Rafael Oliva, Francisca Ballesta, Josep Oriola, Joan Clària

Genètica mèdica

GENÈTICA MÈDICA

Rafael OlivaFrancisca Ballesta

Josep OriolaJoan Clària

Publicacions i Edicions

UNIVERSITAT DE BARCELONAU

B

ÍNDEX Presentació .......................................................................................................................................... 13 Autors i Col·laboradors ..................................................................................................................... 15 TEMA 1. CONCEPTE I HISTÒRIA DE LA GENÈTICA

R. Oliva i J. Oriola 1.1. La ciència de la genètica ............................................................................................................... 17

1.1.1. Breu història de la genètica ..................................................................................................... 17 1.1.2. Mendel..................................................................................................................................... 20

1.2. Àmbits de la genètica .................................................................................................................... 21 1.2.1. Genètica humana ..................................................................................................................... 21 1.2.2. Genètica mèdica ...................................................................................................................... 22 1.2.3. Genètica molecular.................................................................................................................. 23 1.2.4. Citogenètica............................................................................................................................. 24 1.2.5. Genètica bioquímica................................................................................................................ 24 1.2.6. Genètica clínica ....................................................................................................................... 25 1.2.7. Altres àmbits de la genètica..................................................................................................... 25

1.3. Fenotip i genotip............................................................................................................................ 25 1.4. Freqüència de les malalties amb base gènica ................................................................................ 26

1.4.1. Malalties monogèniques.......................................................................................................... 26 1.4.2. Alteracions cromosòmiques .................................................................................................... 26 1.4.3. Malalties multifactorials.......................................................................................................... 26

1.5. Aspectes actuals i organitzatius a l’entorn de la genètica ............................................................. 26 1.6. Consulta de bases de dades de genètica i recerca d’informació a Internet .................................... 27 1.7. Competències que han de tenir els llicenciats en Medicina quant a la formació........................... 28 Bibliografia........................................................................................................................................... 33 TEMA 2. GENOMA HUMÀ I ESTRUCTURA I EXPRESSIÓ DELS GENS

R. Oliva, J. Oriola i J. Clària 2.1. Composició del genoma humà ...................................................................................................... 35 2.2. Genoma nuclear i genoma mitocondrial. Nomenclatura dels cromosomes................................... 36 2.3. Organització de la seqüència del genoma i nombre de gens ......................................................... 38 2.4. Estructura dels gens. Exons. Introns. Transcripció. Splicing ........................................................ 39 2.5. Traducció. Codi genètic ................................................................................................................ 41 2.6. Regulació de l’expressió gènica .................................................................................................... 42 Bibliografia........................................................................................................................................... 46 TEMA 3. REPLICACIÓ, RECOMBINACIÓ I MUTACIÓ DEL GENOMA

R. Oliva i J. Clària 3.1. Cicle cel·lular. Mitosi. Replicació del DNA.................................................................................. 47 3.2. Recombinació................................................................................................................................ 48

3.2.1. Meiosi. Recombinació meiòtica. ............................................................................................. 48 3.2.2. Conseqüències de la recombinació no homòloga.................................................................... 50 3.2.3. Concepte de lligament. ............................................................................................................ 51

3.3. Mutació del genoma ...................................................................................................................... 53 3.3.1. Tipus de mutacions i freqüència.............................................................................................. 54 3.3.2. Mecanismes de les mutacions gèniques .................................................................................. 55 3.3.3. Taxes de mutació..................................................................................................................... 60 3.3.4. Nomenclatura de les mutacions............................................................................................... 60 3.3.5. Efectes de les mutacions.......................................................................................................... 61

Genètica Mèdica 6

Bibliografia........................................................................................................................................... 62 TEMA 4. BASES METODOLÒGIQUES DELS ESTUDIS CITOGENÈTICS. ELS CROMOSOMES HUMANS F. Ballesta i R. Oliva 4.1. Els cromosomes humans. Sèries haploide i diploide..................................................................... 65 4.2. El cariotip humà normal ................................................................................................................ 65

4.2.1. Concepte de cariotip ............................................................................................................... 65 4.2.2. Mètodes d’obtenció ................................................................................................................. 66 4.2.3. Identificació cromosòmica. Bandatge cromosòmic................................................................. 67 4.2.4. Ideograma................................................................................................................................ 68

4.3. Citogenètica molecular.................................................................................................................. 69 4.4. Cromosoma Y................................................................................................................................ 70 4.5. Cromosoma X. Lyonització .......................................................................................................... 71 4.6. Polimorfismes cromosòmics. ........................................................................................................ 72 4.7. Cromosomes en meiosi.................................................................................................................. 72 4.8. Comportament dels cromosomes durant la divisió cel·lular.......................................................... 73 Bibliografia........................................................................................................................................... 74 TEMA 5. BASES METODOLÒGIQUES DE L’ANÀLISI GENÈTICA MOLECULAR R. Oliva i J. Clària 5.1. Aïllament d’àcids nucleics ............................................................................................................ 75 5.2. Enzims de restricció ...................................................................................................................... 76 5.3. Generació de recombinants. .......................................................................................................... 77 5.4. Clonació molecular........................................................................................................................ 77 5.5. Electroforesi d’àcids nucleics........................................................................................................ 78 5.6. Hibridació molecular ..................................................................................................................... 79 5.7. Anàlisi Southern. ........................................................................................................................... 80 5.8. Síntesi d’oligonucleòtids ............................................................................................................... 80 5.9. PCR. .............................................................................................................................................. 81 5.10. Seqüenciació del DNA. ............................................................................................................... 82 5.11. Microxips i xips de DNA ............................................................................................................ 84 Bibliografia........................................................................................................................................... 84 TEMA 6. ESTAT ACTUAL DE LA INFORMACIÓ DISPONIBLE DEL GENOMA HUMÀ R. Oliva i J. Clària 6.1. El projecte genoma........................................................................................................................ 87 6.2. Resultats i informació disponible derivats de l’anàlisi del genoma .............................................. 88 6.3. Aplicacions en la investigació....................................................................................................... 89 6.4. Aplicacions mèdiques i clíniques .................................................................................................. 90 6.5. Consulta de bases de dades d’informació genòmica i d’expressió de gens................................... 92 6.6. OMIM: On Line Mendelian Inheritance in Man........................................................................... 92 Bibliografia........................................................................................................................................... 94 TEMA 7. PATRONS D’HERÈNCIA MONOGÈNICA R. Oliva 7.1. Arbre genealògic ........................................................................................................................... 95 7.2. Herència autosòmica dominant. Reconeixement. Riscs de transmissió ........................................ 96 7.3. Herència autosòmica recessiva. Reconeixement. Riscs de transmissió......................................... 98 7.4. Herència lligada al cromosoma X. Reconeixement. Riscs de transmissió .................................... 99 7.5. Herència lligada al cromosoma Y. Riscs de transmissió............................................................... 100 7.6. Concepte d’heterogeneïtat ............................................................................................................ 100 Bibliografia........................................................................................................................................... 100

Índex 7

TEMA 8. ASPECTES DE L’EXPRESSIÓ FENOTÍPICA I PATRONS NO CLÀSSICS D’HERÈNCIA MONOGÈNICA R. Oliva i F. Ballesta 8.1. Penetrància .................................................................................................................................... 101 8.2. Expressivitat .................................................................................................................................. 101 8.3. Edat d’inici .................................................................................................................................... 101 8.4. Pleiotropia ..................................................................................................................................... 102 8.5. Fenotips influïts pel sexe............................................................................................................... 103 8.6. Herència mitocondrial ................................................................................................................... 103 8.7. Mosaïcisme somàtic. Mosaïcisme germinal .................................................................................. 104 8.8. Empremta genòmica: síndromes de Prader-Willi i d’Angelman................................................... 105 8.9. Disomia uniparental ...................................................................................................................... 106 8.10. Inactivació del cromosoma X...................................................................................................... 107 8.11. Mutacions dinàmiques................................................................................................................. 108 8.12. Factors modificadors de l’expressió............................................................................................ 109 Bibliografia........................................................................................................................................... 110 TEMA 9. ELS GENS EN LES POBLACIONS R. Oliva 9.1. La població humana ...................................................................................................................... 111 9.2. Diversitat de la seqüència del DNA en el context de la població. Índex d’heterozigositat........... 111

9.2.1. Índex d’heterozigositat............................................................................................................ 111 9.2.2. Blocs haplotípics ..................................................................................................................... 111 9.2.3. Relació entre fenotip, genotip i freqüència gènica .................................................................. 112 9.2.4. Llei de Hardy-Weinberg.......................................................................................................... 113 9.2.5. Equilibri de Hardy-Weinberg.................................................................................................. 113

9.3. Factors que modifiquen l’equilibri de Hardy-Weinberg i les seves conseqüències ...................... 114 9.3.1. Unió no aleatòria. Estratificació, unió dirigida, consanguinitat .............................................. 114 9.3.2. Selecció natural ....................................................................................................................... 116 9.3.3. Deriva genètica, colls d’ampolla, efecte fundador .................................................................. 118 9.3.4. Flux gènic. Migració ............................................................................................................... 119

9.4. Aplicacions de la Llei de Hardy-Weinberg. Càlcul de riscs.......................................................... 119 9.5. Mesura de les taxes de mutació en l’espècie humana ................................................................... 121 9.6. Influència de la medicina en la freqüència d’al·lels ...................................................................... 122 Bibliografia........................................................................................................................................... 122 TEMA 10. EXPLORACIÓ EN GENÈTICA CLÍNICA. DISMORFOLOGIA F. Ballesta i R. Oliva 10.1. Introducció .................................................................................................................................. 123 10.2. Premisses i dificultats per al diagnòstic en genètica clínica i en dismorfologia.......................... 123 10.3. Arbre genealògic ......................................................................................................................... 123 10.4. Exploració física en genètica clínica ........................................................................................... 124 10.5. Exàmens complementaris ............................................................................................................ 124 10.6. Dismorfologia.............................................................................................................................. 125 10.7. Grups de trastorns morfològics ................................................................................................... 126 10.8. Classificació dels trastorns morfològics...................................................................................... 127 10.9. Exploració física en dismorfologia.............................................................................................. 130 10.10. Pautes per al diagnòstic sindròmic ............................................................................................ 131 10.11. Embriopaties.............................................................................................................................. 133 10.12. Resum........................................................................................................................................ 134 Bibliografia........................................................................................................................................... 134

Genètica Mèdica 8

TEMA 11. ALTERACIONS CROMOSÒMIQUES. CONSEQÜÈNCIES CLÍNIQUES F. Ballesta, A. Carrió i R. Oliva 11.1. Alteracions numèriques............................................................................................................... 135 11.2. Alteracions morfologicoestructurals ........................................................................................... 136 11.3. Comportament meiòtic de les reordenacions cromosòmiques equilibrades................................ 139

11.3.1. Translocacions recíproques ................................................................................................... 139 11.3.2. Translocacions Robertsonianes ............................................................................................. 140 11.3.3. Inversions .............................................................................................................................. 141

11.4. Risc de descendència amb desequilibri cromosòmic en els portadors de reordenacions cromosòmiques equilibrades ................................................................................................................ 142

11.4.1. Translocacions recíproques ................................................................................................... 142 11.4.2. Translocacions Robertsonianes ............................................................................................. 143 11.4.3. Inversions paracèntriques...................................................................................................... 144 11.4.4. Inversions pericèntriques....................................................................................................... 144

11.5. Autosomopaties ........................................................................................................................... 145 11.6. Alteracions dels cromosomes sexuals

11.6.1. Síndrome de Turner o monosomia X .................................................................................... 151 11.6.2. Augments del cromosoma X en la dona................................................................................ 152 11.6.3. Síndrome de Klinefelter ........................................................................................................ 152 11.6.4. Alteracions del cromosoma Y ............................................................................................... 153 11.6.5. Translocacions dels cromosomes .......................................................................................... 153 11.6.6. Microdelecions del cromosoma X......................................................................................... 154

Bibliografia........................................................................................................................................... 155 TEMA 12. DETERMINACIÓ DEL SEXE, DESENVOLUPAMENT EMBRIONARI I ALTERACIONS ASSOCIADES AMB LA INFERTILITAT R. Oliva i F. Ballesta 12. 1. Determinació del sexe i diferenciació sexual ............................................................................. 157

12.1.1. Gen SRY i determinació del sexe.......................................................................................... 157 12.1.2. Gen SRY i determinació del sexe.......................................................................................... 157 12.1.3. Diferenciació de la gònada primitiva .................................................................................... 158 12.1.4. Estats intersexuals i hermafroditismes .................................................................................. 158 12.1.5. Pseudohermafroditismes........................................................................................................ 161 12.1.6. Receptor d’andrògens............................................................................................................ 163 12.1.7. Hiperplàsia suprarenal congènita .......................................................................................... 164 12.1.8. Fenotip sexual i criteris d’assignació del sexe ...................................................................... 165

12.2. Esterilitat/infertilitat .................................................................................................................... 165 12.2.1. Esterilitat/infertilitat en l’home ............................................................................................. 165

12.2.1.1. Microdelecions del cromosoma Y i del gen DAZ............................................................ 166 12.2.1.2. Síndrome de Klinefelter................................................................................................... 167 12.2.1.3. Agènesi dels conductes deferents .................................................................................... 167

12.2.2. Esterilitat/infertilitat en la dona............................................................................................. 168 12.2.2.1. Síndrome de Turner......................................................................................................... 168 12.2.2.2. Dèficit de 21-hidroxilasa................................................................................................. 168 12.2.2.3. Conseqüències reproductives de les translocacions equilibrades .................................. 169

12.3. Gens implicats en el desenvolupament embrionari i principals alteracions ................................ 169 Bibliografia........................................................................................................................................... 172 TEMA 13. MALALTIES LLIGADES AL CROMOSOMA X R. Oliva i F. Ballesta 13.1. Herència i malalties lligades al cromosoma X. ........................................................................... 173 13.2. Alteracions de la visió en color ................................................................................................... 174 13.3. Síndrome del cromosoma X fràgil .............................................................................................. 175 13.4. Hemofília A................................................................................................................................. 177 13.5. Distròfia muscular de Duchenne ................................................................................................. 177 13.6. Síndrome d’Aarskog ................................................................................................................... 178

Índex 9

13.7. Herència dominant lligada al cromosoma X: Incontinentia pigmenti i síndrome de Rett........... 179 Bibliografia........................................................................................................................................... 180 TEMA 14. MALALTIES AUTOSÒMIQUES DOMINANTS R. Oliva, J. Oriola i F. Ballesta 14.1. Herència i malalties autosòmiques dominants............................................................................. 181 14.2. Malaltia d’Alzheimer familiar i presenil ..................................................................................... 183

14.2.1. Edat d’inici i agregació familiar............................................................................................ 183 14.2.2. Gens APP, presenilina 1 (PS1) i PS2 .................................................................................... 184 14.2.3. Gen APOE i altres factors de risc.......................................................................................... 184 14.2.4. Estudis genètics en els casos de la malatía d’Alzheimer familiar presenil en la població espanyola........................................................................................................................................... 185 14.2.5. Utilitat de les anàlisis moleculars en els casos familiars presenils ........................................ 187

14.3. Malaltia de Huntington................................................................................................................ 188 14.4. Neoplàsia endocrina múltiple de tipus 2 (MEN2)....................................................................... 189

14.4.1. Protoncogèn RET .................................................................................................................. 190 14.5. Hipercolesterolèmia familiar ....................................................................................................... 191 14.6. Síndrome de Marfan.................................................................................................................... 192 14.7. Neurofibromatosi......................................................................................................................... 193 Bibliografia........................................................................................................................................... 195 TEMA 15. MALALTIES AUTOSÒMIQUES RECESSIVES R. Oliva i J. Oriola 15.1. Característiques de les malalties autosòmiques recessives.......................................................... 197 15.2. Hemocromatosi hereditària ......................................................................................................... 198

15.2.1. Descobriment del gen i de les mutacions responsables......................................................... 199 15.2.2. Mecanisme patogènic ............................................................................................................ 200 15.2.3. Clínica ................................................................................................................................... 201 15.2.4. Prevalença i herència............................................................................................................. 202 15.2.5. Diagnòstic ............................................................................................................................. 202 15.2.6. Tractament............................................................................................................................. 203 15.2.7. Prevenció............................................................................................................................... 203

15.3. Fibrosi quística ............................................................................................................................ 204 15.4. Dèficit de 21-hidroxilasa ............................................................................................................. 204

15.4.1. Estructura del gen CYP21 ..................................................................................................... 205 15.4.2. Mutacions del gen CYP21..................................................................................................... 206 15.4.3. Relació genotip-fenotip ......................................................................................................... 206

Bibliografia........................................................................................................................................... 207 TEMA 16. HERÈNCIA POLIGÈNICA I MULTIFACTORIAL R. Oliva, J. Oriola i F. Ballesta 16.1. Concepte de malaltia complexa o multifactorial......................................................................... 209 16.2. Nombre, freqüència i exemple de malalties multifactorials ........................................................ 210 16.3. Determinació de la base genètica en l’herència multifactorial .................................................... 211 16.4. Teoria poligènica de caràcters quantitatius ................................................................................. 211 16.5. Teoria poligènica de caràcters discontinus. Concepte de llindar ................................................ 212 16.6. Risc empíric: concepte i usos ...................................................................................................... 213 16.7. Recerca de loci de susceptibilitat. Estudis d’associació .............................................................. 214

16.7.1. Transmissió disequilibrium test (TDT) ................................................................................. 215 16.7.2. Association sib pairs (ASP) .................................................................................................. 215 16.7.3. Estudis d’associació poblacional casos-controls ................................................................... 218

16.8. Malaltia d’Alzheimer senil no familiar ....................................................................................... 217 16.9. La hipertensió arterial essencial com a malaltia multifactorial ................................................... 221 16.10. Susceptibilitat a malalties infeccioses ....................................................................................... 223 Bibliografia........................................................................................................................................... 223

Genètica Mèdica 10

TEMA 17. CÀNCER J. Oriola, S. R. Costa i R. Oliva 17.1. Introducció .................................................................................................................................. 225 17.2. El càncer com a pèrdua del control de la divisió cel·lular........................................................... 225 17.3. El càncer com a pèrdua dels mecanismes de mort cel·lular programada .................................... 227 17.4. Protooncogens i mecanismes d’activació.................................................................................... 227 17.5. Gens supressors de tumors. Pèrdua d’heterozigositat ................................................................. 229 17.6. Càncer de mama hereditari .......................................................................................................... 231 17.7. Gens reparadors. Integritat del genoma i reparació. Inestabilitat de microsatèl·lits .................... 233 17.8. Evolució seqüencial del càncer: el model del càncer colorectal.................................................. 234 17.9. Malalties hereditàries que comporten un risc incrementat de càncer .......................................... 234 17.10. Anomalies cromosòmiques associades amb neoplàsies hematològiques .................................. 235 Bibliografia........................................................................................................................................... 240 TEMA 18. GENÈTICA D’ALGUNES CARACTERÍSTIQUES FÍSIQUES O FISIOLÒGIQUES QUOTIDIANES I DE LES SEVES ALTERACIONS R. Oliva, J.M. Vidal i F. Ballesta 18.1 Introducció ................................................................................................................................... 243 18.2. Genètica de la pigmentació. Albinismes ..................................................................................... 243 18.3. Herència de la caiguda del cabell: l’alopècia .............................................................................. 246 18.4. Expressió dels gens de les globines. Talassèmies ....................................................................... 248 18.5. Gens i rendiment atlètic. Alteracions musculars ......................................................................... 251 18.6. Regulació del pes corporal. Obesitat ........................................................................................... 253 18.7. Intolerància o reaccions adverses a aliments i a fàrmacs ............................................................ 254 Bibliografia........................................................................................................................................... 257 TEMA 19. PREVENCIÓ DE LES MALALTIES GÈNIQUES. CONSELL GENÈTIC R. Oliva i F. Ballesta 19.1. Àmbits i tipus de prevenció......................................................................................................... 259 19.2. Consell genètic ............................................................................................................................ 259 19.3. Diagnòstic presimptomàtic. Riscs pretest i riscs posttest ............................................................ 263 19.4. Consell genètic per anàlisi directa i consell genètic per anàlisi de lligament o indirecta............ 264 19.5. Opcions reproductives................................................................................................................. 264 19.6. Consell genètic en la consanguinitat ........................................................................................... 265 19.7. Consell genètic en les cromosomopaties ..................................................................................... 265 19.8. Diagnòstic prenatal i diagnòstic preimplantacional .................................................................... 267 19.9. Cribratge ecogràfic, triple cribratge durant l’embaràs................................................................. 268 19.10. Detecció d’individus d’alt risc. Diagnòstic neonatal. Cribratge poblacional ............................ 269 Bibliografia........................................................................................................................................... 270 TEMA 20. TRACTAMENT DE LES MALALTIES HEREDITÀRIES R. Oliva 20.1. Estat actual del tractament de les malalties hereditàries.............................................................. 271 20.2. Possibles estratègies de tractament.............................................................................................. 271 20.3. Trasplantament d’òrgans ............................................................................................................. 272 20.4. Teràpia gènica ............................................................................................................................. 275 20.5. Modulació farmacològica de l’expressió gènica ......................................................................... 276 20.6. Substitució proteica ..................................................................................................................... 276 20.7. Intervenció metabòlica: restricció dietètica, suplements, inhibició i eliminació......................... 277 20.8. Correcció quirúrgica.................................................................................................................... 278 20.9. Tècniques de reproducció assistida. ICSI.................................................................................... 279 20.10. Noves estratègies en desenvolupament. Farmacogenòmica. Cèl·lules mare ............................. 280 20.11. Aspectes ètics i jurídics de la genètica i la teràpia .................................................................... 282 Bibliografia........................................................................................................................................... 288

Índex 11

TEMA 21 (PRÀCTICA 1). CONSTRUCCIÓ DEL MAPA FÍSIC DE RESTRICCIÓ CORRESPONENT A UN CLON PLASMÍDIC R. Oliva 21.1. Supòsit. ........................................................................................................................................ 291 21.2. Digestió amb els enzims de restricció ......................................................................................... 291 21.3. Separació per electroforesi dels fragments generats.................................................................... 291 21.4. Fotografia del gel i càlcul de la mida .......................................................................................... 292 21.5. Interpretació dels resultats i construcció del mapa de restricció del clon.................................... 294 TEMA 22 (PRÀCTICA 2). INTERPRETACIÓ DELS RESULTATS DEL GENOTIP DE L’APOE I RELACIÓ AMB LA MALALTIA D’ALZHEIMER R. Oliva 22.1. Introducció .................................................................................................................................. 295 22.2. Supòsit......................................................................................................................................... 296 22.3. Interpretació del resultat .............................................................................................................. 297 TEMA 23 (PRÀCTICA 3). LECTURA DE GELS DE SEQÜENCIACIÓ CORRESPONENTS AL GEN DE LA PRESENILINA 1 R. Oliva 23.1. Supòsit......................................................................................................................................... 299 23.2. Lectura d’un autoradiograma de seqüenciació ............................................................................ 302 23.3. Identificació de la seqüència genòmica de l’autoradiograma en la seqüència de cDNA ............ 302 TEMA 24 (PRÀCTICA 4). GENOTIP DEL GEN HFE, RESPONSABLE DE L’HEMOCROMATOSI, I APLICACIÓ DE LA LLEI DE HARDY-WEINBERG R. Oliva 24.1. Introducció .................................................................................................................................. 303 24.2. Supòsit......................................................................................................................................... 304 24.3. Interpretació de resultats del genotipatge .................................................................................... 304 24.4. Aplicació de la llei de Hardy-Weinberg...................................................................................... 304 TEMA 25 (PRÀCTICA 5). ACTIVITATS D’APLICACIÓ I EXERCICIS SOBRE ELS CONCEPTES BÀSICS DE LA GENÈTICA MOLECULAR R. Oliva i J. Oriola 25.1. Seqüències complementàries....................................................................................................... 305 25.2. Càrrega elèctrica del DNA .......................................................................................................... 305 25.3. Especificitat d’oligonucleòtids o sondes en el genoma............................................................... 305 25.4. Disseny d’oligonucleòtids per a amplificació per PCR............................................................... 305 25.5. Seqüències de cDNA i seqüències genòmiques .......................................................................... 306 25.6. Estequiometria dels gens i de les bases ....................................................................................... 307 25.7. Mida dels cromosomes................................................................................................................ 308 TEMA 26 (PRÀCTICA 6). ESTUDI DEL POLIMORFISME INSERCIÓ/DELECIÓ (I/D) DEL GEN DE L’ECA (ENZIM DE CONVERSIÓ DE L’ANGIOTENSINA) MITJANÇANT PCR I ELECTROFORESI J. Oriola 26.1. Introducció .................................................................................................................................. 309 26.2. Protocol ....................................................................................................................................... 310 26.3. Anàlisi del resultat de la PCR...................................................................................................... 311 26.4 Interpretació dels resultats............................................................................................................ 313

Genètica Mèdica 12

TEMA 27 (PRÀCTICA 7). ESTUDI DEL POLIMORFISME INSERCIÓ/DELECIÓ (I/D) DEL GEN DE L’ECA (ENZIM DE CONVERSIÓ DE L’ANGIOTENSINA) MITJANÇANT SEQÜENCIACIÓ J. Clària 27.1. Introducció .................................................................................................................................. 315 27.2. Consideracions generals de la seqüenciació................................................................................ 316 27.3. Pla de treball de la pràctica.......................................................................................................... 317 27.4. Interpretació dels resultats........................................................................................................... 320 TEMA 28 (PRÀCTICA 8). PRÀCTIQUES INTERPRETATIVES DE CITOGENÈTICA R. Oliva, A. Carrió, D. Costa i F. Ballesta 28.1. Observació de metafases ............................................................................................................. 323 28.2. Representació gràfica de loci gènics ........................................................................................... 324 28.3. Confecció del cariotip ................................................................................................................. 325 28.4. Interpretació de cariotips ............................................................................................................. 334 28.5. Interpretació de fórmules cromosòmiques .................................................................................. 337 TEMA 29 (PRÀCTICA 9). PRÀCTICA DE BASES DE DADES I D’ANÀLISI DE SEQÜÈNCIES A INTERNET R. Oliva, J. Vidal-Taboada i M. Sánchez 29.1. Introducció .................................................................................................................................. 339 29.2. Recerca de gens o seqüències expressades homòlogues a un gen............................................... 339 29.3. Determinació de si la seqüència de cDNA obtinguda codifica per a una proteïna...................... 341 29.4. Obtenció de la seqüència genòmica corresponent a un cDNA.................................................... 341 29.5. Determinació de l’estructura exònica-intrònica .......................................................................... 341 29.6. Informació disponible a la base de dades GENECARDS ........................................................... 343 29.5. Identificació de mutacions en gens responsables de malalties .................................................... 344 TEMA 30 (PRÀCTICA 10). CONSTRUCCIÓ DE L’ARBRE GENEALÒGIC I RESOLUCIÓ DE CASOS CLÍNICS DE CONSULTA EN GENÈTICA MÈDICA R. Oliva, J. Oriola i F. Ballesta 30.1. Explicació del procediment per realitzar aquesta pràctica .......................................................... 347 30.2-30.3. Exemples de casos clínics resolts........................................................................................ 347 30.4. Casos clínics diversos per resoldre.............................................................................................. 350 SOLUCIONS A LES PRÀCTIQUES I CASOS CLÍNICS Pràctica 1. Construcció de mapes físics de restricció ........................................................................... 355 Pràctica 2. Genotips APOE per RFLP.................................................................................................. 356 Pràctica 3. Seqüenciació del DNA en gels de poliacrilamida ............................................................. 356 Pràctica 4. Genotips HFE per RFLP. Llei de Hardy-Weinberg ........................................................... 357 Pràctica 5. Conceptes bàsics en genètica molecular............................................................................. 358 Pràctica 6. Polimorfisme inserció/deleció del gen ECA per PCR i electroforesi ................................. 360 Pràctica 7. Polimorfisme inserció/deleció del gen ECA per seqüenciació automàtica ........................ 361 Pràctica 8. Citogenètica........................................................................................................................ 362 Pràctica 9. Bases de dades i anàlisi de seqüències ............................................................................... 366 Pràctica 10. Casos clínics 1 a 19 .......................................................................................................... 369 GLOSSARI I ABREVIATURES ...................................................................................................... 383

TEMA 1. CONCEPTE I HISTÒRIA DE LA GENÈTICA R. Oliva i J. Oriola

1.1. La ciència de la genètica

La genètica és la ciència que s’ocupa de l’estudi de la variació i l’herència de tots els organismes vius. El terme genètica va ser proposat l’any 1905 per William Bateson. El terme gen va ser utilitzat per primera vegada l’any 1909 per Wilhelm Johansen per referir-se a les unitats mendelianes de l’herència. Que els fills s’assemblen als seus progenitors és un fet del qual existeixen evidències que és reconegut des de temps antics. Fins i tot alguns aspectes pràctics congruents amb aquesta observació formaven part d’aspectes quotidians com eren el cultiu o la ramaderia. Però durant molts anys els mecanismes que actuaven en els fenòmens referents a l’herència només podien ser tema d’especulació. Va ser a partir de l’aplicació dels principis científics a l’estudi dels fenòmens referents a l’herència i la variació dels éssers vius que va ser possible el desenvolupament de la genètica com a ciència. Actualment, tothom ha sentit a parlar dels gens o de com la genètica és font de notícies o afecta les nostres vides. Com a exemple del reconeixement del paper de la genètica en la medicina es pot esmentar que, dels cent sis premis Nobel de Fisiologia i Medicina atorgats en el període 1901–2007, vint-i-cinc han correspost a avenços en el terreny de la genètica. I, d’aquests vint-i-cinc, vint-i-dos s’han concedit en els últims cinquanta anys.

1.1.1. Breu història de la genètica

Hi ha evidències, segons alguns relleus esculpits en roques, que a l’antic Egipte el cultiu de plantes i la doma d’animals eren activitats quotidianes (2700–2200 aC). A Algèria han aparegut pintures amb una antiguitat de 8.000 anys (6000 aC) que mostren la conducció de bestiar. Possiblement aquestes activitats requerien el reconeixement de les característiques desitjables i la seva selecció. La pol·linització de les palmeres datileres (883–859 aC) que s’observa en gravats egipcis ja indica uns coneixements detallats de la història natural conduent a la fertilització. Uns gravats de fa uns 6.000 anys trobats a Caldea (Iraq) il·lustren pedigrís en els quals es documenta la transmissió de la crinera dels cavalls. El reconeixement de les característiques dels animals i les plantes degué afavorir el reconeixement de les característiques humanes i de com algunes d’aquestes es transmetien a la descendència. A les taules de fang escrites a Babilònia fa 5.000 anys s’esmenten més de seixanta defectes de naixement (Cummings, 1995). Les sagrades escriptures de la religió hindú expliquen que, a l’hora d’elegir una esposa, aquesta no ha de tenir cap malaltia hereditària i ha d’aportar proves de qualitats favorables en les generacions anteriors (Cummings, 1995). El Talmud dels jueus conté una descripció detallada de l’hemofília i de la seva agregació familiar (Cummings, 1995).

Durant la civilització grega van sorgir fonamentalment tres idees referents a les lleis de la reproducció i l’herència, la influència de les quals es va estendre fins al segle XIX: la de la pangènesi, la de l’epigènesi i la del preformacionisme. La pangènesi postulava que el semen es formava com a suma de petites partícules procedents de totes les parts del cos que circulaven per la sang i arribaven fins als testicles. Aquestes partícules, representatives dels trets de qualsevol part del cos, es transmetien durant l’acte sexual a la descendència. L’epigènesi establia que els òrgans de l’adult no existeixen al principi, sinó que es formen durant el desenvolupament. Aquesta idea era contrària a la del preformacionisme, que establia l’existència d’un homuncle dins de l’espermatozoide que contenia tots els òrgans ja formats (figura 1.1).

La influència de les idees iniciades a l’antiga Grècia va quedar fins i tot reflectida en la teoria de l’evolució dels caràcters adquirits formulada per J. B. Lamarck. Segons aquesta teoria, els caràcters adquirits podien transmetre’s a les generacions futures. Per exemple, segons Lamarck, les girafes tenen el coll llarg perquè

Genètica mèdica 18

els seus avantpassats van haver d’estirar el coll per arribar al menjar dels arbres, i aquest tret adquirit va ser transmès a la descendència. Malgrat aquest i altres intents d’explicar com els éssers vius podien haver-se originat a partir de formes ancestrals, en aquesta època prevalia la idea que les espècies no canviaven una vegada havien aparegut.

Figura 1.1. Homuncle i preformacionisme. El preformacionisme establia l’existència d’un homuncle preformat dins de l’espermatozoide(Cummings, 1995).

Aquestes concepcions errònies no van començar a desaparèixer fins que A. R. Wallace i C. Darwin vanformular el principi de la selecció natural, basat en l’observació d’un gran nombre d’éssers vius (taula 1.1). Wallace i Darwin van observar que les diferents espècies produïen un major nombre de descendents que els que eren capaços de sobreviure. D’altra banda, van observar que els descendents solien serportadors de petites variacions que els podien fer més o menys aptes per sobreviure i arribar a tenir descendència. La propagació d’aquestes variacions s’anava produint com a resposta a la variació de les condicions ambientals. Segons aquesta teoria, l’origen del coll més llarg de les girafes es trobaria en el fetque, ancestralment, a causa de la variació en la descendència, només les girafes que espontàniament haguessin nascut amb un coll més llarg haurien sobreviscut o haurien tingut més descendents. Desprésd’una pressió constant per menjar a les branques més i més altes, i per mitjà d’una variació espontània seguida de la selecció natural, en moltes generacions s’hauria anat seleccionant el tret del coll alt.

A la taula 1.1 es resumeixen els principals esdeveniments des de la teoria de l’origen de les espècies l’any 1859 fins a l’obtenció de l’esborrany del genoma humà l’any 2000. Seguint l’ordre cronològic, la següent observació important va ser feta per Gregor Mendel mitjançant el creuament de pèsols, que el va portar a establir les conegudes lleis de Mendel (vegeu la secció següent, «1.1.2. Mendel»).

Concepte i història de la genètica 19

Any Autors principals Descripcions, descobriments o fets 1859 Charles Darwin origen de les espècies de Darwin 1865 Gregor Mendel herència unitària; distribució independent; segregació 1869 Friedrich Miescher aïllament del DNA per primera vegada 1879 Walter Flemming observació de la mitosi 1900 De Vries, Correns, Tschermak redescobriment del treball de Mendel 1902 Archibald Garrod l’alcaptonúria s’hereta seguint les lleis de Mendel 1902 Walter Sutton teoria cromosòmica de l’herència 1905 William Bateson terme de genètica1909 Wilhelm Johansen termes de gen, genotip i fenotip1911 Thomas Hunt Morgan teoria cromosòmica; lligament; recombinació; premi Nobel l’any 1933 1941 G. Beadle, E. Tatum 1 gen, 1 enzim 1943 William Astbury difracció dels raigs X del DNA 1944 Avery, McLeod, McCarty el DNA és el principi de transformació 1944 Barbara McClintock gens saltadors (transposons); premi Nobel l’any 1983 1952 Alfred Hersey, Martha Chase els gens estan fets de DNA 1953 Francis Crick, James Watson el DNA és una doble hèlix; premi Nobel l’any 1962 juntament amb Wilkins 1955 Joe Hin Tjio l’home té 46 cromosomes 1955 Arthur Kornberg. s’aïlla la DNApolimerasa 1956 Vernon Ingram causa de l’anèmia de cèl·lules falciformes 1958 Meselson-Sttahl replicació semiconservativa del DNA 1959 Jerome Lejeune còpia extra del cromosoma 21 en la síndrome de Down 1961 Brenner, Jacob, Meselson l’mRNA porta informació 1961 Robert Guthrie cribratge neonatal per a la fenilcetonúria 1965 McKussick 1a edició del llibre Mendelian Inheritance in Man1966 Nirenberg, Khorana, Ochoa codi genètic; síntesi de DNA i RNA; premi Nobel els anys 1968 i 1969 1968 Meselson, Smith, Wilcox enzims de restricció; premi Nobel l’any 1978 per a Arber, Nathans i Smith 1972 Paul Berg primera molècula recombinant 1973 Cohen, Boyer clonació del primer gen a E. coli75-77 Sanger, Maxam i Gilbert seqüenciació del DNA; premi Nobel 1976 Bob Swanson fundació de Genetech, primera companyia d’enginyeria genètica 1977 Richard Roberts, Phil Sharp intró; premi Nobel l’any 1993 81-83 Múltiples ratolins i mosques transgèniques; GenBank; m. de Huntington en el cr. 4 1983 K. Mullis reacció en cadena de la polimerasa o PCR; premi Nobel1986 Múltiples clonació posicional en la malaltia granulomatosa crònica 87-89 Múltiples mapa genètic humà; IACS; microsatèl·lits; STS 1990 Múltiples inici del Projecte Genoma; programa ELSI; BACS 1991 M. Olsson seqüències expressades úniques (expressed sequence tags, EST) 1994 Múltiples la FDA aprova els tomàquets transgènics; mapa genètic humà 95-96 Múltiples protecció contra la discriminació laboral i genètica 1995 Múltiples seqüències d’H. influenzae i M. genitalium; mapa físic humà 1996 Múltiples seqüència del llevat; 280.000 ETS humans 97-98 Múltiples seqüència d’E. coli; M. tuberculosi, C. elegans, SNP 2000 Múltiples seqüència de Drosophila i primer esborrany del genoma humà 2003 Brenner, Horvitz, Sulston regulació genètica del desenvolupament i mort cel·lular programada; premi

Nobel2006 Andrew Zire, Craig Mello Descobriment del RNA interferent; premi Nobel 2007 Mario Capecci, Martin Evans;

Oliver Smithies Introducció de modificacions en ratolins a través de la utilització de cèl·lules mare embrionàries (generació de knock-outs) ; premi Nobel

Taula 1.1. Cronologia d'alguns dels fets importants en el camp de la genètica

Genètica mèdica 20

L’any 1869 el DNA va ser aïllat per primera vegada. L’any 1902 el metge Archibald Garrod va reconèixer al biòleg William Bateson el fet d’haver-se adonat amb «defectes congènits del metabolisme» del significat genètic de la consanguinitat entre els pares d’alguns dels nens amb «defectes congènits del metabolisme». En concret, va descriure que l’alcaptonúria s’hereta seguint les lleis de Mendel i que si més d’un membre de la família està afectat, normalment són els germans (patró recessiu).

El terme genètica va ser proposat l’any 1905 per William Bateson per descriure l’estudi de l’herència i de les variacions heretades. Wilhelm Johansen va utilitzar per primera vegada el terme gen per referir-se a les unitats mendelianes de l’herència. També va distingir entre genotip (l’heretat) i fenotip (l’aparença externa). L’any 1911 Thomas Hunt Morgan, per mitjà d’experiments realitzats amb la mosca de la fruita (D. melanogaster), va establir que els cromosomes porten als gens (teoria cromosòmica de l’herència). També va descriure el concepte de lligament genètic. L’any 1941, mitjançant els experiments realitzats a N. crassa en presència de combinacions de nutrients, va ser possible arribar a deduir l’ordre de les reaccions enzimàtiques. Es va descriure també que una mutació podia inactivar un enzim i originar canvis en el fenotip. Es va establir el concepte d’1 gen, 1 enzim. L’any 1944 es va establir que el DNA aïllat de soques virulentes de pneumococ és el principi de transformació de les soques no virulentes.

L’estructura de doble hèlix del DNA va ser descrita l’any 1953 per Watson i Crick. Són avenços clau en el desenvolupament de la genètica molecular actual l’aïllament de la DNApolimerasa (1955), la identificació del codi genètic (1966), el descobriment dels enzims de restricció (1968) i de les DNA lligases, i el desenvolupament dels mètodes de seqüenciació del DNA (1977–1978). L’any 1990 es va iniciar el Projecte Genoma, i l’any 2000, cinc anys abans del previst, es va fer públic el primer esborrany de la seqüència del genoma (taula 1.1).

1.1.2. Mendel

Mendel va fer aportacions molt importants a la genètica l’any 1865 a base de creuar línies pures de pèsols amb característiques ben definides i d’observar com aquestes característiques desapareixien o reapareixien en generacions successives. A partir de tots els experiments fets, Mendel va extreure diverses conclusions:

— Herència unitària: les característiques o els fenotips presents en els pares no es barregen en la descendència i encara que no apareguin en la primera generació poden reaparèixer en una generació posterior. Mendel va denominar elements les unitats discretes que es transmeten de generació en generació i que actualment coneixem amb el nom de gens i les seves variants (al·lels). Va crear també el principi de la dominància, aplicable als casos en què només una de les característiques dels pares apareix en la descendència. En concret, va descriure que el color groc dels pèsols és dominant sobre el verd, que és recessiu, i que la textura llisa és dominant sobre la rugosa (figura 1.2).

— Llei de la segregació (o primera llei de Mendel): els dos membres d’un parell gènic (que avui es coneixen amb el nom d’al·lels) se separen en la meiosi i passen a gàmetes diferents (figura 1.2).

— Llei de la distribució independent (o segona llei de Mendel): la segregació dels membres d’un parell gènic (al·lels) és independent de la segregació en altres parells gènics (figura 1.2). No obstant això, Mendel no va reconèixer que si les posicions (avui conegudes com a loci) corresponents a dos parells gènics es troben en el mateix cromosoma i a prop l’una de l’altra, els respectius al·lels no es distribueixen de manera independent i tendeixen a romandre junts (lligats) generació rere generació.

Les lleis de Mendel són aplicables a qualsevol espècie eucariota en la qual tingui lloc el procés de meiosi. Però aquestes observacions de Mendel van passar desapercebudes durant trenta-cinc anys, fins que van ser redescobertes o van comunicar a la comunitat científica De Vries, Correns i Tschemak. Des del punt de vista mèdic, la importància dels principis que va deduir Mendel és que són aplicables a moltes de les malalties i característiques humanes. Qualsevol característica o malaltia humana amb un patró d’herència autosòmica dominant o recessiva pur, pot ser descrita a través de les generacions en els termes dels

Concepte i història de la genètica 21

principis de Mendel. La influència de Mendel es reflecteix fins i tot en el títol d’un dels catàlegs demalalties hereditàries més complets que existeix: OMIM (On Line Mendelian Inheritance In Man).

gàmetes�

xF1F1

R;Y 1/4

R;y 1/4

r;y 1/4

r;Y 1/4

R;Y R;y r;y r;Y 1/4 1/4 1/4 1/4

gàmetes�

1/16 1/16 1/16 1/16

1/16 1/16 1/16 1/16

1/16 1/16 1/16 1/16

F1R/r; Y/y

gàmetes r;YR;y

xPr/r; Y/Y (rugós, groc)

R/R; y/y (llis, verd)

A

B

9 (llis, groc)

3 (llis, verd)

3 (rugós, groc)

1 (rugós, verd)

1/16 1/16 1/16 1/16

Figura 1.2. Experiments bàsics de Mendel. Les característiques o els fenotips presents en els pares no es barregen en la descendència i encara que no apareguin en la primera generació (A) poden reaparèixer en unageneració posterior (B). La figura també il·lustra les lleis de la segregació i de la distribució independent (vegeuel text).

1.2. Àmbits de la genètica

La definició de genètica com la ciència que s’ocupa de l’estudi de la variació i l’herència de tots els organismes vius és molt àmplia. Atès que els camps als quals és aplicable aquest estudi són molt variats, actualment s’utilitzen diferents noms per diferenciar-los.

1.2.1. Genètica humana

La genètica humana és l’estudi de la variació i l’herència en els humans. Evidentment, aquest estudi potaplicar-se tant a les característiques normals com a les característiques patològiques. Els exemples d’estudi de la variació normal poden incloure la coloració de la pell, aspectes d’evolució del genoma humà, tots els mecanismes fisiològics d’adaptació que impliquin canvis en l’expressió gènica i fins i tot l’estudi de l’heretabilitat d’aptituds intel·lectuals. Molts dels aspectes de la variació normal en l’espècie humana portats a l’extrem acaben considerant-se patològics.

TEMA 2. GENOMA HUMÀ I ESTRUCTURA I EXPRESSIÓ DELS GENS R. Oliva, J. Oriola i J. Clària

2.1. Composició del genoma humà La paraula genoma conté l’arrel grega gen, que significa «origen», i l’extensió també grega oma, emprada en substantius del vocabulari biològic i mèdic (Winkler, 1920; Rieger et al., 1991; Riera, 1992). El terme gen aplicat a l’herència va ser encunyat per Johansen l’any 1909 per designar les unitats d’herència associades amb un caràcter transmissible específic (Carlson, 1991). Prèviament, els gens havien estat anomenats elements per Mendel (1866), gèmmules per Darwin (1868), pangens per De Vries (1889), unitats fisiològiques per Spencer (1864) o, simplement, caràcter unitat, factor unitat o factor. El concepte de gen ha anat canviant a mesura que ha avançat l’estat del seu coneixement (Carlson, 1991). Una de les definicions actuals més àmplia de gen seria: «seqüència d’informació que produeix un producte funcional» (Carlson, 1991). Normalment, se sobreentén per gen una seqüència de DNA, amb tots els seus elements reguladors de la transcripció, que dóna lloc a una proteïna o a un RNA. El genoma pot definir-se com el contingut total de material genètic característic d’una espècie (Oliva, 1986; Cummings, 1995; Thompson et al., 1996; Oriola i Oliva, 2001). Aquest terme també s’utilitza per indicar el material genètic present en els virus. A l’escala més elemental de totes, el genoma humà està compost per quatre tipus diferents de bases: (A) adenina, (T) timina, (C) citosina i (G) guanina (Watson i Crick, 1953). Aquestes bases s’uneixen entre si per formar 23 seqüències lineals contínues (amb un total de 3.000 milions de bases) i una seqüència circular de 16.569 bases (cromosoma mitocondrial). Atès que les bases són complementàries dues a dues (T:A i C:G), cada cadena de DNA està aparellada amb una altra cadena complementària. Ambdues cadenes s’enrotllen i formen l’estructura típica de doble hèlix (figura 2.1; Watson i Crick, 1953). És precisament en la seqüència de bases d’aquestes molècules de DNA continguda en els cromosomes que componen el genoma humà on es troba la informació necessària (gens) per determinar totes les característiques amb base hereditària de l’ésser humà. Les molècules de DNA s’organitzen en forma de cromosomes. El nucli d’una cèl·lula diploide conté 23 parells de molècules de DNA. Normalment, el que se sol considerar genoma humà és aquest nivell cel·lular de 23 parells de cromosomes més el cromosoma mitocondrial. Però el genoma humà pot considerar-se també a nivells superiors. La seqüència de les molècules de DNA de les diferents cèl·lules que componen l’organisme humà no és sempre la mateixa, sinó que en certes cèl·lules i en certes regions dels cromosomes es produeixen reorganitzacions de la seqüència de DNA amb una funció fisiològica. Per exemple, l’enorme diversitat d’anticossos presents en l’ésser humà s’aconsegueix gràcies a aquest tipus de reorganització fisiològica durant el desenvolupament del sistema immunitari. També durant la meiosi es produeix un intercanvi de material genètic entre diferents cromosomes homòlegs. El nivell superior a què pot ser considerat el genoma humà és el de tota la humanitat. Cada dos individus de l’espècie humana difereixen entre si aproximadament un 0,1 %. Per conèixer la verdadera magnitud del genoma humà cal considerar el nombre total d’individus de la Terra (6·109) i tenir en compte aquesta variabilitat. Un catàleg que inclogués totes les diferències de seqüències de DNA hauria de tenir 15·1015 entrades. Un catàleg d’aquestes característiques podria ser necessari en un futur per conèixer les malalties genètiques més rares o més complexes. Numèricament, el genoma humà, sense tenir en compte la variabilitat entre els individus de l’espècie humana, té aproximadament 3·109 bases. Per tal d’entendre millor què significa aquesta xifra, és útil fer algunes comparacions: 1) Si haguéssim d’escriure la seqüència sencera del DNA d’una cèl·lula, podríem omplir 200 guies de telèfon de Barcelona (1.000 pàgines cada tom).

Genètica mèdica 36

2) Una altra suposició útil per comprendre millor la magnitud del genoma humà és considerar les dimensions lineals que tindrien els cromosomes d’una sola cèl·lula si poguéssim estirar-los sense trencar-los i disposar-los l’un a continuació de l’altre. La resposta serien 2 metres (el cromosoma més petit [21] mesuraria 3 cm i el més gran [1] en mesuraria 16). 3) La complexitat del genoma humà queda molt palesa quan s’observa per mitjà de microscòpia electrònica el que ocorre si s’eliminen les proteïnes que normalment empaqueten un cromosoma metafàsic (Paulson i Laemmli, 1977) i es visualitza tot l’embolic de cadenes de DNA que sobresurten de les restes de l’esquelet cromosòmic.

3’ G C 5’

T 3’ 5’ A Cèl·lula

Cromosomes: 23

parells de bases:

6 · 109 pb

(diploide)

+ genoma

mitocondrial

(16.569 pb) =

35.000 gens.

Cromosoma

Molècules de

DNA: 2

Mida: entre

5 · 107 pb i

2,5 · 108 pb.

Humanitat

Persones: 6 · 109

El genoma

difereix 1 de

cada 270 bases

entre cada dos

individus.

Individu

Cèl·lules: 1013

El genoma és

gairebé idèntic

entre les

cèl·lules d’un

individu.

Gen

Unitat hereditària

i funcional (amb

excepcions)

Mida: entre 400 i

2 · 106 pb.

DNA

Àcid desoxiribonucleic

4 tipus de bases diferents: adenina

(A), guanina (G), citosina (C) i

timina (T), que s’aparellen entre si

(A:T i G:C). La informació

genètica es troba en la seqüència

de les bases.

Figura 2.1. Nivells a què pot considerar-se el genoma humà. El genoma és el material genètic característic de l’espècie humana, per la qual cosa s’ha de considerar la variació existent entre els diferents individus. Text modificat per Oliva (1996).

2.2. Genoma nuclear i genoma mitocondrial. Nomenclatura dels cromosomes El genoma humà està compost per 23 parells de molècules de DNA contingudes en estructures anomenades cromosomes que es localitzen en el nucli de la cèl·lula (genoma nuclear) i per una petita molècula de DNA circular continguda en un òrgan de la cèl·lula denominat mitocòndria o mitocondri (genoma mitocondrial). Quan les cèl·lules es divideixen per mitosi, els cromosomes es condensen i es fan visibles amb el microscopi òptic, ja que apareixen com a unitats discretes (cromosomes metafàsics; figura 28.2; Schnedl, 1974; Weiss, 1993; Thompson et al., 1991). El conjunt de cromosomes metafàsics d’una cèl·lula es denomina cariotip. El genoma nuclear està format per 22 parells de cromosomes autosòmics i pels cromosomes sexuals, designats X i Y. Els cromosomes autosòmics s’enumeren prenent com a base la seva mida: el cromosoma més gran és l’1, el següent en mida decreixent és el 2, i així successivament. Una excepció és que el cromosoma més petit és el 21, en lloc del 22. Aquesta excepció és deguda al fet que inicialment es va pensar que el cromosoma 22 era el més petit, i encara que actualment se sap que això no és així, la nomenclatura s’ha mantingut.

Genoma humà i estructura i expressió dels gens 37

Cada cromosoma té una constricció central, denominada centròmer, que divideix el cromosoma en dos braços, designats per p (per al braç petit) i q (per al braç gran; la q segueix la p en l’alfabet). Mitjançant diferents tincions és possible subdividir els braços en bandes amb nivells creixents de resolució. Aquestes bandes es designen amb números començant per la banda més centromèrica. Per exemple, per indicar que el complex major d’histocompatibilitat es localitza en el cromosoma 6, braç petit, banda 21.2, s’utilitza la combinació «6p21.2» (es llegeix «sis p dos un punt dos»).

Genoma nuclear Genoma mitocondrial Mida 3.000.000 kb 16,5 kb Nombre de molècules diferents 23 en la dona 1 24 en l’home Nombre de còpies per cèl·lula diploide 2 > 1.000 Tipus de DNA lineal circular Presència de nucleosomes sí no Nombre de gens 35.000 aprox. 37 Densitat gènica 1 gen cada 30-60 kb 1 gen cada 0,45 kb DNA codificador 2 % 95 % Presència d’introns en els gens sí no Seqüències repetitives 50 % < 1 % Recombinació > 1 per cromosoma no i meiosi Herència mendeliana exclusivament per via (excepció Y) materna

Taula 2.1. Diferències fonamentals entre el genoma nuclear i el genoma mitocondrial. A part de les diferències indicades, en el genoma mitocondrial pot donar-se el fenomen de l’heteroplàsmia, consistent en l’existència de diferents seqüències o variants dins d’una mateixa cèl·lula, o en l’existència de cèl·lules diferents dins d’un mateix individu.

El genoma mitocondrial consta d’un sol tipus de molècula de DNA localitzat en les mitocòndries, però del qual poden existir diversos milers de còpies per cèl·lula. La mida del genoma mitocondrial és extraordinàriament petita (16.569 pb) en comparació amb la del genoma nuclear (3·109 pb), però la seva funció és esencial, perquè conté alguns gens (37 en total) relacionats amb el metabolisme oxidatiu (Wallace, 1989; Schapira, 1993). Es tracta d’un genoma extraordinàriament compacte i amb un origen evolutiu i una forma d’herència molt diferents de les del genoma nuclear. En la taula 2.1 es resumeixen les principals diferències entre el genoma mitocondrial i el genoma nuclear. La hipòtesi més afavorida en l’actualitat sobre l’origen del genoma mitocondrial està lligada al propi origen de les mitocòndries. S’especula que aquestes van aparèixer en els eucariotes mitjançant endocitosis de bacteris fotosintètics per part dels precursors anaeròbics eucariotes (Yang et al., 1985). D’aquesta manera, els eucariotes resultants haurien adquirit la capacitat de fosforilació oxidativa, cosa que hauria permès un creixement ràpid en una atmosfera rica en oxigen.

Genètica mèdica 38

2.3. Organització de la seqüència del genoma i nombre de gens La informació continguda en el genoma humà no es distribueix de manera uniforme al llarg de la seqüència, sinó que es concentra sobretot en determinades seqüències denominades gens (figura 2.2). Els gens representen les unitats funcionals del genoma i, típicament, la informació que contenen serveix per donar lloc a proteïnes (figures 2.2 i 2.3). Existeixen evidències que hi ha aproximadament uns 25.000-35.000 gens repartits entre tots els cromosomes (Lander et al., 2001; Venter et al., 2001; Strachan i Read, 2004). Molts d’aquests gens ja es coneixen de manera detallada, així com les seves posicions en el genoma, mentre que de la resta es disposa de representacions en les bases de dades. El primer cromosoma humà que es va seqüenciar va ser el cromosoma 22, en el qual s’han trobat 577 gens i 234 pseudogens. Aquests últims són gens que contenen aberracions en la seva seqüència i que, per això, no són expressats per la maquinària cel·lular. En el cromosoma 1, que és el mes llarg, s’hi ha descrit 3-141 gens i 991 pseudogens (Gregory SG et al., 2006). Si partim del fet que hi ha 35.000 gens funcionals en total i que la majoria de gens tenen una longitud d’entre 3.000 i 10.000 pb, fent un simple càlcul obtindrem que tots els gens sumen entre 105 i 350 milions de pb. Si sabem que el genoma humà té al voltant de 3.000 milions de pb, el resultat és que hi ha molt DNA (al voltant del 90 %) entre gen i gen que, aparentment, no conté informació. Entre aquest DNA que aparentment no conté informació i tenint en compte els resultats obtinguts en el cromosoma 22, avui es coneix l’existència d’una multitud de pseudogens (per cada 4 o 5 gens funcionals n’hi ha 1 de no funcional).

empalmament

traducció

funció

gens ribosòmics

Gens 5-10 %

DNA repetitiu 50 %

DNA sense funció coneguda 40-45 %

en tàndem

dispers

introns

DNA que separa els gens

seqüències Alu, Kpn microsatèl·lits transposons altres

altres

transcripció

centròmer (satèl·lit i alfoide)

telòmer (TTAGGG)n

Figura 2.2. Organització de la seqüència del genoma. Els gens representen només una petita fracció de la seqüència genòmica. Figura reproduïda amb modificacions d’Oliva (1996).

No obstant això, a mesura que se sap més sobre aquest DNA que separa els gens, es van descobrint possibles funcions. Per exemple, la seqüència de l’extrem 5’ dels gens (la seqüència anterior a l’inici de la transcripció) conté informació per a la unió de factors de transcripció específics de cada gen. De fet, aquestes regions anomenades promotores poden considerar-se també part dels gens i poden estar formades per més de 3.000 pb. Dins de cada gen, hi ha seqüències no codificadores (introns), que formen al voltant del 80-90 % del gen (figura 2.3). Addicionalment, aquest DNA que separa els gens o el DNA present en

Genoma humà i estructura i expressió dels gens 39

els introns, podria tenir la funció d’incrementar la freqüència de la recombinació meiòtica tot augmentant la generació de combinacions al·lèliques en l’espècie humana. Un altre tipus de seqüències no codificadores són les repetitives. Aquestes seqüències es poden dividir en: 1) repetides en tàndem i 2) seqüències disperses. Les seqüències repetides en tàndem són característiques de la regió central dels cromosomes (centròmers) i garanteixen la distribució correcta dels cromosomes a les cèl·lules filles durant la divisió cel·lular. En aquestes regions hi ha molt pocs gens. També hi ha repeticions en tàndem a les regions finals de cada cromosoma. Són els telòmers, els quals ajuden a mantenir l’estabilitat i la individualitat de cada cromosoma durant la replicació. Cada telòmer està format per 250-1.500 seqüències TTAGGG repetides (Moyzis et al., 1988; Blackburn, 1991). No tots els tipus cel·lulars presenten el mateix nombre de repeticions; com a exemple podem posar els cromosomes dels espermatozoides, que són els que posseeixen els telòmers més llargs. Aquesta seqüència telomèrica, la tenen tots els vertebrats estudiats fins ara. Altres regions repetides en tàndem són les dels gens implicats en la fabricació dels ribosomes. Aquests es troben repetits centenars de vegades en els braços curts dels cromosomes 13, 14, 15, 21 i 22. Entre les seqüències disperses més abundants hi ha les seqüències Alu I (regions que contenen la seqüència AGCT, que és reconeguda per l’enzim de restricció Alu I). Aquestes seqüències apareixen repetides prop d’un milió de vegades en el genoma, cadascuna amb una longitud de 300-500 pb. Per si soles, aquestes regions representen al voltant del 6-8 % del genoma humà. Hi ha teories que intenten explicar la presència d’aquestes regions Alu I, però cap no ha estat acceptada fins ara de manera general. Un altre tipus de seqüències disperses són les denominades microsatèl·lits. Per exemple, una seqüència microsatèl·lit seria la repetició 5’- CAG CAG CAG CAG CAG- 3’. Observeu que aquestes seqüències impliquen també una repetició en tàndem. Aquestes seqüències es troben distribuïdes més o menys uniformement dins del genoma i són hipervariables o polimòrfiques. La majoria es troben en regions intergèniques i no se’ls coneix cap funció, encara que sí que són de gran ajut en el diagnòstic i la investigació (vegeu la figura 3.11), com a estudis d’associació (vegeu l’apartat 16.7.2), en el càncer (pèrdua d’heterozigositat; vegeu la figura 17.7), en els estudis de paternitat, en medicina forense i, més recentment, en el diagnòstic prenatal (Hulten et al., 2003). Tanmateix, les que es troben dins de gens poden estar implicades en el desenvolupament de malalties (p. ex., síndrome del cromosoma X fràgil, malaltia de Huntington, síndrome de Kennedy, atàxies, etc.) (vegeu l’apartat 8.11).

2.4. Estructura dels gens. Exons. Introns. Transcripció. Splicing La unitat bàsica d’informació genètica és el gen (figura 2.3). Un gen es pot definir com una regió (física) del DNA la seqüència de bases de la qual conté la informació necessària per donar lloc a una unitat transcripcional amb les seves diverses seqüències reguladores associades (figura 2.3; Oliva et al., 1991 i 2001). La mida dels gens oscil·la entre els 500 pb del gen de la protamina (un dels més petits) i els 3 milions de pb del gen de la distrofina (un dels més grans), encara que com s’a dit anteriorment, de mitjana posseeixen al voltant de 3.000-10.000 pb. Una altra característica important dels gens és que tenen una polaritat 5’-3’; això vol dir que el gen es llegeix en sentit 5’-3’, i no al revés (figures 2.3 i 2.4). També es pot assenyalar que en la regió anterior a l’inici del primer exó hi ha la regió promotora (figura 2.3). A aquesta regió del DNA s’uneixen factors de transcripció, ja siguin específics, ja siguin generals. Els primers gens que es van estudiar van ser els bacterians. En aquests, quan se sintetitza l’RNA missatger (mRNA) s’observa el mateix ordre de nucleòtids que posseeix el DNA, tenint en compte que en l’RNA la timina (T) és substituïda per l’uracil (U) (figura 2.4). Quan es van començar a estudiar els gens en els eucariotes, es va pensar que tindrien estructures semblants. Aviat es va veure que això no era així. Els gens que es troben en els organismes eucariotes tenen introns (figures 2.3 i 2.4). Els introns són els segments de DNA que no són presents en l’mRNA i que, per tant, no es tradueixen en aminoàcids. Els introns constitueixen el 85-95 % de la seqüència nucleotídica d’un gen, és a dir, només una petita part de la

Genètica mèdica 40

seqüència d’un gen passa a mRNA. La funció dels introns es desconeix en la majoria dels casos. Tan sols els seus extrems (al voltant de 4 o 5 parells de bases) participen d’una manera molt important en la maduració de l’mRNA. En alguns gens, no obstant això, s’han trobat regions reguladores que es troben dins dels introns.

DNA genòmic

exó 1 intró 1

exó 2 exó 3regió promotora intró 2

5’

transcripció

3’

RNA transcrit primari 3’ 5’

introns

UGAAUG processament de l’RNA (splicing i poliadenilació)

RNA missatger

traducció 3’ UTR

poli-A5’ UTR regió

codificadora

Proteïna NH2 COOH

Figura 2.3. Transcripció i splicing. La majoria dels gens contenen introns que són eliminats per mitjà del procés d’splicing.

El primer pas en la transmissió de la informació genètica present en el DNA a les proteïnes és la còpia d’aquesta informació en una molècula intermediària denominada mRNA. La informació continguda en la seqüència de bases del DNA es transmet fidelment a l’mRNA gràcies a l’aparellament de les bases del DNA amb les bases de l’RNA (la T s’aparella amb la A de l’RNA, la A s’aparella amb l’uracil (U) de l’RNA, la G s’aparella amb la C, i la C s’aparella amb la G; vegeu la figura 2.4). La síntesi de l’RNA missatger és a càrrec de l’RNA polimerasa, que utilitza com a motlle la seqüència de bases que hi ha en el DNA (figures 2.3 i 2.4). L’RNA sintetitzat de nou es denomina transcrit primari. Aquest transcrit primari experimenta un procés de maduració que dóna lloc a l’mRNA madur (figures 2.3 i 2.4). Encara que el procés de transcripció és molt similar en els procariotes i els eucariotes, existeixen notables diferències entre ambdós processos. La més important és que en els procariotes el producte resultant de la transcripció, el transcrit primari, és l’mRNA, que ja està a punt per ser traduït a proteïna. En el cas dels eucariotes això no és cert i el transcrit primari experimenta un procés de maduració que el converteix en mRNA madur. A grans trets, el procés de maduració consisteix en els tres esdeveniments principals següents: 1) modificació de l’extrem 5’ mitjançant l’addició de una 7-metil-guanosina (procés de capping). 2) modificació de l’extrem 3’ mitjançant l’addició d’una cua d’adenines (poly-A); 3) eliminació dels introns (splicing o splicing).

Genoma humà i estructura i expressió dels gens 41

De vegades, un mateix transcrit primari pot ser processat de diferents maneres. Això permet l’aparició de diferents mRNA i, per tant, diferents proteïnes a partir d’un mateix gen. En aquest cas, diem que existeix un splicing alternatiu, el qual constitueix una font de variabilitat important, ja que es considera que afectaria un gran nombre de proteïnes del nostre organisme. Un exemple paradigmàtic d’splicing alternatiu és el de la calcitonina, una hormona sintetitzada en les cèl·lules parafol·liculars de la tiroide i involucrada en la regulació dels nivells de calci plasmàtic. Quan el gen de la calcitonina s’expressa en les neurones hipotalàmiques, produeix una proteïna anomenada CGRP (producte relacionat amb el gen de la calcitonina) que actua com a neurotransmissor. Una altra de les modificacions postranscripcionals possibles és l’edició del missatger (RNA editing). Aquesta modificació consisteix en l’edició de la seqüència de l’mRNA mitjançant un procés enzimàtic que canvia la seqüència de l’mRNA editat i, en conseqüència, la proteïna resultant té una seqüència diferent. Aquest mecanisme afecta molt pocs gens.

2.5. Traducció. Codi genètic Una vegada sintetitzat i processat en el nucli, l’mRNA madur és transportat al citoplasma, on té lloc la traducció, és a dir, la transmissió a la proteïna de la informació present en l’mRNA (figures 2.3 i 2.4). En concret, el codi de traducció d’aquesta informació es denomina codi genètic i consisteix essencialment en el fet que a cada tres bases determinades de la seqüència de l’mRNA (codó) els correspon un aminoàcid (taula 2.2) (el procés de síntesi de proteïnes rep el nom de traducció, ja que es canvia d’un llenguatge basat en bases nitrogenades a un de basat en aminoàcids).

2a posició 1a posició U C A G 3a posició

Phe (F) Ser (S) Tyr (Y) Cys (C) U Phe (F) Ser (S) Tyr (Y) Cys (C) C Leu (L) Ser (S) Stop Stop A U Leu (L) Ser (S) Stop Trp (W) G Leu (L) Pro (P) His (H) Arg (R) U Leu (L) Pro (P) His (H) Arg (R) C Leu (L) Pro (P) Gln (Q) Arg (R) A

C Leu (L) Pro (P) Gln (Q) Arg (R) G Ile (I) Thr (T) Asn (N) Ser (S) U Ile (I) Thr (T) Asn (N) Ser (S) C Ile (I) Thr (T) Lys (K) Arg (R) A

A Met (M) Thr (T) Lys (K) Arg (R) G Val (V) Ala (A) Asp (D) Gly (G) U Val (V) Ala (A) Asp (D) Gly (G) C Val (V) Ala (A) Glu (E) Gly (G) A

G Val (V) Ala (A) Glu (E) Gly (G) G

Taula 2.2. Codi genètic.

A més de l’mRNA, en el procés de traducció intervenen uns altres dos tipus d’RNA, cada un amb una funció determinada i complementària per dur a terme de manera conjunta el procés: — l’RNA ribosòmic (rRNA), que forma part de les dues subunitats que constitueixen els ribosomes, orgànuls cel·lulars que es troben en el citoplasma dels eucariotes, associats amb el reticle endoplasmàtic.

Genètica mèdica 42

— l’RNA de transferència (tRNA), que és una cadena curta de ribonucleòtids acoblada a un aminoàcid específic i amb una configuració espacial en forma de fulla de trèvol amb quatre braços o bucles d’RNA, un dels quals consisteix en tres bases complementàries al codó (l’«anticodó»). El tRNA té un paper fonamental en la traducció, ja que transporta els aminoàcids fins als ribosomes en l’ordre correcte en el qual s’han d’unir per formar una proteïna determinada, segons el codi genètic.

Aminoàcid Abreviatura amb 3 lletres

Abreviatura amb 1 lletra

Àcid aspàrtic Asp D Àcid glutàmic Glu E Alanina Ala A Arginina Arg R Asparagina Asn N Cisteïna Cys C Fenilalanina Phe F Glicina Gly G Glutamina Gln Q Histidina His H Isoleucina Ile I Leucina Leu L Lisina Lys K Metionina Met M Prolina Pro P Serina Ser S Tirosina Tyr Y Treonina Thr T Triptòfan Trp W Valina Val V

Taula 2.3. Aminoàcids i abreviacions estàndard utilitzant els codis amb tres lletres i amb una lletra.

A grans trets, el mecanisme de la traducció es pot resumir dient que l’mRNA s’uneix al ribosoma de manera que dóna accés al primer codó. Aquest primer codó és sempre el mateix, l’AUG, que codifica un tRNA acoblat a l’aminoàcid metionina (figura 2.4, taula 2.2). La síntesi proteica prossegueix amb el següent aminoàcid que correspongui segons les bases del segon triplet o codó. En aquest moment, un enzim uneix ambdós aminoàcids mitjançant un enllaç peptídic i tot el complex es desplaça per facilitar la unió d’un altre tRNA al tercer codó, i així successivament. La síntesi proteica s’acaba quan s’assoleix un dels codons d’acabament (UGA, UAG, UAA). En aquest moment, la nova cadena proteica s’allibera al citoplasma i els ribosomes queden a punt per iniciar una nova traducció. No tot l’mRNA es tradueix. Les seqüències UTR (UnTranslated Regions) de l’RNA no passen a formar part de la proteïna (figura 2.3).

2.6. Regulació de l’expressió gènica L’expressió gènica en el genoma humà és regulada principalment a través d’un control transcripcional. Aquest control transcripcional és exercit típicament per seqüències contingudes en la regió que va des del lloc d’inici de la transcripció fins a (generalment) 1 kb en la direcció 5’ del gen. Com que aquestes

Genoma humà i estructura i expressió dels gens 43

seqüències exerceixen el seu efecte sobre el propi gen o la pròpia molècula de DNA, es descriuen com a elements que actuen en CIS (CIS-acting elements), o bé més col·loquialment s’hi fa referència com a seqüències reguladores.

tRNA

ribosoma

DNA

mRNA mRNA

proteïna sintetitzant-se Figura 2.4. Detall de la transmissió d’informació en els processos de transcripció i traducció proteica. La cadena que actua com a motlle per a la síntesi de l’mRNA és la cadena complementària a la que conté la seqüència 5’ ATG 3’, corresponent al primer triplet codificador. Moltes vegades la metionina iniciadora amb què comencen les proteïnes és eliminada formant part del procés normal de maduració proteica (exemple: en els gens de la cadena beta de la globina o en el gen de la protamina P1).

Existeixen diversos mètodes per a la detecció de seqüències reguladores. La simple comparació de les seqüències de la regió promotora de gens homòlegs d’espècies diferents o fins i tot de gens diferents, pot posar de manifest seqüències conservades en l’evolució. Quan una seqüència es conserva al llarg del procés evolutiu, és que aquesta seqüència és important. Mitjançant aquest procediment ha estat possible predir diverses seqüències reguladores de l’expressió dels gens de protamina P1 (Oliva i Dixon, 1991; Queralt i Oliva, 1993). Una altra alternativa per a la detecció de seqüències reguladores és la detecció d’unió entre la regió del gen estudiada i factors presents en extractes nuclears. Un dels assaigs més sensibles consisteix a detectar retard en la mobilitat electroforètica (band shift) del fragment de DNA en unir-se a una proteïna reguladora. A base d’utilitzar petits fragments que cobreixin la regió promotora és possible construir un mapa de regions que contenen les seqüències reguladores. La detecció definitiva de les seqüències implicades en la unió es fa mitjançant «footprinting amb DNAasa I» (Queralt i Oliva, 1995). A part dels estudis in vitro, també és possible determinar l’efecte in vivo de l’absència o dels canvis en els elements reguladors acoblant la regió promotora objecte d’estudi a un gen control i mesurant l’expressió in vivo. Això pot aconseguir-se per mitjà de la producció de transgènics o bé per mitjà d’estudis de transfecció. El genoma humà, tot sol amb totes les seves seqüències reguladores i en absència de condicions que afavorissin la seva degradació, es comportaria com un fòssil molecular que romandria inert milions d’anys

Genètica mèdica 44

sense cap canvi (el DNA és una de les molècules més estables que existeixen). És obvi que el genoma humà necessita trobar-se en el context de la maquinària cel·lular funcionalment activa per poder expressar-se plenament. Però aquí podem delimitar el problema preguntant-nos quins són els requeriments mínims perquè un gen humà «típic» amb tots els seus elements reguladors pugui ser transcrit específicament en una cèl·lula i/o modulat quant al seu nivell de transcripció. Aquests requeriments mínims són: 1) la maquinària transcripcional comuna a tots els gens, 2) la unió de proteïnes reguladores específiques (o factors que actuen en «trans» [trans-acting factors]) a les seqüències reguladores específiques o elements que actuen en «cis», i 3) els substrats i la força iònica, Mg2+ i pH adequats.

funció

Ac

poly-A

regió

codificadora

NH2 COOH

3´ UTR 5´ UTR

UGAAUG

3´5´

RNA transcrit primari

Control pretranscripcional • metilació del DNA • accessibilitat del DNA (acetilació d’histones) • superhelixitat del DNA

Control transcripcional • elements reguladors • factors de transcripció

Control del processament i el transport de l’RNA • empalmament alternatiu • edició del missatger • transport actiu

Control de l’estabilitat de l’RNA

• elements reguladors • factors d’unió a l’RNA

Control de la traducció

• freqüència i velocitat d’inici • velocitat d’elongació • eficàcia de l’acabament

Control posttraduccional • plegament de proteïnes • modificacions de les proteïnes (acetilació, fosforilació, proteòlisi) • formació de complexos • unió de cofactors

Figura 2.5. Nivells de regulació de l’expressió gènica. No s’ha d’oblidar mai que el DNA genòmic està gairebé sempre associat amb proteïnes, tal com s’indica en la part superior de la imatge. Una associació similar amb proteïnes reguladores ocorre també amb l’RNA, si bé en aquest esquema no s’ha representat per tal d’aconseguir una major claredat.

En la secció prèvia ja s’han indicat diversos mètodes mitjançant els quals és possible detectar la unió de proteïnes reguladores a les seqüències corresponents. Normalment, la identificació de la proteïna responsable exigeix la seva purificació i el seu aïllament de la resta de proteïnes presents en l’extracte. Existeixen diversos protocols de fraccionament més o menys estàndard aplicables a les diferents famílies

Genoma humà i estructura i expressió dels gens 45

de factors de transcripció. El pas següent sol ser la demostració de la funció de la proteïna purificada en estudis de transcripció in vitro. No es pot oblidar que la majoria d’estudis d’unió de proteïnes reguladores a les seves seqüències reguladores corresponents es realitzen in vitro perquè no es disposa de l’estructura nucleosòmica in vivo (figura 2.5; Korenberg i Thomas, 1974; Burlingame et al., 1985). Aquesta estructura es va descobrir tant a partir de dades de microscòpia electrònica (Olins i Olins, 1974) com a partir de l’observació que les nucleases generen fragments de DNA de mida discreta a partir de la digestió de cromatina (Hewish i Burgoyne, 1973; Altenburger, 1976). És sabut que la presència de nucleosomes modifica d’una manera substancial la unió d’aquestes proteïnes reguladores. Aquest és ara un camp d’estudi en plena expansió. A més de l’estructura nucleoproteica present in vivo, cal considerar també el grau de superhelixitat del DNA. El DNA està ancorat cada 50 kb a proteïnes de l’esquelet cromosòmic, de manera que les nanses resultants es comporten topològicament com si fossin DNA circular. Això permet que enzims com la topoisomerasa II, que actuen conferint superhelixitat al DNA i que es localitzen precisament en la base d’aquests dominis o nanses cromosòmiques, puguin contribuir a modular el grau de condensació general del domini. És possible que d’aquesta manera s’aconsegueixi reprimir o activar la totalitat dels gens continguts en una nansa cromosòmica (figura 2.5). Hi ha diversos tipus de modificacions químiques que poden experimentar les histones. Per exemple, la histona H1 és fosforilada concomitantment amb la condensació dels cromosomes en la metafase mitòtica. Una de les modificacions que actualment s’està investigant més és l’acetilació dels residus de lisina de les cues N-terminals de les histones. En acetilar-se un residu de lisina, aquest perd part de la seva càrrega elèctrica positiva, cosa que fa disminuir la interacció possible d’aquest amb els grups fosfat del DNA. Tan bon punt es va descobrir aquest tipus de modificació, es va postular que podria ser necessària per a la transcripció. Actualment, se sap que existeixen patrons específics d’acetilació de les histones que es correlacionen amb els diferents tipus d’expressió gènica (transcripció, replicació). Un altre mecanisme important de regulació de l’expressió gènica és la modificació del DNA per metilació de les citosines. La metilació exerceix un efecte en l’expressió dels gens per mitjà de la modificació de les interaccions amb les proteïnes reguladores associades. La metilació és, a més, un mecanisme d’impressió genètica dels gens. Recentment, s’han detectat canvis en l’estat de metilació dels gens a mesura que els espermatozoides maduren a l’epidídim i durant el desenvolupament embrionari. Els genomes matern i patern no són equivalents, i el mecanisme responsable de la seva expressió diferencial és la metilació (vegeu el tema 8, la figura 8.6 i el tema 17). El mecanisme de la metilació i la impressió genètica dels gens té també un paper important en la inactivació d’un cromosoma X en les femelles. Un altre mecanisme de regulació es troba en els microRNA (miRNA) descoberts recentment. Els miRNA són productes gènics de 70-100 nucleòtids que presenten una estructura en forma de bucle hairpin i que una vegada processats (tallats) tenen entre 21-25 nucleòtids. És quan tenen aquesta forma que poden unir-se a un RNA complementari, amb la qual cosa inhibeixen la traducció d’aquest últim, ja sigui per inhibició de la traducció (quan l’homologia és parcial), ja sigui per degradació de l’RNA (quan l’homologia és total) (Nelson et al., 2003). Gran part dels esforços dels genètics i biòlegs moleculars s’han centrat en la caracterització, la seqüenciació i l’estudi de nous gens, per la qual cosa s’han aconseguit globalment progressos espectaculars en aquest terreny, però el progrés en els aspectes funcionals ha estat molt més lent. L’estudi dels mecanismes de control de l’expressió gènica i de funció dels gens està adquirint, doncs, una importància creixent. En la figura 2.5 es resumeixen tots els nivells possibles de regulació de l’expressió gènica, des del pretranscripcional fins al de la funció. Si el lector necessita més informació, pot buscar-la en altres textos (Luque i Herráez, 2001; Strachan i Read, 2004).

Genètica mèdica 46

BIBLIOGRAFIA Altenburger W, Hörz W, Zachau HG. Nuclease cleavage of chromatin at 100-nucleotide pair intervals. Nature 1976; 264: 517-522. Blackburn EH. Structure and function of telomeres. Nature 1991; 350: 569-573. Burlingame RW, Love WE, Wang BC, Hamlin R, Xuong NH, Mourdrianalis N. Crystallographic structure of the octameric histone core of the nucleosome at a resolution of 3.3 Å. Science 1985; 228: 546-553. Carlson EA. Defining a gene: an evolving concept. Am J Hum Genet 1991; 49: 475-487. Cummings MR. Herencia humana. Nova York: McGraw-Hill, 1995. Darwin C. Provisional hypothesis of pangenesis. A: Darwin C. Animals and plants under domestication. Vol. 2. Nova York: Orange Judd, 1868, 428-483. De Vries H. Intrecellular pangenesis. Chicago: Open Court, 1889. Gregory SG et al., The DNA sequence and biological annotation of human chromosome 1. Nature 2006: 441, 315-321. Hewish DR, Burgoyne LA. Chromatin substructure. The digestion of chromatin DNA at regularly spaced sites by a nuclear deoxyribonuclease. Biochem Biophys Res CO 1973; 52: 504-510. Hulten DT, Dhanjal S, Pertl B. Rapid and simple prenatal diagnosi of common chromosome disorders: advantages and disadvantages of the molecular methods FISH and QF-PCR. Reproduction 2003; 126: 279-297. Korenberg RD, Thomas JO. Chromatin structure: oligomers of the histones. Science 1974; 184; 865-868. Lander ES, Linton LM, Birren B, Nusbaum C, Zody MC, Baldwin J et al. Initial sequencing and analysis of the human genome. Nature 2001; 409: 860-921. Luque J, Herráez A. Texto ilustrado de biología molecular e ingeniería genética: Conceptos. Madrid: Harcourt, 2001. Mendel G. Experiments in plant hybridization. A: Stern C, Sherwoood E. (ed.) A Mendel source book. San Francisco: WH Freeman, 1866, 3-47. Moyzis RK, Buckingham JM, Cram LS et al. A highly conserved repetitive DNA sequence TTAGGG, present at the telomeres of human chromosomes. P Natl Acad Sci USA 1988; 85: 6622-6626. Nelson P, Kiriakidou M, Sharma A, Maniataki E, Mourelatos Z. The microRNA world: small is mighty. Trends Biochem Sci. 2003; 28: 534-540. Olins AL, Olins DE. Spheroid chromatin units (v bodies). Science 1974; 183: 330-332. Oliva R, Dixon GH. Vertebrate protamine gens and the histone to protamine replacement reaction. Prog Nucl Acids Res Mol Biol 1991; 40: 25-94. Oliva R, Ballesta F, Bruguera M, Carreras E, Carrió A, Casademont J, Clària J et al. Monogràfic: Genètica bàsica. JANO 2001; 61: 719-1039. Oliva R, Lawrence SK, Wu Y, Smith CL. Human Chromosomes: Molecular Studies. A: Dulbecco R. (ed.) Encyclopedia of Human Biology. Vol. 2. San Diego: Academic Press, 1991, 475-488. Oliva R. Genoma humano. Barcelona: Masson SA, 1996. Oriola J, Oliva R. Genoma humano y estructura básica de los genes. JANO 2001; 61, 720-722. Paulson JR, Laemli UK. The structure of histone-depleted metaphase chromosomes. Cell 1977; 12: 817-828. Queralt R, Oliva R. Identification of conserved potential regulatory sequences of the protamine-encoding P1 gens from ten different mammals. Gene 1993; 133: 197-204. Queralt R, Oliva R. Demonstration of trans-acting factors binding to the promoter region of the testis-specific rat protamine P1 gene. Biochemical and Biophysical Research Communications 1995; 208: 802-812. Rieger R, Michaelis A, Green MM. Glossary of Genetics. Nova York: Springer-Verlag, 1991. Riera C. Manual de català científic. Barcelona: Claret, 1992. Schapira AHV. Mitochondrial disorders. Current Opinion in Genetics and Development 1993; 3: 457-465. Schnedl W. Banding patterns in human chromosomes. Int Rev Cytol, supl. 1974; 4: 237-273. Spencer H. Principles of Biology. Londres: impressió privada, 1864 (edició americana: Nova York, D Appleton, 1975). Strachan T, Read AP. Human Molecular Genetics 2. Nova York: BIOS, 2004. Thompson MW, McInnes RR, Willard HF. Genetics in Medicine. Saunders Company, 1991. Thompson MW, McInnes RR, Willard HF. Genética en medicina. Barcelona: Masson SA, 1996. Venter JC, Adams MD, Myers EW, Li PW, Mural RJ, Sutton GG et al. The sequence of the human genome. Science 2001; 291: 1304-1351. Wallace DC. Mitochondrial DNA mutations and neuromuscular disease. Trends Genet 1989; 5: 9-13. Watson JD, Crick FHC. Molecular structure of nucleic acids: a structure for deoxyribose nucleic acid. Nature 1953; 171: 737-738. Weiss KM. Genetic variation and human disease: Principles and evolutionary approaches. Cambridge: Cambridge University Press, 1993. Winkler. Verbreitung und ursache der parthenogenese im pflanzen-un tierreiche. Jena: Fischer, 1920. Yang DY, Oyaizy Y, Oyaizu H, Olsen GJ, Woese CR Mitochondrial origins. P Natl Acad Sci USA 1985; 82: 4443.

TEMA 22 (PRÀCTICA 2). INTERPRETACIÓ DELS RESULTATS DEL GENOTIP DE L’APOE I RELACIÓ AMB LA MALALTIA D’ALZHEIMERR. Oliva

22.1. Introducció

La malaltia d’Alzheimer, descrita per primera vegada l’any 1907 per Alois Alzheimer, es manifesta amb una pèrdua de la memòria i de les facultats intel·lectuals. Es tracta d’una neurodegeneració les principals alteracions de la qual a escala microscòpica són les plaques senils i les degeneracions neurofibril·lars. Les plaques senils són dipòsits extracel·lulars d’un pèptid amiloïdogènic (PA4) i d’apolipoproteïna E (APOE) envoltats d’acabaments nerviosos degenerats, mentre que les degeneracions neurofibril·lars són formacions intraneuronals a les neurones piramidals compostes d’una forma anormalment fosforil·lada de la proteïna citoesquelètica tau associada amb l’APOE. La persona afectada perd la memòria recent, presenta ansietat, depressió, deteriorament de la capacitat de raonar, disminució de les capacitats cognitives i desorientació, i tot això va empitjorant fins que condueix en la fase final a la mort.

Existeixen dos tipus de malaltia d’Alzheimer segons la seva forma d’aparició en les famílies: la forma esporàdica, sense cap tipus de vinculació familiar, i la forma familiar, en la qual hi ha múltiples membres afectats dins d’una mateixa família, seguint un patró d’herència autosòmic dominant. S’estima que aproximadament la meitat dels casos d’Alzheimer tenen una base genètica. També es poden distingir dos grups segons l’edat en la qual apareix la malaltia. La forma d’aparició prèvia als seixanta-cinc anys es denomina Alzheimer presenil o Alzheimer d’aparició primerenca (early-onset AD). La forma late-onset o d’aparició tardana apareix a partir dels seixanta-cinc anys. Algunes de les formes familiars de la malaltia d’Alzheimer solen ser d’inici presenil. Sovint és difícil establir una distinció clara entre les formes familiars i els casos esporàdics, a causa que existeixen altres causes de mort que competeixen amb aquesta malaltia i que, per tant, poden ocultar l’aparició de la malaltia d’Alzheimer en diferents membres d’una família.

Se sap que la malaltia d’Alzheimer pot estar causada per mutacions del gen de la proteïna amiloide (cromosoma 21), per mutacions del gen de la presenilina 1 (cromosoma 14) i per mutacions del gen de la presenilina 2 (cromosoma 1). Aquestes mutacions expliquen la malaltia en aproximadament l’1-5 % del total de malalts d’Alzheimer i es tracten en el tema 14. Més important des del punt de vista quantitatiu és el fet que la presència d’una variant al·lèlica (al·lel 4) del gen de l’APOE (cromosoma 19) és un factor de risc de desenvolupar la malaltia d’Alzheimer. Aproximadament la meitat dels malalts d’Alzheimer presenten aquest factor de risc genètic (vegeu el tema 16). Diversos estudis independents han demostrat una clara associació entre la presència de l’al·lel 4 i la probabilitat de desenvolupar la malaltia d’Alzheimer respecte a les persones que posseeixen l’al·lel normal (al·lel 3). Un individu concret pot ser homozigòtic (4/4) o heterozigòtic (4/3) per a l’al·lel 4 del gen de l’apolipoproteïna E. La probabilitat de desenvolupar la malaltia és dosidependent: dos al·lels heretats confereixen un risc molt més gran que un sol al·lel. La presència de l’al·lel 4 del gen de l’APOE explica la major part dels casos de la malaltia d’Alzheimer familiar senil, una bona part dels casos d’Alzheimer esporàdic senil i alguns casos d’Alzheimer presenil. La determinació del genotip de l’APOE en possibles malalts d’Alzheimer serveix actualment de suport diagnòstic addicional en el procés d’obtenció del diagnòstic d’Alzheimer probable.

Per a la detecció molecular del genotip de l’APOE també es parteix del DNA aïllat a partir d’una mostra de sang. Una vegada extret el DNA, es procedeix a l’amplificació de la regió específica que s’ha d’estudiar del genotip de l’APOE mitjançant la reacció en cadena de la polimerasa (PCR), amb la qual cosa s’obté un

Genètica mèdica 296

producte de 227 parells de bases. La digestió d’aquest producte mitjançant Hhal permet la discriminació dels diferents al·lels, ja que aquests difereixen entre si precisament en el fet de la presència o l’absència de llocs de tall Hhal:

productes d’amplificació per PCR al·lel

21 16 19 72 18 48 33

21 16 91 18 81

llocs de tall HhaI

234

genotip: 2/2 3/2 4/2 3/3 4/3 4/4

227

918172

48

mida

Figura 22.1. Estratègia en la determinació del genotip de l’APOE. El producte de PCRobtingut té una mida de 227 bp i és digerit amb HhaI en els llocs indicats. Els genotips possibles s’indiquen en la part inferior de l’electroforesi. Nota: no es mostren els fragments de mida inferior a 48bp, ja que no aporten informació addicional per interpretar el genotip.

La mida i la intensitat de les bandes detectades després de l’anàlisi dels fragments generats mitjançantelectroforesi i tinció amb bromur d’etidi permeten deduir directament la dotació al·lèlica de l’APOE. L’al·lel 3 és el més freqüent (77 %) en la població mundial i es caracteritza per la presència d’una cisteïnaen posició 112 en la proteïna APOE. El segueix en freqüència (16 %) l’al·lel 4. Finalment, l’al·lel més infreqüent (7 %) és el 2.

22.2. Supòsit

Es reben al laboratori d’anàlisi genètica deu mostres de sang consecutives corresponents a deu pacients amb sospita d’Alzheimer possible. Les mostres es reben juntament amb una petició de determinació del genotip de l’APOE. Es procedeix a aïllar el DNA, a amplificar per PCR una regió del gen de l’APOE i a digerir el producte d’amplificació amb HhaI. Els fragments resultants se separen per electroforesi en un gelde poliacrilamida i es visualitzen tenyint-los amb bromur d’etidi. En la figura 22.2 es mostra una fotografia del resultat obtingut.

Interpretació dels resultats del genotip de l’APOE i relació amb la malaltia d’Alzheimer 297

Alumne (nom i cognoms): .............................................................................................................

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

Figura 22.2. Resultat de l’electroforesi dels productes de digestió HhaI de part del gen de l’APOE en deu mostres consecutives.

22.3. Interpretació del resultat

22.3.1. Indiqueu quin és el genotip de l’APOE corresponent a cada pacient:

1:........, 2:........, 3:........, 4:........, 5:........, 6:........, 7:........, 8:........, 9:........, 10:........

22.3.2. Indiqueu quin/s individu/s és més probable que hagi/n desenvolupat la malaltia amb intervenció del genotip de l’APOE. Raoneu la resposta.

22.3.3. Podem dir que el genotip de l’APOE ha actuat com a causa de la malaltia en alguns dels pacients? Raoneu la resposta.

Genètica mèdica 298

22.3.4. En el supòsit que les mostres 1 a 10 haguessin correspost a controls normals (sense sospita d’Alzheimer o pèrdua de memòria) d’un estudi d’investigació:

22.3.4.1. Quins individus seria més probable que desenvolupessin la malaltia?

22.3.4.2. És possible predir exactament quins individus desenvoluparan la malaltia? Raoneu la resposta.