Embed Size (px)
Citation preview
22
BAB IV
METODE PENELITIAN
4.1. Fokus Penelitian
a. Mengidentifikasi kandungan metabolit sekunder yang terkandung dalam
Getah buah sawo (Achras zapota L.)
b. Menentukan aktivitas antimikroba Getah buah sawo (Achras zapota L.)
terhadap mikroba Escherichia coli, Salmonella typhi dan Candida albicans.
c. Menentukan konsentrasi efektif Getah buah sawo (Achras zapota L.)
terhadap mikroba Escherichia coli, Salmonella typhi dan Candida albicans.
d. Membandingkan potensi Getah buah sawo (Achras zapota L.) sebagai
antimikroba yang dibandingkan dengan kloramfenikol dan ketoconazole.
4.2. Bahan yang di Teliti dan Pengambilan Sampel
Bahan yang diteliti adalah Getah buah sawo (Achras zapota L.), Sampel
dikumpulkan dari tamanan sawo di Samarinda tanpa memperhatikan umur
tanaman. Getah buah sawo diperoleh dengan cara buah sawo yang masih muda
disayat dan getah buah dikumpulkan didalam wadah
4.3. Waktu dan Tempat Penelitian
Penelitian ini akan dilakukan pada bulan November 2013 dan dilaksanakan
di Laboratorium Mikrobiologi Farmasi Universitas Mulawarman Samarinda.
4.4. Variabel Penelitian dan Definisi Operasional
4.4.1 Variabel Penelitian
Variabel pada penelitian ini yaitu bobot getah, variasi konsentrasi getah
buah sawo (Achras zapota L.), golongan metabolit sekunder getah buah sawo
(Achras zapota L.), konsentrasi uji getah buah sawo (Achras zapota L.) sebagai
antimikroba dan potensi getah buah sawo (Achras zapota L.) sebagai antimikroba
yang dibandingkan dengan kloramfenikol.
Variabel bebas yang digunakan dalam penelitian ini adalah variasi
konsentrasi getah buah sawo (Achras zapota L.)
Variabel terikat dalam penelitian ini adalah golongan metabolit sekunder
getah buah sawo (Achras zapota L.), aktivitas antimikroba getah buah sawo
23
(Achras zapota L.), konsentrasi efektif getah buah sawo (Achras zapota L.)
sebagai antimikroba dan potensi getah buah sawo (Achras zapota L.) sebagai
antimikroba yang dibandingkan dengan kloramfenikol dan ketoconazole.
4.4.2 Definisi Operasional
a. Bobot getah adalah berat getah yang diperoleh dengan cara menyayat buah
sawo muda.
b. Metabolit sekunder adalah golongan senyawa mikromolekul alami yang
terdapat pada getah buah sawo (Achras zapota L.).
c. Variasi konsentrasi getah buah sawo (Achras zapota L.) adalah kadar getah
buah sawo (Achras zapota L.) yang terlarut dalam pelarutnya dengan satuan
persen (%) berat per volume (b/v) dengan berbagai variasi konsentrasi.
d. Aktivitas antimikroba adalah kemampuan getah buah sawo (Achras zapota
L.) dalam menghambat atau membunuh mikroba.
e. Konsentrasi efektif adalah konsentrasi terkecil getah buah sawo (Achras
zapota L.) yang mampu menghambat atau membunuh mikroba.
24
4.5. Peralatan dan Bahan Penelitian
4.5.1 Peralatan Penelitian
Alat-alat yang digunakan pada penelitian ini dapat dilihat pada Tabel
dibawah ini:
Tabel 4.1. Alat yang digunakan dalam penelitian
No Nama Alat Kegunaan1 Masker Untuk menghindari terhirupnya bahan berbahaya atau
debu2 Sarung tangan Pelindung tangan agar terhindar dari kontak secara
langsung dengan bahan berbahaya3 Timbangan
analitikUntuk menimbang bahan yang akan digunakan
4 Batang pengaduk Untuk mengaduk atau menghomogenkan bahan5 Gelas Kimia Wadah Larutan6 Labu ukur Untuk mengukur volume bahan cair yang ingin
digunakan7 Cawan petri Untuk wadah media pertumbuhan mikroorganisme8 Autoklaf Mensterilkan alat dan bahan
9 Laminar air flow Sebagai tempat kerja yang aseptis
10 Inkubator Sebagai tempat inkubasi bakteri11 Mikrometer skrup Untuk mengukur diameter zona hambat mikroba12 Paper disk Untuk media kontak bahan uji13 Erlenmeyer Untuk wadah medium nutrient agar (NA).14 Spoit Injeksi Mengambil Larutan15 Ose Menginokulasi Mikroba16 Tabung Reaksi Wadah Inokulasi Bakteri Uji Dan Mereaksikan
Ekstrak17 Pipet tetes Untuk mengambil sejumlah bahan cair18 Sendok tanduk Untuk mengambil sejumlah bahan
4.5.2 Bahan Penelitian
Bahan-bahan yang akan digunakan pada penelitian ini meliputi: buah sawo
muda sebagai bahan yang diteliti, biakan mikroorganisme Erscherichia coli,
Salmonella typhi dan Candida albicans, NaCl 0,9%, pelarut organik metanol dan
bahan-bahan pendukung lainnya.
25
Tabel 4.2. Bahan penelitian dan kegunaannya
No. Nama Bahan Kegunaan
1 Biakan Erscherichia coli Mikroorganisme Uji
2 Biakan Salmonella typhi Mikroorganisme Uji
3 Biakan Candida albicans Mikroorganisme Uji
4 Aquadest Pelarut
5 Larutan Fisiologis Nacl 0,9% Membuat Suspensi Bakteri
6 Medium Na (Nutrient Agar) Media Pertumbuhan Bakteri
7 Medium PDA Media Pertumbuhan Bakteri
8 Kloramfenikol Injeksi 5 mL Kontrol Positif Dalam Pengujian
9 Ketoconazole Kontrol Positif Dalam Pengujian
4.6. Rancangan Penelitian
4.6.1.Uji Identifikasi Metabolit Sekunder
Rancangan pengujian identifikasi metabolit sekunder getah buah sawo
(Achras zapota L.) dapat dilihat pada Gambar 4.1. berikut :
Gambar 4.1. Skema Identifikasi Metabolit sekunder
4.6.2. Pengujian Antimikroba
Pengujian aktivitas antimikroba getah buah sawo (Achras zapota L.)
terhadap pertumbuhan mikroba Escherichia coli, Salmonella typhi dan Candida
albicans disajikan dalam Tabel 4.3. berikut:
getah buah sawo
Reaksi Warna (+)/(-)
+ Reagen Kimia
26
Tabel 4.3. Perlakuan Variasi konsentrasi getah buah sawo (Achras zapota L.)
C1GBSU1 C1GBSU2 C1GBSU3
C2GBSU1 C2GBSU2 C2GBSU3
C3GBSU1 C3GBSU2 C3GBSU3
Keterangan :C1GBSU1 : Perlakuan konsentrasi 1 getah buah sawo ulangan 1
4.6.3. Penetuan Konsentrasi Efektif
Penentuan konsentrasi efektif antimikroba getah buah sawo (Achras
zapota L.) terhadap pertumbuhan mikroba Escherichia coli, Salmonella typhi dan
Candida disajikan dalam skema Gambar 4.2. berikut:
Gambar 4.2. Skema Penentuan Konsentrasi Efektif getah buah sawo (Achras zapota L.)
4.6.4. Pengujian Potensi Antimikroba
Pengujian potensi antimikroba getah buah sawo (Achras zapota L.)
terhadap pertumbuhan mikroba Escherichia coli, Salmonella typhi dan Candida
disajikan dalam Gambar 4.3. berikut:
+ Bakteri
Konsentrasi efektif
Statistik
Getah Buah Sawo
C1% C2% C3%
27
Gambar 4.3. Skema Penentuan Potensi Antimikroba Getah Buah Sawo
4.7. Teknik Pengumpulan Data
4.7.1.Data dan Sumber Data Penelitian
Teknik pengumpulan data dalam penelitian ini yaitu data dan sumber data
yang diperoleh dari hasil penelitian serta pelaksanaan penelitian yang meliputi
penyiapan sampel, identifikasi metabolit sekunder, penentuan konsentrasi,
konsentrasi uji sediaan, pengujian aktivitas antimikroba dan uji potensi dengan
membandingkan getah dan kloramfenikol.
4.7.2.Pelaksanaan Penelitian
a. Penyiapan Sampel Uji
Sampel dikumpulkan dari tanaman sawo di Samarinda tanpa
memperhatikan umur tanaman, Sampel yang diambil merupakan buah sawo
yang masih muda dan segar kemudian dibersihkan dan dilakukan sortasi
basah
Gambar 4.4. Bagan Prosedur Kerja Sortasi Basah
Sebanyak X gram sawo muda diambil dan diparut atau diiris sehingga
mengeluarkan getah yang kemudian ditampung dalam vial.
Skema pembuatan ekstrak dapat dilihat pada Gambar 4.5 berikut :
Buah sawo muda
Dicuci, dibersihkan
Mikroba
Getah buah sawo Kontrol Positif
Antimikroba Antimikroba
Konsentrasi (C) efektif
Statistik
28
Gambar 4.5. Skema Pembuatan Getah buah Sawo
b. Pengujian
(1) Identifikasi Metabolit Sekunder
Dalam penelitian ini, pengujian metabolit sekunder yaitu uji golongan
alkaloid, flavonoid, saponin, fenol, tanin, steroid, karotenoid, dan terpenoid. Uji
golongan alkaloid menggunakan pereaksi dragendorf (bereaksi positif jika keruh
atau endapan jingga) dan pereaksi mayer (bereaksi positif jika terbentuk endapan
putih kekuningan). Uji golongan flavonoid menggunakan logam magnesium dan
HCl, reaksi positif jika ditandai dengan larutan menjadi warna merah atau jingga.
Uji golongan fenol menggunakan FeCl3, reaksi positif ditandai dengan larutan
menjadi warna biru atau hitam. Uji golongan tanin menggunakan FeCl3 dengan
ekstrak dilarutkan dengan air dan bereaksi positif jika terbentuk endapan putih.
Uji golongan saponin menggunakan air lalu dikocok kuat dan ditambah HCl,
reaksi positif ditandai dengan terbentuknya buih stabil maka terbukti adanya
golongan saponin. Uji golongan steroid dan terpenoid menggunakan pereaksi
kloroform, asam asetat anhidrat, dan asam sulfat pekat (pereaksi Liebermann
Burchard).Terbentuknya cincin merah atau pink menandakan positif untuk
senyawa terpenoid dan terbentuknya cincin biru atau hijau menandakan positif
untuk steroid. Uji golongan karotenoid menggunakan asam sulfat pekat, reaksi
positif ditandai dengan larutan berubah menjadi biru/hijau kebiruan.
Buah sawo muda
Residu
Larutan Getah sawo muda
Disayat hingga diperoleh getah
Getah sawo
29
(a) Uji Golongan Alkaloid
Gambar 4.6. Skema Uji Golongan Alkaloid
(b) Uji Golongan Flavonoid
Gambar 4.7. Skema Uji Golongan Flavonoid
(c) Uji Golongan Fenol
Gambar 4.8. Skema Uji Golongan Fenol
2 mL ekstrak
Merah / Jingga
Biru / Hitam
2 mL ekstrak
+ logam magnesium+ 4 tetes HCl P
+ 3 tetes FeCl3
3 tetes pereaksi Dragendorf
3 tetes pereaksi Mayer
Larutan pembanding
Endapan putih kekuningan
Keruh/Endapan Jingga
2 mL ekstrak
+ 2 mL HCl 2%
30
(d) Uji Golongan Saponin
Gambar 4.9. Skema Uji Golongan Saponin
(e) Uji Golongan Tanin
Gambar 4.10. Skema Uji Golongan Tanin
(f) Uji Golongan Steroid dan terpenoid
Gambar 4.11. Skema Uji Golongan Steroid dan terpenoid
(g) Uji Golongan Karotenoid
Gambar 4.12. Skema Uji Golongan Karotenoid
Buih stabil selama 15 menit
2 mL ekstrak
Dikocok+ 10 tetes HCl 0.1 N
Biru atau Hitam
2 mL ekstrak dalam air
+ 2-3 tetes FeCl3
Cincin merah untuk terpenoid dan cincin biru
untuk steroid
2 mL ekstrak
+ 3 tetes asam asetat anhidrat+ 3 tetes kloroform+ 3 tetes asam sulfat pekat
2 mL ekstrak
Biru/ hijau kebiruan
+ 3 tetes asam sulfat pekat
31
(2) Pengujian Antimikroba
(a) Penyiapan Mikroba
Biakan mikroorganisme Erscherichia coli, Salmonella typhi dan Candida
albicans diremajakan dengan menginokulasikan 1 ose biakan murni
mikroorganisme ke dalam medium NA (Nutrient Agar) untuk bakteri dan medium
PDA (Potato Dextrosa Agar) untuk jamur, lalu diinkubasi pada suhu 37 0C selama
1 x 24 jam untuk bakteri dan pada suhu kamar untuk jamur. Kemudian
ditambahkan larutan NaCl 0,9% untuk mensuspensikan mikroorganisme. Tujuan
penggunaan NaCl 0,9% adalah untuk menyesuaikan kondisi pengujian
antimikroba dengan tekanan osmosis dalam cairan tubuh.
Skema penyiapan mikroorganisme uji dapat dilihat pada Gambar 4.10.
berikut:
Gambar 4.13. Skema Penyiapan Mikroorganisme Uji
(b) Penentuan Variasi Konsentrasi Uji
Sebanyak X gram getah buah sawo dilarutkan dengan menggunakan
aquades hingga diperoleh larutan stok pada konsentrasi C%. Kemudian dari
larutan stok tersebut dilakukan pengenceran menjadi 3 variasi konsentrasi
yang dikehendaki yaitu C1%, C2%, dan C3%.
Medium NA steril sebanyak 10 mL dituang ke dalam botol pengencer
kemudian diinokulasi suspensi mikroba dan dihomogenkan lalu dituang ke
dalam cawan petri, selanjutnya dibiarkan hingga memadat. Selanjutnya paper
disc yang telah dicelupkan ke dalam larutan uji diletakkan di atas medium
sesuai dengan pola yang telah dibuat pada masing-masing konsentrasi.
Diinkubasi pada suhu 37 0C selama 24 jam. Selanjutnya diamati zona hambat
yang terbentuk dan dilakukan pengukuran daerah hambatan dengan
Biakkan murni MO
Suspensi mikroba uji
Suspensi mikroba siap uji
Disuspensikan dengan NaCl 0,9%
32
menggunakan mikrometer. Konsentrasinya terendah di mana terjadi zona
hambat adalah harga konsentrasi minimumnya. Dari harga konsentrasi
minimum itulah yang dibuat variasi konsentrasi uji.
(c) Pengujian Potensi Antimikroba Getah Buah Sawo
Disiapkan alat dan bahan yang akan digunakan. Dibuat pengenceran
getah buah sawo dengan 3 variasi konsentrasi. Di inokulasi suspensi mikroba
uji pada medium NA di dalam botol pengencer dan dihomogenkan.
Selanjutnya medium yang telah diinokulasi tersebut dimasukkan ke dalam
cawan petri steril dengan cara aseptis. Dicelupkan paper disc ke dalam
masing-masing variasi konsentrasi ekstrak dan antibiotik pembanding.
Setelah media setengah memadat diatas permukaannya diletakkan paper disc
dengan teratur, lalu diinkubasi didalam inkubator selama 24 jam pada suhu
37oC. Diamati zona hambat yang terbentuk dan diukur dengan menggunakan
mikrometer skrup. Selanjutnya dibandingkan hasil daya hambat yang
terbentuk antara sampel dan antibiotik pembanding. Skema pengujian potensi
antimikroba getah buah sawo dapat dilihat pada Gambar 4.11 berikut.
Gambar 4.14. Pengujian Potensi Antimikroba getah buah sawo
Getah Buah Sawo
C1% C3%C2%
Antibiotik Pembanding
A3%A2%A1%
Medium NA / PDA ditambahkan Mikroba Uji
Zona Hambat / Bening
Potensi Antimikroba
Diinkubasi pada suhu 37oC selama 24 jam
untuk bakteri dan suhu kamar untuk jamur
Analisis data
33
4.8.Teknik Analisis Data
Data penelitian ini berdasarkan tujuan penelitian antara lain rendemen
ekstrak, aktivitas antimikroba, dan konsentrasi efektif antimikroba getah buah
sawo
4.8.1.Analisis Data Metabolit Sekunder
Fokus kedua, yakni mengetahui golongan metabolit sekunder apa saja yang
terdapat di dalam getah buah sawo.
Tabel 4.4. Golongan Metabolit Sekunder Getah Buah Sawo
Metabolit Sekunder Getah Buah Sawo
Alkaloid +/-
Flavonoid +/-
Tanin +/-
Saponin +/-
Senyawa Fenol +/-
Karatenoid +/-
Steroid dan Triterpenoid +/-
Keterangan :
Data berupa data kualitatif (-) dan (+), dimana:
(-) : Tidak terdapat atau tidak terdeteksi metabolit sekunder
(+) : Terdapat atau terdeteksi metabolit sekunder
4.8.2. Aktivitas Antimikroba
Data aktivitas antimikroba diperoleh dengan cara mengamati ada atau
tidaknya zona hambat atau bunuh terhadap pertumbuhan mikroba dengan besar
konsentrasi zona hambat atau bunuh dari variasi konsentrasi getah buah sawo
dengan menggunakan kontrol negatif.
34
Tabel 4.5. Data Aktivitas Antimikroba
Mikroba Uji KonsentrasiDiameter Zona Bening (mm)
Getah Sawo Kontrol Negatif
Escherichia coli
Salmonella typhi
Candida albicans
4.8.3.Konsentrasi Terbaik Getah Buah Sawo
Untuk melihat konsentrasi efektif getah buah sawo sebagai antimikroba
terhadap mikroba uji dapat diketahui dari data diameter zona hambat pertumbuhan
bakteri uji dengan menggunakan uji anava satu arah. Anava dapat dilihat pada
Tabel 4.6. berikut :
Tabel 4.6. Rumus-rumus Anava Satu Arah
Sumber
variansiDb JK KT F hitung
Ftabel Keterangan
5% 1%
Perlakuan
Galat
Total
35
Keterangan:
Db = Deraja tBebas
KT = Kuadrat Tengah
JK = Jumlah Kuadrat
PerhitunganAnava
a. Menghitung FK2
FK =
b. Menghitung JK total
JKtotal = T(Yij2) – FK
c. Menghitung JK Perlakuan
JKperlakuan =
d. Menghitung JK galat
JKgalat = JKtotal – JKperlakuan
e. Menghitung Derajat Bebas
1. Dbtotal = (r.t) – 1
2. Dbperlakuan = t – 1
3. Dbgalat = Db total – Dbperlakuan
f. Menghitung Kuadrat Tengah (KT)
KT = masing-masing JK dibagi dengan Dbnya.
g. Menghitung Harga F Hitung yaitu dengan cara membagi KT perlakuan
dengan KT galat
Bila F Hitung> F Tabel 5% , 1% = Sangat Signifikan
Bila F Hitung< F Tabel 1% > 5% = Signifikan
Bila F Hitung ≤ F Tabel 5% , 1% = Non Signifikan
36
4.8.4.Potensi Antimikroba
Untuk membandingkan potensi antibakteri Getah buah sawo dengan
antibotik baku digunakan uji-t. Hasil uji-t dapat dilihat pada Tabel 4.7 berikut:
Tabel 4.7. Tabel uji-t
Pasangan SubjekX1 X2 (X1-µ1) (X2-µ2) (X1-µ1)2 (X2-µ2)2
K E
Total
Keterangan:K = kelompok kontrolE = kelompok ujiB = Perbedaan dari K dan EN = Jumlah subjekµ1 = Mean dari kelompok kontrolµ2 = Mean dari kelompok uji
Keterangan:
= Rata-rata hasil tes akhir kelompok A
= Rata-rata hasil tes akhir kelompok B
SdA = Standar deviasi untuk kelompok ASdB = Standar deviasi untuk kelompok Bn = Jumlah sampel
37
4.9. Hasil-Hasil Penelitian Yang Diharapkan
Hasil-hasil penelitian yang diharapkan antara lain:
a. Adanya golongan metabolit sekunder yang terdeteksi didalam Getah buah
sawo (Achras zapota L.)
b. Getah buah sawo (Achras zapota L.) memiliki aktivitas sebagai antibakteri.
c. Adanya konsentrasi terbaik dari Getah buah sawo (Achras zapota L.) dalam
menghambat atau mebunuh bakteri uji.
d. Adanya potensi antimikroba Getah buah sawo (Achras zapota L.) yang
cukup kuat atau tinggi dibandingkan dengan kloramfenikol (kontrol positif).
