7/24/2019 11111 Recolección de Muestras

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Recolección de muestras

Los puntos de muestreo se determinaran en base al tamaño y la accesibilidad

al pozo de

relave minero. Las muestras líquidas fueron colectadas en frascos de plástico

deprimer uso, con capacidad de 1 litro. Se colectaran aproximadamente 5 mL

de

muestra por cada punto.

!ara cada punto de muestreo se determinará el p" de la muestra, preservadas

a una temperatura #1$% y transportadas inmediatamente al laboratorio para

su procesamiento.

La reco&ida de muestras y el aislamiento bacteriano !ara el aislamiento de

bacterias resistentes a ars'nico, muestras de a&ua residual se obtuvieron de

(ala S)a) (a*oo, !a*istán en el tornillo de tope botellas esterilizadas. +l&unos

parámetros físicoquímicos como el p", la temperatura, el oxí&eno disuelto y el

ars'nico - m& mL/ se midieron. +bout5m

0uestras de a&ua L se extendieron sobre Luria Bertani agarplates que

contienen 1 m& L de arsenito para el aislamiento de bacterias resistentes a

ars'nico -S)a*oori et al., 1/. 2espu's de la incubaci3n "of 4 a 6 $ % seobserv3 el crecimiento de bacterias.

Las colonias individuales se seleccionaron y estrías sobre medio de a&ar Luria

7ertani que contiene m& L de arsenito. 8l a&ar Luria 7ertani fue preparado

por mixin& 5 & de cloruro de sodio, 5 & de extracto de levadura, 1 & de

triptona y 16 a 19& de a&ar por 1 ml de a&ua, el p" del medio se a:ust3

entre 6, y 6,. 2espu's de mezclar 1 ml de medio era tomada en un matraz

y se cubre con tap3n de al&od3n. 8l medio se someti3 a autoclave a 15 libras

por pul&ada cuadrada de presi3n 11 $ % durante 15 min. 2espu's de 4 ) el

crecimiento de colonias bacterianas se oberved a 6 $ % de incubaci3n. Los

efectos de arsenito en crecimiento de las cepas bacterianas se comprob3 en

acetato mínima medio que contenía & L; ,5 & de extracto de levadura, , &

de sulfato de ma&nesio -0&S<4/, 5, & de acetato de sodio, sulfato f'rrico

,1 & -=eS<4/, ,1 & de cloruro de calcio -%a%l/, ,5 & de fosfato de

potasio -("!<4/ y 1. & de cloruro de amonio ->"4%l/ en 1. ml de a&ua

destilada.

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2espu's de mezclar a fondo 5 ml de medio fue tomada en eac)test tubo y en

autoclave a 11 $ %, 15 libras de presi3n por pul&ada cuadrada durante 151?

min. 2espu's de la inoculaci3n bacteriana en tubos de ensayo de medio

mínimo de acetato se mantuvieron en una incubadora a&itadora a 6 $ %

durante 4 ).

%oncentraci3n in)ibitoria mínima de cepas bacterianas

!ara la determinaci3n de la concentraci3n mínima in)ibitoria de las cepas

bacterianas 5 ml de medio mínimo de etilo se añadi3 en cada tubo de ensayo y

diferentes concentraciones de arsenito se añadieron a partir de a 6 m&

L. 8llos se inocularon y se incubaron a 6 $ % durante 4 ) en a&itaci3n

incubadora. 2ensidad 3ptica de cada aislamiento bacteriano se estim3

mediante U 8l mismo proceso se repiti3 en Luria 7ertani placas de a&ar y

observ3 el crecimiento de colonias bacterianas a diferentes concentraciones de

ars'nico. 7ásicamente en la placa de a&ar bacterias s3lo pueden acceder a los

nutrientes por deba:o, y por lo tanto s3lo son capaces de crecer)orizontalmente en se&undo lu&ar en super@cie m'todo de la placa en relaci3n

al volumen de las bacterias contra el ars'nico es muy ba:o, mientras que en el

caldo que están rodeados de nutrientes y de super@cie a volumen relaci3n

tambi'n muy alta. 2ebido a esta raz3n caldo considerado asstandard m'todo

porque la concentraci3n mínima in)ibitoria de bacterias en caldo es muy ba:o

de a&ar

Adenti@caci3n de aislados bacterianos

!ara la identi@caci3n morfol3&ica de aislamientos bacterianos diferentes

pruebas se llevaron a cabo como la tinci3n de Bram, tinci3n rápida ácido,

tinci3n endospora y la prueba de motilidad. !ara la caracterizaci3n bioquímica

de las cepas bacterianas al&unas pruebas como la catalasa, ureasa, )idratos de

carbono, la )idr3lisis de &elatina, a&ar citrato pruebas se llevaron a cabo.

+l&unas pruebas especí@cas se realizaron como prueba de 0etilCed Do&es

!ros*aure, 0ac

!rueba %on*ey a&ar, prueba de a&ar san&re, prueba el c)ocolatea&ar para la

caracterizaci3n a nivel de especie de los aislamientos bacterianos -7roEn,

9/. !ara la caracterizaci3n molecular, el +2> &en3mico se puri@c3 usando

el *it de Ben8lute. +sí, con la ayuda de la reacci3n en cadena de la polimerasa

-!%C/ del 1FS rC>+ se ampli@c3 utilizando cebadores de +C>r 1FS -G>A6=H 5I

+++%J%+++JB++JJB+%BB I, y

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G>A149CH 5I+%BBB%BBJBJBJ+% I/ -(im et al., 1/. La !%C se complet3

con un paso inicial de desnaturalizaci3n a 94 $ % durante 5 min, se&uido de 5

ciclos con la de desnaturalizaci3n a 94 $ %, recocido a 5 $ % y elon&aci3n a 6

$ % durante s, 4 s y s respectivamente. La extensi3n @nal fue dado a 6

$ % durante 1 min. 2espu's de la ampli@caci3n del producto de 1FS rC>+

mediante el uso de !%C *it -=ermentas %o, +lemania/

se compar3 con secuencias conocidas en la base de datos Ben7an* -La base

de datos Ben7an* un acceso abierto, colecci3n comentada de todas las

secuencias de nucle3tidos a disposici3n del pKblico y de sus traducciones de

proteínas/ para identi@car especies más relacionadas.