Contenido

Diagnóstico fitosanitario

Detección de βββββ-exotoxina por HPLC en cepas nativas de Bacillus thuringiensis por HPLC 255Yamilé Baró Robaina, Cecilia Linares Jiménez y Gonzalo Dieksmeier Corcuera

Diagnóstico de fitonematodos en suelos de cultivos frutales 261Raúl Hernández Hernández, Gladis del Vallín y Doris Hernández

Aislamiento, identificación y caracterización morfométrica de aislados nativos de hongos mitospóricos nativos con potencialidad para el control de especies de insectos plaga 265Orestes Elósegui Claro, Jesús Jiménez Ramos y Aidanet Carr Pérez

Ecología

Dispersión, distribución actual y nuevos reservorios de Frankliniella schultzei Trybom (Thysanoptera: Thripidae) en Cuba 273Santiago F. Jiménez Jiménez, Liuva Pérez López, Martha Toro, Criseida Granda, Amelia Mateo, Héctor Sariol, Elisa Rodríguez, Rodney Pérez, Roquelina Jiménez, Ángel Pérez-Alejo y Ransés Vázquez

Variabilidad de las isoenzimas esterasas de Beauveria bassiana (Balsamo) Vuillemin 279María E. Estrada Martínez y Dolores Piñón Gómez

Control biológico

Un medio simplificado a base de soya más azúcar turbinada de caña para la producción del hongo acaropatógeno Hirsutella nodulosa Petch en fase líquida 285Reinaldo I. Cabrera, Marlén Vega y Litzy Ayra

Estudio del efecto protector de Bacillus spp. sobre el desarrollo de la pudrición blanda de la papa (Solanum tuberosum L.) 289Yaritza Reinoso Pozo, Luis Casadesús Romero, Armando García Suárez, Ernesto García Pérez y Victoria Pazos Álvarez-Rivera

Producción de biomasa de Trichoderma harzianum por fermentación líquida 295Rosaima García, María A. Durán y Ramón Riera

Reseña

Caracterización de Ralstonia solanacearum a través del estudio de su diversidad genética 299Yelaine Tejeda Gómez

Comunicación corta

Primer registro de cecidómido asociado a síntomas de roya en plantas medicinales en Cuba 305Marlene M. Veitía Rubio, Víctor M. García Infante, Danay López Manes y María O. López Mesa

Observaciones sobre enemigos naturales de la broca del café (Hypothenemus hampei Ferrari) en Cuba 307Luis L. Vázquez Moreno, Eleazar Blanco Jiménez, Orestes Elósegui Claro, Yaril Matienzo Brito y Janet Alfonso Simonetti

Resumen de tesis

Diagnóstico y saneamiento del Virus Dasheen Mosaic en malanga (Xanthosoma spp. y Colocasia esculenta (L.) Schott) 309Janet Igarza Castro

Comportamiento y control de la enfermedad tizón de fuego causada por el hongo Corynespora cassiicola (Berk. & Curt.) Wei. en el cultivo del pepino (Cucumis sativus L.) en sistemas de organopónicos en la provincia de Camagüey y su relación con otros patógenos fúngicos presentes en el cultivo 310Carlos A. Ferrer González

Phytosanitary diagnosis

Detection of βββββ-Exotoxin by HPLC in Native Strains of Bacillus thuringiensis 255Yamilé Baró Robaina, Cecilia Linares Jiménez and Gonzalo Dieksmeier Corcuera

Phytonematodes Diagnosis on Fruit Crop Soils 261Raúl Hernández Hernández, Gladis del Vallín and Doris Hernández

Isolation, Identification and Morphometric Characterization of Native Mitosporic Fungi with Potential for the Control of Pest Insects Species 265Orestes Elósegui Claro, Jesús Jiménez Ramos and Aidanet Carr Pérez

Ecology

Dispersion, Present Distribution and New Reservoirs of Frankliniella schultzei Trybom (Thysanoptera: Thripidae) in Cuba 273Santiago F. Jiménez Jiménez, Liuva Pérez López, Martha Toro, Criseida Granda, Amelia Mateo, Héctor Sariol, Elisa Rodríguez, Rodney Pérez, Roquelina Jiménez, Ángel Pérez-Alejo and Ransés Vázquez

Variability of Esterase Isoenzymes from Beauveria bassiana (Balsamo) Vuillemin 279María E. Estrada Martínez and Dolores Piñón Gómez

Biological control

A Simplified Medium Based on Soy and Unrefined Sugar Cane for Liquid Phase Production of Fungus Hirsutella nodulosa Petch Pathogen to Mites 285Reinaldo I. Cabrera, Marlén Vega and Litzy Ayra

Study of Protective Effect of Bacillus spp. on the Development of Potato Soft Rot (Solanum tuberosum L.) 289Yaritza Reinoso Pozo, Luis Casadesús Romero, Armando García Suárez, Ernesto García Pérez and Victoria Pazos Álvarez-Rivera

Production of Trichoderma harzianum Biomass by Liquid Fermentation 295Rosaima García, María A. Durán and Ramón Riera

Review

Caracterization of Ralstonia solanacearum by the Study of its Genetic Diversity 299Yelaine Tejeda Gómez

Short communication

First Record of Cecidomide Associate with Rust Symptoms in Cuban Medicinally Plants 305Marlene M. Veitía Rubio, Víctor M. García Infante, Danay López Manes and María O. López Mesa

Observations on Natural Enemies of Coffee Berry Borer (Hypothenemus hampei Ferrari) in Cuba 307Luis L. Vázquez Moreno, Eleazar Blanco Jiménez, Orestes Elósegui Claro, Yaril Matienzo Brit and Janet Alfonso Simonetti

Thesis abstract

Diagnostic and Sanitation of Dasheen Mosaic Virus in Xanthosoma spp. and Colocasia esculenta (L.) Schott 309Janet Igarza Castro

Behavior and Control of Fire Blight Disease Caused by Fungus Corynespora cassiicola (Berk. & Curt.) Wei. in Cucumber Crop (Cucumis sativus L.) in Organoponic Systems of Camagüey Province and its Relation with others Fungi Pathogens Present in the Crop 310Carlos A. Ferrer González

Contents

fitosanidad/255

FITOSANIDAD vol. 10, no. 4, diciembre 2006

Dia

gnós

tico

fito

san

itar

io

DETECCIÓN DE βββββ-EXOTOXINA EN CEPAS NATIVASDE BACILLUS THURINGIENSIS POR HPLC

Yamilé Baró Robaina, Cecilia Linares Jiménez y Gonzalo Dieksmeier Corcuera

Instituto de Investigaciones de Sanidad Vegetal. Calle 110 no. 514 e/ 5.a B y 5.a F, Playa, Ciudadde La Habana, CP 11600, ybaro@inisav.cu

RESUMENSe analizó por cromatografía líquida de alta resolución (HPLC) lapresencia de β-exotoxina en nueve cepas de Bacillus thuringiensis,pertenecientes a la colección del Instituto de Investigaciones deSanidad Vegetal. La concentración de β-exotoxina en el patrón fuede 25 µg.mL–1, y en el producto comercial empleado como controlpositivo fue de 6 µg.mL–1. En las cepas evaluadas solo la LBT9 yLBT47 mostraron la presencia de este metabolito a concentracionesde 34 y 4,5 µg.mL–1 respectivamente.

Palabras claves: Bacillus thuringiensis, β-exotoxina, cromatografíalíquida (HPLC), detección

ABSTRACTThe presence of β-exotoxin in nine Bacillus thuringiensis strainsbelonging to Plant Health Research Institute collection was analyzedby high performance liquid chromatography (HPLC). β-exotoxinconcentration in the standard was 25 µg.mL-1, and in a commercialproduct, used as positive control, was 6 µg.mL-1. β-exotoxin was onlydetected in LBT9 with 34 µg.mL-1 and LBT47 with 4.5 µg.mL-1, amongthe strains proved.

Key words: Bacillus thuringiensis, β-exotoxin, liquid chromatography(HPLC), detection

INTRODUCCIÓN

Algunas cepas de Bacillus thuringiensis producen ade-más de la δ-endotoxinas o proteínas Cry una exotoxinatermoestable denominada β-exotoxina, la cual se se-creta al medio de cultivo al inicio del proceso deesporulación. Esta molécula es un análogo nucleotídicode ADN con un peso molecular de 701 Da y se le atri-buye acción insecticida contra diferentes órdenes deinsectos como Lepidópteros, Dípteros, Coleópteros,Hemípteros, además de ácaros, nematodos, proto-zoarios y platelmintos [Hernández et al., 2003].

Diversos métodos como la cromatografía de intercam-bio iónico, electroforesis capilar, ELISA y la croma-tografía líquida de alta resolución (HPLC) se han des-crito para la determinación de la β-exotoxina, comoalternativas al bioensayo tradicional con Musca domes-tica, el cual resulta más trabajoso, prolongado en eltiempo y presenta algunas limitaciones como estima-ciones inexactas de la potencia de la toxina impura y

poca reproducibilidad. De todos estos métodos la RP-HPLC se emplea más frecuentemente para la detección ycuantificación de este metabolito [Gohar y Perchat, 2001].

El presente trabajo tuvo como objetivo detectar y cuan-tificar la presencia de la β-exotoxina en nueve cepascubanas de Bacillus thuringiensis.

MATERIALES Y MÉTODOS

Como material biológico se emplearon nueve cepas deB. thuringiensis pertenecientes a la colección del Insti-tuto de Investigaciones de Sanidad Vegetal, las cualesse seleccionaron de acuerdo con su serotipo flagelar, y latoxicidad exhibida en el sobrenadante del cultivo este-rilizado a 121ºC frente a un grupo de organismos plaga(Tabla 1).

El estándar de β-exotoxina I lo suministró el doctor JorgeIbarra (Laboratorio de Bioinsecticidas del Centro de

Baró y otros

256/fitosanidad

Investigación y Estudios Avanzados del Instituto Poli-técnico Nacional de México), obtenido a partir de lacepa HD2 Berliner Bacillus thuringiensis var.thuringiensis. La concentración final de la solución deβ-exotoxina I inyectada en el HPLC fue de 25 µg.mL–1.Como control positivo se utilizó un producto comercialruso que contiene β-exotoxina, producido a partir deuna cepa de B. thuringiensis var. thuringiensis, y comocontrol negativo se tomó la cepa HD1, estándar inter-nacional de B. thuringiensis que no produce β-exotoxina.

Las cepas se cultivaron en medio caldo triptona soya,en zaranda orbital a 150 r.min–1 a una temperatura decrecimiento de 30ºC durante 48 h hasta que se comple-tó el proceso de esporulación.

Una vez transcurrido el tiempo de incubación el cultivose centrifugó 10 000 r.min–1 en centrifuga refrigeradadurante 20 min. El precipitado se descartó y elsobrenadante se trató en autoclave a 121ºC durante 15 min.El pH de las muestras se ajustó a 3 con ácido fosfórico85%. El sobrenadante se clarificó por centrifugacióna 10 000 r.min–1 y se guardó a –20ºC hasta su uso.

El proceso de separación se realizó según Levinson etal. (1990), para lo que se utilizó una columna LiChros-pher RP-18 de fase reversa. La corrida se efectúo a 30ºCen 50 milimoles.L–1 de KH2PO4 (pH 3) a una velocidadde flujo de 2 mL.min–1, con detección a 260 nm. El vo-lumen de inyección fue de 100 µL. Se empleó un detec-tor UV, inyector Rheodyne 7725i, bomba water 0,01A.Para el análisis de los cromatogramas se utilizó el soft-ware EZChrom versión 6.8.

Con el objetivo de evaluar si la β-exotoxina se elimina-ba durante el procesamiento de la muestra, se adicio-

naron 100 µL de β-exotoxina estándar a la cepa LBT5de B. thuringiensis una vez iniciado el crecimiento delmicroorganismo y concluido su desarrollo. La croma-tografía se desarrolló en las condiciones descritas ante-riormente.

RESULTADOS Y DISCUSIÓN

Según los cromatogramas obtenidos en la detección deβ-exotoxina para las cepas en estudio, se observó elpico correspondiente al patrón de β-exotoxina estándara una concentración de 25 µg.mL–1 (Fig. 1(A)). El picoque se observa en la muestra patrón apareció a un tiem-po de retención de 11,33 min. El mismo pico aparecióen la muestra correspondiente al producto comercialruso a base de β-exotoxina, cepa utilizada como testigopositivo. Su concentración fue de 6 µg.mL–1 (Fig. 1(B)).La exotoxina no se detectó en la cepa HD1 estándarinternacional de B. thuringiensis var. kurstaki (Fig. 2),la cual no produce esa exotoxina [Galán et al., 1994;Glare y Callaghan, 2000].

En el resto de las cepas en estudio, solo se observó elpico correspondiente a la β-exotoxina en las cepas LBT9(Fig. 3(A)) y LBT47 (Fig. 3(B)). Los niveles de pro-ducción del metabolito en estas cepas fueron de 34 y4,5 µg.mL–1 respectivamente. En la cepa LBT7 tam-bién se observó la presencia de un pico que pudiera co-rresponder a la β-exotoxina, ya que presenta uno simi-lar al del patrón y un tiempo de retención muy cercano.

Las cepas evaluadas presentan serotipos que están infor-mados en la literatura como productores de la β-exo-toxina [Galán et al., 1994; Glare y Callaghan, 2000];sin embargo, estos resultados reafirman lo obtenido porLevinson et al. (1990) y Hernández y Ferré (2001), loscuales mostraron que la producción de la exotoxinatermoestable es más una propiedad específica de la cepade B. thuringiensis que una propiedad serotipo especí-fica. Se ha probado además que su presencia en unacepa en particular no implica la producción de la exo-toxina por otras cepas pertenecientes al mismo se-rovar.

Aunque los estudios que relacionan la producción de laβ-exotoxina y el tipo de serovar que presenta la cepa deB. thuringiensis son muy escasos, y en la mayoría deellos se incluyen muy pocas cepas, algunos autores plan-tean que la producción de β-exotoxina está limitada aciertos serotipos flagelares presentes en las cepas deB. thuringiensis [Hernández y Ferré, 2001].

Tabla 1. Serotipos de las cepas en estudio [Fernández-Larrea, 1999]

Cepas Serotipo LBT-4 kenyae (H4) LBT-5 thuringiensis (H1) LBT-7 kenyae (H4) LBT-9 thuringiensis (H1) LBT-12 thuringiensis (H1) LBT-13 no determinado LBT-16 thuringiensis (H1) LBT-25 israelensis (H14) LBT-47 no determinado

fitosanidad/257

Detección de β-exotoxina en cepas...

Figura 1. Cromatogramas obtenidos para el patrón de β-exotoxina (25 µg.mL–1) (A) y para el producto comercial (6 µg.mL–1)(control positivo) (B). Columna LiChrospher RP-18, 5 mm (250 x 4,6 mm), flujo 2 mL.min–1, λ 260 nm, volumen de inyección100 µL, fase móvil KH2PO4, pH 3,0.

Figura 3. Cromatogramas obtenidos por HPLC para las cepas LBT9 34 µg.mL–1 (A) y LBT47 4,5 µg.mL–1 (B).Columna LiChrospher RP-18, 5 mm (250 x 4,6 mm), flujo 2 mL.min–1, λ 260 nm, volumen de inyección 100 µL, fasemóvil KH2PO4, pH 3,0.

Figura 2. Cromatograma obtenido por HPLC para la cepa HD1 (control negativo). ColumnaLiChrospher RP-18, 5 mm (250 x 4,6 mm), flujo 2 mL.min–1, λ 260nm, volumen de inyección100 µL, fase móvil KH2PO4, pH 3,0.

Baró y otros

258/fitosanidad

La clasificación de las cepas de B. thuringiensis enserovares se desarrolló sobre la base de los antígenosflagelares; sin embargo, las bases genéticas y bioquímicasdel sistema de antígenos flagelares aún son desconocidas.Esto hace especialmente difícil encontrar una relación di-recta entre los genes determinantes del serovar y otrosgenes en B. thuringiensis, como los que determinan la sín-tesis de β-exotoxina [Hernández et al., 2003]. En este es-tudio no fue posible establecer esta relación debido a quese emplearon muy pocas cepas, y las dos que resultaronpositivas pertenecen a serotipos diferentes.

En estudios previos realizados en el Instituto de Inves-tigaciones de Sanidad Vegetal se demostró que elsobrenadante de cultivos obtenidos a partir de las ce-pas estudiadas en este trabajo, y esterilizado a 121ºC,presentaron actividad tóxica contra un grupo de orga-nismos plaga como ácaros y nematodos [Márquez et al.,1999; 2003]; sin embargo, resulta interesante destacarque no pudo observarse en cada una de ellas el picocorrespondiente a la β-exotoxina. Estos resultados pu-dieran tener explicación con lo afirmado por Levinsonet al. (1990) en cuanto a que los patrones de apariciónde la exotoxina termoestable sugieren que puede estarinvolucrado solo un único gen. La producción deexotoxina puede ser resultado de una sola reacciónenzimática, a partir de moléculas precursoras presen-tes tanto en las cepas Exo+ como Exo–. Es probableque estos precursores estén involucrados en el controlde la transcripción de los genes de la esporulación y no

como sugirieron Johnson y Peterson (1983) en la pro-ducción de la exotoxina, lo que implicaría que la β-exo-toxina no se produzca por todas las cepas de B. thu-ringiensis.

Otra explicación a la no detección del metabolito en lasrestantes cepas pudo deberse también a niveles de con-centración bajos en el medio de fermentación, a lo cualse suma la presencia de moléculas contaminantes en lasolución que hace difícil su determinación. Oehler et al.(1982) emplearon una columna C18 y como fase móvilH2O y ácido trifluoracético; sin embargo, el método nodio resultado debido a que los contaminantes delsobrenadante del cultivo de B. thuringiensis coeluíancon la toxina, lo cual se considera que también pudoocurrir en los resultados presentes. Debido a esto y asu pequeña masa molecular, la utilización de un méto-do altamente eficiente en el proceso de obtención de laexotoxina constituye un proceso clave para el recobra-do y purificación de la β-exotoxina.

La adición de β-exotoxina estándar durante el procesode crecimiento de la cepa LBT 5 dio como resultado lapresencia del pico correspondiente a la β-exotoxina a con-centraciones de 0,42 µg.mL–1 y 35,8 µg.mL–1 (Figs. 4(A)y (B)). Esto indica que la β-exotoxina no se pierde du-rante el proceso de obtención previo a la cromatografía.La adición de β-exotoxina estándar a un grupo de cepasen estudio también la utilizaron Gohar y Perchat (2001)para corroborar la presencia de la toxina. A este proce-dimiento se le denominó método del testigo externo.

Figura 4. Cromatogramas de la cepa LBT5 contaminada con β-exotoxina estándar al inicio del cultivo (A) y una vez concluido elprocesamiento de la muestra (B). Columna LiChrospher RP-18, 5 mm (250 x 4,6 mm), flujo 2 mL.min–1, λ 260 nm, volumen deinyección 100 µL, fase móvil KH2PO4, pH 3,0.

fitosanidad/259

Detección de β-exotoxina en cepas...

Otra explicación a la ausencia del pico típico de la β-exo-toxina en las cepas LBT4, LBT5, LBT7, LBT12, LBT13,LBT16 y LBT25 es la presencia de una segundaexotoxina denominada tipo II, la cual se produce a concen-traciones mucho más bajas que la β-exotoxina tipo I. Esteresultado fue corroborado por Levinson et al. (1990) alidentificar la β-exotoxina tipo I en un grupo de cepas deB. thuringiensis; sin embargo, no se pudo detectar enuna cepa de B. thuringiensis var. morrisoni, que exhibióactividad tóxica en el sobrenadante esterilizado a 121ºCcontra Musca domestica, Diabotrica undecimpuntacta yLeptinotarsa decemlinneata. El análisis realizado por es-tos autores dio como resultado la identificación de estenuevo tipo de exotoxina. Esta molécula es menoshidrofóbica y se sugiere que sea un análogo de uracilo dela exotoxina tipo I [Levinson et al., 1990].

La existencia de esta toxina aclaró resultados confusos ycontradictorios reportados en la literatura. IgualmenteGohar y Perchat (2001) lograron identificar la exotoxinatipo II al emplear RP-HPLC, pero con la utilización pre-via de precipitación con solventes orgánicos y unacromatografía de intercambio aniónico. Estos autores con-firman que resulta de vital importancia la preparaciónprevia de la muestra para la detección y cuantificación deeste metabolito, e indican que una alternativa promisoriasería la utilización de detección fluorescente en lugar deabsorción UV, lo que incrementaría ampliamente la sensi-bilidad y la selectividad de la determinación.

CONCLUSIONES• Se detectó la presencia de β-exotoxina en las cepas

LBT9 y LBT47 a concentraciones de 34 µg.mL–1 y4,5 µg.mL–1 respectivamente.

REFERENCIAS

Fernández-Larrea, O.: «Aislamiento, selección y estudio de cepas deBacillus thuringiensis para el control fitosanitario». Informe FinalPNCT, Biotecnología Agrícola, INISAV, Cuba, 1999.

Galán, W.; K. Arévalo: «Uso de un método sencillo para detección de b-exotoxina en cepas de Bacillus thuringiensis», South WesternEntomologist 19 (4):385-390, 1994.

Glare, T.; M. Callaghan: Bacillus thuringiensis: Biology, Ecology andSafety, Eds. John Wiley and Sons, 2000.

Gohar, M.; S. Perchat: «Sample Preparation for b-Exotoxin Determinationin Bacillus thuringiensis Cultures by Reversed-Phase High Perfor-mance Liquid Chromatography», Anal. Biochem. 298:112-117, 2001.

Hernández, C.; C. Martínez; H. Porcar; J. Ferré: «Correlation BetweenSerovars of Bacillus thuringiensis and Type I â-Exotoxin Production»,J. Invertebr. Pathol. 82:57-62, 2003.

Hernández, C.; J. Ferré: «Larget-Thiéry Update on the Detection of b-Exotoxin in Bacillus thuringiensis by HPLC Analysis», J. Appl.Microbiol. 90:643-647, 2001.

Johnson, D.; R. Peterson: «Limitations of HPLC for the Detection of b-Exotoxin in Cultures Filtrate of Bacillus thuringiensis», EuropeanJournal of Appl. Microbiol. Biotechnol. 17:231-234, 1983.

Levinson, B.; K. Kasyan; S. Chiu; T. Curier; J. González: «Identificationof b-Exotoxin Production, Plasmids Encoding b-Exotoxin, and a NewExotoxin in Bacillus thuringiensis by Using High Performance LiquidChromatographic», J. Bacteriol. 172:3172-3179, 1990.

Márquez, María E.; Orietta Fernández-Larrea; Lérida Almaguel: «Pro-ducción y evaluación de cultivos de Bacillus thuringiensis (Berliner)con efecto acaricida sobre P. latus (Banks.) (Acarina: Tarso-nemidae)», Fitosanidad. 3 (3):53-58, 1999.

Márquez, María E.: «Actividad nematicida de cepas de Bacillusthuringiensis para el control de Meloidogyne incognita en Cuba»Tesis en opción al título académico de Maestro en Microbiología Ge-neral, Universidad de La Habana, 2003.

Oehler, D.; R. Gingrich; M. Haufler: «High Performance LiquidChromatographic Determination of b-Exotoxin Produced by the BacteriumBacillus thuringiensis», J. of Agric. Food Chem. 30:407-408, 1982.

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FITOSANIDAD vol. 10, no. 4, diciembre 2006

DIAGNÓSTICO DE FITONEMATODOS EN SUELOSDE CULTIVOS FRUTALES

Raúl Hernández Hernández1, Gladis del Vallín2 y Doris Hernández2

1 Instituto de Investigaciones de Sanidad Vegetal. Calle 110 no. 514 e/ 5.a B y 5.a F, Playa, Ciudad de La Habana, rhernandez@inisav.cu2 Instituto de Investigaciones en Fruticultura Tropical. Ave 7.a no. 3005 e/ 30 y 32, Playa, Ciudad de La Habana, CP 11300

RESUMENSe diagnosticaron campos agrícolas en fase de presiembra paraconocer los principales géneros de nematodos en suelos previamen-te sembrados de piña (Ananas comosus Lin. Merr.), papaya (Caricapapaya Lin.), guayaba (Psidium guajava Lin.), aguacate (Persea ame-ricana Lin.), mango (Manguifera indica Lin.) y uva (Vitis vinifera Lin.)de las provincias de Ciudad de La Habana, La Habana, Ciego deÁvila, Matanzas y el municipio especial de Isla de la Juventud. Parala extracción de los nematodos móviles se utilizó el método deBaermann, mientras el índice de infestación del suelo con el nematodode las agallas se valoró mediante la prueba de la planta indicadoracon la contribución de los agricultores. En todas las muestras desuelo y raíces se observaron nematodos parásitos de plantas condiversos niveles de densidad de población. Los géneros detectadoscon mayor frecuencia fueron Meloidogyne Goeldi (100%), Rotylen-chulus Linford & Oliveira (72%), Helicotylenchus Steiner (33%) yPratylenchus Filipjev (22%). Las mayores densidades de poblaciónse correspondieron con los suelos que anteriormente habían sidocultivados con guayaba.

Palabras claves: Meloidogyne, Rotylenchulus, Helicotylenchus,Pratylenchus, guayaba, piña

ABSTRACTPre sowing agricultural fields which were planted with fruits aspineapple (Ananas comosus Lin. Merr.), papaya (Carica papaya Lin.),guava (Psidium guajava Lin.), avocado (Persea americana Lin.), man-go (Manguifera indica Lin.) and grape fruit (Vitis vinifera Lin.) from fourprovinces of Cuba and especial county Isla de la Juventud, werenematolgically essayed in vitro, to know current status of nematodesmain genera. Motile nematodes extraction was achieved by usingBaermann method, while root-knot nematodes soil infestation wasvalorised with indicator plant test and farmers contribution. Differentpopulation densities of plant-parasites nematodes were detected inall soil and roots samples. Most frequently nematodes wereMeloidogyne Goeldi (100%), Rotylenchulus Linford & Oliveira (72%),Helicotylenchus Steiner (33%) y Pratylenchus Filipjev (22%). Soilsbefore cultivated with guava showed the highest nematode population.

Key words: Meloidogyne, Pratylenchus, Rotylenchulus, Helico-tylenchus, guava, pineapple

INTRODUCCIÓN

En la agricultura cubana actual se incrementa el fo-mento y la diversificación de frutales, pero para lograrcosechas productivas y consistentes es necesario enfren-tarse a las plagas desde el vivero o ya en la plantación.Entre ellas se encuentran los nematodos parásitos quepueden ocasionar pérdidas de rendimiento entre 10 y30% en los cultivos susceptibles [Fernández, 1991;INIFAP, 2002].

El fruticultor debe valerse del diagnóstico nematológicopara conocer el tipo y la cantidad de nematodos en elsuelo antes de sembrar o plantar, a fin de adoptar me-didas preemergentes cuando se detectan poblaciones por

encima de los niveles que causan daño económico. Poresa razón el análisis de laboratorio y campo proporcio-na la ventaja de realizar tratamientos al suelo con unahorro en el costo de la estrategia de manejo [Stirling yKopittke, 2000]. Además de lo señalado, se deben te-ner en cuenta otros aspectos como la topografía y eldrenaje del campo, la eficacia del sistema de riego y lacapacitación de los agricultores.

El presente trabajo muestra la situación nematológicade diversos campos de producción de frutales, lo quepermite facilitar la aplicación del manejo preventivo denematodos en los campos evaluados.

Hernández y otros

262/fitosanidad

MATERIALES Y MÉTODOS

Se realizó un diagnóstico de nematodos en presiembraen suelos que previamente estuvieron sembrados conguayabo, en fincas de los municipios de Alquízar yBejucal en la provincia de La Habana; con mango yaguacate en el municipio de La Lisa, de Ciudad de LaHabana; con piña en Ciego de Ávila, en la propia pro-vincia; con papayo en Jagüey Grande, en Matanzas, ycon uva en el municipio especial de Isla de la Juventud.

Para la evaluación se establecieron parcelas entre 0,5 y1,0 ha/campo, y en sus diagonales se tomaron porcio-nes de suelo de un perfil entre 6 y 30 cm de profundi-dad, con una piocha o pico, y siempre se desechó el sue-lo de los primeros 5 cm; el número de muestras paracada parcela se determinó a partir del producto del va-lor del área por 50, con aproximación por exceso, deacuerdo con la metodología establecida por Fernández(1991). En los puntos donde existía vegetación se ex-trajeron entre 100 y 300 g de raíces que aún no estuvie-ran muertas, marchitas o con ataques de otros pató-genos, conjuntamente con el suelo.

Las muestras se depositaron en una o varias bolsas depolietileno negro identificadas por área, campo, locali-dad, provincia, cultivo, variedad, fecha de siembra ocosecha, cultivo y variedad anterior, fecha del muestreoy técnico colector.

La extracción de los estadios móviles de nematodosse realizó de acuerdo con el método de Baermann.Se procesaron 18 muestras de 50 g cada una, y losnematodos se recuperaron en viales de 15 mL, ypara la identificación de los géneros se realizaronobservaciones al microscopio estereoscopio de acuer-do con las claves taxonómicas [Siddiqi, 2000]. In-mediatamente después se realizó el conteo con uncontador manual y se calculó el promedio de ejem-plares por muestra.

En las muestras de suelo colocadas en bolsas o mace-tas se sembraron tres semillas pregerminadas de ca-labaza (Cucurbita moschata Lin.) o pepino (Cucumissativus Lin.), a razón de tres bolsas o macetas pormuestra de suelo o materia orgánica, y se colocaronsobre una superficie separada del suelo, a fin de evi-tar la contaminación por contacto con el suelo. Lasplantas se regaron e inspeccionaron periódicamentedurante 35 días de cultivo (en el verano) o 45 (en elinvierno); luego se extrajeron con sumo cuidado paraevitar que se partieran las raíces. La presencia denematodos se determinó mediante inspección visualde acuerdo con una escala de seis grados [Zeck, 1971;Püntener, 1981]. A cada planta indicadora se le asig-nó un grado entre 0 y 5 (Tabla 1), y se calculó el pro-medio del grado de agallamiento o índice de agallasdel total de plantas evaluadas.

Tabla 1. Descripción de las raíces de acuerdo con el grado de infestación con Meloidogyne spp.

Grado Descripción 0 Raíces sin agallas 1 Pequeñas agallas difíciles de descubrir o distribuidas por todas las raíces 2 Desde numerosas agallas pequeñas distribuidas en las raíces (algunas pueden

estar encadenadas entre sí) hasta numerosas agallas de mayor tamaño 3 Agallas presentes en 25-50% de las raíces contaminadas 4 Desde 75% de las raíces con agallas semejantes a tumoraciones, hasta la raíz

casi totalmente contaminada (aún la planta conserva su aspecto verde) 5 Desde la raíz casi totalmente contaminada y reducida (la planta muestra

síntomas del daño) hasta el deterioro total por la muerte

Se calculó la frecuencia de aparición de los nematodospor la división de la cantidad de muestras por génerodetectado entre el total de muestras evaluadas expre-sado en porciento.

RESULTADOS Y DISCUSIÓN

En todas las áreas diagnosticadas se detectaronnematodos parásitos de plantas con diversos niveles de

fitosanidad/263

Diagnóstico de fitonematodos...

densidad de población, que en la mayoría fueron bajoso moderados, aunque en las muestras correspondien-tes a los campos de Bejucal y Alquízar de la provincia

de La Habana previamente sembrados de guayaba losniveles alcanzaron valores elevados o muy elevados (Ta-bla 2).

Figura 1. Frecuencia de aparición de los diferentes géneros de nematodos en cultivos frutícolas.

El análisis de laboratorio reveló que en los campos defrutales en fase de presiembra los géneros más frecuen-tes fueron Meloidogyne y Rotylenchulus. Ambos estu-vieron presentes en todos los cultivos en algunas de susestadios infectivos (Fig. 1), lo que permite asumir laexistencia de una estrecha asociación entre estos orga-nismos y los cultivos frutícolas. Estos resultados sonsimilares a los obtenidos en Venezuela por Petit (1990)en los estudios de biodiversidad nematológica. Los com-plejos formados por estos géneros pudieran represen-tar un peligro potencial, fundamentalmente para fru-tales como el guayabo y la piña, debido a los daños quepueden causar en su sistema radical, que limitan sensi-blemente la absorción de los nutrientes y por consi-guiente el desarrollo y la productividad.

Helicotylenchus y Pratylenchus no estuvieron presen-tes en las áreas agrícolas que anteriormente se cultiva-ron con aguacatero y uva; Helicotylenchus tampoco sepresentó en campos de papayo, y Patylenchus no sedetectó en campos de mango (Tabla 2).

En general las mayores poblaciones de nematodos seapreciaron en los campos de guayabo, con predo-minancia de Meloidogyne sobre Pratylenchus, lo cualcoincide con Fernández (1991), quien aseveró que estecultivo es un buen hospedero de ambas especies, y quelas pérdidas económicas que ocasionan estos nematodospueden alcanzar 20 t/ha en plantaciones jóvenes, segúnSuárez et al. (1998) con valores máximos entre 48 y 57%en plantaciones establecidas. Los daños incluso pue-den ser aún mayores en la fase de producción, cuando

se emplean posturas contaminadas, pues la alimenta-ción y reproducción del nematodo tiene lugar desde elmismo inicio del crecimiento del cultivo en la fase devivero. En este trabajo se observó una tendencia des-cendente del índice de agallamiento de Meloidogynedesde la máxima densidad de población hasta 240 J2/250 g de suelo, a partir de la cual no se presentó unainfestación visible en raíces (Tabla 2).

En las muestras de los suelos dedicados a la piña seobservaron poblaciones de Rotylenchulus y Meloidogyne.Estos géneros de nematodos usualmente están asocia-dos al cultivo con una incidencia negativa en el desa-rrollo de la planta y el rendimiento agrícola, por lo quees muy útil realizar el diagnóstico nematológico antesde la siembra [Gandoy y Ortega, 1980; MINAGRI,1989; Araya, 2006].

CONCLUSIONES

• Meloidogyne y Rotylenchulus con 100 y 72% respecti-vamente fueron los géneros de nematodos más fre-cuentes en las muestras de suelos de frutales en fasede presiembra.

• Los suelos procedentes del guayabo se distinguieronnotablemente por las elevadas densidades de pobla-ción de Meloidogyne en comparación con los de piña,uva, papayo, mango y aguacatero.

• Helicotylenchus y Pratylenchus no estuvieron pre-sentes en las áreas agrícolas anteriormente cultiva-das con aguacatero y uva, mientras el primero tam-poco estuvo en papayo y el segundo en mango.

Hernández y otros

264/fitosanidad

Tabla 2. Fauna de nematodos parásitos de los cultivos frutales detectados. Individuos por 250 g de suelo

Meloidogyne sp. Rotylenchu-lus sp.

Municipio/ provincia

Unidad agrícola Cultivo precedente

Variedad

J2 M G J4 M

Helicoty- lenchus sp.

Pratylen- chus sp.

2756 4 25

1305 2 620 1

Alquízar/ La Habana

Estación Experimental

de Fruticultura

Guayabo Enana EEA 18-40

305 0,3 100 240 0,3 50 130 0 15 5 15 110 0 10

Bejucal/ La Habana

Finca La Milagrosa

Guayabo Enana EEA 18-40

100 0 40 35 Super

Hayden 70 0 10 5 Mango

Hyden 30 0 35 10 5

La Lisa/ Ciudad de La

Habana

Finca de

autoconsumo Aguacatero Catalina-

Govin 10 0 5

160 10 0 110 20 Española roja 5 0 5

Ciego de Ávila/ Ciego de Ávila

Empresa de la Piña

Piña

Cayena lisa 53 5 0 85 10 5 Solosunrise 100 10 5 Jagüey Grande/

Matanzas Estación

Experimental de Fruticultura

Papayo Maradol 60 5 0 5 5

140 0 90 0

Isla de la Juventud

Finca orgánica Uva Aramón

30 0 200

J2: Larva infectiva del segundo estadio. M: Espécimen adulto macho. G: Grado de infestación con agallas. J4: Hembra adulta joven infectiva.

REFERENCIASAraya, M.; Comunicación personal, 2006.

Fernández, E. «Los nematodos del género Meloidogyne Goeldi en elcultivo de la guayaba (Psidium guajava L.) y su control». Tesis deDoctorado en Ciencias Agrícolas, Instituto de Investigaciones deSanidad Vegetal, La Habana, 1991.

Gandoy, P.; J. Ortega: «Nematodos parásitos del cultivo de la piña enCuba y posibilidades de su control», Ciencias de la Agricultura7:19-28, 1980.

INIFAP: «Control de nematodos fitoparásitos en piña. Ficha tecnológicapor sistema tecnológico», estado de Veracruz, México, 2002.

http://www.inifap.gob.mx/contenido/innovaciones/innovaciones.html#sanidad.

MINAGRI: Instructivo técnico para el cultivo de la piña, DepartamentoIndependiente de Frutales. Área No Cañera, Centro de Información yDocumentación Agropecuaria, La Habana, 1989.

Petit, P.: «Reconocimiento de nematodos fitoparásitos asociados a fru-tales de importancia económica en Venezuela», Fitopatol. Venez.3(1):2-5, 1990.

Püntener, W.: Manual para ensayos de campo de protección vegetal,2.a ed. revisada y ampliada, Documenta CIBA-GEIGY, Basilea, Suiza,1981.

Siddiqi, M. R.: Tylenchida. Parasites of Plants and Insects, 2th Ed.,CABI Publishing, Wallingford, Inglaterra, 2000.

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Zeck, W. M.: «El esquema de valoración del ataque de cecidiosradicícolas», Pflanzenchutz Nacrichten Bayer 24(1):147-150, 1971.

fitosanidad/265

FITOSANIDAD vol. 10, no. 4, diciembre 2006

AISLAMIENTO, IDENTIFICACIÓN Y CARACTERIZACIÓNMORFOMÉTRICA DE AISLADOS NATIVOS DE HONGOSMITOSPÓRICOS CON POTENCIALIDAD PARA EL CONTROLDE ESPECIES DE INSECTOS PLAGA

Orestes Elósegui Claro, Jesús Jiménez Ramos y Aidanet Carr Pérez

Instituto de Investigaciones de Sanidad Vegetal. Calle 110 no. 514 e/ 5.a B y 5.a F, Playa, Ciudad de La Habana, CP 11600

RESUMENSe realizó una prospección de hongos entomopatógenos a partir deespecies de insectos plaga sospechosos de micosis en cultivos degran importancia económica y de muestras de suelo. De un total de53 muestras se obtuvieron 17 útiles que correspondieron a 15 aisla-dos de Beauveria bassiana (Bals.) Vuill., una de Paecilomyces lilacinusSamson y una de Metarhizium anisopliae (Metsch.) Sorokin. El predo-minio de aislados de Beauveria fue consecuencia en parte del ampliorango de hospedantes de esta especie fúngica y a la cantidad demuestras procesadas que pertenecieron a Hypothenemus hampei(broca del café), donde este microorganismo es un patógeno muyhabitual. Solamente se obtuvo un aislado de hongo de las 15 mues-tras de suelo procesadas mediante el trampeo con insectos patro-nes. Todos los aislados se incorporaron a la Colección de Cepas deHongos Entomopatógenos del Instituto de Investigaciones de Sani-dad Vegetal (INISAV), donde se registraron sus característicasmacroculturales, microculturales, origen y especie a que pertene-cen, con el objetivo de conservarlos para futuros estudios comoagentes potenciales de biocontrol de insectos plaga.

Palabras claves: hongos entomopatógenos, hongos mitospóricos, con-trol biológico, plagas

ABSTRACTA screening for entomopathogenic fungi from both mycosis suspectinsect cadavers in crops of economical importance and soil sampleswas carried out. Of a total out of 53 samples collected 17 resultedsuccessful which belonged to 15 isolates of Beauveria bassiana (Bals.)Vuill., one of Paecilomyces lilacinus Samson and one of Metarhiziumanisopliae (Metsch.) Sorokin. The predominance of Beauveria isolateswas a consequence in part of the large amount of samples taken fromHypothenemus hampei (coffee berry borer) where this microorganismhas been found as a very common pathogen as well as the broad hostrange this fungal species exhibits in nature. Only one fungal isolateof fifteen different soil samples tested by insect bait method wasobtained. All the isolates recovered were stored in the Plant HealthResearch Institute (INISAV) Culture Collection being previouslyrecorded in a datasheet with the micro and macro culturalcharacteristics, origin and species name, for further research for apotential use as biological control agents of insect pests.

Key words: entomopathogenic fungi, mitosporic fungi, biological con-trol, pests

INTRODUCCIÓN

Los hongos mitospóricos están catalogados como ungrupo mundialmente reconocido de agentes microbianosa usarse tanto en los programas de control biológico deplagas como en los de manejo integrado de plagas (MIP).Esto es debido a su forma de actuar, que es por contac-to directo con la cutícula del hospedero y por la dispo-nibilidad de tecnologías para producirlos masivamen-te. Algunos géneros además se pueden formular enaceites y así aplicarse con técnicas de volumen ultrabajo[Bateman et al., 1993; Bateman et al., 1996].

Está demostrado que para llegar a obtener un produc-to altamente efectivo para controlar una especie plagase debe partir de un amplio rango de aislados, seleccio-

nados en principio en cuanto a su virulencia. Los aisla-dos que causan epizootias espectaculares, como es elcaso de algunos de los géneros fúngicos imperfectosentomopatogénicos, son candidatos promisorios parausarse en el control de plagas, siempre y cuando logrenclasificar sobre la base de otras características esencia-les como son un nivel de especificidad de hospedanteestrecho, buena tolerancia a factores ambientales ad-versos, facilidad de producción, comportamiento en al-macenaje adecuado y alta seguridad en mamíferos[Bateman et al., 1996].

Clásicamente hay tres vías de enriquecer el número deaislados fúngicos para utilizarse como candidatos en el

Elósegui y otros

266/fitosanidad

control biológico de plagas. La primera es mediante elaislamiento del hongo a partir de artrópodos ynematodos micosados, la segunda a través de muestrasde suelo y por último directamente de las coleccionesde cultivo [Rhodes y Smith, 1992].

Una vez aislado el agente es necesaria una correcta iden-tificación. La identificación tradicional por medio delas características morfológicas mantiene un peso rele-vante, aunque se han introducido conceptos nuevos queconllevan a algún tipo de marcador molecular que per-mita, entre otras cosas, identificar al agente inclusodespués de su liberación [Bridge y Arora, 1998 citadospor Bieliková et al., 2002].

En Cuba, dentro de los hongos entomopatógenos estánautorizados a producirse masivamente solamente doscepas de Beauveria bassiana de las que una no es nati-va, y la otra es de Metarhizium anisopliae. Para el casode Lecanicillium lecanii (syn. Verticillium lecanii) secuenta con dos cepas en la producción, ambas foráneas.Por estas razones surge la necesidad de contar con ma-yor cantidad de aislados e introducir nuevos en la pro-ducción, que tengan ventajas como controladores dedeterminadas plagas agrícolas con respecto a las queya se producen masivamente en el país.

Los objetivos del trabajo fueron realizar aislamientosde hongos patógenos a artrópodos (insectos), con énfa-sis en especies plaga de relevancia económica, identifi-carlos taxonómicamente e incorporarlos a la Colecciónde Hongos Entomopatógenos y Antagonistas del Ins-tituto de Investigaciones de Sanidad Vegetal (INISAV)para estudios posteriores.

MATERIALES Y MÉTODOSEn los Laboratorios Provinciales de Sanidad Vegetal(LAPROSAV) y en el INISAV se recibieron muestrasque consistieron en individuos muertos pertenecientes ala clase Insecta, sospechosos de micosis, según síntomasde momificación y/o mecanización, o con esporulación denaturaleza fúngica en la superficie cuticular; también serecibieron muestras de suelo. Ambas muestras proce-dían de zonas donde se habían observado epizootias y noaplicado productos a base de hongos entomopatógenos,de acuerdo con registros históricos de campo.

Para el aislamiento del hongo, que ya estaba esporuladosobre los individuos colectados, se realizaron siembrasen placas Petri de 9 cm de diámetro, por agotamientoen agar sabouraud dextrosa o agar papa dextrosa(PDA) o agar extracto de malta (MEA), en presencia deantibióticos, según el método descrito por Rhodes y

Smith (1992). Para los individuos sospechosos de mico-sis se realizaron lavados con agua estéril y desinfeccionescon NaHClO a 0,5% durante 1 min. Seguidamente serealizaron dos lavados por agua estéril y se colocaron encámaras húmedas incubadas a 28ºC por 7-9 días. A par-tir del segundo día se observaron, y en los individuosdonde se detectó emersión de micelio se realizaron trans-ferencias bajo condiciones asépticas, con siembras poragotamiento de acuerdo con el método ya mencionado.

Para el aislamiento de hongos entomopatógenos conGalleria mellonella se siguió el método de trampeo des-crito por Zimmermann en 1986 [citado por Sun, 2002]con algunas modificaciones para este trabajo. Las mues-tras de suelo se obtuvieron a partir de la selección deuna hectárea que fuese representativa de un agroeco-sistema con registros de infecciones por hongosentomopatógenos en insectos plaga. Se tomaron cincopuntos al azar y de cada punto se colectaron 10submuestras de 10 cm3 de suelo cada una. El materialse colocó en bolsas oscuras y se homogenizaron en unamuestra única en el laboratorio. Se vertieron 6-10 g desuelo por placa Petri de 12 cm de diámetro y en cadauna se colocó un individuo de Galleria mellonella oCorcyra cephalonica de primeros estadios larvales, comoinsectos cebo o trampeadores. Las placas se observa-ron a partir del segundo día hasta el noveno, con movi-miento diario. Si en este intervalo ocurría la muerte seprocedía a la desinfección superficial, incubación y ais-lamiento del supuesto hongo de forma similar a lo ex-plicado en el párrafo anterior para los individuos sos-pechosos de micosis.

Las colonias obtenidas en placa se observaron al mi-croscopio estereoscópico y se realizaron preparacionesal microscopio óptico que se compararon con las des-cripciones de géneros hifomicetos de Carmichael et al.(1980) y Barnett y Hunter (1998). En caso de pertene-cer el individuo a un género patogénico de interés, serealizaba un subcultivo en medio agarizado y se regis-traba como un nuevo aislado de la colección; en casocontrario las muestras procesadas se destruían. La iden-tificación del patógeno a nivel de especie se realizó conayuda de las descripciones de especies de hongosentomopatógenos del CMI, de acuerdo con las caracte-rísticas macro y microculturales [CMI, 1979].

RESULTADOS Y DISCUSIÓN

Los aislados de hongos entomopatógenos obtenidos co-rrespondieron a los géneros Beauveria, Paecilomyces yMetarhizium, a los que se les estudiaron sus caracterís-ticas macro y microculturales más notables (Tabla 1).

fitosanidad/267

Aislamiento, identificación y caracterización...

Tabla 1. Aislados de hongos entomopatógenos obtenidos. Principales características macro y microculturales

Aislado (número de

registro de origen) Origen Identificación Características

macroculturales Características microculturales

Bb-102 Metamasius hemipterus ceriseus (coleóptero), Matanzas

Beauveria bassiana

En PDA colonias al inicio blancas afieltradas que con el tiempo se tornan crema polvorientas. Reverso amarillo ligero

Células conidiógenas muy típi-cas de la especie, con bases glo-bosas. 2,0-3,0 (2,3 µm) x 2,0-2,5 (2,1 µm). Conidios hialinos, globosos a subglobosos1,0-2,5 (1,9 µm) x 1,0-2,0 (1,7 µm)

Bb-103 Metamasius hemipterus (coleóptero), Santiago de Cuba

Beauveria bassiana

En PDA colonias algodonosas y blancas al inicio que se tornan crema y polvorientas con el tiempo. Reverso amarillo ligero

Muy abundantes conidioforos con grupos densos de células fialídicas. Células conidiógenas globosas unas y otras en forma de botella con formas interme-dias, 1,5-3,0 (2,7 µm) x 2,0-3,0 (22 µm). Conidios hialinos, a veces con un ápice muy definido, globosos a elipsoidales 1,5-3,0 (2,3 µm) x 1,5-3,0 (21 µm)

Bb-105 Hypothenemus hampei (coleóptero), cafetal, zona montañosa, Granma

Beauveria bassiana

Colonias en PDA que al inicio son blancas y algodonosas y se tornan beis claro y ligeramente polvorientas, según esporulan con el tiempo. Reverso amarillo ligero

Células conidiógenas muy típi-cas de la especie, con bases glo-bosas. 2,0-3,0 (2,3 µm) x 2,0-2,5 (2,2 µm). Conidios muy homo-géneos, hialinos, globosos, algunos subglobosos, 2,0-2,0 µm

Bb-106

Hypothenemus hampei (coleóptero), café, zona montañosa, Granma

Beauveria bassiana

Colonias en PDA que al inicio son blancas y algodonosas y se tornan crema claro y ligeramente polvorientas según esporulan con el tiempo. Algunos coremios. Reverso amarillo ligero

Células conidiógenas globosas unas y otras en forma de botella con formas intermedias, 2,0-3,5 (2,3 µm) x 1,0-2,5 (1,9 µm). Conidios hialinos, globosos a subglobosos1,5-2,0 (1,9 µm)x1,0-2,0 (1,7µm)

Bb-107

Hypothenemus hampei (coleóptero), café, zona montañosa, Granma

Beauveria bassiana

Colonias en PDA que al inicio son blancas y algodonosas y se tornan beis claro y ligeramente polvorientas según esporulan con el tiempo. Algunos coremios Reverso amarillo ligero

Células conidiógenas globosas unas y otras en forma de botella con formas intermedias, 2,0-3,5 (2,3 µm) x 1,0-2,5 (1,9 µm). Conidios hialinos, globosos a subglobosos1,5-2,0 (1,9 µm) x 1,0-2,0 (1,7µm)

Bb-SP Spodoptera frugiperda (lepidóptero), maíz, Camagüey

Beauveria bassiana

En PDA colonias algodonosas y blancas al inicio que se tornan beis y ligeramente polvorientas con el tiempo. Reverso miel

Células conidiógenas muy típicas de la especie, con bases globosas, 2,0-3,0 (2,4 µm) x 2,0-2,5 (2,3 µm). Conidios muy homogéneos, hia-linos, globosos, algunos ligera-mente subglobosos, 2,0-2,0 µm

Elósegui y otros

268/fitosanidad

Bb-200603 Hypothenemus hampei (coleóptero), café, zona montañosa, Holguín

Beauveria bassiana

Colonias en MEA que al inicio son blancas y algodonosas y se tornan beis y polvorientas según esporulan con el tiempo. Reverso amarillo claro

Células conidiógenas, predominan las de forma de bo-tella, 3,0-4,0 (3,3 µm) x 3,0-2,0 (2,3 µm). Conidios variables, aunque predominan formas elipsoidales, base apiculada en ocasiones, hialinos, 2,0-3,0 (2,3 µm) x 2,0-3,0 (23 µm)

Bb-cepa2 Hypothenemus hampei (coleóptero), café, zona montañosa, Santiago de Cuba

Beauveria bassiana

Colonias en MEA que al inicio son blancas y algodonosas y se tornan beis y polvorientas según esporulan con el tiempo. Reverso amarillo pálido

Células conidiógenas típicas de la especie, con bases globosas, 2,0-3,0 (2,2 µm) x 2,0-2,5 (2,3 µm). Conidios globosos a subglobo-sos, hialinos, algunos apicu-lados, 2,0-2,5(2,2 µm) x 1,5-2,0 (1,8 µm)

Bb-cepa3 Hypothenemus hampei (coleóptero), café, zona montañosa, Santiago de Cuba

Beauveria bassiana

Colonias en MEA que al inicio son blancas y algodonosas y se tornan beis y polvorientas según esporulan con el tiempo. Reverso amarillo muy pálido

Células conidiógenas típicas de la especie, con bases globosas, 2,0-3,0 (2,3 µm) x 2,0-2,5 (2,4 µm). Conidios subglobosos a ligeramente elipsoidales, predominando estos últimos, hialinos, 2,0-3,0 (2,6 µm) x 2,0

Bb-cepa4 Hypothenemus hampei (coleóptero), café, zona montañosa, Santiago de Cuba

Beauveria bassiana

Colonias en MEA que al inicio son blancas y algodonosas y se tornan beis claro y polvorientas según esporulan con el tiempo. Reverso amarillo pálido

Células conidiógenas predominan las de forma de botella, 3,0-4,0 (3,2) x 3,0-2,0 (2,4 µm). Conidios, predominan formas elipsoidales, algunos globosos a subglobosos, hialinos, en ocasiones apiculados, 2,0-3,0 (2,5 µm) x 2,0-2,5 (2,2 µm)

Bb-cepa5 Hypothenemus hampei (coleóptero), café, zona montañosa, Santiago de Cuba

Beauveria bassiana

Colonias en MEA que al inicio son blancas y algodonosas y se tornan beis claro y polvorientas según esporulan con el tiempo. Tendencia discreta a formar coremios. Reverso amarillo miel

Células conidiógenas, predominan las de forma de botella, 3,0-4,0 (3,3) x 3,0-2,0 (2,5 µm). Conidios, predominan formas elipsoidales con ápice definido, algunos subglobosos, hialinos, 2,0-3,0 (2,6 µm) x 2,0

Bb-1234 Hypothenemus hampei (coleóptero), café, Guamá, Santiago de Cuba

Beauveria bassiana

Colonias en MEA que al inicio son blancas y algodonosas y se tornan beis medio y polvo-rientas según esporulan con el tiempo. Tendencia a formar coremios. Reverso amarillo

Células conidiógenas típicas de la especie, con bases globosas, 2,0-3,0 (2,3 µm) x 2,0-2,5 (2,4 µm). Conidios globosos a subglobosos ligeramente, hialinos, 2,0 x2,0 µm

Bb-SIM Hypothenemus hampei (coleóptero), café, Tercer Frente, Santiago de Cuba

Beauveria bassiana

Colonias en MEA que al inicio son blancas y algodonosas y se tornan beis pálido y polvorien- tas según esporulan con el tiem-po. Reverso amarillo pálido

Células conidiógenas con bases globosas, 2,0-3,0 (2,1 µm) x 2,0-2,5 (2,4 µm). Conidios subglobosos a ligeramente elípticos, hialinos, 2,0-3,0 (2,3) x 1,5-2,5 (2,1) µm

fitosanidad/269

Aislamiento, identificación y caracterización...

Bb-SL Hypothenemus hampei (coleóptero), café, San Luis, Santiago de Cuba

Beauveria bassiana

Colonias en MEA que al inicio son blancas y algodonosas y se tornan beis pálido y ligeramente polvorientas según esporulan con el tiempo. Tendencia a formar coremios. Reverso amarillo pálido

Células conidiógenas predo-minan las de forma de botella 3,0-4,0(3,3) x 3,0-2,0 (2,7 µm). Conidios subglobosos a ligeramente elípticos y hasta elipsoidales, hialinos,2,0-3,0 (2,3) x 2,0 µm

Bb-Inv Cylas formicarius (coleóptero), boniato, Camagüey

Beauveria bassiana

Colonias en PDA que al inicio son blancas y algodonosas y se tornan beis pálido y ligeramente costrosas según esporulan con el tiempo. Reverso amarillo pálido

Células conidiógenas predominan las de forma de botella, 3,0-4,0 (3,4) x 3,0-2,0 (2,8 µm). Conidios ligeramente elípticos hasta elipsoidales, ápice discreto, hialinos, 2,0-3,0 (2,5) x 1,0-2,0 (1,6) µm

Bb-1212 Hypothenemus hampei (coleóptero), café, Los Llanos, Guisa, Granma

Beauveria bassiana

Colonias en PDA que al inicio son blancas y algodonosas y se tornan beis y polvorientas según esporulan con el tiempo. Reverso amarillo

Células conidiógenas con bases globosas, 2,0-3,0 (2,2 µm) x 2,0-2,5 (2,3 µm). Conidios globosos a subglobosos, hialinos, 1,5-2,0 (1,8) x 2,0µm

Pl-01M2 Hypothenemus hampei, café, Santiago de Cuba

P aeci l o myces li l ac i nus

Colonias en PDA al inicio blanco lanoso que se tornan violeta grisácea con la edad y con micelio aéreo irregular. Reverso vináceo

Conidioforos solos o en grupos, forman sinemas con verticilos de hasta seis fiálides, con la edad se tornan rugosos. Células conidiógenas típicas, 7,0-13,0 (9,5 µm) x 1,5-3,0 (2,8 µm). Conidios catenulados, gris-violeta claro, elipsoidales a fusiformes, algunos con un ápice, 1,5-3,0 (2,2 µm) x 1,5-3,0 (2,4 µm)

Ma-30 Muestra de suelo (insecto trampa Galleria mellonella), IPA Villena, La Habana

Metarhizium anisopliae

Colonias en PDA blancas y algodonosas al inicio que se tornan amarillo verdoso y finalmente verde olivo oscuro y costroso con zonas con micelio aéreo abundante blanquecino. Reverso amarillo intenso

Patrón conidioforo típico de la especie con verticilos de 2-3 ramas cada uno, con tonos verde olivo oscuro que aclara al ápice. Células conidiógenas 6,0-10,0 (8,1 µm) x 2,0-2,5 (2,1 µm). Conidios subhialinos a ligeramente verdes, cilíndricos a ligeramente elipsoidales, 5,0-8,5 (6,6 µm) x 2,0-3,0 (2,4 µm)

De un total de 53 muestras procesadas de las que 15fueron de suelo de zonas donde se habían observadoepizootias, 17 resultaron muestras exitosas. De los ais-lados obtenidos solamente uno correspondió a unamuestra de suelo, que fue obtenido por trampeo conlarvas de Galleria mellonella (Fig. 1).

Con respecto a las especies de interés detectadas se puedeobservar que hubo una predominancia de aislados per-tenecientes a la especie Beauveria bassiana (Balsamo)Vuillemin (Tabla 1, Fig. 2).

En contraste, solo se obtuvo un aislado de Metarhiziumanisopliae (Metschnikoff) Sorokin y otro de Paecilomy-ces lilacinus (Thom.) Samson (Fig. 1).

Este comportamiento se puede atribuir a la efectivi-dad del método de trampeo con insectos susceptibles,donde se requiere de una cantidad de propágulos via-bles que garantice la infección, los que deben ser delorden de 104 unidades por insecto como mínimo segúnBateman et al. (1996) y Moore y Caudwell (1997). Sesabe que el establecimiento de poblaciones de hongos

Elósegui y otros

270/fitosanidad

entomopatógenos en el suelo está determinado tantopor las propiedades físicas y químicas de cada suelocomo por las de la cepa fúngica en cuestión [Rhodes ySmith, 1992]. También existe la posibilidad de que losmicroorganismos competidores con su producción de

metabolitos activos afecten la viabilidad de estospropágulos fúngicos deseados [Jenkins y Grzywacz,2000]. Por ello, el trampeo puede fallar si no existe unaconcentración alta de esporas viables del microorga-nismo de interés en el suelo

Figura 1. Larva momificada de Galleria mellonella en cámara húmeda infectado con el aislado Ma-30 deMetarhizium anisopliae a partir de muestra de suelo. Nótese la emersión temprana del micelio en blanco.

Figura 2. Colonia de Beauveria bassiana aislado Bb-105 obtenido de Hypothenemus hampei.

Sun (2002) logró 6,7% de éxito para Metarhizium y10% de éxito para Beauveria en trampeos con el termiteCoptotermes formosanus, a partir de 90 muestras origi-nales de suelo, porcentajes superiores de éxito con res-pecto al procesamiento de termites muertos sospecho-sos de micosis; sin embargo, Zimmermann (1986) [citadopor Sun, 2002] se refiere al método de trampeo con

Galleria como uno de los más exitosos para detectarentomopatógenos en termites.Por otro lado, Dhoj et al. (2006) recomiendan tambiénel método de trampeo con Galleria en contacto conmuestras de suelo, porque fundamentalmente es el quelleva poca especializacion y el tiempo del ensayo es cor-to con un porcentaje de éxito alrededor de 75% para

fitosanidad/271

Aislamiento, identificación y caracterización...

aislar Beavuveria y Metarhizium. Estos mismos auto-res usaron 15 g de suelo aproximadamente por cadaindividuo de Galleria y pusieron en contacto con el sue-lo al insecto trampeador hasta 18 días; sin embargo, eneste trabajo se obtuvo una sola muestra de suelo útilpor trampeo con Galleria, lo que representó 7% de éxi-to. Este comportamiento puede deberse a que la canti-dad de suelo por individuo fue de 6-10 g, y el tiempo encontacto con este solo fue de nueve días, además de quela cantidad de propágulos del hongo de interés presen-te en el suelo es muy variable y depende de condicionesespecíficas de cada ecosistema (Tabla 1 y Fig. 1).

Un método más efectivo para obtener nuevos aisladosde hongos es el aislamiento de colonias fúngicas únicas(ufc) a partir de muestras de suelo por dilucionesseriadas, según procedimiento detallado por Lecuona(1996). No obstante, es ampliamente aceptado que estemétodo es muy caro y se prefiere usar en el aislamientoy selección de especies bacterianas, como por ejemploBacillus thuringiensis [Johnson y Bishop, 1996], de ahíque se decidiera no emplearlo para enriquecer el núme-ro de aislados de la Colección de Hongos Entomopa-tógenos del INISAV.

El porcentaje de éxito obtenido en este trabajo paralas muestras de insectos sospechosos de micosis o conuna evidente fue de 42%. Jackson et al. (2000) plan-tean que aunque este método de aislamiento directoconlleva mucho tiempo de muestreo en campo y expe-riencia, la realidad es que entre los más exitosos agen-tes de control con microorganismos se encuentranaquellos aislados obtenidos directamente de los insec-tos hospederos, y no de las colecciones de cultivos o demétodos indirectos a través de medios de cultivo se-lectivos.

La frecuencia alta de aparición de Beauveria bassianase debió al amplio rango de hospedantes de este pató-geno, además de que la mayoría de los aislamientos sehicieron a partir de Hypothenemus hampei (broca delcafé), y se conoce que esta especie fúngica regularmen-te se ha encontrado que atacan las poblaciones del in-secto de forma natural en los cafetales. De hecho, esesta la razón de que sea uno de los entomopatógenosmás estudiados para el control de esta plaga [Bustilloet al., 1999].

Beauveria bassiana (Bals.) Vuill. así como Metarhiziumanisopliae (Metsch.) Sorok. y Metarhizium flavovirideGams and Rozsypal están entre los hongos entomo-patógenos más usualmente encontrados en la natura-

leza. Por ello, colecciones de cultivo internacionalmentereconocidas cuentan con varios cientos de aislados deestas tres especies como la Colección de HongosEntomopatógenos para Investigaciones Agrícolas delDepartamento de Agricultura de Estados Unidos(ARCEF), la ATCC (American Type Culture Collection)y la Colección del IMI (International MycologicalInstitute) en el Reino Unido [Humber, 1992; Batemanet al., 1996]. En Cuba más del 85% de la Colección deHongos Entomopatógenos del INISAV está represen-tada por aislados de Beauveria y Metarhizium.

En relación con el aislamiento de Paecilomyces lilacinusobtenido de Hypothenemus hampei se sabe que estehongo se encuentra comúnmente en las crías de brocaen laboratorio, donde es posible que las condiciones dehacinamiento, la alta humedad relativa y la falta dedesinfección de las cerezas favorezcan la invasión de estaespecie para atacar a la broca, si bien en la planta decafé en el campo no se ha encontrado [Posada et al.,1998]. También es cierto que P. lilacinus está cataloga-do como hongo entomopatógeno oportunista y se hausado exitosamente en el control de nematodosfitopatógenos [López, 1995]. Por esta razón se decidióincorporarlo a la Colección de Hongos Entomo-patógenos del INISAV para futuras investigaciones.

Los productos exitosos a base de hongos desarrolladosen el mercado han surgido a partir de un monitoreo deaislados obtenidos de las regiones geográficas yagroecosistemas, donde está el organismo plaga porcontrolar, así como de las colecciones de cultivos.Bateman et al. (1996) reportaron la selección de unasola cepa de M. anisopliae, después de haber ensayado159 aislados de Beauveria y Metarhizium contraSchistocerca gregaria (langosta del desierto). Esto con-firma la necesidad de contar con abundante cantidadde aislados de los más diversos orígenes cuando se pre-cisa obtener agentes microbianos efectivos comobiocontroladores de plagas [Bateman et al., 1996;Jenkins y Grzywacz, 2003].

Como se puede apreciar, de acuerdo con las caracterís-ticas macro y microculturales, para los aislados deBeauveria existió una alta similitud, por lo que unaseparación entre estos por los métodos tradicionalesmorfométricos no es factible (Tabla 1). Para lograr ladistinción entre aislados hay que recurrir a métodos debiología molecular como RFLP y PCR-RAPDS [Brid-ge et al., 1993; Bridge y Arora, 1998; Bielikova et al.,2002]. Estos métodos moleculares también se usan comouna forma altamente reproducible de reconocer cada

Elósegui y otros

272/fitosanidad

aislado para patentar, registrar los productos ymonitorear tanto su destino en el ecosistema donde selibere como las posibles interacciones negativas quepuedan existir entre el aislado liberado y el resto de losaislados de la misma especie [Jenkins y Grzywacz, 2000;Bielikova et al., 2002].

Finalmente todos los aislados de interés obtenidos seincorporaron al banco de cepas de hongos entomo-patógenos, y en la base de datos de esa colección se re-gistraron las características macroculturales, micro-culturales, origen y especie a que pertenecen, con elobjetivo de conservarlos como agentes potenciales debiocontrol de insectos plaga para futuros estudios.

CONCLUSIONES

• Se obtuvieron 17 nuevos aislados de hongos ento-mopatógenos de los que uno fue de Metarhiziumanisopliae, uno de Paecilomyces lilacinus y el restode Beauveria bassiana.

• El método de aislamiento directo a partir de insec-tos micosados tuvo 42% de efectividad.

• El método de aislamiento a partir de muestras desuelo de hongos entomopatógenos mediante trampeocon larvas de Galleria y Corcyra fue muy inefectivo,con 7% de éxito solamente.

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fitosanidad/273

FITOSANIDAD vol. 10, no. 4, diciembre 2006

DISPERSIÓN, DISTRIBUCIÓN ACTUAL Y NUEVOSRESERVORIOS DE FRANKLINIELLA SCHULTZEI TRYBOM(THYSANOPTERA: THRIPIDAE) EN CUBA

Santiago F. Jiménez Jiménez,1 Liuva Pérez López,2 Martha Toro,3 Criseida Granda,4 Amelia Mateo,5

Héctor Sariol,6 Elisa Rodríguez,7 Rodney Pérez,8 Roquelina Jiménez,9 Ángel Pérez-Alejo10 y RansésVázquez11

1 Instituto de Investigaciones de Sanidad Vegetal. Calle 110 no. 514 e/ 5.a B y 5.a F, Playa, Ciudad de La Habana, CP 11600, sjimenez@inisav.cu2 Centro Nacional de Sanidad Vegetal. Laboratorio Central de Cuarentena Vegetal. Ayuntamiento 231 e/ San Pedro y Lombillo, Plaza de la Revolución, Ciudad de La Habana3 Laboratorio Provincial de Sanidad Vegetal. Carretera a Santiago de Cuba Km 2½, Guantánamo4 Laboratorio Provincial de Sanidad Vegetal. Carretera Siboney Km 6, Ternerito Lindo, Santiago de Cuba5 Laboratorio Provincial de Sanidad Vegetal. Prolongación de Carbó 40, Alturas de Perera y calle Holguín, Holguín.6 Laboratorio Provincial de Sanidad Vegetal. Carretera Central vía Santiago de Cuba Km 3½, Bayamo, Granma7 Laboratorio Provincial de Sanidad Vegetal. Genaro Rojas 86 e/ Marcelino Diéguez y Antonio Barrera, Las Tunas, CP 75200.8 Laboratorio Provincial de Sanidad Vegetal. Ave Finlay Km 2½ e/ Planta de Nitrógeno y Circunvalación Norte, Camagüey9 Laboratorio Provincial de Sanidad Vegetal. Carretera Palmira Km 4, Cienfuegos10 Laboratorio Provincial de Sanidad Vegetal. Carretera Maleza Km 2½, Santa Clara, Villa Clara11 Instituto de Meteorología. Apdo. 17032, Habana 17, Ciudad de La Habana, CP 11700

RESUMENDurante el período 2001-2006 se realizaron muestreos en diferentesprovincias de Cuba que permitieron actualizar la situación de F.schultzei en relación con el grado de dispersión logrado por la espe-cie, así como las plantas que le sirven de reservorios y su distribu-ción. Se detectó la presencia de esta especie de trips en la mayoríade las provincias del país, y se reconoció que su mayor distribuciónla alcanza en la región oriental, especialmente en Camagüey, Granma,Holguín, Santiago de Cuba y Guantánamo. Las especies botánicassobre los que se detectó F. schultzei alcanzaron la cifra de 94, de lascuales 84 se informan por primera vez para el país. No obstante, elinsecto se detectó de forma mayoritaria solamente sobre 24 espe-cies de plantas, básicamente vegetales, hortalizas y ornamentales.El mayor número de detecciones correspondió a las rosas de dife-rentes colores, y se realizó también un número considerable de ellassobre quimbombó, abrojo, margaritas japonesas, lirios, espinaca,tomate, claveles, calabaza, carolá, berenjena y habichuelas, lo queapunta a las preferencias de F. schultzei. Debido a la posibilidad deinfectarse con tospovirus, que presentan algunas de estas especiesde plantas, y dada la capacidad vectora de estos patógenos –demos-trada por este trips en numerosos países, incluidos algunos de estehemisferio–, se considera que son ellas las que actualmente poseenel mayor peligro potencial de resultar afectadas por esas enfermeda-des virales.

Palabras claves: distribución, Frankliniella schultzei, reservorios,trips

ABSTRACTSamplings in different provinces of Cuba were carried out during theperiod 2001-2006 that allowed upgrading the status of F. schultzei inrelation with the dispersion grade achieved by the species, as well asthe plants that serve it as reservoirs and their distribution. The presenceof this trips species was detected in most of the provinces and it wasrecognized that its biggest distribution is reached in the orientalregion, especially in Camagüey, Granma, Holguín, Santiago de Cubaand Guantánamo. Botanical species on those F. schultzei was detectedreached the figure of 94 and 84 of them are informed the first time forthe country. Nevertheless, the insect was only detected in a majorityway on 24 species of plants, basically vegetables and ornamentals.The biggest number of detections corresponded to different coloursroses, and a considerable number of them on quimbombó (lady’sfingers), thistle, Japanese daisies, irises, spinach, tomato, carnations,pumpkin, carolá, eggplant and kidney beans, what points out to thepreferences of F. schultzei. Keeping in mind the possibility to beinfected with tospovirus that present some of these species of plantsand given the vector capacity of these patogens –demonstrated bythis thrips in numerous countries, including some of our hemisphere–, itis considered they possess the biggest danger potential to be affectedby this viral group at the moment.

Key words: distribution, Frankliniella schultzei, reservoirs, thrips

Eco

logí

a

Jiménez y otros

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INTRODUCCIÓN

Frankliniella schultzei Trybom (Thysanoptera:Thripidae) es una especie de trips que, además defitófago, se incluye entre las confirmadas como vectoresde tospovirus [Mound, 2002], razón que la convierte enun insecto plaga doblemente peligroso.

Según Vierbergen y Mantel, 1991 [citados porKormelink et al., 1998], F. schultzei se distribuye en lostrópicos, extendida a lo largo de África, Asia, Austra-lia, Caribe, Pacífico y América del Sur. También se in-forma en la Florida y en zonas de clima templado (in-troducida) como Gran Bretaña, Italia y Países Bajos.Palmer et al. (1992) le atribuyen hábitos polífagos (flo-res), y la informan en ají chile, algodón, compuestas,cebolla, sorgo y tomate, entre otras.

En Cuba Suris et al. (2001) realizaron el primer informede la presencia de F. schultzei en sus formas clara y oscu-ra sobre los cultivos de papa y tomate. PosteriormentePérez et al. (2004) confirmaron su presencia y la infor-maron sobre Phaseolus vulgaris L. (habichuela) y Cucumissativus L. (pepino). En ambos casos los autores se refie-ren a muestras colectadas en provincias de la zona occi-dental del país (La Habana y Ciudad de La Habana), ymencionan una baja intensidad de la especie.

La forma oscura de F. schultzei está reconocida comovector de los cuatro tospovirus Tomato Spotted WiltVirus (TSWV) [Samuel et al., 1930; Sakimura, 1969;Wijkamp et al., 1995], Tomato Chlorotic Spot Virus(TCSV), Groundnut Ringspot Virus (GRSV) [Wijkampet al., 1995] y Chrysanthemum Stem Necrosis Virus(CSNV) [Nagata y de Ávila, 2000]. Esta forma oscuraestá extendida a lo largo de América del Sur y se indicacomo un vector importante de tospovirus en Brasil (DeÁvila et al., 1998) y Argentina [Williams et al., 2001].Más recientemente Sakurai (2004) demostró también quela forma oscura de F. schultzei, originaria de Paraguay,puede transmitir TSWV eficazmente, y puede ser unvector importante del virus en los campos de tomate.

Este trabajo se realizó como una contribución al cono-cimiento del grado de dispersión, la distribución actualy la diversidad de hospedantes que posee F. schultzeien Cuba, dado el peligro potencial que representa estaespecie, más que como fitófago, como vector de enfer-medades virales, particularmente de tospovirus.

MATERIALES Y MÉTODOS

El trabajo se llevó a cabo en dos etapas durante el pe-ríodo comprendido entre los años 2001-2006, y mediante

muestreos efectuados en las diferentes provincias delpaís, en los que se realizó la inspección local de áreassembradas con plantas ornamentales (jardines domés-ticos, jardines botánicos, jardines de instalaciones vin-culadas al turismo y otros); áreas productoras de cul-tivos en empresas y cooperativas agrícolas; semillerosy viveros; áreas de floricultura; huertos intensivos,organopónicos y cultivos protegidos y áreas citrícolas.

En la primera etapa, que comprendió del 2001 al 2003,los muestreos mensuales se realizaron en el período com-prendido entre septiembre y marzo, y se tomó unamuestra compuesta por no menos de 10 especies botá-nicas por provincia. En la segunda etapa, entre el 2004y el 2006, los muestreos se extendieron a lo largo detodo el año, y en cada inspección mensual se observa-ron no menos de 20 especies botánicas.

En los dos períodos se revisaron vegetales, hortalizas,viandas, frutales, ornamentales y otras. Las muestrasestuvieron compuestas tanto de hojas como de hojas yflores, según el caso. Cada una de ellas, después de co-lectada, se introdujo de modo independiente en bolsasplásticas que se identificaron de acuerdo con el sitio deprocedencia y la fecha de muestreo.

El material vegetal con los trips se revisó en las Esta-ciones Territoriales de Protección de Plantas (ETPP)de las diferentes provincias, con la finalidad de extraerde cada muestra los especímenes presentes e introdu-cirlos en viales con alcohol al 70%, en los que se anotó,para cada caso, el hospedante, el sitio de procedenciade la muestra y la fecha en que se obtuvo. Posterior-mente los viales se enviaron a los Laboratorios Provin-ciales de Sanidad Vegetal (LAPROSAV) para su iden-tificación y/o al Laboratorio Central de Cuarentenapara su identificación y/o confirmación, según corres-pondiera. Para la ejecución del diagnóstico se utiliza-ron las claves de Palmer et al. (1992), Mound y Marullo(1996), Rodríguez et al. (1997) y Mound y Kibby (1998).

En la mapificación de las muestras con detecciones deF. schultzei se utilizó el Sistema de CuadrantesCartográficos [CNSV, 1997], según su versión digita-lizada [Vázquez et al., 2003]. Todo el trabajo se realizóen estrecha relación con la encuesta nacional de espe-cies peligrosas de trips, que patrocina el Centro Nacio-nal de Sanidad Vegetal.

RESULTADOS Y DISCUSIÓN

Durante el período comprendido entre el 2001 y el 2003,de un total de 4818 muestras positivas para trips, solose identificó F. schultzei en 33 de las muestras revisadas,

fitosanidad/275

Dispersión, distribución actual...

y estas correspondieron al último año de ese trienio.Procedían fundamentalmente de las provincias deGuantánamo y Holguín, en el oriente de Cuba (Tabla 1).Este resultado constituyó la primera evidencia del co-mienzo de la dispersión de la especie, cuya presencia enel país, hasta ese momento, se limitaba a las provinciashabaneras [Suris et al., 2001].

Del total de las muestras obtenidas en el período com-prendido entre el 2004 y el 2006 se realizaron 313detecciones de F. schultzei, lo que demostró un nota-ble incremento respecto al período precedente, así comouna mayor distribución por diferentes provincias delpaís (Tabla 1), con la mayor abundancia en la regiónoriental.

Tabla 1. Dispersión de F. schultzei en el país (período 2001-2006)

Período I Período II Provincias 2001 2002 2003 2004 2005 2006

Pinar del Río 0 0 0 0 0 1 La Habana 0 0 0 0 0 13 Ciudad de La Habana 0 0 0 0 0 6 Matanzas 0 0 0 0 0 2 Villa Clara 0 0 1 0 0 0 Cienfuegos 0 0 0 0 0 4 Sancti Spíritus 0 0 0 0 0 0 Ciego de Ávila 0 0 0 0 0 0 Camagüey 0 0 0 0 24 0 Las Tunas 0 0 0 1 0 0 Granma 0 0 2 4 8 2 Holguín 0 0 9 7 48 14 Santiago de Cuba 0 0 0 16 50 54 Guantánamo 0 0 21 37 22 0 Total 0 0 33 65 152 96

La ubicación de las muestras según el sistema de cua-drantes cartográficos permite visualizar el grado dedispersión alcanzado por F. schultzei a lo largo del paísen el curso de los años que comprendió el trabajo. Enel mapa se aprecia que la especie se distribuye mayor-mente en las provincias de la región oriental de Cuba,básicamente Camagüey, Granma, Holguín, Santiagode Cuba y Guantánamo, donde se localiza la mayorcantidad de cuadrantes en los que se ha detectado lapresencia de la especie (Fig. 1).

En relación con los reservorios de F. schultzei, du-rante el estudio se detectó la presencia del insecto en93 especies botánicas, de las cuales ocho ya habíansido informadas anteriormente: Lycopersicum lyco-persici Mill. [Surís et al., 2001], Vigna sesquipedalisF. (habichuela), Cucumis sativus L. [Pérez et al.,2004], Allium sativum L., Beta vulgaris L., Capsicumannum L., Portulaca oleracea L. y Argemone mexica-na L. [González y Surís, 2005]. Esto significa que seinforman 85 nuevos reservorios de la especie para elpaís (Tabla 2).

La mayor preferencia de F. schultzei, según la frecuen-cia de detección registrada, se muestra en la Tabla 3,donde se relacionan las 24 especies de plantas sobre lascuales la especie se detectó en un número de muestrasmayor o igual a cuatro. Entre ellas se incluyen funda-mentalmente vegetales, hortalizas y ornamentales. Detodas las referidas, el mayor número de detecciones seprodujo sobre quimbombó (7), abrojo y margaritasjaponesas (8), lirios (9), espinaca (11), tomate (12),claveles (13), calabaza (15), carolá y berenjena (16),habichuela (19), y entre todas se destacaron las rosasde diferentes colores con 42 detecciones en cinco pro-vincias del país.

En consideración a la posibilidad de infectarse contospovirus que presentan algunas de estas especies deplantas, y dada la capacidad vectora de estos patógenosdemostrada por F. schultzei en numerosos países y bá-sicamente en este hemisferio norte [De Ávila et al., 1998;Williams et al., 2001; Sakurai, 2004], se considera queen Cuba son ellas las que, actualmente, poseen el ma-yor peligro potencial de resultar afectadas por dichasenfermedades virales.

Jiménez y otros

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Tabla 2. Relación de especies de plantas encontradas como nuevos reservorios de F. schultzei en Cuba

Nombre científico Nombre común Acalypha sp. Rabo de gato Allamanda cathartica Lin. Alamanda Allium cepa Lin. Cebolla Allium schoenoprassum Lin. Cebollino Althaea rosea Car. Varita de San José Amaranthus spinosus, Lin. Bledo espinoso Angelonia cubensis Robinson Nomeolvides malva Argyreia nervosa Boj. Cordón de seda Bastardia viscosa (L.) Malva bruja Begonia sp. Begonia Benincasa hispida Cong. Calabaza china Beta vulgaris L. var. cicla Acelga Bidens pilosa L. Romerillo Cajanus indicus Spreg Frijol guandul Calendula officinalis Lin. Marigol Callotropis procera (Ait.) R. Br. Algodón de seda Capsicum frutescens L. Ají Cassia fistula Cañandonga Cestrum nocturnum Lin. Galán de noche Citrullus vulgaris Schrad. Melón Codiaeum variegatum Blume. Croton Crinum sp. Lirio flor Cucurbita pepo L. Calabaza Dahlia coccinea Cav. Dalia malva Datura metel L. Clarín Daucus carota sativa D. C. Zanahoria Dianthus caryophyllus L. Clavel Gardenia jasminoides Ellis Jazmín del cabo (gardenia) Gerbera jamesonii Hort. Margarita japonesa Gliricidia sepium L. Júpiter Gossypium hirsutum L. Algodón Helianthus annuus Lin. Girasol Helychrysum bracteatum Andr. Siempreviva Hibiscus esculentus L. Quimbombó Hibiscus rosa-sinensis Lin. Marpacífico Hibiscus sp. Hibiscus, Marpacífico

Tabla 3. Especies botánicas sobre las que se detectó F. schultzei en cuatro o más ocasiones y procedencia de las muestras

Nombre común Nombre científico Procedencia Cebolla A. cepa Guantánamo Acelga B. vulgaris var. cicla Holguín, Santiago de Cuba, Guantánamo Romerillo B. pilosa Ciudad de La Habana, Holguín, Guantánamo Melón C. vulgaris Holguín Lirio flor Crinum sp. Santiago de Cuba Pepino C. sativus Holguín, Guantánamo Calabaza C. pepo Camagüey, Holguín, Santiago de Cuba, Guantánamo

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Dispersión, distribución actual...

Dalia D. coccinea Granma, Santiago de Cuba Clavel D. caryophyllus La Habana, Holguín Margarita japonesa G. jamesonii Cienfuegos, Camagüey, Santiago de Cuba Quimbombo H. esculentus Holguín, Guantánamo Marpacífico H. rosa-sinensis Matanzas, Camagüey, Santiago de Cuba Jazmín Jasminum sp. Holguín, Santiago de Cuba Lechuga L. sativa Ciudad de La Habana, Holguín, Santiago de Cuba Tomate L. lycopercisi Holguín, Santiago de Cuba, Guantánamo Frijol Phaseolus sp. Holguín, Guantánamo Rosa Rosa sp. Ciudad de La Habana, Las Tunas, Granma, Santiago de Cuba,

Guantánamo Berenjena S. melongena Santiago de Cuba, Guantánamo Espinaca S. oleracea Holguín, Santiago de Cuba, Guantánamo Carolá T. erecta Pinar del Río, La Habana, Santiago de Cuba, Guantánamo Copetúa T. patula Holguín Abrojo terrestre T. cistoides Santiago de Cuba Habichuela V. sesquipedalis Villa Clara, Holguín, Santiago de Cuba, Guantánamo Vicaria V. rosea Santiago de Cuba

Figura 1. Distribución por cuadrantes cartográficos de F. schultzei en Cuba según la ubicación geográfica de sus reservorios (2001-2006).

CONCLUSIONES

• F. schultzei se dispersó a lo largo de Cuba entre el2001 y el 2006, y diversificó sus reservorios hastaalcanzar la cifra de 92 especies botánicas.

• La más amplia distribución de la especie se registróen los territorios de las provincias de Camagüey,Granma, Holguín, Santiago de Cuba y Guantánamo.

• Se informan 84 especies de plantas que constituyennuevos reservorios de F. schultzei para Cuba, entre

las cuales quimbombó, abrojo, margaritas japone-sas, lirios, espinaca, tomate, claveles, calabaza, carolá,berenjena, habichuela y especialmente las rosas re-sultan preferidas por el insecto.

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Jiménez y otros

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fitosanidad/279

FITOSANIDAD vol. 10, no. 4, diciembre 2006

VARIABILIDAD DE LAS ISOENZIMAS ESTERASAS DE BEAUVERIABASSIANA (BALSAMO) VUILLEMIN

María E. Estrada Martínez y Dolores Piñón Gómez

Instituto Nacional de Investigaciones de la Caña de Azúcar. Carretera CAI Manuel Martínez PrietoKm 2½, Boyeros, Ciudad de La Habana, CP 19390, fax: (53-7) 260 2571, meem@inica.edu.cu

RESUMENSe determinó la variabilidad de las isoenzimas esterasas delhifomiceto entomopatógeno Beauveria bassiana (Balsamo) Vuilleminmediante electroforesis vertical en gel de poliacrilamida a 8,5%. Seanalizaron los zimogramas de 21 aislamientos de diferentes oríge-nes geográficos y entomológicos. A partir de la matriz de los datosoriginales se calculó la distancia genética y se realizó el análisis deagrupamiento de los individuos mediante el método de los promediosde las distancias no ponderadas. La presencia de 24 bandas diferen-ciales y de seis grupos de diversidad molecular evidenciaron la va-riabilidad genética de B. bassiana para el sistema enzimático estu-diado.

Palabras claves: Beauveria bassiana, variabilidad, esterasas, Diatraeasaccharalis, caña de azúcar

ABSTRACTIsoenzyme esterases variability of hyphomycete fungus Beauveriabassiana (Balsamo) Vuillemin was determinated by means verticalelectrophoresis on 8.5% polyacrylamide gel. Twenty one isolates fromdifferent geographical and entomology origin groups were analyzed.Starting from the matrix of the original data the genetic distance wascalculated. The analysis of individuals cluster was carried out bymeans of the unweighted pair–group method, arithmetic average. Thepresence of 24 differential bands and six groups of molecular diversityevidenced the genetic variability of B. bassiana for the studiedenzymatic system.

Keys words: Beauveria bassiana, variability, esterases, Diatraeasaccharalis, sugar cane

INTRODUCCIÓN

Beauveria bassiana (Balsamo) Vuillemin es un hi-fomiceto entomopatógeno ampliamente utilizado en lalucha biológica contra los insectos plaga de los cultivosagrícolas [Moino et al., 2002; Sáenz de Cabezón et al.,2003; Estrada et al., 2004; Kauffman et al., 2005]. EnCuba se utiliza para disminuir las poblaciones larvalesde Diatraea saccharalis (Lepidoptera: Cambridae), ba-rrenador de la caña de azúcar (Saccharum sp. híbrido).

El estudio de las isoenzimas esterasas contribuye alconocimiento de la variabilidad genética de diferen-tes especies entomopatógenas [Estrada et al., 1997;Bruce et al., 2003]. Este análisis permite establecerdiferencias no detectables desde el punto de vistamorfológico.

El interés agronómico y ecológico de las aplicaciones deB. bassiana en el cultivo de la caña de azúcar precisaconocer las diferencias isoenzimáticas entre los aisla-mientos del hifomiceto, de forma tal que estos puedan

ser identificados luego de su aplicación en el agroe-cosistema cañero. En este sentido en el presente tra-bajo se determina la variabilidad de las isoenzimasesterasas de B. bassiana, sistema enzimático repor-tado polimorfo para esta especie [Fernandes et al.,2006].

MATERIALES Y MÉTODOS

Se analizaron 21 aislamientos (Tabla 1) de B. bassiana,los cuales se cultivaron en 50 mL de medio de cultivoestático Adamek (1965) e incubados a 25oC durantesiete días.

El micelio obtenido se pesó húmedo y seco, después defiltrarlo por papel Filtrak 390 y llevarlo a sequedad atemperatura ambiente durante tres días. Un gramo delsecado se maceró con tampón fosfato a pH = 6,5 consacarosa a 20% en una proporción de 1:3. El maceradose centrifugó a 10 000 rpm durante 10 min.

Estrada y Piñón

280/fitosanidad

Se realizaron seis extracciones para cada aislamiento,las que se examinaron comparativamente por electro-foresis vertical en gel de poliacrilamida a 8,5%. Laelectroforesis se realizó entre 50-60 mA durante 4 h.Para el revelado de los geles se utilizaron como sustratosα y β-naftil acetato, y se analizaron visualmente, paralo cual se tuvo en cuenta el número y la posición de lasbandas de cada aislamiento. Las movilidades relativasde las manchas se calcularon a partir del punto de apli-cación como:

Rf = Movilidad de la mancha / Movilidad del frente de corrida

Cada banda enzimática se consideró como una varia-ble cualitativa presente (1) o ausente (0). Se utilizó elprograma NTSYS versión 2.01, y a partir de la ma-triz de los datos originales se calculó la distanciagenética mediante el coeficiente de similitud SM y serealizó el análisis de agrupamiento de los individuos

Tabla 1. Relación de los aislamientos de Beauveria bassiana (Bals.) Vuill. utilizados en el trabajo

Aislamientos País de origen Hospedante de origen 1 Cuba Diatraea saccharalis 2 Cuba Diatraea saccharalis 3 Cuba Diatraea saccharalis 4 Cuba Diatraea saccharalis 5 Francia Leptinotarsa decemlineata 6 Cuba Diatraea saccharalis 7 Guadalupe Insecta 8 Estados Unidos Artiples flloridus 9 Cuba Diatraea saccharalis

10 Cuba Diatraea saccharalis 11 Cuba Diatraea saccharalis 12 Francia Sitona discoideus 13 Cuba Diatraea saccharalis 14 Cuba Insecta 15 Cuba Diatraea saccharalis 16 Cuba Diatraea saccharalis 17 Cuba Diatraea saccharalis 18 Cuba Hysipyla grandella 19 Cuba Diatraea saccharalis 20 India Insecta 21 Bulgaria Insecta

por el método de los promedios de las distancias noponderadas (Unweighted Pair-Group Method,Arithmetic Average). Los patrones de marcadoresmoleculares se determinaron según Cornide et al.(2000).

RESULTADOS Y DISCUSIÓN

La Fig. 1 corresponde a los zimogramas para esterasasde los 21 aislamientos de B. bassiana estudiados. Se apre-cia un total de 41 bandas. De ellas 24 son polimórficas,es decir, son bandas únicas para diferentes aislamientosque representan 58,53% del total de las bandas revela-das. La presencia de 18 patrones de bandas evidencia elpolimorfismo para esterasas de B. bassiana, lo que hasido demostrado por diferentes autores para esta espe-cie entomopatógena [Liu et al., 2003; Meyling y Eilenberg,2005].

fitosanidad/281

Variabilidad de las isoenzimas...

Figura 1. Zimograma para esterasas de 21 aislamientos de Beauveria bassiana (Bals.) Vuill. (1-41: bandas; I-XVIII: patrones)

De acuerdo con lo obtenido mediante el análisis de agru-pamiento de los 21 aislamientos de B. bassiana estu-diados, se formaron seis grupos de diversidad molecular(I, II, III, IV, V y VI) (Fig. 2), donde los aislamientosno aparecen agrupados por su origen geográfico yentomológico.

La presencia de bandas diferenciales (Tabla 2) permitiódistinguir las bandas de los grupos de diversidadmolecular. Así, por ejemplo, en el grupo I, formado porlos aislamientos 1, 3, 18, 2, 4 y 5, se puede diferenciar

el aislamiento 3 del 5 por la presencia de las bandasB14 y B34 en el primero, y la ausencia en el segundo.En el grupo II se evidencia la presencia de bandas dife-renciales entre los aislamientos que conforman en estegrupo. En el caso del grupo III los aislamientos 11 y 12se identifican del resto de los aislamientos por presen-tar las bandas B11, B25 y B35; sin embargo, estos ais-lamientos no pudieron diferenciarse entre sí. El restode los aislamientos que conforman los grupos IV, V yVI presentaron bandas diferenciales que permitieronidentificarlos entre sí.

Estrada y Piñón

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Figura 2. Análisis de agrupamiento de los 21 aislamientos de B. bassiana basado en la matriz de similitud.

Tabla 2. Patrones de descriptores moleculares de los aislamientos de B. bassiana con isoenzimas esterasas

Grupos de diversidad molecular

Aislamientos B11 B12 B25 B28 B35 B38 B39 B41

I 1 0 1 0 0 1 0 0 0

3 0 1 0 0 0 0 0 0

18 0 1 0 0 0 0 0 0

2 0 1 0 0 0 0 0 0

4 0 1 0 1 0 0 0 0

5 0 0 0 0 0 0 0 0

II 6 0 0 0 1 1 0 1 0

7 0 0 0 1 0 0 1 0

15 0 0 0 1 0 0 1 0

19 0 0 0 1 0 0 0 1

20 0 0 0 1 0 0 0 1

8 0 0 0 1 0 0 1 0

13 1 0 0 1 0 0 0 0

9 0 0 0 0 0 1 0 0

10 0 0 0 1 0 1 0 1

III 11 1 0 1 0 1 0 0 0

12 1 0 1 0 1 0 0 0

IV 16 0 0 0 0 0 0 1 0

17 0 0 0 0 0 0 0 0

V 21 0 0 0 0 0 0 0 0

VI 14 0 0 0 0 0 0 0 0

Bandas diferenciales entre grupos de diversidad molecular.

Bandas diferenciales entre aislamientos de un mismo grupo de diversidad molecular.

fitosanidad/283

Variabilidad de las isoenzimas...

La caracterización basada en el estudio de las isoenzimasesterasas evidenció la variabilidad genética de B. bassia-na y permitió contar con otro criterio para diferenciarlos aislamientos del hifomiceto por sus patrones debandas, lo que resulta de utilidad práctica para la co-lección de microorganismos entomopatógenos.

La determinación de un carácter discriminante paraB. bassiana a partir de las bandas diferenciales resultade interés agronómico, pues fue posible diferenciar elaislamiento 3 que se aplica en el cultivo de la caña deazúcar del 5 que se aplica en la agricultura no cañera.Como B. bassiana se ha aislado a partir de larvas ycrisálidas de D. saccharalis colectadas en diferentespartes de la planta y a partir de muestras de suelo (Ta-bla 1), la evaluación de la aplicación del aislamiento 3en el campo requiere de su caracterización para la dife-renciación de los aislamientos que aparecen natural-mente en el agroecosistema cañero.

Generalmente los patrones isoenzimáticos no secorrelacionan con los insectos hospedantes, con el paísde origen ni con otro carácter. Ellos pueden emplearsecomo marcadores individuales, y se han utilizados paraconocer la estabilidad genética de especies de hifomicetosentomopatógenos sometidas a diferentes presiones deselección [Rakotoniainy et al., 1994].

El conocimiento de la variabilidad de las isoenzimasesterasas constituye una herramienta para la caracte-rización de los aislamientos de B. bassiana en el Pro-grama Nacional de Lucha Biológica contra el barrena-dor de la caña de azúcar D. saccharalis.

CONCLUSIONES

• La caracterización basada en el estudio de lasisoenzimas esterasas evidenció la variabilidad genéticade B. bassiana y permitió contar con otro criteriopara diferenciar los aislamientos del hifomiceto porsus patrones de bandas.

• Fue posible diferenciar el aislamiento 3, que se aplicaen el cultivo de la caña de azúcar, del aislamiento 5que se aplica en la agricultura no cañera.

• La evaluación de la aplicación del aislamiento 3 en elcampo requiere de su caracterización para la dife-renciación de los aislamientos que aparecen natural-mente en el agroecosistema cañero.

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Estrada y Piñón

284/fitosanidad

fitosanidad/285

FITOSANIDAD vol. 10, no. 4, diciembre 2006

Con

trol

bio

lógi

co

UN MEDIO SIMPLIFICADO A BASE DE SOYA MÁS AZÚCARTURBINADA DE CAÑA PARA LA PRODUCCIÓN DEL HONGOACAROPATÓGENO HIRSUTELLA NODULOSA PETCHEN FASE LÍQUIDA

Reinaldo I. Cabrera,1 Marlén Vega2 y Litzy Ayra1

1 Instituto de Investigaciones de Fruticultura Tropical. Ave 7.a no. 3005 e/ 30 y 32, Playa, Ciudad de La Habana, entomopatogeno@iift.cu.2 Instituto de Investigaciones del Arroz. Autopista Novia del Mediodía Km 16½, Bauta, La Habana, iiarroz@bauta.esihabana.cu; iiarroz@sba.esihabana.cu

RESUMENEl hongo Hirsutella nodulosa Petch resulta un importante enemigonatural de muchos ácaros fitófagos. Para su producción comobioplaguicida es muy necesaria la determinación de un medio decultivo sencillo, económico y eficiente. Se ensayaron cinco concen-traciones de soya (6, 8, 10, 12 y 14% p/v) con dos de azúcar turbinadade caña (3 y 4% p/v). Cada combinación se distribuyó por separadoen tres erlenmeyers de 300 mL con 100 mL de medio cada uno, yprevia esterilización en autoclave a 121oC durante 25 min; se inocu-laron con una suspensión micelial del hongo a 3% v/v para su fer-mentación durante cuatro días en zaranda de producción continua a27 ± 1oC y 180 rpm como ocurrió con el inóculo. Seguidamente serecuperó cada biomasa en papel de filtro por filtración al vacío y secolocó en una estufa a 60oC durante 24 h para determinar su pesoseco en balanza analítica. Los resultados se analizaron mediante unANOVA de clasificación doble, previa transformación de los datos en

1+x , y las medias se compararon entre sí por la prueba de rangosmúltiples de Duncan para p < 0,05. La mejor combinación de soyamás azúcar fue la de 14 y 3% p/v respectivamente, con resultadosque alcanzaron hasta un promedio de 1,14 g (peso seco de micelio)por cada 100 mL de medio, lo que permite considerarlo económico yeficiente para la producción a gran escala de este acaropatógeno ycomo la primera experiencia en Cuba.

Palabras claves: Glicine max, Hirsutella nodulosa, cultivo sumergi-do, azúcar de caña

ABSTRACTThe fungus Hirsutella nodulosa Petch is an important natural enemy ofmany phytophague mites and it is very necessary the determination ofa simple, economic and efficient culture medium for its production asbioplaguicide. Five soybean concentrations have been assayed (6;8; 10; 12 and 14% w/v) with turbinated cane sugar (3 and 4% w/v).Each combination has been distributed separately in three erlenmeyersof 300 mL with 100 mL of medium each one. They have been sterilizedin autoclave at 121ºC during 25 min and inoculated with a micelialsuspension of the fungus at 3% v/v. They were fermented four dayswith a continuous shaker at 27 ± 1ºC and 180 rpm as well as theinoculum. Each biomass was recovered on fitter paper by vacuumfiltration. They were put in an oven at 60ºC during 24 h to determinedry weight by analytical balance. The results were analyzed by anANOVA of double classification, previous data transformation in 1+x .Means were compared by Duncan Multiple Range Test for p < 0.05.The best combination of soybean plus sugar was 14 and 3% w/vrespectively, with a mean up to 1.14 g (dry weight of mycelium) byeach 100 mL of medium. This result allows considering it as economicand efficient for the great scale production of this mite pathogen andwhich the first Cuban experience.

Key words: Glicine max, Hirsutella nodulosa, submerge culture, canesugar

INTRODUCCIÓN

Las investigaciones realizadas en Cuba y otros paísescon el hongo Hirsutella nodulosa Petch, al que se le con-sidera un importante enemigo natural de muchos ácarosfitófagos [Cabrera y Domínguez, 1987 y 1987a; Mintery Brady, 1980], han motivado el interés por su utiliza-ción como bioacaricida.

La llegada al país del ácaro tarsonémido del arrozSteneotarsonemus spinki Smiley a finales de 1997 [Ra-mos et al., 1998] y los estudios de H. nodulosa comoenemigo natural de este ácaro en Cuba y Sri Lanka[Cabrera et al., 2002 y 2005], así como lo difícil queresulta su control por la vía de la lucha química [Ca-

Cabrera y otros

286/fitosanidad

brera et al., 2002a], potenciaron la necesidad de pro-fundizar en la posible utilización de H. nodulosa en losprogramas de control biológico y manejo integrado con-tra esta y otras plagas. Para ello se requiere disponer,en primer lugar, de un medio de cultivo y una tecnolo-gía barata que permitan la producción de este aca-ropatógeno a gran escala y en las cantidades requeri-das para tales fines.

El presente trabajo ofrece los primeros resultados enCuba sobre la búsqueda de un medio simplificado, eco-nómico y eficiente para la producción del hongo H. no-dulosa en fase líquida y su importancia en la multipli-cación acelerada de este control biológico.

MATERIALES Y MÉTODOS

Para la determinación del medio se pesaron por separa-do 36, 48, 60, 72 y 84 g de soya en grano (Glycine max(Lin.) Merr.) y se echaron en erlenmeyers de 2 L con500 mL de agua destilada para su cocción en autoclavea 121oC durante 35 min. Luego el contenido de cadarecipiente se batió en una batidora licuadora durante20 s y se filtraron separadamente por un paño de lien-zo, con presión manual para la extracción de cada par-te líquida, las que se enrazaron con agua destilada a600 mL para que la soya quedara a 6, 8, 10, 12 y 14% p/v,respectivamente.

A los primeros 300 mL con cada concentración de soyase le adicionó entonces el azúcar turbinada de caña a3% p/v y a los 300 restantes a 4% p/v, y se filtraron alvacío por papel de filtro Whatmann no.1. Seguidamen-te se vertieron por separado 100 mL de cada una de lascombinaciones de nutrientes a las diferentes concen-traciones en erlenmeyers de 300 mL, y se esterilizarona 121oC durante 25 min. En las tres repeticiones quetuvo el ensayo, el pH fluctuó entre 5,8 y 7.

Como inóculo al 3% v/v se utilizó una cepa de H. nodulosarecién aislada del ácaro S. spinki y reproducida durante96 h en medio H [McCoy et al.,1972, citado por Cabrera,2001], colocado en zaranda de producción continua a180 rpm y una temperatura de 27 ± 1oC.

Transcurridos los primeros cuatro días de fermenta-ción, bajo las mismas condiciones antes señaladas serecuperó por filtración al vacío la biomasa producidaen cada medio, y estas se colocaron en estufa a 60oCdurante 24 h para luego determinar, en balanza analíti-ca, la producción micelial que se obtuvo en cada er-lenmeyer.

Todo el trabajo se realizó bajo un diseño de bloques alazar, en mesa de flujo laminar y con pro pipeta automáti-ca. Para el análisis de los resultados se utilizó un ANOVAde clasificación doble, previa transformación de los datosen , y las medias se compararon entre sí por laprueba de rangos múltiples de Duncan para p < 0,05.

RESULTADOS Y DISCUSIÓN

Se logró la determinación de un medio de cultivo conbuenas características para su utilización en la produc-ción de H. nodulosa en fase líquida, y cuyos resultadossuperan significativamente a los del testigo, sin la pre-sencia de la conidiación del hongo en los medios líqui-dos ensayados, pero sí una abundante biomasa en lasdiferentes combinaciones de soya más azúcar formadapor sus micelios y conidióforos.

Se presentaron diferencias significativas para p < 0,05entre el testigo y todas las concentraciones de soya másazúcar, así como entre algunas de las combinaciones deestas fuentes de nutrientes, con los mayores resultadosa medida que se incrementaba el contenido de soya (Fig. 1).La dinámica de desarrollo de este acaropatógeno en lascombinaciones de nutrientes ensayadas fue muy rápi-da en lo que respecta a la producción de biomasamicelial, la que alcanzó hasta un promedio de 1,14 g(peso seco) por cada 100 mL de medio a los cuatro díasde fermentación a 27 ± 1oC y 180 rpm. La mejor com-binación de soya más azúcar turbinada de caña fue lade 14% p/v y 3% p/v respectivamente.

La selección de los medios de cultivos a partir desustratos naturales y sus buenos resultados no solodependerán de su riqueza nutricional, ya sea en nitró-geno, carbono u otros elementos, sino además de lascaracterísticas del medio como viscosidad, turbidez ypH entre otras, según señalara Cabrera (2001).

El procedimiento metodológico utilizado para la extrac-ción de elementos como el nitrógeno a partir de la soyafue similar al desarrollado por Cabrera (2001); resultóeficaz, lo que permitió disponer de un medio simplifica-do, eficiente y económico para la reproducción de H. no-dulosa, una vez combinada la soya con el azúcarturbinada de caña como fuente de carbono. La ausen-cia de conidias en este caso no es consecuencia de losmedios utilizados, sino de que este acaropatógeno nopresenta conidiación en cultivo líquido, como ocurre conla mayoría de las cepas de H. thompsonii [Cabrera,2001].

1+x

fitosanidad/287

Un medio simplificado a base de soya...

Figura 1. Producción de biomasa de H. nodulosa en diferentes concentraciones de soya y azúcar turbinada de caña más un testigo.

Como se aprecia en la Fig. 1, se presentaron diferenciassignificativas entre el testigo y todas las concentracio-nes de soya, en lo que a la producción de biomasa micelialse refiere. Ello confirma la importancia del nitrógenoorgánico en el desarrollo micelial de H. nodulosa, comose señaló para H. thompsonii por Cabrera (2001).

La posibilidad de sustituir el extracto de levadura y lapeptona como fuentes portadoras de nitrógeno por lasoya, así como la glucosa y la sacarosa, portadoras decarbono, por el azúcar turbinada de caña, permite dis-poner de un medio de cultivo mucho más económico yeficiente para la producción de H. nodulosa, con rendi-mientos de hasta 1,14 g de biomasa (peso seco) por cada100 mL de medio a las 96 h de fermentación. Esta cons-tituye la primera vez que en Cuba se realizan estudiospara la búsqueda de un medio simplificado para la pro-ducción de este hongo en fase líquida, y cuyos resulta-dos son de vital importancia para la producción acele-rada de este control biológico si se toma en consideraciónsu lento crecimiento tanto en fase sólida como líquida.

CONCLUSIONES

• El medio a base de soya 14% p/v más azúcar de cañaturbinada a 3% p/v resulta el más eficiente y econó-mico para la producción masiva del hongo H.nodulosa en fase líquida, lo que valida su utilizacióna gran escala.

• Las diferentes concentraciones de soya más azúcarque se ensayaron permitieron una buena dinámica

de desarrollo del hongo con resultados, en todos loscasos, superiores a los del testigo.

• H. nodulosa produce una abundante masa micelialen el medio antes señalado, y en ninguno de los casosse observó la presencia de conidias.

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FITOSANIDAD vol. 10, no. 4, diciembre 2006

ESTUDIO DEL EFECTO PROTECTOR DE BACILLUS SPP.SOBRE EL DESARROLLO DE LA PUDRICIÓN BLANDADE LA PAPA (SOLANUM TUBEROSUM L.)

Yaritza Reinoso Pozo,1 Luis Casadesús Romero,1 Armando García Suárez,2 Ernesto García Pérez1 yVictoria Pazos Álvarez-Rivera1

1 Facultad de Biología, Departamento de Microbiología y Virología. Calle 25 no. 455 e/ I y J, Plaza de la Revolución, Ciudad de La Habana, CP 10400, yreinoso@fbio.uh.cu2 Laboratorio Central de Cuarentena Vegetal, Centro Nacional de Sanidad Vegetal. Ayuntamiento 231 e/ Lombillo y San Pedro, Plaza de la Revolución, Ciudad de La Habana, CP 10400

RESUMENLa pudrición blanda bacteriana, causada por Pectobacteriumcarotovorum, ocurre en una amplia variedad de cultivos y es una delas más severas enfermedades poscosecha de la papa (Solanumtuberosum L.) en el mundo entero. El control de esta enfermedad sebasa fundamentalmente en la aplicación de químicos que contami-nan el medio ambiente y deterioran la salud humana. Una de lasalternativas ecológicas adoptadas es el uso de microorganismoscomo agentes de control biológico, entre los que se encuentran losmiembros del género Bacillus. El objetivo del presente trabajo fuedeterminar el efecto protector de 23 cepas de Bacillus sp. sobre eldesarrollo de la pudrición blanda de la papa. Para ello se trataronrodajas de papa con cultivos bacterianos de 24 h y posteriormente seinocularon con una cepa de P. carotovorum a dos concentracionesdiferentes. Las rodajas se mantuvieron durante 24 h en condicionesde temperatura y humedad favorables para el desarrollo de lapudrición. Transcurrido este tiempo se evaluó la efectividad de lostratamientos respecto a los controles no tratados, y se tuvo en cuentala aparición o no de los síntomas característicos de la enfermedad.Las cepas G15, G19 y G25 solamente tuvieron efecto protector en lasrodajas tratadas con la menor concentración de P. carotovorum, mien-tras que B1, G10, Q7 y Q18 inhibieron el desarrollo de la pudrición enlas dos variantes analizadas. El resto de las cepas estudiadas nomostró protección, y en algunos casos se observó un incremento enla severidad de las lesiones.

Palabras claves: Bacillus, control biológico, Pectobacteriumcarotovorum, Solanum tuberosum

ABSTRACTBacterial soft rot, caused by Pectobacterium carotovorum, happens ina wide variety of cultivations and it is one of the most severe postharvestdiseases of potato (Solanum tuberosum L.) in the world. The control isbased fundamentally on the application of chemical products thatcontaminate the environment and deteriorate human health. One ofthe ecological alternatives adopted in this sense is the use ofmicroorganisms as biological control agents, the members of generaBacillus are among them. The objective of the present work was todetermine the protective effect of 23 Bacillus sp. strains on thedevelopment of the potato soft rot. Potato slices were treated with 24 hgrowth bacterial cultures and were inoculated with a strain of P.carotovorum, using two different concentrations. The slices stayedduring 24 h in conditions of temperature and favourable humidity forthe development of the soft rot. Lapsed this time the effectiveness ofthe treatments was evaluated in comparison with non treated controlsobserving the appearance or not of disease characteristic symptoms.G15, G19 and G25 strains only had protective effect in the slices triedwith the smallest concentration of P. carotovorum. While B1, G10, Q7and Q18 inhibited soft rot development in two analyzed variants. Therest of the studied strains did not show protection, so an increment inlesions severity was observed in some cases.

Key words: Bacillus, biological control, Pectobacterium carotovorum,Solanum tuberosum

INTRODUCCIÓN

La papa (Solanum tuberosum L.) ocupa el cuarto lugarentre los diez cultivos de mayor importancia en el mun-do, superada únicamente por el trigo, el arroz y el maíz.Su producción anual asciende a más de doscientos mi-llones de toneladas que repercuten en la alimentaciónde gran parte de la población mundial [Estévez et al.,2001]. En la producción de papa el cultivo puede afec-tarse por una serie de factores bióticos y abióticos quedisminuyen el rendimiento y calidad de las cosechas,

en especial por la presencia de daños en los tubérculos.Los factores bióticos de mayor importancia son la pre-sencia de plagas y enfermedades que generan elevadoscostos de manejo y control [Gregory y Andrade, 1996].

Las condiciones tropicales y húmedas resultan pocofavorables para el cultivo de la papa debido a que espropenso a infectarse con numerosos microorganismospatógenos fúngicos y bacterianos, además de las difi-cultades que se presentan para conservar los tubércu-

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los. Las enfermedades bacterianas de la papa provocangeneralmente pudriciones húmedas y pueden ser origina-das por microorganismos pertenecientes a variados géne-ros [MINAGRI, 2000]. En Cuba la pudrición blanda, cau-sada por Pectobacterium carotovorum, Dickeya chrysanthemiy Pectobacterium atrosepticum, es una de las enfermeda-des bacterianas que se presenta con mayor incidencia enel campo, y las pérdidas durante el almacenamiento delos tubérculos son considerables [Galán, 2004].

El control de estos patógenos se dificulta mucho debi-do a que la enfermedad se puede presentar en diferen-tes etapas del desarrollo de la planta. Estas bacteriasademás pueden sobrevivir en el suelo, el agua de riegoy la maquinaria agrícola. Por el momento el control dela calidad fitosanitaria de los tubérculos-semilla y laaplicación de productos químicos son medidas que con-tribuyen a disminuir los daños [Galán, 2004].

Actualmente se aboga por el uso de prácticas agrícolasecológicas como el control biológico mediante el uso demicroorganismos antagonistas, los cuales pueden limi-tar la iniciación y propagación de las enfermedadescausadas por patógenos vegetales mediante mecanis-mos de competencia, antibiosis, inducción de resisten-cia, entre otros [Fernández-Larrea, 2001].

Varias especies de los géneros Bacillus, Paenibacillus yBrevibacillus producen sustancias antimicrobianas, de

las cuales se han descrito más de de setenta antibióticosde bajo peso molecular y naturaleza polipeptídica, en-tre las cuales B. subtilis, B. licheniformis, B. pumilus,B. circulans, B. cereus, Brevibacillus laterosporus yPaenibacillus polymyxa son los mayores productores.Los metabolitos secundarios producidos por algunasde estas especies inhiben el crecimiento de bacterias yhongos, por lo que se ha sugerido su uso como un méto-do suplementario para la protección de las plantas con-tra microorganismos fitopatógenos [Földes et al., 2000].

El objetivo de este trabajo fue determinar el efecto pro-tector de diferentes cepas del género Bacillus sobre eldesarrollo de la pudrición blanda de la papa.

MATERIALES Y MÉTODOS

Se utilizaron como material biológico 23 cepas del gé-nero Bacillus conservadas en agar nutriente (Biocen) yaisladas de suelos procedentes de regiones paperas dediferentes municipios de la provincia de La Habana(Tabla 1). Estas cepas se seleccionaron en considera-ción a su actividad antagónica in vitro frente a cepas dePectobacterium carotovorum, Dickeya chrysanthemi yPectobacterium atrosepticum (datos no publicados). Seempleó además la cepa P. carotovorum 2046 conservadaen medio GYCA (glucosa, extracto de levadura, carbo-nato de calcio, agar).

Para el crecimiento de las especies del género Bacillus seutilizaron frascos erlenmeyers de 1 L de capacidad con100 mL de medio caldo nutriente (Biocen). Los frascos seinocularon con una suspensión bacteriana correspondiente

a un valor de 0,5 en la escala de Mac Farland (1 x 108 ufc/mL)preparada a partir de cultivos de 24 h de crecimiento enagar nutriente. Los cultivos se colocaron en zaranda orbitaltermostatada durante 24 h a 30oC y 120 rpm.

Tabla 1. Procedencia de las cepas del género Bacillus utilizadas

Cepas Procedencia Cepas Procedencia G1 Municipio de Güines G29 Municipio de Güines G2 Municipio de Güines G30 Municipio de Güines G10 Municipio de Güines Q6 Municipio de Quivicán G11 Municipio de Güines Q7 Municipio de Quivicán G12 Municipio de Güines Q12 Municipio de Quivicán G14 Municipio de Güines Q13 Municipio de Quivicán G15 Municipio de Güines Q18 Municipio de Quivicán G17 Municipio de Güines S1 Municipio de San José G18 Municipio de Güines B1 Municipio de Güines G29 Municipio de Güines B2 Municipio de Güines G23 Municipio de Güines B4 Municipio de Güines G25 Municipio de Güines

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Estudio del efecto protector...

El inóculo de P. carotovorum se obtuvo a partir de culti-vos de 24 h de la bacteria fitopatógena en medio GYCA.Con agua destilada estéril se prepararon suspensionesajustadas a un valor de densidad óptica de 0,05 y 0,1respectivamente, a una longitud de onda de 580 nm.

Tubérculos-semilla certificados de la variedad Spuntaprocedentes de Holanda se desinfectaron superficial-mente con alcohol 70%, luego se sumergieron enhipoclorito de sodio a 3% durante 3 min, se lavaroncon abundante agua destilada estéril y se colocaron enun flujo laminar durante 1 h. Rodajas de papa de 1 cmde grosor se sumergieron durante 1 min en los cultivosde Bacillus spp. Las rodajas tratadas se colocaron en elflujo laminar durante 30 min para eliminar la hume-dad superficial. Posteriormente se inocularon con 10 µLde las suspensiones preparadas de la cepa Pectobacteriumcarotovorum 2046. Cada rodaja se inoculó en tres pun-tos diferentes, y se emplearon como controles rodajassin tratar inoculadas con la bacteria fitopatógena ypreviamente sumergidas en agua destilada estéril yrodajas tratadas con cultivos de Bacillus spp. sin ino-cular. Se utilizaron seis rodajas por tratamiento y secolocaron en placas Petri con papel de filtro humedeci-do con agua destilada estéril y se incubaron a 30oC du-

rante 24 h. Transcurrido este tiempo se determinó laefectividad de los tratamientos mediante inspecciónvisual y observación de la aparición o no de síntomascaracterísticos de la enfermedad.

RESULTADOS Y DISCUSIÓN

El control biológico de P. carotovorum mediante espe-cies de microorganismos antagonistas se ha estudiadopor varios grupos de investigación debido al amplio ran-go hospedero y a la gran importancia económica queposeen los cultivos que esta bacteria puede afectar. Sehan utilizado como alternativas el empleo de Erwiniaherbicola [Vanneste et al., 1995], Pseudomonas fluo-rescens [Abdel-Alim et al., 2001] y Trichoderma hamatum[Blom, 2001]; sin embargo, los resultados máspromisorios han sido in vitro e in vivo, con especies delgénero Bacillus productores de sustancias con activi-dad antibacteriana [Bernal et al., 2002] [Sharga y Lyon,1998] [Abdel-Alim et al., 2001].

En el estudio realizado el tratamiento de las rodajas depapa con las cepas B1, G10, Q7 y Q18 previno total-mente el desarrollo de la pudrición blanda en todas lasvariantes del experimento (Fig. 1).

Figura 1. Efecto protector de la cepa G10 en rodajas de papa inoculadas con la mayorconcentración de la cepa P. carotovorum 2046. A la derecha se muestran los controles deP. carotovorum 2046 y G10.

En experimentos realizados por otros autores se hanproducido resultados similares. Tal es el caso de Shargay Lyon (1998), quienes emplearon una cepa de Bacillussubtilis productora de antibióticos para tratar rodajas

de papa y raíces de la planta, con el objetivo de inhibirel desarrollo de la pudrición blanda ocasionada por P. ca-rotovorum y P. atrosepticum. Estos autores solamenteemplearon en los tratamientos suspensiones de la cepa

Reinoso y otros

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antagonista preparadas con agua y no los cultivos lí-quidos como en este trabajo. Es por esto quizás quesolamente hubo resultados positivos, que se traducenen la disminución de la severidad de las lesiones cuan-do emplearon una alta concentración de Bacillussubtilis, mientras que en este estudio se pudo evitarcompletamente la aparición de lesiones característicasde la pudrición blanda con las cepas antes menciona-das, lo cual pudiera deberse a la acción antibacterianade los metabolitos producidos por estos aisladosbacterianos que son excretados al medio de cultivo.

Las cepas B2, G15 y G25 solamente mostraron efectoprotector en aquellas rodajas inoculadas con la menorconcentración de P. carotovorum (Fig. 2). Esta diferen-cia respecto a los resultados con las cepas B1, G10, Q7

y Q18 puede estar relacionada con la producción demetabolitos antibacterianos de menor actividad bioló-gica inhibitoria, cuya acción se ve limitada por la densi-dad de bacterias fitopatógenas presentes en el medio alque son vertidos. También es posible que la producciónde estos compuestos en las cepas antes mencionadas co-mience en etapas más tardías del crecimiento, por lo queen el momento de tratar las rodajas sus concentracionesen el medio de cultivo no son suficientes como para lo-grar un efecto igual al obtenido con B1, G10, Q7 y Q18.De hecho se plantea que la producción de sustancias conactividad antimicrobiana por parte de especies del géne-ro Bacillus está muy relacionada con la fase estacionariadel crecimiento microbiano y en particular con la etapade esporulación [Schallmey et al., 2004].

Figura 2. Efecto protector de la cepa B2 en rodajas de papainoculadas con la menor concentración de la cepa P. carotovorum2046. A la derecha se muestran los controles de P. carotovorum2046 y B2.

El resto de las cepas de Bacillus spp. estudiadas noinhibieron el desarrollo de la pudrición blanda. Algu-nas como G11, G12 y G14 provocaron cambios de colo-ración de color beis a pardo oscuro en las rodajas trata-das, aunque no se observaron síntomas de pudriciónblanda. La cepa B4 produjo modificaciones drásticasen las rodajas tratadas y el control; se observaron cam-

bios de color de beis a marrón con presencia de fetidezy una gran maceración del tejido del tubérculo. Conanterioridad otros autores han aislado algunas espe-cies del género Bacillus, productoras de enzimaspectinolíticas y proteolíticas, causantes de la pudriciónblanda en algunos cultivos [US EPA, 1997] [Kararahet al., 1985].

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Estudio del efecto protector...

CONCLUSIONES

• Las cepas B1, G10, Q7 y Q18 inhibieron el desarrollode la pudrición blanda en las rodajas inoculadas conambas concentraciones de P. carotovorum utilizadas.

• Las cepas B2, G15 y G25 solamente tuvieron efectoprotector en las rodajas inoculadas con la menor con-centración de P. carotovorum.

• La cepa B4 produjo un incremento en la severidadde los síntomas de la enfermedad.

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FITOSANIDAD vol. 10, no. 4, diciembre 2006

PRODUCCIÓN DE BIOMASA DE TRICHODERMA HARZIANUMPOR FERMENTACIÓN LÍQUIDA

Rosaima García,1 María A. Durán1 y Ramón Riera2

1 Instituto Nacional de Investigaciones Agrícolas. Mérida, Venezuela, AP 25, teléf. 0251-2630090, rgcrespo@inia.gov.ve.2 Servicio Autónomo de Sanidad Agropecuaria. Mérida, Venezuela

RESUMENCon el objeto de mejorar la eficiencia en la producción masiva deTrichoderma harzianum Rifai se evaluó la metodología de producciónpor fermentación líquida estática en forma artesanal. Para ello seutilizó como sustrato melaza de trapiche de caña panelera fresca ylevadura panadera granulada (Saccharomyces cerevisiae). Se usa-ron frascos de vidrio transparente de 500 mL donde se colocaron 100 mLde solución de melaza a 5%, se llevó a 200 mL con agua destilada yse ajustó el pH a 5,5. Se esterilizaron en autoclave a 121ºC y 15 PSIpor 20 min, se dejaron reposar 24 h y luego se agregó 10 g de levadu-ra (5%). Se inoculó con 5 mL de suspensiones de conidios deTrichoderma harzianum (1 x 1010 ufc), se agitaron e incubaron enforma estática inclinada durante 14 días hasta obtener la produccióncompleta de conidios. Se encontró desarrollo de diferentes estructu-ras o biomasa del hongo (micelio, conidios y clamidosporas) a partirde dos días. La producción de conidios se completó entre 8-14días, de acuerdo con la cepa T

12 = 1,8 x 109 ufc, T

3 = 5,8 x 108 ufc,

IUTE = 5,4 x 108 ufc, Natibiol = 4,2 x 108 ufc, T8 = 5,8 x 108 ufc, Inprodi-

ca = 6,4 x 108 ufc, T2 = 3,0 x 108 ufc, T

11 = 2,8 x 108 ufc, T

1 = 2,6 x 108 ufc

y Bioagrícola = 5 x 107 ufc. Con este proceso se acelera la obtenciónde inóculo del hongo para el proceso de producción, lo que se lograantes de tres días en relación con la producción normal de conidiospor fermentación sólida usados para resuspender y aplicar comoinóculo, el cual se alcanza entre seis y siete días.

Palabras claves: biomasa, Trichoderma, fermentación líquida

ABSTRACTIn order to improve the efficiency of Trichoderma harzianum massiveproduction a methodology by static liquid fermentation in handmadeform was evaluated. French brown sugar loaf cane molasses andgranulated Bakery yeast (Saccharomyces cerevisiae) were utilizedas substratum. In glass bottles of 500 mL were place 100 mL of 5%molasses solution, it was added distilled water to 200 mL, and pH wasadjusted to 5.5. These were sterilized in autoclave at 121ºC and 15PSI for 20 minutes, putting at rest for 24 h and then were added 10 g ofyeast (5%). The inoculation was made with 5 mL of Trichodermaharzianum conidia suspensions (1 x 1010 ufc), shaked and incubatedin inclined static form during 14 days until getting complete productionof conidia. Develop of different structures or fungus biomass(mycelium, conidia and clamidosphora) since two days was found.Conidia production finished between 8 and 14 days, in accordancewith strain T

12 = 1.8 x 109 ufc, T

3 = 5.8 x 108 ufc, IUTE = 5.4 x 108 ufc,

Natibiol = 4.2 x 108 ufc, T8 = 5.8 x 108 ufc, Inprodica = 6.4 x 108ufc, T

2 =

3.0 x 108 ufc, T11

= 2.8 x 108 ufc, T1 = 2.6 x 108 ufc and Bioagrícola = 5 x 107

ufc. With this process is speeded up the obtaining of fungus inoculumsfor the production process, and it is obtained before three days withregard to normal conidia production by solid fermentation used toresuspend and apply as inoculums, which is reached between sixand seven days.

Key words: biomass, Trichoderma, liquid fermentation

INTRODUCCIÓN

La versatilidad, adaptabilidad y la fácil manipulaciónde las especies del hongo Trichoderma permite su usoefectivo en el control biológico. Trichoderma spp. pro-duce tres tipos de propágalos como son hifas, cla-midosporas y conidios, que son activas contrafitopatógenos en diferentes fases del ciclo de vida, des-de la germinación de las esporas hasta la esporulación[Fernández-Larrea, 2002].

De acuerdo con Fernández-Larrea (2002) existen dife-rentes formulaciones de hongos antagonistas, las cua-les se usan en dependencia del mecanismo de acción para

uso comercial; pero el material seco es el preferido, de-bido a que uno de los aspectos más importante en lacomercialización es el peso y la manipulación de los pro-ductos. Las hifas son poco resistentes al secado, por loque se trabaja en las formulaciones de las formasreproductoras (conidios y clamidosporas) como polvoshumedecibles, polvos secos, formulaciones en aceite yencapsulados que contienen el hongo.

Los conidios son más resistentes que las clamidosporasy se producen en mayor cantidad por diferentes vías:sobre soporte sólido y en cultivos líquidos estáticos y

García y otros

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agitados, aunque más débil debido a que la pared celu-lar es más delgada, de tal manera que son menos resis-tentes a las condiciones adversas del ambiente, comolos rayos ultravioletas del sol y a la tecnología de apli-cación, ya que se puede romper más rápidamente ydañarse antes de realizar su efecto de biocontrol.

Sin embargo, la producción de Trichoderma líquido re-presenta una alternativa para cuando la demanda es alta,ya que de esta manera se acelera el proceso de produc-ción masiva y se obtiene el producto en un tiempo máscorto, con mayor cantidad y variedad de propágalos, locual indiscutiblemente aumenta su eficiencia.

Por otro lado, una de las formas de acelerar el proceso deproducción es el uso de métodos combinados, es decir, através de fermentación bifásica, en que se utiliza un pro-ceso de fermentación líquida para la obtención de un bueninóculo que luego se inocula sobre sustratos sólidos.

Estudios realizados por Wei Lin et al. (2006) demues-tran que en el proceso de fermentación líquida de T. har-zianum se obtienen sustancias promotoras de crecimien-to (ácido indolacético, ácido giberélico, citoquininas yvitaminas), las cuales son una clase de péptido. Cuan-do aplicaron T. harzianum sobre la rizósfera de plan-tas inoculadas con bacterias fijadoras de nitrógeno selogró un aumento del tamaño de los nódulos radicularesy se produjo un incremento en la eficiencia de la fija-ción de nitrógeno.

El método más comúnmente utilizado en Venezuelapara la producción masiva del hongo Trichoderma espor fermentación sólida monobásica, con el uso desustrato alimenticio sólido tanto para la producción deinóculo como para la obtención final del biopreparado.En otros casos se obtienen formulaciones líquidas porresuspensión de los conidios proveniente de una fermen-tación sólida [Zambrano, 2005].

El presente trabajo tuvo por objetivo evaluar la meto-dología de producción líquida estática en formaartesanal mediante el uso de melaza de caña panelera,obtenida en la zona (estado de Mérida), más levadurapanadera como sustrato alimenticio líquido para la ob-tención del inóculo del hongo T. harzianum, a fin demejorar la eficiencia en tiempo y producción de biomasadentro del proceso de producción masiva.

MATERIALES Y MÉTODOS

Se utilizaron 10 cepas de T. harzianum pertenecientes ala Colección de Hongos Antagonistas del Laboratorio

de Fitopatología del Instituto Nacional de Investiga-ciones Agrícolas del estado de Mérida (INIA-Mérida).

Para iniciar el trabajo se hizo una reactivación de lascepas; se sembró por duplicado en el medio de cultivoagar papa dextrosa (PDA) y se incubaron a 27oC detres a cinco días. Las cepas de T. harzianum utilizadasfueron siete no comerciales (T1, T2, T3, T8, T11, T12,IUTE) y tres comerciales (Natibiol, Inprodica yBioagrícola). La producción del inóculo del hongo enforma líquida se realizó a partir de una solución de 100 mLde melaza a 5%, que se aforó a 2000 mL con agua des-tilada, y se ajustó a pH 5,5. La solución se dispensó enfrascos de vidrio de 500 mL, en una cantidad de 200 mLpor frasco y se esterilizó en autoclave a 121ºC y 15 PSIpor 20 min, se dejaron reposar 24 h y entonces se leañadió 5% de levadura (Saccharomyces cerevisiae) enforma aséptica bajo la cámara de flujo laminar.

La producción del hongo en forma líquida se llevó a caboa partir de una solución de 100 mL de melaza de trapi-che de caña panelera fresca a 5% que se diluyó a 2000 mLde agua destilada y se ajustó el pH a 5,5. La solución sedispensó en frascos de vidrio de 500 mL, a razón de 200mL por frasco, se esterilizó en autoclave a 121oC, 15 PSIpor 20 min y se dejaron reposar 24 h; luego se le añadió5% de levadura (Saccharomyces cerevisiae) en formaaséptica bajo la cámara de flujo laminar.

A las placas de Petri con los cultivos de Trichoderma seles agregaron 10 mL de agua destilada estéril, se agitóun poco, se tomaron 5 mL de suspensiones de conidiosde cada cepa (1 x 1010 ufc) y se inoculó en cada frascoque contenía la solución de melaza más levadura.

Una vez inoculados los frascos con la melaza se taparoncon algodón y papel aluminio, y sellaron con parafilmpara proporcionarles condiciones asépticas. Se some-tieron a agitación y se incubaron en forma estática in-clinada durante 14 días hasta obtener la produccióncompleta de conidios. Cada tratamiento se repitió diezveces. Las observaciones se hicieron todos los días paradetectar tipo de estructuras producidas y luego medirlas cantidades.

La determinación de la concentración de conidios pormililitros se realizó en cámara de Newbauer por mediodel microscopio óptico y un objetivo de 40X, en una di-lución de 102, y se calculó por la fórmula [Lecuona, 1996]:

Concentración (ufc.mL = Número de conidios x 4 x 106 x dilución)

Se realizaron observaciones directas al microscopio óp-tico de muestras tomadas a las 24 h de incubación de

fitosanidad/297

Producción de biomasa de Trichoderma...

las siembras realizadas en placas con PDA para des-cartar las posibles contaminaciones. Los datos sobreconcentración de conidios se analizaron a través delprograma Estadística 6.0.

RESULTADOS Y DISCUSIÓN

En la Tabla 1 se observan los resultados sobre produc-ción de biomasa de Trichoderma bajo fermentación lí-quida. Se encontró que todas las cepas lograron produ-cir biomasa del hongo a partir de dos días. La producciónde conidios se alcanzó entre 8-14 días. Hubo alta pro-ducción de micelios y clamidosporas, y además se en-contró una alta concentración de conidios que variódesde 5,7 x 107 en la cepa comercial Bioagrícola hasta1,81 x 109 ufc/mL. Se obtuvieron diferencias significa-tivas entre las cepas en cuanto a producción de conidios.También se observaron diferencias en forma cualitati-vas en cuanto a la producción de micelios y clami-dosporas.

De acuerdo con la prueba de medias de LDS a 5%, to-das las cepas tuvieron diferentes comportamientos encuanto a producción de conidios. La que presentó mejorproducción fue T12, seguida de la comercial Inprodica,T8 y IUTE. Se encontraron también diferencias signi-

ficativas en el tiempo necesario para la obtención finalde conidios. Estas mismas cepas alcanzaron la produc-ción en solo ocho días, que fue la más rápida, seguidasde T8, T2 y T3 que lo lograron en diez. Las demás nece-sitaron entre 12 y 14 días.

Lo anterior indica que existe una alta variación en cuan-to a la obtención final de estructuras reproductivas deTrichoderma cuando se usa medio líquido, y que elloestá estrechamente relacionado con el comportamientode la cepa a pesar de que todas son T. harzianum.

Trabajos similares se han realizado en Cuba para laobtención de Trichoderma por fermentación líquida conel uso de melaza de caña de azúcar y levadura torula, yse logró producir una concentración de 2-3 x 108 conid./mL[Fernández-Larrea, 2002; Fernández-Larrea et al., 1992;Stefanova et al., 1999].

Asimismo Prakash y Lumsden (2006), con el objeto deobtener un preinóculo líquido de especies de Tricho-derma utilizaron 0,3 g melaza y 0,05 g extracto de leva-dura en 100 mL de agua, y lograron una producción de103-108 ufc. En tanto, en el proceso de producción debiomasa, cuando utilizaron 2,5 g de extracto de leva-dura y 500 mL de melaza en 1 L de agua, lograron unaproducción de 106 a 107 clamidosporas/mL.

Tabla 1. Producción de biomasa y conidios de diferentes cepas de T. harzianum bajo fermentación líquida

Cepas Producción de micelios

Tiempo (días)

Producción de clamidosporas

Tiempo (días)

Producción de conidios

Tiempo (días)

T12 +++ 2 ++ 7 1,81 x 109 a 8

Cepa comercial Inprodica

+ 2 + 8 6,4 x 108 b 12

T3 ++ 2 ++ 8 5,8 x 108 c 10

T8 +++ 2 ++ 8 5,8 x 108 c 10

IUTE ++ 2 ++ 8 5,4 x 108 d 8

Cepa comercial Biogrícola ++ 3 + 8 5,0 x 107 e 14

Cepa comercial Natibiol

++ 3 ++ 8 4,2 x 108 f 14

T2 +++ 2 + 9 3,0 x 108 g 10

T11 ++ 2 + 9 2,8 x 108 h 14 T1 ++ 2 + 10 2,6 x 108 i 14

CV 4,4%

Sx 0,378

Letras distintas son diferentes en la prueba de LSD con probabilidad menor o igual a 5%.

García y otros

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CONCLUSIONES

• La producción de biomasa del hongo T. harzianum através del proceso de fermentación líquida es varia-ble, depende del comportamiento de la cepa, por loque se requiere realizar pruebas preliminares antesde aplicar este método para reproducción de una cepaen forma masiva.

• La melaza de trapiche panelera fresca y levadura decerveza, probada por primera vez en Venezuela comosuplementos nutricionales de T. harzianum para la ob-tención de biomasa por fermentación líquida, resultóexitosa. Se desarrollaron estructuras reproductivas delhongo: micelio, clamidosporas y conidios. Se requierevalidar el método a mayor escala.

• Debido a la alta cantidad de estructuras reproduc-tivas obtenidas por este método de fermentación lí-quida, se puede recomendar su utilización en la fasede preparación de inóculo dentro del proceso de pro-ducción para agilizarlo, así como para la producciónfinal de propágalos a utilizar en campo para elbiocontrol de enfermedades de plantas.

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FITOSANIDAD vol. 10, no. 4, diciembre 2006

Res

eña

CARACTERIZACIÓN DE RALSTONIA SOLANACEARUMA TRAVÉS DEL ESTUDIO DE SU DIVERSIDAD GENÉTICA

Yelaine Tejeda Gómez

Instituto de Investigaciones de Sanidad Vegetal. Calle 110 no. 514 e/ 5.a B y 5.a F, Playa, Ciudad de La Habana, CP 11600, ytejeda@inisav.cu

RESUMENLa bacteria fitopatógena Ralstonia solanacearum es causante de lamarchitez bacteriana en diversos cultivos de importancia económicaen regiones de clima tropical y subtropical, así como en diversospaíses de clima templado. La especie constituye una unidadtaxonómicamente compleja en la que las cepas muestran una ampliadiversidad a nivel fisiológico, serológico, genético y de rango dehospedantes. El análisis por RFLP proporciona un nuevo esquemade clasificación al dividir la especie en los grupos Asiaticum yAmericanum, en relación con el origen geográfico de las cepas. Apartir de estos análisis preliminares se ha incrementado el empleo ydesarrollo de las técnicas moleculares para el estudio de la diversi-dad genética dentro de esta especie bacteriana. En el presente tra-bajo se destacan los principales aportes que, con el empleo de téc-nicas moleculares, han realizado varios grupos de investigación a lacomprensión de las relaciones filogenéticas y evolutivas entre lascepas.

Palabras claves: Ralstonia solanacearum, bacteria, diversidadgenética

ABSTRACTRalstonia solanacearum causes bacterial wilt in many important cropsin tropical and subtropical regions, and some mild climate countries.The species is taxonomically complex and the strains show a highdiversity at different levels as physiological, serological, genetic, andhost range. RFLP analysis has provided a new classification systemin which the species is divided in Americanum and Asiaticum groups,related to the geographic origin of the strains. Since these preliminaryinvestigations were performed, the development of moleculartechniques in the study of Ralstonia solanacearum genetic diversityhas increased. In this paper, the most outstanding contributions ofvarious researches groups in this field are outlined. Theseinvestigations have improved the comprehension of phylogenetic andevolutionary relationships among Ralstonia solanacearum strains.

Key words: Ralstonia solanacearum, bacteria, genetic diversity

INTRODUCCIÓN

La bacteria fitopatógena Ralstonia solanacearum escausante de la marchitez bacteriana en diversos culti-vos en regiones de clima tropical y subtropical[Kelman, 1953], así como en algunos países de climatemplado [Hayward, 1991; Janse, 1996]. La enferme-dad afecta a varios cientos de especies vegetales dis-tribuidas en más de cincuenta familias [Hayward,1994]. Dentro de ellas se encuentran cultivos de im-portancia económica como papa (Solanum tuberosum,Sw.), tabaco (Nicotiana tabacum, Lin.), tomate(Licopersicum esculentum, Mill.), pimiento (Capsicumannuum, L.), plátano y banano (Musa sp.), berenje-na (Solanum melongena, L.), además de numerosasplantas ornamentales, medicinales, malezas y algu-nas especies silvestres [Kelman, 1953].

Ralstonia solanacearum es una especie heterogénea quese encuentra poco relacionada filogenéticamente conotros grupos del género Pseudomonas. Las únicas espe-cies que muestran relación con ella son P. picketii –pató-geno ocasional en humanos– y P. syzygii, causante delmarchitamiento del clavo de olor en Sumatra [Seal etal., 1993; Taghavi et al., 1996]. Las evidencias sugierenque R. solanacearum es una especie que surgió tempra-no en la historia geológica, posiblemente como un pa-tógeno de los ancestros de las plantas modernas[Sequeira, 1994]. Buddenhagen y Kelman (1964) con-cluyeron que las cepas de R. solanacearum son el pro-ducto de un largo proceso evolutivo que se ha produci-do de manera independiente en varias áreas geográficasy en diferentes hospederos. Esta hipótesis se ha confir-

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mado por estudios del material genético [Cook et al.,1989].

La especie R.solanacearum constituye una unidadtaxonómicamente compleja en la que las cepas mues-tran una amplia diversidad a diferentes niveles: fisioló-gico, serológico, genético y de rango de hospedantes. Elgran número de cepas de R. solanacearum existente entodo el mundo dificulta el establecimiento de criteriospara la diferenciación de cepas, aspecto esencial para eltrabajo de los taxónomos y del personal de cuarentena.Con el objetivo de describir esta variabilidad intra-específica se han propuesto diversos sistemas de clasi-ficación.

Se conocen cinco razas de R. solanacearum cuya separa-ción está basada en el rango de los hospedantes y lahabilidad para sobrevivir bajo diferentes condicionesambientales [Buddenhagen et al., 1962; He et al., 1983;Buddenhagen, 1985; Pegg y Moffett, 1971]. La utiliza-ción de tres disacáridos y/u oxidación de tres hexosaalcoholes ha permitido la separación de los aislamien-tos en seis biovares [Hayward, 1964; He et al., 1983;Hayward et al., 1990]. El sistema de clasificación enrazas y biovares es confuso, pues cada biovar contienecepas con diferentes rangos de hospedantes, y variasrazas contienen una amplia diversidad de cepas perte-necientes a diferentes biovares. Solo existe correspon-dencia entre la raza 3 y el biovar 2. El análisis de ácidosgrasos [Janse, 1991] y del perfil de proteínas [Dianeseet al., 1994] no ha logrado esclarecer las relaciones en-tre las cepas ni el establecimiento de un criterio de cla-sificación uniforme. Esto hace que los métodos tradi-cionales de clasificación no sean lo suficientementeefectivos [Poussier et al., 1999; Sequeira, 1994].

Estas dificultades condujeron a la búsqueda de un nue-vo sistema de clasificación basado en el análisis del ma-terial genético. Muchas de las técnicas moleculares em-pleadas en la actualidad tienen como fundamento comúnla separación de fragmentos de ADN de diferentes pesosmoleculares. El resultado electroforético se representapor un patrón de bandas en un gel. Estos patrones sue-len ser muy complejos y de difícil interpretación.

Entre las técnicas utilizadas para el estudio de R. sola-nacearum se encuentran el polimorfismo de longitud defragmentos de restricción (Restriction Fragment LengthPolymorphism (RFLP)) en sus dos variantes: Southernblotting-RFLP y PCR-RFLP, el ADN polimórficoaleatoriamente amplificado (Random AmplifiedPolymorphic DNA or Arbitrary Primed PCR, RAPD),

el Rep-PCR, el polimorfismo de longitud de fragmen-tos amplificados (Amplified Fragment LengthPolymorphism (AFLP)) y la secuenciación de regionesespecíficas del genoma. El empleo de cada una de ellasha contribuido a una caracterización y diferenciaciónmás acertadas de las cepas. El análisis a nivel genéticode las cepas ofrece la posibilidad de estudiar las rela-ciones filogenéticas y evolutivas entre ellas.

Contribución de los estudios de diversidad genéticaa la diferenciación intraespecífica de las cepasde Ralstonia solanacearum

Los primeros trabajos que constituyeron un hito en elestudio de la diversidad genética del patógeno fueronreportados por Cook et al. (1989) y Cook y Sequeira(1994). Estos investigadores utilizaron el Southernblotting-RFLP con nueve sondas, lo que les permitiódetectar y localizar secuencias específicas en el ADN,las cuales contenían información esencial para la viru-lencia y la respuesta de hipersensibilidad. Estas secuen-cias se sometieron a digestión con enzimas de restric-ción específicas. La ubicación de los sitios de corte parauna enzima de restricción determinada dentro de unlocus de interés puede variar de una cepa a otra, y traercomo resultado fragmentos que difieren en tamaño encepas diferentes [Olive y Bean, 1999]. El análisis de lospatrones electroforéticos obtenidos por este procedi-miento posibilitó establecer la existencia de dos gruposo divisiones con un coeficiente de similitud de 13,5%:la división I, que incluyó los biovares 3, 4 y 5, y la divi-sión II, formada por las cepas de biovares 1, 2 y N2.Dentro de cada división los coeficientes de similitudresultaron ser muy elevados, y fueron mayores den-tro de la división I. Más del 90% de las cepas de ladivisión I procedían de Asia y Australia (divisiónAsiaticum), mientras que 98% de las cepas de la divi-sión II eran originarias de las Américas (divisiónAmericanum).

Estas divisiones se han confirmado por análisis de lasecuencia del gen que codifica para el ARN ribosomal16 S [Li et al., 1993; Seal et al., 1993; Taghavi et al.,1996]. El análisis de esta secuencia permitió estudiarlas relaciones filogenéticas y evolutivas entre losmicroorganismos, dado su elevado contenido infor-macional, su naturaleza conservativa, su distribuciónuniversal y la accesibilidad de las secuencias en bancosde genes [Woese, 1987]. Las secuencias de los genes quecodifican para el ARNr 16S son por lo general específi-cas para cada especie y están presentes en múltiples

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Caracterización de Ralstonia...

copias en el genoma, lo que las hace excelentes para laidentificación de bacterias a nivel de especie. Taghavi etal. (1996) demostraron la existencia de dos subdivisionesdentro de la división Americanum: la 2b, que contieneaislamientos pertenecientes a los biovares 1, 2 y N2procedentes de Indonesia, y la 2a que incluye el restode las cepas de biovares 1, 2 y N2. En este trabajo sereportó una cepa biovar 2 atípica, similar a las cepas debiovares 3 y 4 estudiadas, por lo que se agrupó dentrode la subdivisión Asiaticum.

Fegan et al. (1998) realizaron el análisis de la secuenciade la región intergénica 16S-23S RNA. Dada la elevadasimilitud de secuencia de los genes que codifican paraARNr 16S en las cepas de R. solanacearum, resulta másfactible el análisis de la región espaciadora entre 16S y23S, que produce información filogenética más valiosaal ser mayor su grado de variabilidad entre diferentescepas [Barry et al., 1991; Leblond-Bourget et al., 1996].En este trabajo se analizaron además las secuencias delos genes que codifican para las enzimas poli-galacturonasa y endoglucanasa. En todos los casos seconfirmó el sistema de clasificación obtenido porTaghavi et al. (1996).

El análisis PCR-RFLP de diferentes regiones delgenoma bacteriano demostró también la existencia delas divisiones Asiaticum y Americanum [Gilling et al.,1993]. Poussier et al. (1999), por medio del PCR-RFLP,analizaron regiones del gen hrp relacionado con la res-puesta de hipersensibilidad, y tuvieron resultados ma-yormente consistentes con lo reportado por Cook et al.(1989); sin embargo, encontraron que las cepas biovar 1del sur de África quedaban agrupadas en una subdivi-sión diferente, la cual poseía mayor homología con lascepas de la división Asiaticum que con las de la divi-sión Americanum. Para esclarecer las relaciones entrelas cepas biovar 1 del sur de África y otras cepas de R. sola-nacearum ampliaron el estudio con la inclusión de 59cepas, dentro de las que se encontraban las de biovaresN2 y 5, así como nuevas cepas africanas.

Como resultado de estas nuevas investigaciones,Poussier et al. (2000) reportaron por primera vez elempleo de la técnica AFLP para el análisis de una co-lección de cepas internacionales dentro de un estudiode diversidad genética. Este método pertenece a la ca-tegoría de las técnicas de amplificación selectiva de frag-mentos de restricción, basadas en la ligazón deadaptadores a fragmentos de restricción genómicos se-guido de una amplificación por PCR con cebadores es-

pecíficos para los adaptadores [Olive y Bean, 1999]. ElAFLP permitió una fina discriminación entre los ais-lamientos y logró diferenciar cepas que resultaronindistinguibles por PCR-RFLP. De las 96 cepas anali-zadas por AFLP se obtuvieron 60 patrones diferentes,y se observó el 95% de polimorfismo en las bandas,mientras que en el análisis por PCR-RFLP, de 178 ce-pas se obtuvieron 20 patrones diferentes. Incluso alcompararse con lo obtenido por Cook et al. (1989, 1991)y Cook y Sequeira (1994), donde se produjeron 46 perfi-les diferentes a partir de 164 cepas analizadas, sedemuestra que el AFLP tiene un nivel de resolu-ción superior para la diferenciación intraespecíficade R.solanacearum. El AFLP posibilitó una separa-ción más definida entre cepas de biovar 2 y N2, y tam-bién entre cepas de biovares 3, 4 y 5. El AFLP y elPCR-RFLP confirmaron que el biovar 2 es el menosdiverso genéticamente entre todos los biovares [Cook etal., 1989; Cook y Sequeira, 1994; Smith et al., 1995; VanDer Wolf et al., 1998; Thammakijjawat, 2001].

Pese a que los estudios llevados a cabo por Poussier etal. (2000) confirmaron la clasificación ofrecida por Cooket al. (1989), se encontraron excepciones en este esque-ma. Los resultados confirmaron la presencia de unasubdivisión formada por cepas biovar 1 del sur de Áfri-ca. Aunque el análisis por PCR-RFLP mostró unamayor homología entre estas cepas y las cepas biovar 1de la división Asiaticum, el análisis por AFLP y lasecuenciación de genes para ARNr 16S arrojaron unresultado opuesto. Las cepas biovar 1 del sur de Áfricafueron por lo tanto incluidas en una nueva subdivisión–2c– con respecto a lo reportado por Taghavi et al.(1996). La explicación más probable a la diferencia exis-tente entre las cepas biovar 1 africanas y americanas esun desarrollo evolutivo diferenciado debido a la sepa-ración geográfica. Otros aislamientos africanos quepertenecen a la división Americanum pueden haber sidointroducidas al continente africano por medio de inter-cambios comerciales.

No obstante la gran cantidad de investigaciones queapoyaron y enriquecieron los estudios preliminares deCook y colaboradores, el análisis de nuevos aislamien-tos aportó resultados que demuestran el elevado gradode complejidad taxonómica de esta especie bacteriana.

En 1998 Tsuchiya y Horita reportaron el análisis de 64cepas japonesas por medio de diferentes técnicasmoleculares: el Southern blotting-RFLP con cuatrosondas específicas para DNAr 23S y 16S (también co-

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nocido como ribotyping), el PCR-RFLP y el Rep-PCR.Las cepas analizadas correspondían a raza 1 (biovares1, 2, 3 y 4) y raza 3 (biovar 2). Según el esquema declasificación de Cook et al. (1989), las cepas raza 1 de-bían pertenecer a la división Asiaticum y las cepas raza 3a la división Americanum. Como resultado del empleode las técnicas mencionadas anteriormente se logróobtener una clara diferenciación entre las cepas de raza1 y raza 3. Con Southern blotting-RFLP el coeficientede similitud entre raza 1 y 3 fue de 15,4%, y dentro dela raza 1 de 75,5%. Los patrones electroforéticos obte-nidos a partir de cepas raza 1 (biovares 1, 2, 3 y 4)fueron similares a los patrones de los biovares 3, 4 y 5de la división Asiaticum. Los patrones de las cepas raza3/biovar 2 fueron similares a los de las cepas biovar 1 dela división Americanum, lo que apoya la hipótesis plan-teada por Buddenhagen (1985), quien sugirió que la raza3 se originó en la región andina de Sudamérica, de don-de es originaria la papa, su principal hospedante, y quela aparición de raza 3 fuera de esta región es resultadodel comercio internacional. La distribución de las ce-pas japonesas raza 1 (biovares 1 y 2) no se correspondecon lo reportado por Cook et al. (1989). Las nueve ce-pas japonesas raza 1/biovar 2 resultaron ser homogé-neas a la cepa atípica perteneciente a la divisiónAsiaticum reportada por Taghavi et al. (1996). Con res-pecto a las cepas raza 1/biovar 1, fueron semejantes alas cepas japonesas raza 1/biovar 4, y no a los biovares1 americanos. Estas cepas pueden ser mutantes de raza1/biovar 4 que perdieron la capacidad de degradar lastres hexosas alcoholes.

Thammakijjawat et al. (2001) realizaron el análisisPCR-RFLP de cepas tailandesas y otras internaciona-les tuvieron con Cook et al. (1989) resultados consis-tentes. Las excepciones fueron dos cepas biovar 1atípicas y tres cepas biovar N2 de Japón, que se agru-paron dentro de la división Asiaticum. Excepciones deeste tipo fueron reportadas por Horita y Tsuchiya(2001).

Aunque actualmente existe una mejor comprensión dela diversidad intraespecífica de la bacteria R.sola-nacearum, las investigaciones en este campo continúancon la búsqueda de nuevas metodologías de mayor sen-sibilidad. Lee et al. (2001) reportaron el aislamiento deuna secuencia de inserción –IS1405– a partir de unacepa de raza 1. Este tipo de secuencia constituye uncomponente importante de la mayoría de los genomasbacterianos. Las mutaciones y reordenamientos pro-vocados por las secuencias de inserción es uno de los

mecanismos más importantes en la generación de di-versidad genética [Galas et al., 1989]. En algunos casosla localización de secuencias de inserción específicas ensitios definidos del cromosoma es lo suficientementeestable como para permitir su análisis por RFLP[Mahillon y Chandler, 1998]. La caracterizaciónmolecular de cepas con el uso de secuencias de inserciónpuede reflejar mejor la organización del genomabacteriano que la búsqueda de diferencias en las se-cuencias [Lee et al., 2001]. En este trabajo la IS1405 seempleó como sonda en un análisis por RFLP, lo quepermitió clasificar cepas de raza 1 de Taiwán.

El estudio de la diversidad genética entre las cepas deR. solanacearum no solo permitió conocer más clara-mente las relaciones filogenéticas y evolutivas entreellas, sino que proporcionaron nuevas herramientaspara el esclarecimiento de numerosas interrogantescomo la posible correlación entre diversidad genética yla virulencia de las cepas [Darrase et al., 1998].

CONCLUSIONES

• Los métodos de estudio de la diversidad genética deR. solanacearum se han desarrollado vertiginosamen-te desde finales del pasado siglo a partir de los estu-dios preliminares realizados en este campo, los quelograron suministrar un sistema de clasificación conel empleo del RFLP que fue de gran utilidad paraestudios posteriores.

• El sistema de clasificación se ha corroborado por losresultados de otros investigadores, y se ha enrique-cido en el transcurso de los años con la definición denuevas subdivisiones.

• Los métodos moleculares para la caracterizacióngenética han probado ser imprescindibles, reflejadoen su amplia adopción por diversos grupos de inves-tigación y los resultados promisorios de su empleo.

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Caracterización de Ralstonia...

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304/fitosanidad

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fitosanidad/305

FITOSANIDAD vol. 10, no. 4, diciembre 2006

PRIMER REGISTRO DE CECIDÓMIDO ASOCIADO A SÍNTOMASDE ROYA EN PLANTAS MEDICINALES EN CUBA

Marlene M. Veitía Rubio, Víctor M. García Infante, Danay López Manes y María O. López Mesa

Instituto de Investigaciones de Sanidad Vegetal. Calle 110 no. 514 e/ 5.a B y 5.a F, Playa, Ciudadde La Habana, CP 11600

En los cultivos de plantas medicinales como tilo (Justi-cia pectoralis Jacq.), caléndula (Calendula officinalis L.)y verbena cimarrona (Stachytarpheta jamaicensis (L.)Vahl.) se asocian numerosos patógenos fúngicos, entrelos cuales están los que ocasionan el síntoma denomi-nado roya.

En Cuba se informa sobre tilo a Puccinia sp. [Fornet yGutiérrez, 1984] y Puccinia justiciae, del cual se des-criben sus síntomas, así como su importancia en lascondiciones de la Granja Estatal de Plantas Medicina-les en Alquízar [Veitía et al., 2003]. En caléndula se haregistrado a Puccinia melampodii Diet. & How. en Cuba[Acosta, 1995] y en el resto del mundo [Farr et al., 1995].En verbena cimarrona es de importancia Pucciniaurbaniana P. Henn. por el número de áreas donde se

presenta y los síntomas que provoca en las condicionesdel país [Veitía et al., 2003]. Con anterioridad se regis-tró en este cultivo por Secades et al. (1989), quienesdescriben sus síntomas. Acosta (1995) lo menciona comoun patógeno de importancia porque sus daños intensoslos causa en el follaje y los tallos, que son las partesutilizadas para fines medicinales.

En colectas realizadas en áreas de producción de plan-tas medicinales y en patios particulares en los munici-pios de Alquízar y San Antonio de los Baños, en laprovincia de La Habana, y en la de Cienfuegos, se en-contró en la mayoría de las ocasiones las larvas de uncecidómido (Diptera: Cecidomyiidae) cuando se alimen-taba de las pústulas ocasionadas por especies dePuccinia (Fig. 1).

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Figura 1. Larvas de cecidómido asociado a pústulas de roya (Puccinia urbaniana) enverbena cimarrona (Stachytarpheta jamaicensis).

Veitía y otros

306/fitosanidad

En más del 50% de las observaciones efectuadas paraeste trabajo, la alta población de larvas coincidió con laelevada infestación por roya (Tabla 1). En verbena ci-marrona se encontraron hasta nueve larvas asociadas alos síntomas y de una a tres por pústula en tilo.

Según Alayo y Garcés (1989), en Cuba se mencionan lasespecies Neolasioptera Felt, Ctenodactylomyia Felt,

Bruggmannia Tavares, Johnsonomyia Felt, MeinertomyiaFelt y Retinodiplosis Keiffer, aunque no se descarta lapresencia de otras especies en el resto de las Antillas.

Nieves-Aldrey (1998) refiere que los cecidómidos com-prenden especies micófagas y zoófagas. AsimismoBarranco (2003) menciona especies de cecidómidos queviven en asociación con ciertos hongos.

Tabla 1. Localidades donde se detectó la presencia de cecidómido asociado a pústulas de roya

Lugar Cultivo Ocurrencia

Roya Cecidómido

Tilo +++ ++ Granja Estatal de Plantas Medicinales Valle Grande, en Alquízar

Caléndula + +

Tilo + – División Experimental del Instituto de Investigaciones de Sanidad Vegetal

Verbena cimarrona +++ ++

Patio en Guanímar, Alquízar Verbena cimarrona +++ ++

Tilo (en parcelas) ++ +

Tilo (en vivero a la sombra) +++ ++

Estación Experimental de Plantas Medicinales Dr. J. T. Roig, en San Antonio de los Baños

Verbena cimarrona (en vivero a la sombra)

+ –

Huerto de plantas medicinales del Instituto Politécnico Agropecuario O. Jiménez, en Lajas, Cienfuegos

Verbena cimarrona +++ ++

Leyenda para población de cecidómido: – No se observan larvas. + Se observa una larva en una mancha por hoja. ++ Se observa más de una larva en varias manchas por hoja. Leyenda para infestación por roya: + Ligera incidencia de roya en algunas plantas en el campo. ++ Incidencia media: plantas con más del 25% y hasta el 50% del follaje con síntomas. +++ Incidencia alta de plantas con más del 50% del follaje con síntomas de roya.

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fitosanidad/307

FITOSANIDAD vol. 10, no. 4, diciembre 2006

OBSERVACIONES SOBRE ENEMIGOS NATURALES DE LA BROCADEL CAFÉ (HYPOTHENEMUS HAMPEI FERRARI) EN CUBA

Luis L. Vázquez Moreno,1 Eleazar Blanco Jiménez,2 Orestes Elósegui Claro,1 Yaril Matienzo Brito1 yJanet Alfonso Simonetti1

1 Instituto de Investigaciones de Sanidad Vegetal. Calle 110 no. 514 e/ 5.a B y 5.a F, Playa, Ciudad de La Habana, CP 116002 Instituto de Ecología y Sistemática. Carretera de Varona Km 3½, Capdevila, Boyeros, AP 8029, Ciudad de La Habana, CP 10800

La broca del café (Hypothenemus hampei Ferrari)(Coleoptera: Scolytidae) está considerada como una delas principales plagas del cultivo del cafeto en el mundo[Le Pelley, 1968; Baker, 1999] debido a los daños direc-tos que ocasiona al fruto de esta planta, el nivel tanelevado de sus poblaciones, las dificultades para reali-zar un control eficiente y las limitaciones para lacomercialización del café afectado, entre otras [Jaramilloet al., 2006].

En África, región de origen de H. hampei, se han estu-diado diversas especies de enemigos naturales, las quese han utilizado exitosamente en programas de controlbiológico clásico en otras regiones del mundo, princi-palmente los parasitoides Cephalonomia stephanoderisBetrem (Hymenoptera: Bethylidae), Heterospiluscoffeicola Schenedeken (Hymenoptera: Braconidae),Phymastichus coffea La Salle (Hymenoptera: Eulo-phidae) y el hongo entomopatógeno Beauveria basiana(Balsamo) Vuillemin (Hyphomycetes: Moniliales), en-tre otros [Baker, 1999; Vega et al., 1999].

Con el propósito de conocer la ocurrencia de enemigosnaturales en poblaciones de H. hampei bajo las condi-ciones de cafetales en Cuba, se realizaron observacionesen frutos perforados en las localidades de Buey Arriba,Granma (agosto de 1998), Trinidad, Sancti Spíritus (fe-brero del 2006) y Bahía Honda, Pinar del Río (2005, 2006).

Como entomopatógeno solamente se observó a B. bassia-na (Fig. 1) que se había detectado anteriormente comocausante de una epizootia en Buey Arriba, Granma[Mario García, comunicación personal]. Posteriormen-te esta patología se ha manifestado en todos los muni-cipios cafetaleros del país, entre uno y tres años des-pués de la detección de H. hampei en esos territorios.

En observaciones realizadas en campos de cafeto dondese manifestaba esta epizootia en Bahía Honda, en Pinardel Río, se pudo comprobar que los campos donde exis-tía sombra de árboles de mayor porte y mixta (Theobromacacao, Citrus spp., Mangifera indica, Musa spp. y otros),la enfermedad se manifestaba más intensa y prolonga-da, en comparación con los campos donde la sombra erade menor porte y de una especie (Gliricidia sepium).

La epizootia por este hongo entomopatógeno se ha ob-servado igualmente en otros países cafetaleros comoMéxico [Barrera et al., 1990] y Colombia [Bustillo etal., 1998; 2002], entre otros, donde se refiere que sumanifestación es de forma variada en los diferentes años,la que depende de las condiciones climáticas. Se consi-dera que varios años después de su introducción enColombia, es el principal factor de mortalidad naturalde H. hampei.

Como predadores, los más comunes han sido las hor-migas Pheidole megacephala (F.), Wasmania auropunctataRoger, Solenopsis geminata (F.) y Pseudomyrmex sp.(Hymenoptera: Formicidae), insectos que se introdu-cen en las perforaciones en la etapa en que predominanlos estados inmaduros de la broca, los que devora, y enmuchos casos realizan sus nidos en el interior del fruto,donde además come sus partes, que están necrosadas odonde crecen hongos saprófitos.

Otros predadores que se han encontrado en muy bajaspoblaciones han sido Laemophloeus sp. (Coleoptera:Laemophloeidae) y Cathartus sp. (Coleoptera: Cucuji-dae), cuyas larvas devoran los huevos y las larvas delprimer estadio de H. hampei, principalmente las quehabitan en frutos donde existen altas poblaciones de laplaga y en etapas finales del período de fructificación.

Vázquez y otros

308/fitosanidad

También se realizó un hallazgo de una chinchitapredadora de la familia Anthocoridae (Hemiptera), laque al parecer picaba y chupaba la hemolinfa de laslarvas de H. hampei, pues estas se observaron defor-mes y muertas en el interior de las perforaciones.

Estos son los primeros informes de tales enemigos na-turales de H. hampei bajo las condiciones de Cuba, ysobre los cuales existen algunos antecedentes en otrospaíses, pues Vega et al. (1999) refirió hallazgos de variasespecies de estas familias en Togo y Costa de Ivore enÁfrica, pero sin atribuirle importancia en la regulaciónde las poblaciones de esta plaga en esa región.

Igualmente en Colombia, Bustillo et al. (2002) encon-traron hormigas de los géneros Solenopsis, Pheidole,Wasmannia, Paratrechina, Crematogaster, Brachymyrmexy Prenolepis, así como el cucújido Cathartus quadricollis(Guérin-Méneville) y un antocórido no identificado,asociados a perforaciones de H. hampei, los que obser-varon con actividad como predadores de inmaduros.

En la búsqueda de la posible existencia de parasitoides,en 1998 se hallaron cuatro especies de las familiasBethylidae y Encyrtidae (Hymenoptera) que emer-gieron de frutos donde había adultos e inmaduros deH. hampei en plantaciones de Buey Arriba, Granma.

Aunque estos parasitoides no se lograron identificar,pueden ser nuevas especies de enemigos naturales de

Figura 1. Corte de un fruto de café donde se aprecia lahembra adulta de H. hampei infectada con B. bassiana.

otras especies de Hypothenemus, que habitan en losecosistemas donde se cultiva cafeto en el país.

De la familia Encyrtidae se ha descubierto a Coccidoc-tonus sp. en Togo y un Anagyrini en Costa de Ivore, mien-tras que de la familia Bethylidae hay informes en Áfricade parasitoides de los géneros Prorops, Cephalonomia yGoniozus, los dos primeros utilizados en programas decontrol biológico clásico [Vega et al., 1999].

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Vega, F. E.; G. Mercadier; A. Damon; A. Kirt: «Natural Enemies of theCoffee Berry Borer, Hypothenemus hampei (Ferrari) (Coleoptera:Scolytidae) in Togo and Cote d Ivoire and Other Insects Associatedwith Coffee Beans», African Entomology 7 (2):243-248, 1999.

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FITOSANIDAD vol. 10, no. 4, diciembre 2006

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DIAGNÓSTICO Y SANEAMIENTO DEL VIRUS DASHEENMOSAIC EN MALANGA (XANTHOSOMA SPP. Y COLOCASIAESCULENTA (L.) SCHOTT)

Janet Igarza Castro

Laboratorio de Biotecnología Vegetal. Centro de Investigaciones y Servicios Ambientales y Tecnológicosdel CITMA. Carretera a Mayabe, Jardín Botánico, Holguín, Cuba

Tesis presentada en opción al grado académico de Máster en Biotecnología Vegetal.

El cultivo de la malanga es de gran importancia económi-ca en nuestro país. La propagación acelerada por víasbiotecnológicas de clones de interés comercial es uno delos principales retos en la agricultura, pero este cultivo seha visto afectado por la enfermedad viral conocida comoDasheen Mosaic Virus (DMV), lo que disminuye los ren-dimientos. Para la obtención de plantas libres del virus seaplican técnicas de saneamiento y se confirman con otrasde diagnóstico, por lo que en esta investigación se compa-ran distintas técnicas para la eliminación de virus comoson la extracción de meristemos, la termoterapia, laelectroterapia y la quimioterapia en los clones México 8 yCamerún 14, para conocer su efectividad en la obtenciónde plantas libres al DMV, y se confirman con la utiliza-ción de diagnósticos de alta sensibilidad.

Los resultados permitieron confirmar la efectividadde la electroterapia 5 y 10 vol/5 min y la quimiotera-pia 3 mg/L. El diagnóstico inmunoquímico utilizado,con grandes ventajas sobre otros tipos de análisis, tie-ne un límite de sensibilidad que puede permitir el esca-pe de material enfermo; pero con la introducción detécnicas moleculares se pueden detectar concentracio-nes virales ínfimas en vitroplantas sanas. En la pre-sente investigación se realiza la detección del DMV porRT-PCR, la cual servirá de base para la aplicación fu-tura de una técnica confirmativa de mayor sensibili-dad durante el saneamiento. Finalmente se propone unametodología de diagnóstico y saneamiento al DMV quepermite la introducción de líneas puras en biofábricaspara su propagación en campo.

FITOSANIDAD vol. 10, no. 4, diciembre 2006

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COMPORTAMIENTO Y CONTROL DE LA ENFERMEDAD TIZÓNDE FUEGO CAUSADA POR EL HONGO CORYNESPORACASSIICOLA (BERK. & CURT.) WEI. EN EL CULTIVO DEL PEPINO(CUCUMIS SATIVUS L.) EN SISTEMAS DE ORGANOPÓNICOSEN LA PROVINCIA DE CAMAGÜEY Y SU RELACIÓNCON OTROS PATÓGENOS FÚNGICOS PRESENTES EN EL CULTIVO

Carlos A. Ferrer González

Laboratorio Provincial de Sanidad Vegetal. Ave Finlay Km 2½ e/ Planta de Nitrógeno y CircunvalaciónNorte, Reparto Puerto Príncipe, Camagüey, Cuba, sanivecm@enet.cu

Tesis en opción al grado académico de Máster en Hortalizas.

La necesidad de implementar un sistema de manejo dela enfermedad tizón de fuego del pepino, causado por elhongo Corynespora cassiicola (Berk. & Curt.) Wei. den-tro de una agricultura sostenible, implica la búsquedadel conocimiento de aspectos relacionados con la inci-dencia, comportamiento y control que permitan trazarestrategias en la solución de esta problemática. Se rea-lizaron investigaciones para determinar la importanciade C. cassiicola en comparación con otros patógenosfúngicos presentes en el cultivo, su comportamiento ycontrol en los organopónicos de la Empresa de CultivosVarios de Camagüey y en el Laboratorio Provincial deSanidad Vegetal durante el período 2001 a 2003. Se de-terminó que los hongos causantes de afectaciones eneste cultivo son Pseudoperonospora cubensis (Berk. &Curt.) Rostow con 10%, Collectotrichum lagenarium(Pass.) Ell & Halst y Alternaria cucumerina (Ell. & Ev.)S. A. Elliott con 1% cada uno, y C. cassIicola como elde mayor importancia con 100% de incidencia y afec-taciones de 85%. Su comportamiento se caracterizó porla permanencia durante todo el ciclo del cultivo con unincremento a medida que avanza la edad fenológica de

la plantación, aspecto estrechamente relacionado con loscambios climáticos dentro de los cuales el efecto de la tem-peratura máxima entre 28 y 30oC, y la humedad relativamedia superior a 80% resultaron favorables para el desa-rrollo de esta enfermedad. El crecimiento micelial y laesporulación del hongo en condiciones in vitro coincidencon temperaturas de 30oC. La mayor circulación y distri-bución de los conidios en condiciones naturales se observaa las diez de la mañana. Los ensayos de sensibilidad deC. cassiicola ante diferentes productos fungicidas en con-diciones de laboratorio y campo arrojaron mejores resul-tados de inhibición del crecimiento de las colonias y delcontrol de la enfermedad con mancozeb PH 80% ybenomyl PH 80% a 5 ppm y 2 kg/ha i. a. El control bioló-gico con Trichoderma harzianum R. (cepa A-34) a dosis de10 kg/ha y del producto natural hidrato de cal a dosis de5 kg/ha en tratamientos foliares, alcanzaron eficacias de42 y 47% respectivamente, e incrementaron los rendimien-tos en 50%. Todos estos resultados fueron utilizados en laelaboración de estrategias de control de la enfermedad convistas a su inclusión en un esquema de manejo integradopara el control de C. cassiicola en el cultivo del pepino.