titolo nobiliare ma è il titolo… quindi ogni titolazione virale o anticorpale equivale a un numero e il numero in questo caso è il titolo degli anticorpi emagglutinanti, la più alta diluizione di questo siero significa che contiene meno, man mano che lo diluisci, che contiene meno anticorpi agglutinanti, giusto? Quindi è la più alta diluizione del siero capace di prevenire l’emagglutinazione, questo è il titolo che poi si da, vi è chiaro? Se non vi è chiaro lo ripetiamo.

Allora, vieni tu nel mio laboratorio e vuoi fatto un titolo anticorpale di anticorpi antiagglutinanti allora io devo sapere ma scusami che cosa testo? Tu mi dici ho avuto una forma simil influenzale, non so bene ecc e allora io cosa penso? Penso ai virus che hanno l’emagglutinina, se penso ai virus che hanno l’emagglutinina se tu hai avuto uno di questi virus, un parainfluenza, un parvovirus avrai nel tuo organismo gli anticorpi quindi io vado a cercare i tuoi anticorpi. Non cerco altro, prendo il tuo siero e cerco gli anticorpi, tu mi dai il tuo siero e te ne vai dal laboratorio. Allora io ti dovrò dare un titolo a questo siero, ti devo dire il tuo siero ha un milione di unità emagglutinanti… c’ha dieci unità emagglutinanti… non ne ha, ti sei sbagliata. Ok? Quando io ho a disposizione questo siero, questo siero dovrà… cosa cerco nel siero sono gli anticorpi antiagglutinanti ma io per vedere tutto questo devo avere a disposizione qualcosa che agglutina, giusto? Chi è che agglutina? Abbiamo detto i globuli rossi e i virus. Quindi io ho il virus della parainfluenza, il virus dell’influenza e mi faccio questa sorta di… ehm… mi preparo tutte queste provette, poi preparo il tuo siero e lo voglio testare sia contro il virus influenzale, sia contro il virus parainfluenzale. Me lo voglio testare contro diversi virus ma mettiamo che per fare le cose più semplici voglio cercare il virus dell’influenza, voglio sapere se tu hai un titolo di anticorpi emagglutinanti contro il virus dell’influenza perché se ti faccio più ci confondiamo, facciamo uno solo. Allora io ho nel mio laboratorio in una provetta, congelato il virus influenzale. In un’altra provetta, nel frigorifero in questo caso perché non lo posso congelare e scongelare perché si spaccano i globuli, c’ho i globuli rossi. Allora prendo dal congelatore il virus che so già quanto ne ho per ml e allora faccio una bella miscela in questi pozzetti, una micropiastra con tanti pozzetti e metto tot virus, tot globuli rossi e tot siero tuo. Il tuo siero però non lo saggio così com’è, faccio tante diluizioni. Quindi per ogni diluizione del tuo siero farò un pozzetto, allora se il tuo siero c’ha gli anticorpi l’agglutinazione che fa? Me la inibisce l’agglutinazione, no? Perché è un siero che

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contiene anticorpi antiagglutinanti e quindi vuol dire che ti sei beccata l’influenza e io lo sto vedendo con questa reazione, mentre se tu non ti sei beccata l’influenza e io metto lì il virus influenzale, ho messo le emazie, sto mettendo il tuo siero. Il tuo siero non contiene niente, queste emazie che fanno? Agglutinano, se no non agglutinano e allora vedete che la differenza fra il bottoncino e il non bottoncino, ok ora? Perché io sono pronta a ripeterlo anche trenta volte, giusto per affliggervi. Vi è chiaro?

Ecco qua c’era quest’immagine che era pure meglio per la mia spiegazione comunque questo è un riassunto delle puntate precedenti, guardate qui gli anticorpi, gli anticorpi dal siero del paziente abbiamo detto ______?_____ i virus. Vedete che l’anticorpo reagisce col virus quindi saturando… questi antigeni virali che sono le agglutinine, l’ema si chiama nello specifico emaglutinina per questo motivo perché agglutina i globuli rossi se no l’avrebbero chiamata in un’altra maniera. Neutralizza gli anticorpi o neutralizza il virus quindi non si può avere l’agglutinazione. Posso andare avanti?

Questo è l’ (hemofol myxovirus?) la stessa cosa: siero del paziente addizionato all’emagglutinina del virus influenzale, questo è l’esempio che abbiamo fatto poco fa e quindi positivo per l’emagglutinazione perché c’è stata una reazione fra l’anticorpo e il virus, negativo vuol dire che non c’era l’anticorpo specifico. La presenza di anticorpi specifici antiemagglutinina, attività derivante dei globuli rossi è inibita. Se invece in assenza di anticorpi specifici antiemagglutinina l’attività derivante dei globuli rossi è rilevabile. RBC sono Red Blood Cell. Ricerca di anticorpi neutralizzanti, test di neutralizzazione per virus ad esempio Polio, ecco quest’esempio forse non è calzante visto che mi avete detto che il virus Polio non l’avete studiato… in questo caso quindi che cosa neutralizziamo? Il virus Polio è un Picornavirus, quindi ce n’ha emagglutinine? Ce n’ha o non ce n’ha? Ve lo ricordate com’è fatto, per esempio, il virus dell’epatite A? Pure quello è un Picornavirus. Il Rinovirus che è il virus del raffreddore, sono dei virus nudi non hanno pericapside, quindi queste agglutinine di solito chi ce l’hanno? Ce l’hanno quei virus che hanno il pericapside, avevamo detto Ortho, Para… giusto? Quindi io qua il virus Polio che cosa gli posso neutralizzare? Gli posso mai fare una reazione di emagglutinoinibizione per scoprire se ha gli anticorpi? No, non avrebbe senso. E allora che cosa posso neutralizzare invece dell’emagglutinazione, l’effetto citopatico e quindi i virus che danno un effetto citopatico, quindi che coltivati su delle cellule danno questo cambiamento visibilissimo della morfologia cellulare possono essere… questo può essere sfruttato per fare diagnosi. Quindi andiamo a neutralizzare, in questo caso, non più l’emagglutinazione ma andiamo a neutralizzare l’effetto citopatico.Qualche cellula vera… _________?_________ . Qui ci sono le fiasche, queste fiaschette, in queste fiasche si coltivano le cellule, vedete quel liquido _____?______ , quello è un liquido, un terreno di coltura per le cellule perché è abbastanza ricco di diversi componenti.

Ecco, per esempio, vedete in quest’immagine è un po’ sfocata si però rende l’idea. Nella parte superiore dell’immagine c’è mostrato come è possibile osservare al microscopio invertito o invertoscopio che dir si voglia, quella fiasca che abbiamo visto prima, poi si osserva… non è colorata, quindi per questo ha questa sorta di colorino marroncino, è stato fatto apposta il contrasto per farvelo vedere. Non sono colorate queste cellule, quindi si vedono i contorni, vedete che i contorni delle cellule è lo stesso tipo di cellula prima dell’infezione virale e sotto dopo l’infezione virale. Vedete che le cellule… Allora sopra abbiamo uno strato di cellule, sotto vedete le stesse cellule, vedete che sono più scure che sono arrotondate e che ci sono delle zone in cui si sono già staccate le cellule dal supporto della plastica. Questa è una plastica dove crescono… è una plastica particolare che ha una particolare carica ionica e dove queste cellule possono aderire più facilmente. È particolarmente trattata, ovviamente tutto è sterile, altrimenti se ci fosse un’infezione batterica non si capirebbe più nulla. Quindi questo che vedete qua, ed è realmente quello che si vede al microscopio è la trasformazione morfologica di un monostrato di cellule in seguito a infezione con il virus. Ora qua che virus hanno usato non lo vedo… Un? _______?________ ah quindi proprio ci siamo, era quello che vi volevo dire e siamo qua. Allora in queste immagini quelle specie di macchie rosa che vedete sarebbero le cellule. Positivo o negativo, che cosa significa? Stiamo cercando di neutralizzare… allora io c’ho, al solito, il siero del paziente, questo siero del paziente con chi lo metto a contatto? Con il virus, faccio una bella miscela. Li tengo a contatto per almeno un’oretta, per cui il virus se c’è, l’anticorpo si lega al virus. Poi piglio questa miscela e la metto sulle cellule, se le cellule mi si infettano significa che non c’erano anticorpi, giusto? È al contrario, se si infettano non c’erano gli anticorpi neutralizzanti. Se invece le cellule che

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fanno? Non si infettano, che cosa significa? Che ci sono gli anticorpi che hanno neutralizzato il virus e quindi non gli hanno fatto espletare questa sua capacità di formare un effetto citopatico. È chiaro?

Il Polio l’ho maneggiato molte volte, intanto perché sono vaccinata… _____?______ ci sono delle protezioni particolari, ci sono delle stanze particolari in cui non si lavora su un bancone, si lavora in delle cabine sterili. Sono delle cabine appunto verticali dove ci sono una serie di filtri che prendono l’aria e la filtrano continuamente, sia per proteggere il materiale, sia per proteggere l’operatore. Ma ci sono delle cabine dove si può fare ricerca, per esempio, per l’HIV è chiaro che devi avere particolari… allora ci sono, c’è… queste cabine con questi filtri tu non li vedi i filtri, senti solo questo flusso d’aria continuo, poi c’hanno davanti un cristallo molto spesso, due fori in questo cristallo, ci sono dei guanti, dei guanti lunghi fin qua. Quindi tu metti il braccio, infili questo guanto, metti l’altro braccio. Metti già i guanti per i fatti tuoi e poi ci metti _____?______ e lavori sotto questa cappa, poi questa cappa dove lavori, di lato c’è una sorta di scaffale, diciamo così, dove tu in questo scaffale puoi intanto prendere il materiale da fuori, per esempio a me serviva il terreno che devo coltivare l’HIV, devo vedere se infettava delle cellule linfoidi, per esempio dei linfociti T. C’è una linea molto comune che si chiama Jurkat. Sono dei linfociti derivati da un linfoma umano. Ora tu sai benissimo che l’HIV si replica dove su linfociti, soprattutto si replica sui linfociti. Infetta pure i macrofagi e si replica pure sui macrofagi ma preferenzialmente sul macrofago tende a integrarsi, giusto? Mentre per replicarsi preferisce replicarsi sui linfociti T, si integra anche lì per carità però tende di più a… quindi se devo vedere se si moltiplica io uso delle cellule T. Siccome ci sono delle colture cellulari di cellule T, ci sono di tante cose, ora se abbiamo il tempo se parliamo se no continuiamo poi la chiacchierata perché se vi interessa...

Se io ho bisogno quindi della fiasca, di una fiasca pulita, del terreno. Le metto in questa sorta di armadietto, quest’armadietto dentro gira su un perno. Sai quegli armadi da cucina che tu li fai girare e ce l’hai sempre a disposizione? Ecco! Più o meno quelle ____?____ . Quindi tu prima di infilare le braccia ti prepari tutto quello che ti serve, il materiale dentro questa sorta di armadio, chiudi lo sportello, __?___ sotto la cappa, apri l’altro sportello dove c’è sotto la cappa e tiri fuori le tue fiasche, il terreno, tutto quello che ti serve, quello che hai messo prima, le pipette, le provette… quindi sei protetto. Non solo ma queste stanze dove si trovano queste cappe particolari che sono ____?____ 1, 2 e 3, cioè a seconda di quello che maneggi. Se maneggi cose molto pericolose devi andare nella cabina più… che ha questi requisiti di protezione sia dell’operatore che del materiale che stai maneggiando. Mentre se tu maneggi, che so, la Brucella oppure, che ne so, il Polio… io il Polio lo maneggio molto così perché… ora non ce l’abbiamo più perché ce l’hanno fatto distruggere una decina di anni fa. Tutti i laboratori sono stati invitati a distruggere il virus Polio perché si era pensato che non c’era più la Poliomielite, anzi oggi tendono pure a non vaccinare più, sbagliatissimo secondo me. Tra l’altro c’è un vaccino virus ucciso che è il vaccino di Salk che è innocuo e quindi si può usare… pensate che io sono stata vaccinata con il vaccino di ______?_______ che era un vaccino a virus vivo, zuccherino, goccina, zuccherino e… ci sono stati dei problemi per alcuni con quel tipo di… perché…

Siccome stiamo parlando di un Polio, come si piglia un’infezione poliomielitica? Esatto è un enterovirus e quindi se io piglio quello nel braccio è quello a virus ucciso ma se io prendo un virus vivo devo fare lo stesso percorso del virus infettante. Infatti l’immunità che dava la vaccinazione di Sabin non aveva nulla a che fare con l’immunità che da quello di Salk però siccome in quello di Sabin che era a virus vivi, questo virus che era vivo e attenuato quindi aveva perso la capacità neurotropa, si moltiplicava lo stesso nell’intestino. Il problema fu che a distanza di 48 ore le feci di queste persone che erano state vaccinate ___?____ con il vaccino di Sabin si ritrovavano dei virus virulenti non più attenuati e quindi una distrazione igienica, soprattutto in un bambino è possibile, poteva intanto infettare gli altri abitanti della casa o un fratellino o una sorellina. Successe qualcosa del genere, infatti, proprio perché successe una cosa del genere si scoprì la pericolosità, ripeto, era quella che questo virus faceva tutto questo percorso e si rinvigoriva, da attenuato che era, perché si attenuava con non so 24 o 25 passaggi in colture di cellule, perdeva il potere neurotropo, quello è il problema perché il virus ad un certo punto va a colpire le corna anteriori del midollo spinale ____?______ più o meno a seconda dove colpisce la paralisi può essere degli arti inferiori, degli arti superiori, poi può essere bulbare e a quel punto muori pure. Quindi questo vaccino vivo era stato attenuato con questi passaggi in colture cellulari. Il problema fu che nelle feci si ritrovò questo virus,

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nelle feci delle persone che erano state vaccinate e quindi potevano essere fonte di infezione per altri. Oggi non si fa più, si fa il vaccino di Salk e si fa la punturina sottocute ed è un virus ucciso col formolo o col calore,,, no col formolo credo che sia stato ucciso. Quindi è più sicura perché non ci può essere una riattivazione perché essendo ucciso il virus che cosa uccide di questo virus? Hanno ucciso la sua capacità di replicarsi e hanno ucciso la sua capacità, dell’acido nucleico che nello specifico è un RNA positivo a fungere da messaggero e innescare la replicazione virale. Quindi non c’è questa possibilità nel Salk, non si può riattivare una cosa morta. Per cui che cosa funziona? Funziona come evocatore di una risposta immune il capside perché pericapside non ne hanno, il capside di questo virus. È chiaro?

Ritorniamo a noi, quindi questo virus… virus che tra l’altro ehm… nei paesi industrializzati, non voglio usare altre parole, è scomparsa questa malattia però pare che ci siano dei focolai non nei paesi industrializzati ma nei paesi del terzo mondo. Ora con tutta questa circolazione umana che c’abbiamo oggi e questa grande accoglienza che abbiamo oggi, perché noi siamo molto accoglienti e accogliamo tutto ci accogliamo pure queste cose. Quindi dobbiamo stare un po’ così con gli occhi sbarrati, stare un po’ più attenti a vedere ____?___ sentinella. Perché se ci siamo importati la sifilide grazie a… chi ce l’ha portata la sifilide? La sifilide fino a dieci anni fa c’avevamo qualche caso di sifilide ____?_____ che continuava a essere positivo. Ora la sifilide ha avuto un revival meraviglioso, stupendo. In più ci siamo ritrovati ad avere ancora qua da noi non ci sono stati casi diagnosticati ma in Italia in altri posti si, quell’ultima Haemophilus ducreyi non c’era, non esisteva da noi era appannaggio di America del Sud, di zone del continente africano ma vi rendete conto che… ci siamo beccati, giusto per non lasciare nessuno fuori, ci siamo ribeccati, c’è stato un altro revival di tubercolosi che è endemica nello Sri Lanka, è endemica in India, è endemica in quei paesi. Quindi è chiaro che tutta questa circolazione che ci arricchisce moltissimo, ci arricchisce soprattutto dal punto di vista culturale sicuramente ma non riarricchisce dal punto di vista delle malattie e fa parte del gioco, quindi ci sono i pro e ci sono i contro. Bisogna tenerli in giusta considerazione.

Andiamo avanti, qui vi fa vedere assenti effetto citopatico, anticorpi neutralizzanti, se sono presenti gli anticorpi neutralizzanti e assenti ovviamente l’effetto citopatico. Se invece gli anticorpi neutralizzanti sono assenti ci sarà l’effetto citopatico perché il virus ha tutta la sua capacità di funzionare e di distruggere le cellule, le cellule vedete che hanno un aspetto diverso nei due schemi. Lì sono cellule sane, lì sono cellule infettate. Quelle cose blu sarebbero i nuclei delle cellule, non sono i virus. Qua vi fa vedere come _____?_____ titolazione di anticorpi neutralizzanti facendo una diluizione scalare del siero. Allora abbiamo parlato, abbiamo accennato a queste _____?_____ però ora le vediamo un po’ più nello specifico ____?_______.

Essendo i virus, lo sapete, parassiti endocellulari obbligati per poterne ottenere la moltiplicazione in laboratorio è necessario disporre di cellule viventi, o in animali da laboratorio ma oggi si tende a lavorare più in vitro che in vivo. In vivo non si lavora neanche più da nessuna parte, intanto perché è costosissimo, gli altri motivi a me sono sconosciuti, solo perché è costosissimo. Intanto perché l’animale da laboratorio può essere utile per fare degli esperimenti perché altrimenti non ci sarebbe nessun progresso poi d’altronde sono dei topini e dei ratti che vengono coltivati da certe ditte appositamente per fare gli esperimenti. Io sono una che li adora gli animali, non che li ama, che li adora gli animali. Sicuramente non farei mai un esperimento su un cane o su un gatto ma su topi… ne ho ammazzati nella mia vita migliaia, ratti non li conto e non vi dico. Se volete fare di me un’assassina, fate pure. Però se c’è una necessità, ecco certo non è che possiamo testarlo sugli altri esseri viventi, là sarei assassina. Se io potessi testare un farmaco, una qualsiasi altra cosa su un altro essere vivente sarei una pazza. Però se io lo faccio su un topino che è coltivato ad hoc, che è fatto crescere, fatto moltiplicare… anche perché ogni topino costa trenta euro non è che costa niente perché sono topi particolari, devono essere ben nutriti, devono essere senza infezioni e quindi gli animali da laboratorio per fare che cosa? Faccio ricerca ma se devo fare diagnostica non mi rivolgo all’animale da laboratorio, ok? La diagnostica si fa in colture cellulari in vitro. In vitro significa che facciamo coltivare delle cellule in vitro, ora vediamo come le facciamo coltivare. Guardate le cellule possono crescere in quelle bottigliette che vi ho fatto vedere prima o adese oppure in sospensione. Le cellule in sospensione che non hanno capacità di adesione sono le cellule di origine ematica e le cellule che vi dicevo di cui parlavo… linea cellulare Jurkat di origine da un linfoma sono cellule che crescono in sospensione. Una cellula in sospensione che aspetto ha secondo voi? Sia che sia fibroblasta, sia che sia… se io la tengo in

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un liquido in sospensione è sferica. Quindi la cellula in sospensione è sempre sferica poi quando vanno ad aderire, quelle che possono aderire, quelle che hanno capacità di aderire e sono quelle che non sono di derivazione dal sangue umano e allora assumono questo aspetto____?______. Sopra sono le cellule epiteliali, endoteliali e poi i fibroblasti che sono quelle affusolate, quelle sotto sono le cellule neuronali. E queste si osservano al microscopio invertito, ecco qua vi fa vedere le cellule di origine nervosa, epiteliale che fanno parte del tessuto solido crescono per adesione, quelle in sospensione sono le cellule di origine ematopoietica che vivono in un ambiente fluido e hanno capacità di… si sono adattate a vivere… e sono sempre tonde. Ora vi faccio vedere degli esempi, questi sono delle cellule adese endoteliali viste con un ingrandimento maggiore. Queste al microscopio ottico perché queste sono colorate, poi queste sono le famose cellule di Jurkat che sono _____?______ dai linfociti T e con sospensione, vedete che sono tondeggianti. Questi sono i terreni di coltura, che cosa devono contenere per mantenere le cellule in vita? Hanno acidi, sali minerali in più vanno aggiunti a parte questi fattori nutrienti, si deve tenere conto dell’ambiente fisico e dell’ambiente chimico, del pH, della temperatura che deve essere a 37 °C, ci sono degli incubatori che mantengono la temperatura, ci sono degli _____?_______ a CO₂ che mantengono anche un certo grado di anidride carbonica che serve anche come tampone per il pH cellulare. Contengono il siero fetale bovino, il siero fetale bovino si usa perché contiene tanti fattori di crescita e alcuni dei quali favoriscono anche l’adesione delle cellule al supporto di plastica. Poi ancora si aggiungono degli antibiotici che servono per evitare le infezioni da parte dei batteri.

Ci sono due tipi di colture cellulari: le colture primarie e le linee cellulari continue. Le colture cellulari primarie sono universalmente riconosciute come il migliore sistema colturale in quanto replicano lo spettro più ampio di virus e in quanto si avvicinano di più alle cellule in vivo. Perché sono cellule diploidi e perché, per esempio, come si ottengono? Se io voglio ottenere una coltura primaria io di solito lo facevo sempre dal topino… io prendo un topino, prima lo anestetizzo con… poi dopodichè _______?_________non va in anestesia, passa dall’anestesia alla morte, per cui non sente niente. Per cui io posso prendermi queste cellule, per esempio, del tessuto muscolare. Mi servono le singole cellule, quindi io devo trattare questo pezzo di tessuto con delle sostanze tipo la tripsina, le_______?________ che scindono i legami tra una cellula e l’altra e alla fine di tutto questo processo che dura un paio d’ore, è un processo chimico ovviamente, avrò le singole cellule separate. Queste cellule sono cellule normali con un corredo diploide e quindi queste sono colture primarie. Queste colture primarie servono perché, ad esempio, alcuni virus tipo il virus citomegalico cresce solo su coltura primaria, nelle linee cellulari continue non cresce. Si possono anche comprare perché c’è una banca di cellule, una banca mondiale che serve sia in Europa che in America e si scambiano pure queste linee cellulari, sia primarie che non. Quindi si possono comprare ma costano una enormità.

Allora il problema delle colture primarie è che vivono non più di 15 – 20 passaggi. Io queste cellule le prendo le metto in un monostrato ma un po’ me le congelo per la prossima volta perché se no poi che faccio sempre la stessa cosa? Un pochino mi servono, le altre me le congelo. Ora quante volte io posso scongelarle e metterle in coltura? Se io le metto in coltura e non le infetto posso ehm… si chiama passaggio, posso fare un ulteriore passaggio. Quindi le ____?______ le tolgo dalla plastica e da quelle _______________?_____________ perché poi si moltiplicheranno da una bottiglia almeno ne faccio due. La capacità di replicazione di queste… Da un passaggio… da una bottiglia se ne fanno due e così via. Questo fatto si può fare per un numero limitatissimo di volte perché poi vanno incontro ad apoptosi e morte. Questo le colture primarie, le colture invece in linea continua sono delle cellule di origine tumorale che si moltiplicano un numero di volte indefinito, immaginate che abbiamo in laboratorio le cellule He – La che sono state prelevate da un carcinoma del collo dell’utero di una signora che si chiamava Helena Lambert, He – La sta per questo. Sono famosissime sono scritte in tutti i libri. Quindi queste cellule sono state prelevate da questo carcinoma del collo dell’utero che aveva questa donna nel 1952, ancora oggi, sono passati sessantadue anni, sono nei laboratori di tutto il mondo ed è una linea cellulare. Perché è una linea di origine tumorale. Quindi queste cellule hanno perso l’inibizione da contatto, si moltiplicano alla grande perché essendo cellule tumorali hanno perso tutti i freni inibitori e si moltiplicano, non fanno neppure il monostrato fanno i pluristrati, cioè tu le vedi che a un certo punto se non le passi entro un certo limite, se le tieni un giorno in più in coltura si formano delle montagnette di cellule. Quindi non è più un monostrato ma formano dei pluristrati. Le più famose sono le

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He – La, le cellule velo, le cellule HB2. Queste sono più facili da gestire ma se si replicano il numero di cellule è più limitato qua bisogna tenere conto del tropismo virale. Il concetto di tropismo virale sicuramente ce l’avete, se non ce l’avete ve lo dico in due parole. Hanno un’affinità per alcune colture e per altre no. Per esempio il virus epatitico ha un’affinità di tropismo per una cellula epatica e non per una cellula nervosa. Il Polio virus, invece, ha un’affinità per la cellula nervosa. Che poi a seconda di quello che io devo studiare, o devo analizzare, devo avere a disposizione quella data cellula che ha il recettore giusto per potere replicare quel virus e non un altro, va bene? Quindi bisogna tenere conto del tropismo cellulare e del tropismo virale che poi sono la chiave e la serratura di questo meccanismo.

Lo leggi tu che mi brucia la gola?

“La coltura primaria è una coltura preparata indirettamente da_________?__________, le cellule sono in grado di compiere un numero finito di divisioni cellulari in vitro dopo dei quali va incontro ad apoptosi, fenomeno che avviene indipendentemente dalla presenza di metaboliti ______?________. I vantaggi: le cellule isolate riflettono una maggiore probabilità di affinità biochimiche delle cellule. Gli svantaggi che hanno una vita limitata. La linea cellulare continua _______?__________”

O indotta, la possiamo indurre noi con delle sostanze chimiche. Prendiamo una linea primaria e la trasformiamo, mettiamo un virus oncogeno e la trasformiamo e da linea primaria mi diventa linea cellulare.

“Derivazione: la coltura primaria da tumori o da manipolazioni genetiche di colture primarie particolare. Le cellule trasformate presentano delle caratteristiche simili alle cellule cancerose. I vantaggi: le cellule clonali, facili da coltivare________?________Svantaggi: non riproducono esattamente l’ambiente fisiologico ________?_______”Queste sono due. Vedete quella specie di montagnetta, quelle sono le cellule tumorali e quelle la no.La coltura primaria a breve termine, vedete? Dieci duplicazioni. La coltura più a lungo termine ma sempre primaria oltre le sessanta duplicazioni non va.La linea cellulare è immortale. Questa è quella che dicevo io la He – La _______?________Vedete le He – La _______?__________Questa banca dati che si trova in America che ha tutta questa teca di cellule di varia natura, di varia origine e queste sono le He – La human carcinoma. Le cellule epiteliali del carcinoma della cervice in una donna di 31 anni… Questi sono tutti dati che hanno in questa sorta di catalogo di banca mondiale. Hanno tutti i dati delle cellule che fanno pagare _____?________ trasporto in ghiaccio secco,costano un’enormità. A parte che viaggiano in aereo. Queste sono le He – La come si vedono al microscopio invertito, queste sono le piastre per le colture cellulari, ci sono le bottiglie che abbiamo già visto ma ci sono diversi altri sistemi che…Vedete quel vetrino in fondo? Sono dei vetrini con delle camerette, poi spacchi la cameretta e il vetrino lo devi osservare al microscopio ottico e non invertito. Perché il microscopio invertito non ha il potere di risoluzione del microscopio ottico, ha un potere di risoluzione molto più basso.

Qua vi fa vedere una serie di effetti citopatici, _________?_________ virus, qua un HSB, questo qui è un effetto citopatico, formazione di sincizi, RSB in alto e morbillo a destra. Questi sono tutti nuclei di cellule. Questo qua è un altro sincizio, quest’ammasso di cellule. Le cellule singole sono queste qua, vedete? L’aspetto è completamente diverso. E qua pure, queste sono le singole cellule e questa è la formazione ________?__________. Questa è una infezione da _____?_____, le cellule erano fibrobastiche, vedete che sono allungate, fusiformi. Le cellule infettate assumono un aspetto tondeggiante, vedete? A un certo punto si distaccano, essendo cellule adese, a un certo punto si staccano dal bordo della plastica e si formano le placche _______?__________.

Queste sono le formazioni di sincizi causati dal virus del morbillo _________?____________ perché c’erano cellule infettate da morbillo, aggiungendo questi globuli rossi, essendo il morbillo un Paramyxovirus ha l’emagglutinina, quindi le cellule infettate da questo virus se io aggiungo globuli rossi si agglutinano, se poi io lavo i globuli rossi non si muovono da lì, dal monostrato cellulare. Per esempio tu hai una coltura e vuoi vedere se nel siero del paziente ci sono gli anticorpi, tu lo puoi applicare… Questa non è una tecnica, questa è una cosa che è

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stata fatta diciamo per la ricerca perché se no tu ti dovresti cimentare… il virus con __________?__________ infettato per essere più certi che si trattasse di un virus, vediamo se è un virus emagglutinante, mettiamogli degli anticorpi. Perché se un virus emagglutinante ha l’emagglutinina, noi aggiungiamo gli anticorpi __________?______________

Questa è una dimostrazione di cellula infettata da quei virus che hanno la capacità emagglutinante ma non è solo il virus perché la cellula… intanto questi virus tu lo sai come escono dalla cellula? Guarda ti devi ricordare una cosa, ti ricordi _______ la gemmazione? Ti ricordi che cosa fanno questi virus? Tutti i virus che hanno il pericapside _________ prima di uscire gemmando nella membrana della cellula che hanno infettato __________ pensa a questa cellula che gli hanno messo sulla membrana cellulare? Hanno messo l’emagglutinina e la neuraminidasi del pericapside è chiaro che se io gli aggiungo… vedo che c’è un virus emagglutinante.

Questo è un sincizio da HIV, questa è un’immunofluorescenza di un citomegalovirus. Si può dire che le cellule infettate da un citomegalovirus sono essere trattate con anticorpi monoclinali fluorescenti e poi osservati al microscopio _________________ Guarda che bella, questa qua è bellissima, questa è una colorazione di ________________ . Guarda che bella quella cellula grossa, citomegalica. Questo è effetto citopatico del citomegalo virus, vedete l’occhio di civetta? È bellissima questa, questa è una delle fotografie più belle in assoluto. Non è chiarissimo che questa è una cellula infettata da un citomegalo virus? Guardate una cellula non infettata. Guardate che pure questa è infettata e diventerà enorme quanto questa e poi esploderà. Esplodono ed esce la progenie virale, migliaia di virus nuovi . Queste sono le fiasche dove si coltivano le cellule. Questa è un’altra coltura di cellule che sono state infettate da un Adenovirus, li hanno usato una molteplicità di infezione più bassa, lì una molteplicità di infezione più alta. La molteplicità di infezione è un valore che si da per quante cellule __________

Per ogni cellula metti dieci unità formanti placche o dieci unità emagglutinanti, è un modo di titolare i virus. Mentre dove c’è scritto 01 significa che ci stai mettendo ogni dieci cellule…Queste sono cellule fibroblastiche infettate dal virus dell’Herpes simplex e questo è un pezzo delle placche, e questi sono una serie di virus che ____________ in colture cellulare e sono l’ ________________ , la varicella zoster , ________________ il morbillo, _____________l’influenza, la parainfluenza, la parotite e virus respiratori sinciziali. Tutti questi danno effetto citopatico. Questo poi si potrebbe fare diagnosi della microscopia elettronica ma sarebbe una cosa piuttosto __________ e infatti si fa solo per fare ricerca. Questo è un ____________di HIV, vedete come fuoriesce dalla cellula? Vedete il ________ della membrana che si sta spezzando __________________. Questo è il problema del costo elevatissimo e poi ci vuole ________________ per usare un microscopio elettronico. Perché il microscopio elettronico si piglia… è grande quanto da li alla porta fino li in fondo.Questa è un’immunofluorescenza diretta, questa è una cellula infettata e messa in evidenza con anticorpi monoclonali contro quel dato virus e quindi è diretta perché ___________________È una vescicola dei genitali. Sono cellule del paziente che hai prelevato dal vivo le messe sul vetrino e le hai colorate.