10. Vorlesung WS 2005/06Softwarewerkzeuge1 Bereich 3: V10 - Integrative Biologie 1 Protein-Netzwerke: topologische Graphen-Netzwerke 2 Analyse von Stoffwechselwegen

10. Vorlesung WS 2005/06

Softwarewerkzeuge 1

Bereich 3: V10 - Integrative Biologie

1 Protein-Netzwerke: topologische Graphen-Netzwerke

2 Analyse von Stoffwechselwegen (metabolic pathways):

Konzentration auf Metabolite, enzym. Reaktionen

3 Zell-Simulationen: dynamische Simulation auf

Sekunden-Zeitskala, t = 0.01 s (V10 und V11)

Systems Biology: Integration von genomischen und

proteomischen Analysen (V12)

www.systemsbiology.org

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Analyse von Stoffwechselwegen: Beispiel E. coli

verwende Daten aus Datenbank EcoCyc

(siehe auch MetaCyc: Stoffwechsel von > 150 Organismen)

EcoCyc enthält 905 Reaktionen für E.coli

davon gehören 161 nicht zum Stoffwechsel kleiner Moleküle, z.B. DNA Replikation,

von den verbleibenden 744 wurden 569 mindestens einem Pfad zugeordnet

Dagegen gibt es 607 Enzyme.

Es gibt also keine 1:1 Zuordnung zwischen Enzymen und Reaktionen, denn

(1) Manche Enzyme katalyiseren mehrere Reaktionen,

und manche Reaktionen werden von mehreren Enzymen katalysiert

(2) nicht zu allen Reaktionen sind die Enzyme bekannt, die sie katalysieren.

Ouzonis, Karp, Genome Research 10, 568 (2000)


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Beispiel: Stoffwechsel von E. coli

Von den 3399 Reaktionen der

Enzym-Nomenklatur (ENZYME

Datenbank, Bairoch 1999) wurden in

E.coli 604 gefunden.

Dies bedeutet, dass 301 Reaktionen

in E.coli keine E.C. Nummer

besitzen.

Problem bei auf E.C. Nummern

basierender Bioinformatik ...



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Die 744 Reaktionen enthalten

791 verschiedene Substrate.


Im Mittel enthält jede Reaktion

4 Substrate.


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EcoCyc enthält 131 Stoffwechsel-

Pfade.

Die Länge der Pfade variiert von

1 bis 16. Im Mittel 5.4.

Von den 607 Enzymen sind

100 multifunktional.

Purin-Nukleosid-Phosphorylase

und Nukleosid-Diphosphatkinase

katalysieren 7 bzw. 9 Reaktionen.

483 Reaktionen gehören zu einem

Pfad, 99 Reaktionen gehören zu

mehreren Pfaden.



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Fazit

Stoffwechsel-Netzwerke von einfachen Organismen sind mittlerweile

fast vollständig bekannt.

Ist die Beschreibung mit einzelnen Stoffwechsel-Wegen adäquat?

- Reaktionen, Enzyme und Substrate gehören oft zu mehreren Pfaden.

- Die Einteilung in einzelne Stoffwechsel-Pfade ist nicht immer eindeutig.


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Protein-Netzwerke: Cytoscape

Main window of Cytoscape 2.0,

displaying a network of protein-

protein and protein-DNA

interactions among 332 yeast

genes.

http://www.cytoscape.org/


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Protein-Wechselwirkungsnetzwerke: Cytoscape

You can flip through different

visual styles by making a

selection from the Visual Style

pull down menu. "Sample2" will

give gene expression values

for each node will be colored

along a color gradient between

red and green.



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With the Cytoscape Visual

Style feature, you can easily

customize the visual

appearance of your graph.

Cytoscape can also map

values such as probabilities,

confidence levels, and

expression values to the

visualization of networks.



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Cytoscape implements an algorithm for

finding "active pathways", i.e., subnetworks

of genes that jointly show significant

differential expression over a set of

experimental conditions observed by

microarray experiment. The image right

show the results of a run of this algorithm.

Several active paths have been found; the

highest scoring one has 22 genes identified

as being active in three of the 20

experimental conditions. From here, one

can view a graph with only these genes,

display the expression data for any of the

conditions, and examine Gene Ontology

(GO) information available to assess the

biological significance of this network. http://www.cytoscape.org/



Features of Cytoscape v2.0 (July 2004)

Input

Input and construct molecular interaction networks from raw interaction files (SIF

format) containing lists of protein-protein and/or protein-DNA interaction pairs.

For yeast and other model organisms, large sources of pairwise interactions

are available through the BIND and TRANSFAC databases. User-defined

interaction types are also supported.

Load and save previously-constructed interaction networks in GML format (Graph

Markup Language).

Input mRNA expression profiles from tab- or space-delimited text files.

Load and save arbitrary attributes on nodes and edges. For example, input a set

of custom annotation terms for your proteins, create a set of confidence

values for your protein-protein interactions.

Import gene functional annotations from the Gene Ontology (GO) and KEGG

databases.





Visualization

Customize network data display using powerful visual styles.

View a superposition of gene expression ratios and p-values on the network.

Expression data can be mapped to node color, label, border thickness, or

border color, etc. according to user-configurable colors and visualization

schemes.

Layout networks in two dimensions. A variety of layout algorithms are available,

including cyclic and spring-embedded layouts.

Zoom in/out and pan for browsing the network.

Use the network manager to easily organize multiple networks.

Use the bird’s eye view to easily navigate large networks.





Analysis

Java plug-ins available for network and molecular profile analysis. E.g.:

Filter the network to select subsets of nodes and/or interactions based on the

current data. E.g., users may select nodes involved in a threshold number of

interactions, nodes that share a particular GO annotation, or nodes whose gene

expression levels change significantly in one or more conditions according to p-

values loaded with the gene expression data.

- Find active subnetworks / pathway modules. The network is screened against

gene expression data to identify connected sets of interactions, i.e. interaction

subnetworks, whose genes show particularly high levels of differential

expression. The interactions contained in each subnetwork provide hypotheses

for the regulatory and signaling interactions in control of the observed

expression changes.

- Find clusters (highly interconnected regions) in any network loaded into

Cytoscape. Depending on the type of network, clusters may mean different

things. For instance, clusters in a protein-protein interaction network have been

shown to be protein complexes and parts of pathways. Clusters in a protein

similarity network represent protein families. http://www.cytoscape.org/



Metabolische Pfade in der post-genomischen Ära

(a) klassische Biochemie

bestimmt Stöchiometrien

einzelner Reaktionen

(b) Katalogisierung vieler

Reaktionen, Gruppierung nach

gemeinsamen Metaboliten führt

zu traditionellen Pfaden wie

Glykolyse, Pentose-Phosphat-

Pfad

(c) Durch komplette Information

können nun die kompletten

metabolischen Pfade zugeordnet

werden.



Metabolische Pfade in der post-genomischen Ära

Traditionelle metabolische Pfade dienen als konzeptioneller Rahmen

für Forschung und Lehre.

Man kann dadurch Metabolismen verschiedener Organismen vergleichen.

Jedoch sind sie nicht für quantitative, systemische Bewertungen biologischer

Reaktionsnetzwerke geeignet, da sie nur Teile der Netzwerke darstellen.

Sie wurden oft in Zelltypen entdeckt, in denen sie wichtige metabolische

Funktionen übernehmen (z.G. Glykolyse in Hefe).

Man kann diese Pfade jedoch nicht einfach auf andere Zelltypen mit anderen

Enzymleveln und metabolischen Profilen übertragen.



3 Vorgehensweisen

1 konstruiere alle Transformationswege, die von einem gegebenen

Substrat zu einem gegebenen Produkt führen

2 verwende Satz von linear (systemisch) unabhängigen Basisvektoren

im Raum der Reaktionsflüsse, durch Linearkombination sollen sich

alle möglichen Flußverteilungen darstellen lassen.

Allerdings ist die Wahl dieser Basisvektoren nicht eindeutig.

3 Konzept der elementaren (Fluss-) Moden

Eine Elementarmode ist ein minimaler Satz von Enzymen, die im

Gleichgewicht operieren können. Minimal heisst: falls nur die

Enzyme dieser Mode operieren, führt Inhibition jedes einzelnen seiner

Enzyms zum Stop aller Gleichgewichtsflüsse im System



Beschreibung vernetzter metabolischer Pfade

(a) aus genomischen, biochemischen, physiologischen Daten wird ein

Reaktionsnetzwerk aufgestellt. Es gibt interne Flüsse innerhalb der

Systemgrenzen und externe Flüsse mit der Umgebung.

(b) Dieses Netzwerk wird durch eine stöchiometrische Matrix dargestellt,

in der Metaboliten durch Reaktionen miteinander verbunden werden.

(c) Mögliche Zustände der Zelle aufgrund dieser Matrix werden mit

Techniken wie „elementary modes“ oder „extreme pathways“ identifiziert.

Die möglichen Zustände liegen innerhalb eines Konus im durch die

verschiedenen Flüsse aufgespannten Koordinatensystem.

Papin et al. TIBS 28, 250 (2003)



Analyse der stöchiometrischen Matrix

Analyse der Matrix S Pathway-Darstellung P.Deren Zeilen enthalten den Reaktionen entsprechende Flüsseund die Spalten die sichergebenden Pfade.

Darstellung des Reaktions-netzwerks mit stöchiometrischerMatrix S.

Metabolite

stöchiometrischeKoeffizienten der einzelnenReaktionen.

Darstellung derPfade ist möglichfür einfache Netzwerke.




Netzwerk-Analyse

(a) welche Substrate (A-E) sind zur

Produktion der Biomasse erforderlich

(B,E), welche nicht?

(b) Aufspüren von nicht genutzten

Reaktionen (F E), Refinement

der Annotation von Genomen.

(c) quantitative Beschreibung von

Pathway-Redundanz bzw. Robustheit

des Netzwerks: P1 und P2 führen beide

von A nach D.

(d) Reaktionen RA, RB und RC werden

stets gemeinsam benutzt. Ihre Gene

werden daher vermutlich koordiniert

reguliert.




Welche Rolle spielt Pathway-Analyse?

Die auf Netzwerken basierende Analyse von Pfaden stellt eine gute Basis dar

um die heutige Flut an experimentellen Daten ohne vorgefasste Meinungen

in biologische Modelle zu übersetzen.




konkretes Beispiel:Glykolyse

http://biotech.icmb.utexas.edu/glycolysis/pathway.html

Stoffwechselpfadin Lehrbuch.



Glykolyse

Glucose G6P

Hexokinase

F6P

Pgi

FP2

Pfk

GAPFba

DHAP

TpiA

1,3BPG

3PG

PgkGap

Gpm

2PG

Eno

PEP

Pyk

Pyr

Schematische Darstellung.Metabolite sind blau,Enzyme rot dargestellt.



Pentose-Phosphat-Stoffwechsel

G6P

Zwf

GO6P

Pgl

6PG

Gnd

Ru5P

RpeXyl5P

R5P GAP

Sed7P

TktI

F6P

Ery4P

Tal

G6PF6P

TktII

Analoge Darstellung für PPP.G6P und F6P tauchen je zweimal auf!



Konkretes Beispiel: Monosaccharid-Stoffwechsel

Benötigter Input: Deklaration interner und externer Substanzen,Enzymreaktionen und ihre Richtung

Schuster, Fell, Dandekar, Nature Biotech 18, 326 (2000)



Reaktionsschema für Monosaccharid-Stoffwechsel


Kopplung von Glykolyse und

Pentose-Phosphat-Pfad:

15 Metabolite,

19 Reaktionen

Daher besitzt die

stöchiometrische Matrix

die Dimension 15 19.

Welche Reaktionen

müssen notwendigerweise

gemeinsam ablaufen?

Offensichtlich

{Gap, Pgk, Gpm, Eno, Pyk}

und {Zwf, Pgl, Gnd}.

Weiterhin auch {Fba, TpiA}

und {2 Rpe, TktI, Tal, TktII}.



Reduktion(I): Reduziertes Schema

Schema wurde aus vorherigem Schema erhalten indem all Enzyme kombiniert

wurden, die immer gemeinsam operieren.




Reduktion (II): Elementarmoden

Identifizierung der Moden:

(1) ursprünglicher Glykolyse-Stoffwechsel. Die Moden (3)-(6) stimmen mit den

4 Moden des Pentose-Phosphat-Stoffwechsels aus Stryer überein.

Eine Elementarmode ist ein minimaler Satz von Enzymen, die im Gleichgewicht

operieren können. Minimal heisst: wenn nur die Enzyme einer Mode aktiv sind,

führt Inhibition jedes einzelnen Enzyms zum Stop aller Gleichgewichtsflüsse.




Elementarmoden

Graphische Darstellung von 7 Elementarmoden.

Die Moden beinhalten unterschiedliche Anzahl an Enzymen und überlappen

teilweise miteinander. Die Zahlen entsprechen den relativen Flüssen.

Jeder Systemzustand im Gleichgewicht lässt sich als Linearkombination

dieser Elementarmoden darstellen.




Software: FluxAnalyzer, setzt auf Matlab auf

Steffen Klamt.

Klamt et al. Bioinformatics 19, 261 (2003)



Software: FluxAnalyzer, setzt auf Matlab auf

Links: Network composer of the FluxAnalyzer facilitating

the definition of the network structure.

Mitte: Input mask for defining a new network element of type reaction

Rechts: Pull-down menu of the FluxAnalyzer

providing an interactive use of the various functions of the toolbox. http://pinguin.biologie.uni-jena.de/bioinformatik/



Fazit

Stoffwechselpfade sind nicht isoliert voneinander,

besitzen in verschiedenen Organismen verschiedene Komponenten bzw.

Bedeutung.

Oft sind mehrere alternative Reaktionspfade möglich.

Das Program BIOMINER (Prof. Lenhof) wählt z.B. den Pfad/Graphen der

geringsten Länge.

Komplexe metabolische Netzwerke sind daher für uns schwer zu durchschauen.

Man benötigt intelligente und robuste Algorithmen um daraus biologische

Modelle abzuleiten.

Diese biologischen Modelle sehen jedoch vermutlich nicht so einfach aus

wie in heutigen Lehrbüchern.



E-cell: Software Umgebung zur Simulation ganzer Zellen

Institute for Advanced Biosciences der Keio University (existiert seit 1996)

Dr. Masaru Tomita, Team enthält > 50 Mitglieder!

weitere Programme für integrative Zellsimulationen:

GEPASI (1993, 1997) – Simulation von Stoffwechselpfaden

KINSIM (1983, 1997)

METAMODEL (1991)

SCAMP (1993)

DBSolve (1997)

V-Cell (1999)

es gibt auch separate Programme, mit denen man Genregulation und –expression,

sowie Signaltransduktion und Zellteilung untersuchen kann.

Das allgemeine Problem sind fehlende experimentelle Daten.



Implementation des E-cell Systems

E-CELL wurde in C++ geschrieben, existiert nun in der Version 3.

Das Modell besteht aus 3 Listen, die bei Programmstart geladen werden:

substance list definiert alle Objekte, die die Zelle und das Kulturmedium enthalten

rule list definiert alle Reaktionen, die in der Zelle stattfinden

system list definiert die räumliche und/oder funktionelle Struktur der Zelle und

ihrer Umgebung

Der Zustand der Zelle zu jedem Zeitpunkt wird als Liste von Konzentrationen und

globalen Parametern wie Zellvolumen, pH und Temperatur angegeben.

Das Programm (simulation engine) erzeugt neue Zustände der Zelle nach

Iterationsschritten von jeweils z.B. t = 1 ms.



Erstes Modellsystem: Mycoplasma genitalium

1996 Veröffentlichung des Genoms von Mycoplasma genitalium

Dies ist eines der kleinsten bisher bekannten Genome (580 kb).

Es enthält die kleinste bisher bekannte Anzahl von Genen (ca. 480) von allen

bisher bekannten lebenden Organismen.

Genom ist 10 kleiner als E.coli

ca. 80% der Gene sind homolog zu Proteinen mit bekannter Funktion.

Intensive Gene-Knockout Untersuchungen zeigten, dass viele der 480 Gene für

das Überleben von M. genitalium nicht notwendig sind.

Es wurde ein minimaler Satz von 127 Genen als notwendig und hinreichend für das

Überleben und einen stabilen Zustand der Zelle ausgewählt.



Large-scale Organisation von metabolischen Netzwerken

Modell einer Zelle, die aus eigener Kraft lebt. Diese minimale Zelle besitzt 127

Gene, gerade ausreichend um Proteingehalt und Membranstruktur aufrecht zu

erhalten.

Glukose wird aus der Umgebung als Energiequelle aufgenommen; ATP wird durch

den Glykolyse-Pfad produziert und wird hauptsächlich zur Proteinsynthese

verbraucht.

Proteine und Phospholipide werden mit der Zeit spontan abgebaut.



127 Gene der überlebensfähigen Zelle

Anzahl der Gene in wichtigen

Pfaden der hypothetischen Zelle.

‚Other‘ sind solche Gene, die in der

Genliste von M. genitalium nicht

gefunden wurden und daher von

anderen Organismen übernommen

wurden, wie z.B. E.coli.



Für Proteine kodierende Gene in der hypothetischen Zelle



Enzyme in der hypothetischen Zelle

Die Information über Pfade wurde aus 2

Datenbanken übernommen

KEGG (Kanehisa, 1996):

enthält eine grosse Sammlung von

diagrammatischen Stoffwechselpfaden,

die nicht für bestimmte Spezien spezifisch

sind

EcoCyc (Karp et al. 1996):

Datenbank mit Pfaden mit vielen Links auf

Literaturstellen sehr nützlich um

kinetische Daten für Reaktionen zu finden.



KEGG: Stoffwechsel-Datenbank

enthält metabolische Pfade für viele

sequenzierte Organismen



Substanzen

Kleine Moleküle in der

hypothetischen Zelle:

Metabolite

Aminosäuren

Nukleotide

Kationen

andere Substanzen:

Proteine, DNA, RNA,

Multi-Protein-Komplexe

Protein-DNA Komplexe

Protein-RNA Komplexe



Reaktionsregeln

495 Reaktionsregeln

(1) enzymatische Reaktionen:

erhöhen und verringern die Mengen von Substraten und Produkten

(2) Komplexbildungen, bei denen mehrere Substrate Komplexe bilden

(3) Transportvorgänge, bei denen Substanzen zwischen verschiedenen

Kompartments ausgetauscht werden (keine Diffusion innerhalb der

Kompartments)

(4) stochastische Prozesse wie die Bindung eines Transkriptionsfaktors

Die Reaktionen (1) – (3) werden als einfache Ratengleichungen formuliert.

Alle Reaktionen werden parallel simuliert.



Reaktionsregeln

Chemische Reaktionen können verallgemeinert werden als:

Sn ist die Konzentration der n ten Substanz, und n deren stöchiometrischer

Koeffizient. Die Geschwindigkeit jeder Reaktion kann als Funktion von Sn und n

dargestellt werden.

Die meisten nicht-enzymatischen Reaktionen sind erster Ordnung. D.h. ihre

Geschwindigkeiten v hängen direkt von den Konzentrationen der Substrate ab:

Enzymatische Reaktionen mit einem Substrat und einem Produkt können durch die

Michaelis-Menten-Gleichung dargestellt werden:

mKS

SVv

max

1

vj

i

vi

iSk

nnjj SvSvSvSv ......2211



graphische Kontrolle

Mit Hilfe von verschiedenen

graphischen Oberflächen kann der

Benutzer dynamische Änderungen

der Substanzmengen und

Reaktionsflüsse überwachen.

Die Mengen jeder Substanz können

während der Simulation ausserdem

jederzeit von aussen verändert

werden.



Ontologische Structur des E-CELL Systems

Es gibt drei fundamentale Klassen: Substanzen, Reaktor und System.

Reaktoren und Zellkomponenten sind die vom Benutzer zu definierenden Klassen.



Transcriptions-Stoffwechsel in der Modellzelle

Komplexe Reaktion wie

Transkription und

Translation werden als

detaillierte Abfolge von

Reaktionen modelliert.



Modell des menschlichen ErythrozytenEnthält drei grosse Stoffwechselwege: (1) Glykolyse; (2) Pentose-Phosphat-

Stoffwechsel; and (3) Nukleotid-Stoffwechsel.

Abbreviations: ADA; adenosine deaminase;

ADE, adenine; ADPRT, adenine phosphoribosyl transferase;

AK, adenosine kinase; ALD, aldolase;

AMP; adenosine monophosphate;

AMPDA, adenosine monophosphate deaminase;

APK, adenylate kinase; CAH, carbonic anhydrase;

DHAP, dihydroxy acetone phosphate;

DPG, diphosphogrycerate;

DPGase, diphosphogrycerate phosphatase;

DPGM, diphosphogrycerate mutase; EN, enolase;

E4P, erythrose 4-phosphate; FDP, fructose 1,6-diphosphate;

F6P, fructose 6-phosphate; G6P glucose 6-phosphate;

GA3P, glyceraldehyde 3-phosphate;

GAPDH, glyceraldehyde phosphate dehydrogenase;

GLC, glucose; GLCtr, glucose transport process;

GO6P, gluconate 6-phosphate; GSH, glutathione;

GSHox, glutathione turnover;

GSSGR, glutathione reductase (NADPH);

Hb, hemoglobin; HGPRT, hypoxanthanine-guanine

phosphoryl transferase; HK, hexokinase; HX, hypoxanthine;

HXtr, hypoxanthine transport process;

IMP, inosine monophosphate;

IMPase, inosine monophosphatase;

INO, inosine; LAC, lactate; LACtr, lactate transport process; LDH, lactate dehydrogenase; mOsm, osmolarity; 2PG, 2-phosphogrycerate; 3PG, 3-phosphogrycerate; 6PGLase, 6-phosphogluconolactonase; 6PGODH, 6-phosphogluconate dehydrogenase; PEP, phospho-enolpyruvate; PFK, phosphofructokinase; PGI, phosphoglucoisomerase; PGM, phosphoglyceromutase; Pi, inorganic phosphate; PNPase, purine nucleotide phosphorylase; PRM, phosphoribomutase; PRPP, 5-phosphoribosyl 1-phosphate; PRPPsyn, phosphoribosyl pyrophosphate synthetase; PYRtr, pyruvate transport process; PYR, pyruvate; R5P, ribose 5-phosphate; RIP, ribose 1-phosphate; Ru5P, ribulose 5-phosphate; S7P, sedoheptulose 7-phosphate; TA, transaldolase; TK1, transketolase I; TPI, triose phosphate isomerase; VOL, volume; X5P, xylulose 5-phosphate; X5PI, xylulose 5-phosphate isomerase



menschlicher Erythrozt mit Aldolase-Mangel

Sowie mit jedem Simulationspaket kann man auch E-CELL benutzen um durch

Änderung von Enzymparametern virtuelle Experimente durchzuführen.

Aldolase wandelt Fruktose-1,6-

bis-phosphat (X12) in

Glyceraldehyd-3-Phosphat (X14)

und Dihydroxy-Aceton-Phosphat

(X13) um.

Durch einen Mangel an Aldolase

steigt der Level des Reaktanden X12

deutlich an und die

Reaktionsprodukte X14 and X13

deutlich abgesenkt.



Ausblick

Zusätzlich zu der „virtuellen, überlebensfähigen Zelle“ und zum Modell des

menschlichen Erythrozyten werden in Keio andere Modelle konstruiert:

- ein Modell eines Mitochondriums

- ein Signaltransduktionsmodell für Chemotaxis in E.coli

Ein allgemeines Problem von umfangreichen Zellmodellen ist derzeit der

Mangel an quantitativen experimentellen Daten:

- Konzentrationen von Metaboliten und Enzymen

- Flussraten

- kinetische Parameter und Dissoziationskonstanten

Das Institute of Advanced Biosciences in Keio besteht aus 3 Zentren:

Metabolom-Forschung, Bioinformatik, Genom-Engineering.

Ziel: Entwicklung von custom-made Bakterien.

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