Producción de proteínas recombinantes en Escherichia coli

Importancia biológica

Componentes estructurales de los seres vivos y son sintetizadas como parte del metabolismo normal de las células: • Enzimas: biocatalizadores incrementan la

velocidad de la RXN metabólicas. • Integran estructuras celulares: citoesqueleto,

pared celular, ribosomas. • Funciones celulares: organización del DNA,

replicación, transcripción, movilidad, señalización, respuestas inmune, adhesión celular, ciclo celular.

Metabolitos precursores para síntesis, E y crecimiento

Metabolismo Síntesis de enzimas

Traslocación de enzimas

Difusión de enzimas

Hidrólisis del polímero

Gradiente de moléculas pequeñas

Transportadores específicos

Hidrólisis de almidón: amilasas

Amilosa

Amilopectina

Unidad de glucosa

Maltosa

(14)

(14)

(16)

O

H

OH

HO

O

H

OH

CH2OH

O

H

OH

H

OH

H

O

H

OH

CH2OH

OH

H

O

H

OH

CH2OH(14)

Maltosa Glucosa

Maltosa

Industria de enzimas

• Para 1970s, la mayoría de las enzimas utilizadas eran de origen vegetal o animal: baja disponibilidad, altos costos.

• Usos de sistemas microbianos (1980s):

– 1) Escherichia coli, amidasa para la producción de ácido aminopimélico (6-APA), 40,000 tons/año;

– 2) Streptomyces, xilosa isomerasa para producción de D-fructosa ade D-glucosa, 100,000 tons/año:

– 3) Pseudomonas chlorapis nitrilo hidrolasa para producir acrilamida de acrilonitrilo, 30,000 tons/año.

Tecnología de DNA recombinante

(Inicio de 1970s: Berg, Cohen and Boyer in California):

La modificación deliberada del genoma de un microorganismo a través del cambio de la secuencia de nucleótidos que lo conforman se denomina como ingeniería genética y se logra a través de la aplicación de una serie de métodos conocidos como tecnología del ADN recombinante.

Uso de la tecnología de DNA recombinante

• Producción de enzimas de origen vegetal y animal en sistemas microbianos por sistemas fermentación.

• Producción de enzimas de organismos patógenos, difíciles de crecer o manipular genéticamente en sistemas conocidos.

• Incremento en la producción de enzimas por el uso de varias copias de genes , promotores fuertes, secuencias señal eficientes, etc.

• Ingeniería de proteínas: mejora de la estabilidad, actividad y/o especificidad.

Importancia biotecnológica

Secreción de proteínas

• Papel de Signal Recognition Particle (SRP), presentes en todas las

células.

• En Bacteria, presencia de un solo tipo de SRP y una molécula ARN

pequeña (small RNA) 4.5S RNA.

• Durante el transporte la secuencia señal es hidrolizada

(modificación post-traduccional)

• Sistema de traslocasas (Sec), p.e. SecYEG, ampliamente

distribuida en procariontes: asisten en los eventos de transporte y

Twin arginine traslocase (Tat).

Algunos sistemas de secreción de proteínas en bacterias Gram-negativas

Sistema Nombre Dependencia Sec Descripción

Tipo I Exportador ABC Independiente Consiste de 3 proteínas, una de las cuales es

ATP dependiente.

Opera en proteínas que no tiene señal de

reconocimiento

Tipo II Sistema de dos pasos Dependiente Mueve la proteína al periplasma por el sistema

Sec en un paso. Entonces 14 proteínas

accesorias la mueven a través de la membrana

en un segundo paso.

Tipo III Sistema dependiente

de contacto

Independiente Involucra 20 o más proteínas incluyendo

ATPasa, que forman un sistema continuo entre

el citoplasma y la superficie.

Activado por contacto por una célula

hospedera, libera una toxina (proteína) en el

hospedero directamente.

Tipo IV Sistema de

transferencia conjugal

Desconocido Utiliza el mismo sistema de transferencia de

DNA de algunas bacterias a células

eucariontes.

Tipo V Autotransporte Dependiente Están involucrados dos pasos como el tipo II,

pero no requiere de proteínas transportadoras

para transferir a través de la membrana

Secreted proteins

Proteins to be inserted in the membrane

Chaperonas en E. coli

DnaK (Familia Hsp 70): previene la formación de CI reduciendo la agregación y promueve proteólisis de proteínas mal plegadas. Sistema de bichaperonas DnaK y ClpB (Familia Hsp100) favorece la solubilización de o desagregación de proteínas GroEL (Familia Hsp60) Controla la transición entre proteínas solubles e insolubles y participa en la desagregación de CI. Proteínas de heat shock lbpA, lbpB protegen a proteínas desnaturalizadas térmicamente de una agrgación irreversible y se han encontrado asociados a CI La expresión soluble de proteínas recombinantes se estimula por la co-sobree xpresión de GroEL–GroES y DnaK–DnaJ–GrpE junto con trigger factor (chaperonas citoplasma de 40 kDa).

Fig. 1. SDS–PAGE analysis (12%, Coomassie blue-stained) of CorA overexpressed in E. coli at (A) 37 °C, (B) 20 °C, and (C) 15 °C. Control lane at 37 °C: uninduced whole cell lysate. The expressed CorA protein migrated as a 40 kDa polypeptide. Inclusion bodies were solubilized in 6 M urea before the sample was loaded onto the gel.

Estrategias para mejorar la excreción de proteínas recombinantes en E. coli

1. Ingeniería de sistemas de excreción nativos en E. coli patógenas.

2. Uso de proteínas acarreadoras con mecanismos de translocación no conocidos

3. Desarrollo de mutantes en superficie celular 4. Co-expresión de proteínas promotoras de lisis (Kil)