12-Paper 9- 96A242 Farajollahi et al-2

مجله بيوتكنولوژي كشاورزي

ISCپژوهشي و -علمي

هاي اسيد ساليسيليك و تيمار شده با هورمون زايي در گياه توتونبيان چند ژن مرتبط با بيماري القاي

Pseudomonas syringae pv. tabaciدنبال آلودگي با باكتري ه جاسمونيك اسيد ب

3حشمت االله رحيميان، 2 زادولي االله بابايي، ∗∗∗∗1فريده فرج اللهي ، ساري، ايران.كارشناسي ارشد بيماري شناسي گياهي دانشگاه علوم كشاورزي و منابع طبيعي ساري1 ، ساري، ايران.دانشيار گروه گياهپزشكي دانشگاه علوم كشاورزي و منابع طبيعي ساري2

، ساري، ايران.منابع طبيعي سارياستاد گروه گياهپزشكي دانشگاه علوم كشاورزي و 3

26/04/1396، تاريخ پذيرش: 11/02/1396تاريخ دريافت:

چكيده

عاملات ت، امروزه به طور چشمگيري در تحقيقات مولكولي با هدف درك مباني ياهي مدلگتوتون به عنوان

به وجهيت قابل و خسارتگسترش جهاني دارد توتون آتشك باكتريايي بيماريشود. و گياه استفاده مير بيمارگ

مرتبط هايژن باشد. القايمي Pseudomonas syringae pv. tabaci (Pst)عامل اين بيماري .كندمي وارد توتون

شواهد اشد.ب مؤثر بيماري شدت كاهش در تواندمي كنندمي نقش ايفاي هابيماري به مقاومت در كه زاييبيماري با

هاي تابوليتمده و موجب افزايش توليد در گياهان مؤثر بو هاژن اين گياهي در بيانهاي دهد كه هورموننشان مي

هاي مرتبط با مكانيسم دفاعي سازي رونويسي ژنيستم دفاعي گياه را از طريق فعالگردند. علاوه بر اين سثانويه مي

، PR1 ،PR5 ،PAL هايان ژنگردند. در اين تحقيق، بيالقايي مي تحريك نموده و باعث تنظيم مقاومت را گياه

Catlase وWRKY12 مولار و اسيد ميلي 3ن اسيد ساليسيليك با غلظت در گياه توتون تيمار شده با هورمو

Pseudomonas syrigae pv. tabaciباكتري آلودگي بامولار و گياه شاهد، پس از ميلي 5/0جاسمونيك با غلظت

رفت. گمورد بررسي قرار Quantitative Real time PCR (QRT-PCR) تكنيكبا استفاده از زماني بازهچند در

بيان اين در قابل توجه اسيد ساليسيليك باعث تغييراتاسيد جاسمونيك و به خصوص نتايج نشان داد كه تيمار

ها پس از تزريق باكتري شده است.ژن .هاي مقاومت، ژنQRT-PCR، اسيد ساليسيليك، اسيد جاسمونيك، توتون آتشك: هاي كليديواژه

mail: [email protected] 09111188742تلفن: نويسنده مسئول: فريده فرج اللهي ∗

)1396، زمستان 4، شماره 9مجله بيوتكنولوژي كشاورزي (دوره

١٣٠ Journal of Agricultural Biotechnology; Printing ISSN: 2228-6705, Electronic ISSN: 2228-6500

مقدمه

ها، از ايعالي گلدار، از راسته دو لپه گياه توتون

Nicotianaو با نام علمي Solonaceaeخانواده

tabacum در چند دهه اخير به توتونگياه باشد. مي

اف مهندسي ژنتيك تبديل يك سيستم مدل براي اهد

به عنوان ابزاري براي امروزه گياه توتون. شده است

ي گياهي مبدل بدست آوردن دانش بنيادي در بيولوژ

مولكولي گياهي علم هايپيشرفت شده است. با

توتون به عنوان يك كارخانه گياهي براي اهدافي

هاي آنزيمتركيب، هاي نوليد پروتئينچون سيستم تو

استها توسعه يافته باديصنعتي و آنتي

)Ganapathi et al., 2004.(

بيماري آتشك توتون گسترش جهاني دارد.

Pseudomonas syringae pv. tabaciبيمارگر

ند. آتشك هم كبرتوتون، سويا را هم آلوده مي هعلاو

زند. در خزانه و هم در مزرعه خسارت مي

هاي آلوده ممكن است بميرند. در بوته هايگياهچه

مرده روي و نامنظم هاي بزرگ،توتون در مزرعه، لكه

ريزند هاي آلوده ميها و برگشود؛ لكهبرگ ظاهر مي

ارزش حصول را از نظر تجاري بيكه اين پديده م

.)Agrios, 2005( كندمي

به بيماري جزء مهمي از استراتژي مقاومت

باشد كه كاربرد مواد شيميايي رامدرن مي كشاورزي

گردد. كاهش داده و سبب ايجاد كشاورزي سالم مي

ز گياهان توسط مكانيسم ساختاري و مقاومت القايي ا

Sticher et( كننددفاع مي هاخود در برابر بيمارگر

al., 1997; Heil and Bostock, 2002.( استفاده از

هاي كارآمد جهت مهندسي ژنتيك يكي از روش

Lillemo( باشدها ميمقاوم به بيمارگر انتوليد گياه

et al., 2008; He et al., 2009(.

هاي هاي مقاومت به خصوص ژندر اين ميان ژن

) PRs( زاييهاي مرتبط با بيماريه پروتئينكنندسنتز

توان اند كه ميبيشترين توجه را به خود جلب كرده

اهان تراريخت مقاوم به عوامل ها در توليد گياز آن

;Kogel and Langen, 2005( زا استفاده كردتنش

Van Loon and Pieterse, 2006.( هاي پروتئينPR

موجب تخريب ها،توليد شده توسط اين دسته از ژن

هاي سلول قارچي، ايجاد اختلال درغشاهاي ديواره

خ دفاعي ميزبان، سلولي آن، تقويت سيستم پاس

هاي ضد ايي و سنتز پروتئينزدخالت در بيماري

بيان اين ).Dahleen et al., 2001( شوندقارچي مي

به ي مختلفهاها در گياه در برابر بيمارگرپروتئين

,.Thomma et al( شودصورت اختصاصي انجام مي

1998(.

از مهمترين آنها PR1ها، پروتئين PRدر ميان

Van( باشدهاي مختلف ميدر مقاومت به بيمارگر

Loon and Pieterse, 2006 اگرچه عملكرد .(

بيوشيميايي خاصي براي آن در نظر گرفته نشده اما

نقش ضد ميكروبي آن توسط محققين گزارش شده

). Rauscher et al., 1999; Sels et al., 2008( است

و احتمالا در است موثر غشا روي بر پروتئين اين

1396فرج اللهي و همكاران،

١٣١ Journal of Agricultural Biotechnology; Printing ISSN: 2228-6705, Electronic ISSN: 2228-6500

ضخيم شدن ديواره سلولي و جلوگيري از گسترش

بيمارگر در آپوپلاست نقش دارند. مشخص شده كه

ي سيستم توتون به واسطه PR1هاي ژن

و يا اتيلن SA ،JAهاي رساني وابسته به مسيرسيگنال

شود. مسيرهاي وابسته به جاسمونيك اسيد و القا مي

بعضي از هاي وابسته به اتيلن در القاي بيانيا مسير

حالي كه مسير نقش دارند. در، بازي PR1 هايژن

اسيدي موثر PR1هاي در القاي ژن SAوابسته به

).Vidhyasekaran, 2002( باشدمي

به دليل PR5هاي متعلق به خانواده پروتئين

ها با پروتئين گياهي تائوماتين تشابهات توالي آن

)Thaumatin( هاي شبه تائوماتين به پروتئين

)TL(Thaumatin-like معروف هستند )Moralejo

et al.,1999 .(هاي گروه پروتئينPR5 از تاكنون

گياهان بسياري و برنج، گندم سيس،پدوآرابيتوتون،

اين تجمع ).Vigers et al., 1991( اندديگر جدا شده

هاي در گياهان در واكنش به موقعيت هاپروتئين

ها يا حمله زخم هاي نمك بالا،زا مانند غلطتاسترس

ها، . اين پروتئينديده شده است بيمارگرها

دهدپذيري غشاي سلولي بيمارگر را تغيير مينفوذ

)Kitajima and Sato, 1999(هاي بازي . فرم

باشند. اسموتين شبيه اسموتين مي PR5هاي پروتئين

تنش شوري در يك پروتئين القايي است كه در اثر

هاي بازي را فرم تون رديابي شده است. بنابراينتو

خنثي در PR5هاي خوانند. پروتئيناسموتين مي

گياهان سالم وجود ندارد ولي به وسيله اتيلن القا

.)Vidhyasekaran, 2002( شوندمي

مبني بر دخالت مشتقات به گزارشاتي با توجه

مواجهه با انواع مسير بيوشيميايي فنيل پروپانوئيد در

Campbell and( هاي زيستي و غير زيستيتنش

Elis, 1992; Xu et al., 2012توان به بررسي ي) م

از جمله فنيل آلانين هاي اين مسيرآنزيمتغييرات

از طريق PAL) اشاره كرد. ژن PAL( آمونيالياز

ها و هاي سنتز فنيل پروپانوئيدمسير دخالت در

فعاليت فيتوآلكسيني دارند در ها كهايزوفلاونوئيد

كند. اين ژن مهمي ايفا ميمقاومت گياه نقش بسيار

در مسير بيوسنتز اسيد ساليسيليك و ديگر تركيبات

دهي وابسته دفاعي دخيل بوده و يك تركيب سيگنال

هاي وابسته دفاعي، كاتاليز سازي ژنكليدي براي فعال

,.Stotz et al( هاي رونويسي استفاكتورها و كننده

2009 .(

ازجمله ذاتي، دهيسيگنال مسيرهاي تغييرات

SAR و ISR، از تعداديباعث فعال شدن دتوانمي

ژن از زيادي تعداد بيان افزايش ورونويسي عوامل

مسيرهاي سازي كلفعال اصلي اشكال شود.ي دفاع

بالقوه عملكرد و كاهش تناسب هزينه دهي،سيگنال

هاژن از زيادي تعداد ساختاري بيان با ارتباط در

هايي كه بخشي از مسير را فعال بنابراين، ژن است.

آل هاي ايدهكنند، نامزدمسير را تقويت ميكنند يا مي

شامل، ژنتيك مهندسي براي ژن نامزد بالقوه هستند.

و WRKY ،ERF1 مانند رونويسي فاكتورهاي

NPR1 باشد.مي

مهمترين گروهنماينده WRKYخانواده ژني

Zhang and( عوامل تنظيم كننده رونويسي است


١٣٢ Journal of Agricultural Biotechnology; Printing ISSN: 2228-6705, Electronic ISSN: 2228-6500

Wang, 2005(هاي رونويسي به . باند شدن فاكتور

DNA هاي سازي ژنبراي فعالPR مهم است )Van

Loon and Pieterse , 2006(نوع ژن . يكصد

WRKY ژن در برنج شناسايي شده است. بيان

WRKY12 در برنج در اثر باكتريXoo موجب

آمونيالياز فنيل آلانين، NPR1 ،PR1bافزايش بيان

)PAL( پراكسيداز و )pox (افزايش بيان شود. مي

WRKY70 به مقاومتباعث آرابيدوپسيس در

و Pseudomonas syringe هايباكتري

Pectobacterium carotovora شودمي )Li et al.,

2004; Li et al., 2006( كه شد . پيشنهادWRKY

يگنالي سيك تنظيم كننده رونويسي در آبشارهاي

,Song and Goodman( است SAو JAوابسته به

در توتون موجب WRKYنتيجه بيان ژن .)2001

ريزي شده سلولي و افزايش سطح پاسخ مرگ برنامه

HR شودمي )Oh et al., 2008 پيشنهاد شده است .(

در توتون WRKY12سازي رونويسي فاكتور فعال كه

تورواي در پرومبا متصل شدن به توالي حفاظت شده

)،WK-boxes )TTTTCCACبه نام PR1ژن

,.Verk et alشود(مي PR1بياني ژن موجب بيش

2010.(

هاي ها و ساختماناسيد ساليسيليك در برگ

.)Raskin, 1992( زايشي گياه يافت شده است

است داخليساليسيليك اسيد يك مولكول سيگنال

كه در گياهان وجود دارد و پس از آلودگي به وسيله

. كندها، به طور سيستميك تجمع پيدا ميبيمارگر

پروتئين متصل به ساليسيليك اسيد در گياهان رديابي

است. كاتالاز و مشخص شده است كه يك كاتالاز

) را متوقف كرده و 2O2H( فعاليت آب اكسيژنه

ن فعاليت كاتالاز جلوگيري از ايساليسيليك اسيد هم

به واسطه مهار در گياه، 2O2Hند. افزايش سطوح كمي

هاي دفاعي هاي كاتالاز، در فعال شدن واكنشآنزيم

). اسيد Vidhyasekaran, 2002( نقش دارد

القاي ساليسيليك سيستم دفاعي گياه را از طريق

و هاي مرتبط با دفاع رونويسي گروه مشخصي از ژن

كند. مطالعات مقاومت سيستميك تحريك ميتوسعه

بعد از هاپروتئين PR برخينشان داد كه ميزان بيان

ها با ساليسيليك اسيد افزايش يافته تيمار گياهچه

).Yang et al., 2013( است

ديگري از ها و استرمتيل آنها گروهسموناتجا

مشتقات اسيد تنظيم كنندگان رشد گياهان، و از

ر شوند كه از طريق مسيلينولينيك محسوب مي

,Schaller( شوندسنتز ميبيوسنتزي اكتادكانوئيد

خاطر فعاليت ها به جاسمونات ). در آغاز2001

ولي ندمورد توجه قرار گرفت بازدارندگي رشدي

كه اين تركيبات در بيشتر مشخص شدهامروزه

آنها درافزايش هاي گياهي وجود داشته و تأثيرگونه

واكنش به در هنگام هاي خاص گياهيميزان بيان ژن

,.Yu et al( مورد توجه قرار گرفته است ايجاد زخم

رسان مها به عنوان تركيبات پيا). جاسمونات2002

هاي د القا كه منجر به تجمع متابوليتكليدي در فرآين


١٣٣ Journal of Agricultural Biotechnology; Printing ISSN: 2228-6705, Electronic ISSN: 2228-6500

Schmidt and( اندشود معرفي شدهثانويه مي

Delaney, 2010.(

ندكي در زمينه استفاده از مطالعات ا

هاي اي گياهي به منظور القاي بيان ژنههورمون

ايجاد مقاومت در گياه زايي ومرتبط با بيماري

صورت گرفته است. بنابراين هدف از اين پژوهش،

، PR1 ،PR5 ،PAL هايارزيابي ميزان بيان ژن

Catalase وWRKY12 در سطحRNA تحت تيمار

در دو هورمون ساليسيليك اسيد و جاسمونيك اسيد

گياه توتون است تا از اين طريق درك بهتر مسير القا

و عكس العمل گياه توتون امكان پذير گردد.

هامواد و روش

Pseudomonas syringaeتهيه وكشت باكتري

pv. tabaci

شگاه علوم ندر دا 1394اين مطالعه در سال

ر اين د اري انجام شد.منابع طبيعي س كشاورزي و

Pseudomonasبررسي از سويه استاندارد باكتري

syringae pv. tabaci هايباكتري كلكسيوناز

) GCPB( آلمان گوتينگن دانشگاه گياهي زايبيماري

و شماره ثبت GCPB113با شماره كاتالوگ

دانشگاهدكتر خدايگان، اهدايي آقاي 460134043

در محيط Pst باكتري .استفاده شد رفسنجانوليعصر

به مدت يك ماه در king Bكشت جامد اختصاصي

باشد.قابل نگهداري مي C27oدماي

زاييآزمون بيماري

10در محلول Pst ساعته باكتري 24كشت ز ا

810با غلظت سوسپانسيوني ₂Mgclميلي مولار

20ليتر تهيه گرديد. حدود هر ميلي ) درCFU( سلول

به وسيله سرنگ اين سوسپانسيونميكروليتر از

هاي توتون برگي برگبه فضاي ميانمخصوص

نيز براي 2MgClمولار ميلي 10محلول تزريق شد. از

Klement et( استفاده شدتزريق در گياهان شاهد

al., 1990(ناسب مين رطوبت و دماي م. جهت تأ

گياه، پس از قرار دادن پوشش براي فعاليت باكتري در

Plant Growth( ها در اتاقك رشدنمونه، پلاستيكي

Chamberگراد، رطوبت سانتيجه در 25ي ) در دما

8روشنايي و ساعت 16درصد و شرايط نوري 75

هاي آبسوخته قرار داده شد. ظهور لكه تاريكي ساعت

نشانه مثبت بودن آزمون روز 4-3ها بعد از در برگ

زايي تلقي شد.بيماريي

تهيه گياهچه

از انستيتو تحقيقات K326رقم هاي توتون نشا

هاي نشاتيرتاش بهشهر دريافت شد. -توتون ايران

و انتخاب برگ 5-4 ومتر سانتي 7-5 ارتفاع داراي

شده منتقل شد. هاي حاوي خاك اتوكلاو به گلدان

جه در 27تحت شرايط دمايي اتاقك رشد ها در گلدان

16درصد و شرايط نوري 70گراد، رطوبت سانتي

ساعت تاريكي قرار گرفتند. 8يي و ساعت روشنا

محلول اسيد جاسمونيك ها باگياهچهتعدادي از

جهت حل نمودن اسپري شدند. mM 5/0با غلظت


١٣۴ Journal of Agricultural Biotechnology; Printing ISSN: 2228-6705, Electronic ISSN: 2228-6500

(چهار درصد اسيد جاسمونيك ابتدا آن را با اتانول

با آب مقطر به حجم حجمي) حل نموده سپس

. )Traw and Bergelson, 2003( رسانيده شد

محلول اسيد ساليسيليك با همچنين تعدادي گياهچه

تيمار شدند. جهت حل نمودن اسيد mM 3با غلظت

(ده درصد حجمي) ساليسيليك ابتدا آن را با اتانول

حل نموده و سپس با آب مقطر به حجم رسانيده شد

)Muchembled et al., 2006(هاي تيمار . گياهچه

و روز 7به مدت شده با جاسمونيك اسيد

به مدت هاي تيمار شده با ساليسيليك اسيد گياهچه

ير پوشش پلاستيكي در ژرميناتور نگهداري روز ز 2

تعدادي گياهچه هم به عنوان شاهد در نظر گرفته .شد

شد.

سوسپانسيوني Pst باكتري هساعت 24كشت از

تهيه ₂Mgclميلي مولار 10در محلول cfu/ml710با

پس اين غلطتبا Pstشد. جذب نوري سوسپانسيون

تومتر از غلظت سنجي با استفاده از دستگاه اسپكتروف

01/0بايست در حدود نانومتر مي 600با طول موج

ميكروليتر از 20زني، حدود باشد. براي مايه 02/0تا

مخصوص به ه وسيله سرنگ سوسپانسيون حاصله ب

هر گياه تزريق برگي جوانترين دو برگفضاي ميان

هاي اصليما بين رگبرگشد. در هر برگ، يك نقطه

جهت فراهم آوردن . براي تزريق در نظر گرفته شد

شرايط مناسب براي فعاليت باكتري در نسوج گياه،

، ددرص 80براي بالا بردن سطح رطوبت تا مرز

و در اتاقك رشد انده گياهان با پوشش پلاستيكي پوش

16گراد و دوره نوري درجه سانتي 25ي در دما

تاريكي قرار گرفتند. ساعت 8و ساعت روشنايي

زني برداشته از مايهساعت پس 12پلاستيكي پوشش

هاي تيمار برداري از بافت برگي گياهچه. نمونهشد

72 و 48، 24 ،12، 0در فاصله زماني شده و شاهد

در فريزر با دماي انجام گرفت وپس از آلودگي

C70o- شدند. نگهداري

هاژنومي از نمونه DNAو زدودن RNAاستخراج

ــتخراج هاي نگهداري از نمونه RNA براي اسـ

ــده در فريزر ــركت TRIZOLاز بافر -C70o ش (ش

Invitrogen (زدودن منظور به .شــد اســتفاده DNA

-RQ1 RNase كيت از ،RNA هاي نمونه از ژنومي

free DNase ت شرك ساختFermentas ستفاده ا

ستفاده از ژل آگارز RNAكميت و كيفيت . شد ، با ا

.و اسپكتوفتومتر ارزيابي گرديد

cDNAساخت و بررسي كيفيت

AccuPowerRبا استفاده از cDNAسنتز

CycleScript RT PreMix (dN6) kit .انجام شد

گرادانتيس درجه -20ر د استفاده زمان تاها نمونه

هاي جهت بررسي كيفيت نمونه شد. نگهداري

cDNA شده از سنتزPCR صيبا آغازگر اختصا

Actin .استفاده گرديد


١٣۵ Journal of Agricultural Biotechnology; Printing ISSN: 2228-6705, Electronic ISSN: 2228-6500

ها به كمك روش بررسي ميزان بيان ژنQuantitative Real- time PCR

Quantitative real- timeبيان ژن با تكنيك

PCR انجام شد. براي اين منظور از دستگاهApplied

Biosystems® StepOnePlus™ Real-Time

PCR .واكنش از كيت در اين استفاده شدMaxima

SYBR Green/ROX qPCR Master Mix (2X) استفاده شد. Thermoشركت

ــازگر ــان ژن ازآغـ ــي بيـ ــور بررسـ ــه منظـ بـ

ــتي ژن ــرو و برگشـ ــي پيشـ ــه Actinاختصاصـ بـ

ــي ــرل داخلــ ــوان كنتــ ) و Housekeeping( عنــ

، PR1همچنــين آغــازگر پيشــرو و برگشــتي ژن

PR5 ،PAL ،Catalase وWRKY12 بــــــــــراي

اســــتفاده شــــد RT-PCRدر cDNAتكثيــــر

)Schmidt and Delaney, 2010.(

ميكروليتــر 15در حجــم نهــايي PCRهــر واكــنش

ــر ــك ميكروليتــ ــاوي يــ ــو، cDNAحــ 8الگــ

ــايبرگرين، ــوط س ــر مخل ــر از 1ميكروليت ميكروليت

ميكروليتــــر آب عــــاري از 4هــــر آغــــازگر و

Nuclease ــره ــام گرفـــت. واكـــنش زنجيـ اي انجـ

دمــاي بــا پليمــراز شــامل مرحلــه واسرشــت اوليــه

دقيقـه، سـپس 10درجه سانتي گراد بـه مـدت 95

راد بـه گ ـدرجـه سـانتي 95دمـاي چرخه شامل 40

ه گــراد بــدرجــه ســانتي 60دمــاي ،ثانيــه 15مــدت

ــراي اتصــال آغــارگردقي 1مــدت ســپس هــا،قــه ب

درجـــه 95منحنـــي ذوب بـــا دمـــاي رســـم

درجـــه 60ثانيـــه، 15بـــه مـــدت گـــرادســـانتي

1قيقـه و افـزايش دمـاي د 1گـراد بـه مـدت سانتي

ــاي درجــه ســانتي ــا دم 95گــراد در هــر چرخــه ت

ــداردرجــه ســانتي ــه گــراد و نگه ــا ب ــن دم ي در اي

ــدت ــام 15م ــه انج ــدار تكثيــر در ثاتي ــد. مق ش

گيــري تهــاي هــر چرخــه توســط دســتگاه انــدازهان

هــاي مــورد شــد. ســپس تغييــرات نســبي بيــان ژن

ــ ــد. بررس ــاليزه ش ــين نرم ــه ژن اكت ــبت ب در ي نس

محاسبه و تغييـرات بيـان ژن نيـز مطـابق بـا نهايت

Livak and( گيـري شـد انـدازه 2 –)∆∆CT(فرمـول

Schmittgen, 2001.(

)TC∆ كنترلنمونه-TC∆ نمونه آزمايش( =TC∆∆

)TC دار ژن خانه- TC ژن هدف( =TC∆

نتايج و بحث

در اين تحقيق الگوي بيان چند ژن در گياه

باكتري به بازه زماني پس از آلودگي 5توتون، در طي

Pst در سه تيمار ساليسيليك اسيد، جاسمونيك اسيد

Real timeو شاهد مورد بررسي قرار گرفت. نتايج

PCR يهاژنبيان سطح تأييد كرد كه PR1 ،PR5 ،

PAL وWRKY12 ،در هر سه تيمار ساليسيليك اسيد

و افزايش عد از آلودگي جاسمونيك اسيد و شاهد ب

بررسي پيدا كرد. كاهش Catalaseسطح بيان ژن

دهد كه سطح روند تغييرات بيان اين ژن نشان مي

هاي مختلف پس از آلودگي در زمان هاتظاهر اين ژن

شاهد ميزان در گياه باشد.سه تيمار متفاوت مياين در

از گي باكترياييدر پاسخ به آلود PR1bبيان ژن

زني افزايش اندكي داشت و تا پس از مايه 12ساعت

ساعت پس از آلودگي نيز اين افزايش بيان ادامه 48


١٣۶ Journal of Agricultural Biotechnology; Printing ISSN: 2228-6705, Electronic ISSN: 2228-6500

1/14حدود . نرخ بيان اين ژن در زمان اوجداشت

نرخ زمان صفر افزايش داشت. سپس برابر نسبت به

زني به كمترين ميزان بيان پس از مايه ساعت 72 نبيا

ر گياهان تيمار شده با هورمون د خود رسيد.

ن در پاسخ به يليك اسيد ميزان بيان اين ژساليس

زني جهش ز مايهساعت پس ا 12 آلودگي باكتريايي

برابر افزايش نسبت به 1/65( قابل توجهي داشت

ساعت 48زمان صفر). پس از آن نيز بيان اين ژن تا

پس از آلودگي به افزايش خود ادامه داد و بيشينه بيان

39/95 ( شدز در همين ساعت مشاهده اين ژن ني

برابر افزايش نسبت به زمان صفر). نرخ بيان اين ژن

پس 72پس از زمان اوج كاهش يافت و در ساعت

زني به كمترين ميزان بيان خود يعني در حدود از مايه

برابر بيشتر از بيان اين ژن در زمان صفر رسيده 3/20

است.

در گياهان تيمار شده با جاسمونيك اسيد نيز ميزان

ساعت 12 ژن در پاسخ به آلودگي باكترياييان اين بي

ش كرد و بيان آن نيز زني شروع به افزايپس از مايه

د ادامه داد ساعت پس از آلودگي به افزايش خو 48تا

نيز در همين ساعت مشاهده شد و بيشينه بيان

برابر افزايش نسبت به زمان صفر). نرخ 9/28حدود (

ج كاهش يافت و در بيان اين ژن پس از زمان او

زني به كمترين ميزان بيان خود پس از مايه 72ساعت

يان اين ژن در برابر بيشتر از ب 2/3يعني در حدود

. نرخ بيان اين ژن در گياهان تيمار زمان صفر رسيد

48شده با جاسمونيك اسيد در زمان اوج بيان (

برابر بيشتر از بيان اين 6/1ساعت پس از مايه زني)

باشدميدر گياهان شاهد در بازه زماني فوق ژن

).1(شكل

هاي در گياه شاهد، تيمار شده با ساليسيليك اسيد و جاسمونيك اسيد در زمان PR1bالگوي بيان ژن -1شكل

.Pstمختلف پس از آلودگي با باكتري Figure 1- PR1b pattern of gene expression in control plants, treated with salicylic acid,

jasmonic acid in various times after infection with Pst.

0

20

40

60

80

٠ ١٢ ٢۴ ۴٨ ن٧٢ياح بطس

Exp

ress

ion l

evel

ساعت پس از آلودگي

Hours of infection

PR1

Controlکنترل

Salicylic acidساليسيليک اسيد

Jasmonic acidجاسمونيک اسيد


١٣٧ Journal of Agricultural Biotechnology; Printing ISSN: 2228-6705, Electronic ISSN: 2228-6500

هاي مختلف گياهي مثل در بافت PR1 پروتئين

ها وجود ديواره سلولي، دستجات آوندي و واكوئل

,.Hoegen et al., 2002; Grunwald et al( ددار

2003 .(PR1 مقاومت ها، به عنوان شاخصي براي

شدندشناخته ) SAR( القايي سيستميك

)Schulthesis et al., 2003.( نقش ژن PR1 در دفاع

به خوبي ثابت شده است Pstتوتون عليه باكتري

)Block et al., 2005(. بيان ژن اين بررسيدرPR1b

ساعت 12( اوليه پس از آلودگي هايتدر همان ساع

آناليز شيره طبقكه افزايش يافت، از آلودگي) پس

استخراج شده از آوند آبكش ناحيه دمبرگ گياهان

مشخص شد كوبي شده با سوسپانسيون باكتري، مايه

12كه اولين افزايش تجمع اسيد ساليسيليك در

گيردساعت پس از تلقيح باكتري صورت مي

)Rasmussen et al., 1991( اين افزايش بيان در هر .

ادامه يافت. بالا بودن بيان ژن 48سه تيمار تا زمان

PR1b م در گياهان تيمار هم در گياهان شاهد و ه

سيليك اسيد و جاسمونيك هاي ساليشده با هورمون

Pstدهنده القاي اين ژن در تعامل باكتري اسيد نشان

ساعت 72 هاي اين ژننسخهتجمع .استبا توتون

سير نزولي را طي در هر سه تيمار زني پس از مايه

كم شدن تحريك باكتري در نمود كه احتمالا به دليل

و پاتوژن در گياه مستقر شدن گياهان تيمار شده و

در گياه شاهد مد نبودن بيان بيشتر اين ژنآكار

باميزان بيان اين ژن در گياهان تيمار شده باشد.مي

ز هاي زماني بعد اساليسيليك اسيد در تمامي بازه

اهان شاهد بود. داري بيشتر از گيآلودگي به طور معني

توان به اين صورت توجيه كردكه اين افزايش را مي

مولكول سيگنال اسيد تيمار ساليسيليك باعث افزايش

NPR1شود كه سبب فعال شدن ژن ساليسيليك مي

و القاي مكانيسم PR1ن ژن و به دنبال آن افزايش بيا

SAR شوددر گياه مي )Shah and Klessing, 1999;

Rate 2001 بنابراين گياه با افزايش بيان اين ژن در .(

سبب ايجاد مرگ سلولي برنامه ريزي شده 48زمان

مي شود تا از توسعه بيمارگر در سلول ميزبان

و بدين صورت موجب مقاومت گياه جلوگيري كند

هاي ديگر محققين نيز بيانگر نتايج بررسي. شود

پس از آلودگي در گياهان بود بيان اين ژنافزايش

)Yang et al., 2013(.

در PR1bاز طرفي با توجه به افزايش بيان ژن

عنوان ه شدن آن به ساعت پس از آلودگي و شناخت 12

SA توسط يك ماركر مقاومت القايي تحريك شده

)Ingrid et al., 2005 و همچنين با توجه به (

در دفاع غالباً SAهاي محققين مبني بر اين كه يافته

هاي بيوتروف موثر واقع پاتوژنگياهان در مقابل

توان نتيجه مي ،)Glazebrook, 2005( گرددمي

، مشابه توتوندر تعامل با Pst گرفت كه

در توتونبيوتروف رفتار نموده و هميهاي ارگانيسم

به SA به ابتدا با فعال نمودن مسيرهاي دفاعي وابسته

دهد.العمل نشان ميحمله اين پاتوژن عكس

در پاسخ به PR5در گياهان شاهد ميزان بيان

زني جهش از مايهساعت پس 12 آلودگي باكتريايي


١٣٨ Journal of Agricultural Biotechnology; Printing ISSN: 2228-6705, Electronic ISSN: 2228-6500

برابر افزايش نسبت 3(در حدود قابل توجهي داشت

ساعت 24به زمان صفر). پس از آن نيز بيان اين ژن تا

پس از آلودگي به افزايش خود ادامه داد و بيشينه بيان

4/11حدود ( ژن نيز در همين ساعت مشاهده شداين

برابر افزايش نسبت به زمان صفر). نرخ بيان اين ژن

پس 72ت پس از زمان اوج كاهش يافت و در ساع

حدود عني زني به كمترين ميزان بيان خود ياز مايه

برابر بيشتر از بيان اين ژن در زمان صفر رسيده 8/5

است.

در گياهان تيمار شده با هورمون ساليسيليك

در پاسخ به آلودگي باكتريايي اسيد ميزان بيان اين ژن

ني جهش قابل توجهي داشتزساعت پس از مايه 12

افزايش نسبت به زمان صفر). پس از آن برابر 4/8(

ساعت پس از آلودگي به 24نيز بيان اين ژن تا

ز در افزايش خود ادامه داد و بيشينه بيان اين ژن ني

برابر افزايش 6/139 ( همين ساعت مشاهده شد

نسبت به زمان صفر). نرخ بيان اين ژن پس از زمان

به زنيپس از مايه 72اوج كاهش يافت و در ساعت

برابر 3/2كمترين ميزان بيان خود يعني در حدود

بيشتر از بيان اين ژن در زمان صفر رسيده است. نرخ

بيان اين ژن در گياهان تيمار شده با ساليسيليك اسيد

10زني) ساعت پس از مايه 24( زمان اوج بيان در

در گياهان شاهد در زمان برابر بيشتر از بيان اين ژن

باشد.زني) ميساعت پس از مايه 24( اوج بيان

در گياهان تيمار شده با جاسمونيك اسيد نيز

12 ن در پاسخ به آلودگي باكترياييميزان بيان اين ژ

برابر 1/7( زني افزايش داشتساعت پس از مايه

مان صفر) و پس از آن نيز بيان اين ژن تا نسبت به ز

ساعت پس از آلودگي به افزايش خود ادامه داد 48

و بيشينه بيان اين ژن نيز در همين ساعت مشاهده

برابر افزايش نسبت به زمان صفر). 5/37(حدود شد

نرخ بيان اين ژن پس از زمان اوج كاهش يافت و در

ترين ميزان بيان خود زني به كمپس از مايه 72ساعت

يان اين ژن در زمان صفر برابر بيشتر از ب 5/1 يعني

در گياهان تيمار شده با. نرخ بيان اين ژن رسيد

ساعت پس 48( جاسمونيك اسيد در زمان اوج بيان

برابر بيشتر از بيان اين ژن در گياهان 7/1زني) از مايه

زني) ساعت پس از مايه 24( زمان اوج بيان شاهد در

).2(شكل باشدمي

Thaumatin Like Proteinيا PR5پروتئين

سبب تغيير نفوذپذيري اجزاي ساختاري ديواره

سلولي باكتري شده و در نهايت سبب مرگ سلول

).Vidhyasekaran, 2002( گرددباكتري مي


١٣٩ Journal of Agricultural Biotechnology; Printing ISSN: 2228-6705, Electronic ISSN: 2228-6500

هاي در گياه شاهد، تيمار شده با ساليسيليك اسيد و جاسمونيك اسيد در زمان PR5الگوي بيان ژن -2شكل

.Pstمختلف پس از آلودگي با باكتري Figure 2- PR5 pattern of gene expression in control plants, treated with salicylic acid and


يان ژن ناليز ب له از آ ــ تايج حاصـ هم در PR5ن

هد و ه ــا هان شـ يا با گ ــده مار شـ هان تي يا م در گ

سيد هورمون سمونيك ا سيد و جا سيليك ا سالي هاي

باشـــد كه ســـطح بيان ژن هم گوياي اين مطلب مي

PR5 الگوي همانند PR1b ــاعت پس از 12در سـ

يه به افزايش مي ما ــروع ند. زني شـ يان ك افزايش ب

در اين ساعت رابطه SAهاي القاء شونده توسط ژن

سيگنال ستقيم با افزايش تجمع اين مولكول دارد. م

ضد سيس طي PR5ي قارچفعاليت در گياه آرابيدوپ

شاهده هاي ورتآلودگي با قارچ سيليم و فوزاريوم م ي

Fitzgerald et al., 2004; Xu and Reddy( شــد

سموتين، يك عضو از خانواده . )1997 افزايش بيان ا

تراريخته، منجر در گياه ســيب زميني، PR5پروتئين

مت در برابر قاو جاد م Phytophthoraقارچ به اي

infestans شــد )Liu et al., 1994( . در اين مطالعه

ــخه ميزان ــه تيمار PR5هاي نسـ پس از ،در هر سـ

ــازي گياهان با آلوده ميزانافزايش يافت، اما Pstسـ

يان ها آنب مار فاوت در تي هد در . بودمت ــا ياه شـ گ

سيد سيليك ا سالي شده با بيان ژن همانند گياه تيمار

PR5 24 سيد اوج خودپس از آلودگي به ساعت ر

سبت به ت ميزان بيان آن لي و سيد ن سيليك ا سالي يمار

سيار پايين هورمون بود كه اين امر بيانگر اهميت تر ب

.است Pst تعامل گياه با باكتريدر ساليسيليك اسيد

ــيد ــمونيك اسـ يان اين ژن اما در تيمار جاسـ 48 ب

0

10

20

30

40

50

60

٠ ١٢ ٢۴ ۴٨ ٧٢

نياح بطس

Exp

ress

ion l

evel


Hours of infection

PR5

Controlكنترل

Salicylic acidساليسيليك اسيد

Jasmonic acidجاسمونيك اسيد


١۴٠ Journal of Agricultural Biotechnology; Printing ISSN: 2228-6705, Electronic ISSN: 2228-6500

سي ساعت د و نرخ بيان پس از آلودگي به حداكثر ر

ــاهد وبازه آن در همه ــتر از گياه شـ كمتر از ها بيشـ

سيد بود سيليك ا سالي سي .تيمار هاي ديگر نتايج برر

پس از بيــان اين ژن بيــانگر افزايش محققين نيز

).Yang et al., 2013( آلودگي در گياهان بود

در WRKY12در گياهان شاهد ميزان بيان ژن

ساعت پس از مايه زني 12پاسخ به آلودگي باكتريايي

ساعت پس از آلودگي 72شروع به افزايش كرد و تا

نيز اين افزايش بيان ادامه داشت. نرخ بيان اين ژن در

برابر نسبت به زمان صفر 1/7حدود زمان اوج در

داشت. افزايش


ن در پاسخ به آلودگي باكتريايياسيد ميزان بيان اين ژ

(در حدود داشت زني افزايشساعت پس از مايه 12

برابر افزايش نسبت به زمان صفر). پس از آن نيز 3

آلودگي به افزايش ساعت پس از 48بيان اين ژن تا

خود ادامه داد و بيشينه بيان اين ژن نيز در همين

برابر افزايش نسبت 21ساعت مشاهده شد(در حدود

به زمان صفر). نرخ بيان اين ژن پس از زمان اوج

زني به پس از مايه 72كاهش يافت و در ساعت

برابر 1/1كمترين ميزان بيان خود يعني در حدود

بيشتر از بيان اين ژن در زمان صفر رسيده است. نرخ

ساليسيليك اسيد بيان اين ژن در گياهان تيمار شده با

5/5زني) ساعت پس از مايه 48( در زمان اوج بيان

در گياهان شاهد در زمان برابر بيشتر از بيان اين ژن

باشد.زني) ميساعت پس از مايه 72( اوج بيان

در گياهان تيمار شده با جاسمونيك اسيد نيز

12 ن در پاسخ به آلودگي باكترياييميزان بيان اين ژ

زني جهش اندكي داشته و پس از ساعت پس از مايه

ساعت پس از آلودگي به 48آن نيز بيان اين ژن تا

نيز در افزايش خود ادامه داد و بيشينه بيان اين ژن

برابر 5/6(در حدود همين ساعت مشاهده شد

افزايش نسبت به زمان صفر). نرخ بيان اين ژن پس

پس از 72از زمان اوج كاهش يافت و در ساعت

ود يعني در حدود زني به كمترين ميزان بيان خمايه

ژن در زمان صفر رسيده برابر بيشتر از بيان اين 3/3

گياهان تيمار شده با نرخ بيان اين ژن در است.

ساعت پس 48( اسمونيك اسيد در زمان اوج بيانج

بيان اين ژن در گياهان برابر بيشتر از 1/1زني) از مايه

زني) ساعت پس از مايه 72( بيانشاهد در زمان اوج

).3(شكل باشدمي

به WRKY12متصل شدن فاكتور رونويسي

DNA سازي ژن پايين دستبراي فعال PR1b مهم

با NPR1هاي . پروتئين)Verk et al., 2010(د است

واكنش داده و بيان ژن پايين WRKYاعضاي خانواده

). Johnson et al., 2003( نماينددست را تحريك مي

هاي رونويسي از بيانراين فاكتو شدن سركوب

).Boyle et al., 2009( دنكميجلوگيري PRهاي ژن

در گياه برنج منجر به WRKY45 افزايش بيان ژن

در برابر بيماري SAه به مسير وابستايجاد مقاومت

مشاهده ).Shimono et al., 2012( شودبلاست مي

منجر در توتون NtWRKY12ژن افزايش بيان شد كه


١۴١ Journal of Agricultural Biotechnology; Printing ISSN: 2228-6705, Electronic ISSN: 2228-6500

زا در بيماريباكتريايي عواملبه افزايش مقاومت به

در تحقيق .)Verk et al., 2010( توتون شده است

هايي با كاهش عملكرد مشاهده شد كه در موتانت

WRKY70، ه به تمقاومت وابسSA برابر در

Erysiphe cichoracearum قارچي هايپاتوژن

در اين پژوهش .)Li et al., 2006( مختل شده است

ساعت در NtWRKY12با توجه به حداكثر بيان ژن

و ديگر نتايج به دست زني باكتريمايهپس از 48

توان گفت كه اين ژن نقش مهمييآمده م

هايي مانند دهي دفاعي و بيان ژنهاي سيگنالدرمسير

PR1b هاي ديگر محققين نيز نتايج بررسيرد. دا

پس از آلودگي در گياهان بيان اين ژنبيانگر افزايش

اختلاف چشمگير بيان ژن ).Yang et al., 2013( بود

NtWRKY12 با در گياهان شاهد و تيمار شده

هاي مورد بررسيساليسيليك اسيد در تمام زمان

Pstه در دفاع علي ساليسيليك اسيد بيانگر نقش مهم

است.

در پاسخ PALدر گياهان شاهد ميزان بيان ژن

زني شروع ساعت پس از مايه 12 به آلودگي باكتريايي

24تا به افزايش كرد. پس از آن نيز بيان اين ژن

امه داد و ساعت پس از آلودگي به افزايش خود اد

همين ساعت مشاهده شددر بيشينه بيان اين ژن

برابر افزايش نسبت به زمان صفر). نرخ 5/1حدود (

72بيان اين ژن پس از زمان اوج كاهش يافت و

زني به كمترين ميزان بيان خود پس از مايهساعت

.ز زمان صفر رسيدبرابر بيشتر ا 1/1يعني در حدود


باكتريايي اسيد ميزان بيان اين ژن در پاسخ به آلودگي

ي داشته زني جهش قابل توجهساعت پس از مايه 12

در همين ساعت مشاهده شد و بيشينه بيان اين ژن

ن صفر). برابر افزايش نسبت به زما 6/5(در حدود

72نرخ بيان اين ژن پس از زمان اوج كاهش يافت و

ن ميزان بيان خود زني به كمتريپس از مايهساعت

. از زمان صفر رسيدبرابر بيشتر 2/1يعني در حدود

ضمناً نرخ بيان اين ژن در گياهان تيمار شده با

ساعت پس 12( ساليسيليك اسيد در زمان اوج بيان

در برابر بيشتر از بيان اين ژن 8/3از مايه زني)

ساعت پس از 24( گياهان شاهد در زمان اوج بيان

تيمار شده با در گياهان باشد.زني) ميمايه

ن در پاسخ به ميزان بيان اين ژجاسمونيك اسيد

زني جهشساعت پس از مايه 12 آلودگي باكتريايي

پس از آلودگي به ساعت 24تا اندكي داشت و

امه داد و بيشينه بيان اين ژن در همين افزايش خود اد

برابر افزايش نسبت 3/2حدود ( ساعت مشاهده شد

به زمان صفر). نرخ بيان اين ژن پس از زمان اوج

به كمترين زني ساعت پس از مايه 72كاهش يافت و

برابر بيشتر از زمان 3/1د حدو ميزان بيان خود يعني

. ضمناً نرخ بيان اين ژن در گياهان تيمار رسيدصفر

24شده با جاسمونيك اسيد در زمان اوج بيان (

بيان اين برابر بيشتر از 3/2 زني) ز مايهساعت پس ا

ساعت 24( در گياهان شاهد در زمان اوج بيانژن

)4(شكل باشدزني) ميپس از مايه


١۴٢ Journal of Agricultural Biotechnology; Printing ISSN: 2228-6705, Electronic ISSN: 2228-6500

در گياه شاهد، تيمار شده با ساليسيليك اسيد و جاسمونيك اسيد در WRKY12الگوي بيان ژن -3شكل

.Pstهاي مختلف پس از آلودگي با باكتري زمانFigure 3- WRKY12 pattern of gene expression in control plants, treated with salicylic acid

and jasmonic acid in various times after infection with Pst.

هاي در گياه شاهد، تيمار شده با ساليسيليك اسيد و جاسمونيك اسيد در زمان PALالگوي بيان ژن -4شكل

.Pstمختلف پس از آلودگي با باكتري Figure 4- PAL pattern of gene expression in control plants, treated with salicylic acid and


0

2

4

6

8

10

12

14

16

٠ ١٢ ٢۴ ۴٨ ٧٢

نياح بطس

Exp

reti

on l

evel


Hours of infection

WRKY12

Controlكنترل

Salicylic acidاسيد ساليسيليك


0

20

40

60

80

100

٠ ١٢ ٢۴ ۴٨ ٧٢

ان بيطح

سE

xp

ress

ion l

evel


Hours of infection

PAL

Controlكنترل




١۴٣ Journal of Agricultural Biotechnology; Printing ISSN: 2228-6705, Electronic ISSN: 2228-6500

Phenylalanin ammonia lyazeمحصــول ژن

بوده كه Phenylpropanoidآنزيمي حياتي در مسير

توليــد تركيبــات طبيعي فنيــل اولين واكنش در

ها، فلاوونوئيد و دانه پروپانوئيدي مثل ليگنين، رنگ

).Blilou et al., 2000( كندفيتوالكسين را كاتاليز مي

شده كه افزايش مقدار شخص پيامبر RNAم

PAL ــد. گياهان ، مبناي افزايش فعاليت آن مي باشـ

باشد، ليگنين ها كم ميدر آن PALتوتون كه فعاليت

ها كمتري در ديواره داشته و نسبت به تهاجم بيمارگر

با .)Vidhyasekaran, 2002( باشــندتر ميحســاس

توجه به اطلاعات بدســـت آمده و همچنين با توجه

ــي نقش آنزيم ــده پيرامون بررسـ به مطالب ذكر شـ

PAL، ها در مقاومت توان گفت كه فيتوالكســـينمي

همچنين دارند.نقش بســزايي Pstباكتري به توتون

شد كه اين آنزيم نقش مهمي در شخص د دار HRم

عاملات ما را پيرامون ت ــير فاسـ و Pstباكتري كه ت

همچنين ).Silva et al., 2006( نمايدتائيد ميتوتون

ــنتز ــير سـ اين آنزيم اولين آنزيم دخيــل در مسـ

ــين ــ ها فيتوآلكسـ ).Coquoz et al., 1998( تاسـ

يان با افزايش تجمع PALافزايش ب ياه توتون در گ

ــدميكروبي، مقــاومــت بــه تركيبــات فنلي ضــ

Cecospora nicotiana وPhytophthora

parasitica pv. nicotiana يش فزا دهــدمي را ا

)Way et al., 2002; Shadle et al., 2003 .(

در را PAL ژن نقش قبلي هاي پژوهشهمچنين

Acidovorax avenae باكتري به برنج گياه مقاومت

subsp. Avenae شان Heydarinezhad( دهد مي ن

et al., 2016.( حال، مواردي گزارش شــده اين با

كه تغيير درتركيبات فنلي، منجر به افزايش حساسيت

ست در برابر عوامل بيماري شده ا Hanhineva( زا

et al., 2009 .( تركيباتPAL هاي مقاوم در واكنش

هاي حساس تجمع پيدا مي از واكنش تربسيار سريع

ــت آمده در اين تحقيق كنند كه اين با نتايج به دسـ

همخواني دارد. در اين پژوهش مشـــخص شـــد كه

سيليك PALتركيبات سالي شده با در گياهان تيمار

تر از گياهان شاهد و همچنين تيمار شده اسيد سريع

يدا مي يد تجمع پ ــ يك اسـ ــمون ند. با جاسـ تايج كن ن

ــي يانگر افزايش بررسـ يان هاي ديگر محققين نيز ب ب

هان بود اين ژن يا Yang et( پس از آلودگي در گ

al., 2013.( ــين يب فيتوآلكسـ ــ عد از آسـ ها نيز ب

ــت ــلول در گياه تجمع برگشـ ــاي سـ ناپذير به غشـ

هاي كنشها به ســرعت در هميابند. فيتوآلكســينمي

حساسيت مقاوم/ ناسازگار كه به صورت واكنش فوق

ــتند، تجمع پيدا ميقاب كنند. مرگ ل تشـــخيص هسـ

ها درون بافت آلكســـينســـلولي، قبل از تجمع فيتو

).Vidhyasekaran, 2002افتد (آلوده اتفاق مي

هاي در گياهان شاهد سطح فراواني رونوشت

پس از آلودگي افزايش قابل توجهي CAT ،12ژن

برابر) و سپس روند كاهشي به 3/4(حدود داشت

نرخ بيان اين ژن در گياهان شاهد در خود گرفت.

زني) حدود ساعت پس از مايه 12( زمان اوج بيان

برابر بيشتر از بيان اين ژن در گياهان تيمار شده 2/3


١۴۴ Journal of Agricultural Biotechnology; Printing ISSN: 2228-6705, Electronic ISSN: 2228-6500

باشد. نرخ با ساليسيليك اسيد در زمان اوج بيان مي

12( بيان اين ژن در گياهان شاهد در زمان اوج بيان

برابر بيشتر از 3/3ساعت پس از مايه زني) حدود

بيان اين ژن در گياهان تيمار شده با جاسمونيك اسيد

زني) ساعت پس از مايه 12( در زمان اوج بيان

باشد.مي


اسيد برخلاف آنچه در الگوي بيان ژن كاتالاز در

گياهان شاهد مشاهده شد، سطح فراواني

پس از ايجاد 12ساعت در CATهاي ژن رونوشت

برابر 9/1(در حدود آلودگي افزايش ناچيزي داشت

پس 72و سپس تا زمان افزايش نسبت به زمان صفر)

از تلقيح به شدت كاهش يافت.

در گياهان تيمار شده با هورمون جاسمونيك

12هاي اين ژن اسيد ميزان سطح فراواني رونوشت

ساعت پس از ايجاد آلودگي افزايش ناچيزي داشت

برابر افزايش نسبت به زمان صفر) و 3/1(در حدود

پس از تلقيح به شدت كاهش يافت 72سپس تا زمان

).5(شكل

ليسيليك اسيد و جاسمونيك اسيد در در گياه شاهد، تيمار شده با سا CATالگوي بيان ژن -5 كلش

Pstهاي مختلف پس از آلودگي با باكتري زمانFigure 5- CAT pattern of gene expression in control plants, treated with salicylic acid and


انفجار اكسيداتيو با هدف قرار دادن مستقيم

بيمارگر در اولين مراحل آلودگي، به عنوان اولين

رود. كاتالاز دفاعي گياهان مقاوم به شمار ميمرحله

كند، باكتري را مقابل اثرات را تجزيه مي H₂O₂كه

0

0.5

1

1.5

2

2.5

3

3.5

٠ ١٢ ٢۴ ۴٨ ٧٢

نياح بطس

Exp

ress

ion l

evel

ساعت پس از آلودگیHours after infection

CAT

Controlكنترل




١۴۵ Journal of Agricultural Biotechnology; Printing ISSN: 2228-6705, Electronic ISSN: 2228-6500

AOS موجب كاهش اثرات تنشكنند و محافظت مي

هاي اكسيداتيو كه به وسيله عوامل محيطي مختلف

در اين مطالعه در گياهان گردند.شود، ميايجاد مي

نين جاسمونيك تيمار شده با ساليسيليك اسيد و همچ

موجب مرگ CATاسيد، سطوح پايين بيان ژن

) به عنوان پاسخي بر PCD( ريزي شده سلوليبرنامه

كه شودزاي باكتريايي فعال ميعليه عوامل بيماري

ي حضور و فعاليت سيستمي سركوبگر نشان دهنده

هاي اين نتايج با يافتهباشد. در مسير بيان اين ژن مي

).Yang et al., 2013دارد ( محققين ديگر مطابقت

CATدر حالي كه در گياه شاهد سطح بالاي بيان ژن

شودمي H₂O₂موجب حذف مولكول سيگنال

)Neill et al., 2002(. سازي بنابراين به جهت فعال

حساسيت كه خود به تجمع مولكول واكنش فوق

H₂O₂ بايست بيان و فعاليت ژن وابسته است، مي

CAT سركوب شوند )Mittler et al., 2004.(

دهد كه گياهان در مقابله با مطالعات نشان مي

هاي مرگ سريع عوامل بيوتروف عمدتا با مكانيسم

سلولي، محكم كردن ديواره سلولي در محل نفوذ

هاي ضد بيمارگر و با افزايش توليد بعضي از پروتئين

از نفوذ و توسعه PRهاي ميكروبي مثل پروتئين

كنند. پيش نياز توليد ود جلوگيري ميبيمارگر در خ

هاي درگير در واكنش ارقام مقاوم، شناسايي مكانيسم

زا است كه منجر به ظهور مقاومت به عوامل بيماري

در ارقام مقاوم و حساسيت در ارقام حساس گياهي

نابراين درك درست ب ).Baker et al., 1997( شودمي

ميزبان از روند تخريب بيماري و همچنين مقاومت

به بيمارگر ممكن است به محقق كمك كند تا با

هاي تحقيقاتي بيشتري براي غلبه بر بيماري گام ايده

هاي بردارد. با توجه به تغييرات مشاهده شده نقش ژن

هاي شده در اين تحقيق در مقاومت به بيمارگر مطالعه

مختلف در گياهان بخوبي روشن است. در آلودگي

ها در ارتباط با شود اين ژنميآتشك توتون، تصور

هاي دفاعي گياه داراي نقش باشند. با توجه به پاسخ

نتايج اين تحقيق، هورمون ساليسيليك اسيد قادر به

زايي، مرتبط با بيماريPALهاي القاي بيشتر ژن

)PR1 ،PR5 ( و فاكتور رونويسيWRKY12 در

در گياه توتون است. علاوه بر اين در JAمقايسه با

هاي فوق، آنزيم كاتالاز گياهان تيمار شده با هورمون

كاهش قابل توجهي يافت كه خود باعث افزايش

هاي آزاد اكسيژن و بيشتر شدن پاسخ تجمع راديكال

مقاومت گياه به مقاومتي مرگ سلولي و افزايش

ن توان گفت ايشود. در مجموع ميآتشك توتون مي

ها به عنوان القا كننده زيستي كارآمد بوده و هورمون

ها باعث از طريق القاي سيستم بيان ژن و توليد آنزيم

شوند. با مقاومت گياه به بيماري آتشك توتون مي

توان از آن در مي SAتوجه تاثير بيشتر هورمون

مديريت اين بيماري با تيمار آن روي گياه و يا توليد

از توتون كه در آن توليد اين هورمون هايي تراريخت

هايي كه داراي سطح بيشتر باشد و يا تراريخت

هاي آنزيم يا سركوب كننده PALبيشتري از ژن

كاتالاز باشد، بهره جست.


١۴۶ Journal of Agricultural Biotechnology; Printing ISSN: 2228-6705, Electronic ISSN: 2228-6500

منابعAgrios GN (2005). Plant pathology. 5th ed. Academic press, San Diago, 922.

Baker B, Zambryski P, Staskawicz B, Dinesh-Kumar SP (1997). Signaling in Plant Microbe

Interactions. Science 276: 726-733.

Blilou I, Ocampo JA, Garcia-Garrido JM (2000). Induction of Ltp (lipid transfer protein) and

Pal (phenylalanine ammonia-lyase) gene expression in rice roots colonized by the

arbuscular mycorrhizal fungus Glomus mosseae. Journal of experimental botany 51: 1969-

1977.

Block A, James R (2011). Plant targets for Pseudomonas syringae type III effectors. Plant

Physiology 123: 1341–1356.

Boyle P, Su EL, Rochon A, Shearer HL, Murmu J, ChuJY, Fobert PR, Despres C (2009). The

BTB ⁄ POZ domain of the Arabidopsis disease resistance protein NPR1 interacts with the repression domain of TGA2 to negate its function. Plant Cell 21: 3700–3713.

Campbell MM, Ellis BE (1992). Fungal elicitor- medated responses in pine cell cultures: III.

Purification and characterization of phenylalanine ammonia-lyase. Plant Physiology 98:

62-70.

Coquoz J, Buchala A, Metraux JP (1998). The biosynthesis of salicylic acid in potato plants.

Plant Physiology Biochemistry 117: 1095-1101.

Dahleen L, Okubara PA, Blech AE (2001). Transgenic approaches to combat fusarium head

blight in wheat and barley. Crop Science 41: 628-637.

Fitzgerald HA, Chern MS, Navarre R, Ronald PC (2004). Overexpression of (At)NPR1 in rice

leads to a BTH- and environmentinduced lesion-mimic/cell death phenotype. Molecular

Plant-Microbe Interaction 17: 140-151.

Ganapathi TR, Suprasanna P, RaoPS, Bapat VA (2004).Tobacco (Nicothiana tobacum L.)A

model system for tissue culture intervention and genetic engineering. Indian Journal of

Biotechnology 3: 171-184.

Glazebrook J (2005). Contrating mechanisms of defense against biotrophic and necrotrophic

pathogens. Annual Review of Phytopathology 43: 205–227.

Grunwald I, Rupprecht I, Schuster G, Kloppstech K (2003). Identification of guttation fluid

proteins: the presence of pathogenesis- related proteins in noninfected barley plant.

Physiologia Plantarum 119: 192-202.

Hanhineva K, Kokko H, Siljanen H, Rogachev I, Aharoni A, Karenlampi SO (2009). Stilbene

synthase gene transfer caused alterations in the phenylpropanoid metabolism of transgenic

strawberry (Fragariaxananassa). Journal Experimental Botany 60: 2093-2106.

He R, Chang Z, Yang Z, Zhan H, Zhang X, Liu J. (2009). Inheritance and mapping of powdery

mildew resistance gene Pm43 introgreessed from Thinopyrum intermedium into wheat.

Theoretical and Applied Genetics 118: 1173-1180.

Heil M, RM Bostock (2002). Induced systemic resistance (ISR) against pathogens in the context

of induced plant defences. Annual Botany 89: 503-512.

Heydari-Nezhad AM, Babaeizad V, Rahimian H (2016). Studying PR2 and PAL genes

involvement in rice resistance against Acidovorax avenae subsp. Avenae. Journal of

Agricultural Biotechnology 7: 67-82 (In Farsi).


١۴٧ Journal of Agricultural Biotechnology; Printing ISSN: 2228-6705, Electronic ISSN: 2228-6500

Hoegen E, Stromberg A, Pihlgren U, Kombrink E (2002). Primary structure and tissue specific

expression of the pathogenesis- related protein PR-1b in potato. Molecular Plant Pathology

3: 329-345.

Johnson C, Boden E, Arias J (2003). Salicylic acid and NPR1 induce the recruitment of trans-

activating TGA factors to a defense gene promoter in Arabidopsis. Plant Cell 15: 1846-

1858.

Kitajima S, Sato F (1999). Plant pathogenesis-related proteins: Molecular mechanisms of gene

expression and protein function. Journal of Biochemistry 125: 1-8.

Klement Z, Rudolph K, Sands DC (1990). Methods in Phytobacteriology. Akademiai Kiado,

Budapset 568.

Kogel KH, Langen G (2005). Induced disease resistance and gene expression in cereals. Journal

Cellular Microbiology 11: 1555-1564.

Li J, Brader G, Palva ET (2004). The WRKY70 transcription factor: A node of convergence for

jasmonate-mediated and salicylate-mediated signals in plant defense. Plant Cell 16: 319-

331.

Li J, Brader G, Kariola T, Palva ET (2006). WRKY70 modulates the selection of signaling

pathways in plant defense. Plant Journal 46: 477-491.

Lillemo M, Asalf B, Singh RP, Huerta-Espino J, Chen XM, He ZH Bjrnstad A (2008). The adult

plant rust resistance loci Lr34/Yr18 andLr46/Yr29 are important determinants of partial

resistance to powdery mildew in bread wheat line saar. Theoretical and Applied Genetics

116: 1155-1166.

Liu D, Raghothama KG, Hasegawa PM, Bressan RA (1994). Osmotinoverexpression in potato

delays development of disease symptoms. proceedings of the national academy of sciences

USA 91: 1888–1892. Livak KJ, Schmittgen TD (2001). Analysis of relative gene expression data using real-time

quantitative PCR and the 2 -(∆∆CT) CT method. Methods 25: 402-408.

Mittler R, Vanderauwera S, Gollery M, Van Breusegem F (2004). Reactive oxygen gene

network of plants. Trends Plant science 9: 490–498.

Moralejo FJ, Cardoza RE, Gutierrez S, Martin JF (1999). Thaumatin production in Aspergillus

awamori by use of expression cassettes with strong fungal promoters and high gene dosage.

Applied and Environmental Microbiology 65: 1168–1174.

Muchembled J, Lounes-Hadj shahraoui A, Grandmougin-Fer jani A, Sanchollen M (2006).

Changes in lipid composition of Blumeria graminis f.sp. tritici conidia produced on wheat

leaves treated with heptanoyl SA. Phythochemistry 67: 1104-1109.

Neill SJ, Desikan R, Clarke A, Hurst RD, Hancock JT (2002). Hydrogen peroxide and nitric

oxide as signalling molecules in plants. Journal of Experimental Botany 53: 1237–1247.

Oh S, Baek K, Park J, Yi S, Yu S, Kamoun S, Choi D (2008). Capsicum annuum WRKY protein

CaWRKY1 is a negative regulator of pathogen defense. New Phytology 177: 977–989.

Raskin I (1992). SalisylateT a new plant hormone. Plant Physiology 99: 799-803.

Rasmussen J, Hammerschmidt R, Zook NM (1991). Systemic Induction of Salicylic Acid

Accumulation in Cucumber after Inoculation with Pseudomonas syringae pv syringae.

Plant Physiology 97: 1342-1347.

Rate DN, Greenberg JT (2001). The Arabidopsis aberrant growth and death2 mutant shows

resistance to Pseudomonas syringae and reveals a role for NPR1 in suppressing

hypersensitive cell death. Plant Journal 27: 203-2110.


١۴٨ Journal of Agricultural Biotechnology; Printing ISSN: 2228-6705, Electronic ISSN: 2228-6500

Rauscher M, Adam AL, Wirtz S, Guggenheim R, Mendgen K, Deising HB (1999). PR-1 protein

inhibits the differentiation of rust infection hyphae in leaves of acquired resistant broad

bean. Plant Journal 19: 625-633.

Schaller F (2001). Enzymes of the biosynthesis of octadecanoid-derived signaling molecules.

Journal Experimental Botany 52: 11-23.

Schmidt G, Delaney S (2010). Stable internal reference genes for normalization of real-time

RT-PCR in tobacco (Nicotiana tabacum) during development and abiotic stress. Molecular

Genetics and Genomics 283: 233-241.

Schulthesis H, Derchert C, Kogel KH, Huckelhoven R (2003). Functional analysis of barley

PAC/ROP G-protein family members in susceptibility to the powdery mildew fungus. Plant

Journal 36: 589-601.

Sels J, Mathys M, De Coninck BMA, Cammue BPA (2008). Plant pathogenesis- related (PR)

proteins: A focus on PR peptides. Plant Physiology and Biochemistry 46: 941-950.

Shadle GL, Wesley SV, Korth KL, Chen F, Lamb C, Dixon RA. (2003). Phenylpropanoid

compounds and disease resistance in transgenic tobacco with altered expression of L-

phenylalanine ammonia-lyase. Phytochemistry 64: 153-161.

Shah J, Klessig DF (1999). Salisylic acid: signal perception and transduction. In: Libbenga K,

Hall M, Hooykaas PJJ (Eds.). new comprehensive biochemistry. Biochemistry and

Molecular Biology Plant hormones. Elsevier UK: 513-554.

Silva MD, Várzea V, Guimarães LG, Azinheira HG, Nicole M (2006). Coffee resistance to the

main diseases: leaf rust and coffee berry disease. Brazil Journal of Plant Physiology 18:

119-147.

Shimono M, Koga H, Akagi A, Hayashi N, Goto S, Sawada M, Kurihara T, Matsushita A,

Sugano S, Jiang CJ, Kaku H, Inoue H, Takasuji H (2012). Rice WRKY45 plays important

roles in fungal and bacterialdisease resistance. Molecular Plant Pathology 13: 83–94.

Song F, Goodman RM, (2001). Molecular biology of disease resistance in rice. Physiological

and Molecular Plant Pathology 59: 1-11.

Sticher L, Mauchmani B, Metraux JP (1997). Systemic acquired resistance. Annual Review of

Phytopathology 35: 235- 270.

Stotz HU, Thomson J, Wang Y (2009). Plant defensins: defense, development and application.

Plant Signaling & Behavior 4: 1010-1012.

Thomma BPHJ, Eggermont K, Penninckx IAMA, Mauch-Mani B,Vogelsang R, Cammue BPA,

Broekaert WF (1998). Separate Jasmonate- dependent and salicylate- dependent defense-

response pathway s in Arabidopsis are essential for resistance to distinct microbial

pathogens. Proceeding of the Nothinal Academy of Science of USA 95: 15107-15111.

Traw MBd, Bergelson J (2003). Interactive effects of jasmonic acid, salicylic acid and

gibberellin induction of trichomes in Arabidopsis. Plant Physiology 133: 1367-1375

Van Loon LC, Rep M, Pieterse CMJ (2006). Significance of inducible defense- related proteins

in infected plants. Annual Review Phytopathology 44: 135-162.

Verk MC, Neeleman L, Bol JF, Huub JM (2010). Tobacco Transcription Factors NtWRKY12

and TGA2.2 Interact in vitro and in vivo and Activate PR-1a Gene Expression. Plant

Physiology 123: 1341–1356.

Vidhyasekaran P (2002). Bacterial Disease Resistance in Plants: Molecular Biology and

Biotechnological Application.


١۴٩ Journal of Agricultural Biotechnology; Printing ISSN: 2228-6705, Electronic ISSN: 2228-6500

Vigers AJ, Roberts WK, Selitrennikoff CP (1991). A new family of plant antifungal proteins.

Molecular Plant Microbe Interactions 4: 315-323.

Way HM, Kazan K, Mitter N, Goulter KC, Birch RG, Manners JM (2002). Constitutive

expression of a phenylalanine ammonia-lyasegene from Stylosanthes humilisin transgenic

tobacco leads to enhanced disease resistance but impaired plant growth. Physiology

Molecular Plant Pathology 60: 275-82.

Xu H, Reddy ASN (1997). Cloning and expression of a PR5-like protein from Arabidopsis:

inhibition of fungal growth by bacterially expressed protein. Plant Molecular Biology 34:

949–959.

Yang L, li W, Guohua C, Shanshan J, Liping S, Dequan L (2013). Response of tobacco to the

Pseudomonas syringae pv. tomato DC3000 is mainly dependent on salisylic acid signaling

pathway. FEMS Microbiology Letters 344: 77-85.

Yu KW, Gao W, Hahn EJ, Paek KY (2002). Jasmonic acid improves ginsenoside accumulation

in adventitious root culture of panax ginseng C.A. Mayer. Journal of Biochemistry 11: 211-

215.

Zhang Y, Wang L (2005). The WRKY transcription factor superfamily: its origin in eukaryotes

and expansion in plants. BMC Evolutionary Biology 5: 1–12.


١۵٠ Journal of Agricultural Biotechnology; Printing ISSN: 2228-6705, Electronic ISSN: 2228-6500

Induction of several Pathogenesis-Related genes in tobacco plants treated by salicylic and

jasmonic acid after challenging with Pseudomonas syringae pv. Tabaci

Farajollahi F.1∗∗∗∗, Babaeizad V. 2, Rahimian H. 3

1Master in Plant Pathology of Sari Agricultural Sciences and Natural Resources University, Sari, Iran. 2Associate Professor in Plant Protection Department of Sari Agricultural Sciences and Natural Resources

University, Sari, Iran. 3Professor in Plant Protection Department of Sari Agricultural Sciences and Natural Resources University,

Sari, Iran.

Abstract

Tobacco as a model plant (owing to certain features) is extensively used in molecular research

with the aims to understand the fundamental plant and pathogen interactions. Fire blight bacterial

disease of tobacco (Pseudomonas syringae pv. tabaci (Pst)) causes considerable damage to tobacco

worldwide. Induction of genes associated with virulence that play a role in resistance to diseases

can be effective in reducing the severity of disease. The evidence suggests that plant hormones are

effective in gene expression in plants and increase the production of secondary metabolites. In

addition, they stimulate the immune system of plant through the activation of transcription of genes

linked with plant defense mechanisms that regulate the induced resistance. In this study, the

expression of PR1, PR5, Pal, Catalase and WRKY12 in tobacco plants treated with salicylic acid

at a concentration of 3 mM and tobacco plant treated with jasmonic acid at a concentration of 0.5

mM and also control plant in times 0, 12, 24, 48 and 72 after injection of Pseudomonas syrigae pv.

tabaci was investigated by Quantitative Real-time PCR (QRT-PCR) technique. The results showed

that jasmonic acid and particularly salicylic acid treatments caused significant changes in the

expression of these genes after bacterial injection.

key words: Fire blight, Salicylic acid, Jasmonic acid, QRT-PCR, Resistance genes.

∗ Corresponding Author: Farajollahi F. Tel: +989111188742 Email: [email protected]

Documents

12-Paper 9- 96A242 Farajollahi et al-2