1219-2521-1-SM (1)

132

Riris Istighfari Jenie dan Edy MeiyantoFakultas Farmasi, UGM, Sekip Utara Yogyakarta 55281

APLIKASI KO-KEMOTERAPI FRAKSIETIL ASETAT EKSTRAK ETANOLIKDAUN SAMBUNG NYAWA(GYNURA PROCUMBENS (LOUR.) MERR.)PADA SEL KANKER PAYUDARA MCF-7

Majalah Ilmu Kefarmasian, Vol. VI, No. 3, Desember 2009, 132 - 141ISSN : 1693-9883

ABSTRACTCombination chemotherapy has been an interesting attention in recent years to curecancer e.g. non-toxic or less toxic phytochemicals are being combined with chemo-therapeutic agents to sensitize cancer cell and to enhance the efficacy of chemothera-peutic agents as well as to reduce its toxicity to normal tissues. The aim of thisresearch is to examine whether ethyl acetate fraction of Gynura procumbens ethanolicextract (SEF) synergizes the therapeutic potential of doxorubicin (Dox) on breastcancer cell line MCF-7. MTT assay were used to measure the growth inhibitory effectof the combination therapy on MCF-7 cells. SEF (5-250 g/ml) treatment of cellresulted in 15-76% growth inhibition in a dose dependent manner (IC50 85 g/ml),while Dox (10-100 nM) treatment did not show any inhibitory effect. The combina-tions of SEF (5-40g/ml) with Dox (10-75 nM) seemed to not have any synergisticefficacy towards cell growth inhibition. Nevertheless, this result need further observa-tion regarding the IC50 of Dox on MCF-7 has not been determined yet. The cellcharacterization may influence the result. Doxorubicin could induce Akt survivalapoptosis pathway in MCF-7 resulting resistancy of the cell towards doxorubicin.

Key words: MCF-7 human mammary cancer cell, Doxorubicin, Sambung Nyawaleaves ethanolic extract, co-chemotherapy.

ABSTRAK

Penggunaan kombinasi kemoterapi, yaitu senyawa kemoprevensi yang bersifat non-toksik atau lebih tidak toksik dikombinasikan dengan agen kemoterapi, diketahui mampumeningkatkan sensitifitas sel kanker serta efikasi kemoterapi dengan penurunantoksisitas terhadap jaringan normal. Penelitian ini bertujuan untuk mengetahui efeksinergisme aplikasi ko-kemoterapi fraksi etil asetat ekstrak etanolik daun SambungNyawa (FES) atau Gynura procumbens (Lour.) Merr. terhadap sel kanker payudaraMCF-7. Uji MTT digunakan untuk mengukur besarnya efek penghambatan

Corresponding author : E-mail : [email protected]

133Vol. VI, No.3, Desember 2009

PENDAHULUAN

Strategi terapi yang tersediauntuk mengobati kanker payudara,termasuk agen sitotoksik (kemo-terapi), telah cukup banyak, namunsampai saat ini belum ada pengobat-an yang tepat untuk kanker payudarayang telah metastasis. Doxorubicin(Dox) merupakan salah satu agenkemoterapi yang banyak digunakandalam terapi kanker. Meskipundemikian ternyata penggunaan agenkemoterapi sistemik bukan saja tidakbegitu efektif namun juga tidakselektif dan sangat toksik bagijaringan lain yang normal (1).Pengurangan dosis akan mengurangiefek samping Dox oleh karenanyamenjadi suatu tantangan untuk dapatmemperbaiki aplikasi klinik agenkemoterapi supaya lebih efektif.Salah satu pendekatan yang sedangmendapat perhatian baru-baru iniadalah penggunaan kombinasi kemo-terapi (ko-kemoterapi), dimana

pertumbuhan sel MCF-7 oleh adanya perlakuan kombinasi FES-Dox, kemudianditentukan index kombinasinya (IK) untuk menetapkan apakah efeknya sinergis, aditifatau antagonis. Perlakuan dengan FES (5-250 g/ml) selama 48 jam menghasilkanpenghambatan pertumbuhan sel sebesar 15-76%, dengan IC50 85 g/ml sedangkanperlakuan dengan Dox (10-100 nM) belum menghasilkan efek penghambatan. Aplikasikombinasi FES (5-40 g/ml)-Dox (10-75 nM) nampaknya tidak menunjukkan efekyang sinergis, namun demikian hal ini masih perlu diteliti lebih lanjut mengingatIC50 Dox terhadap sel MCF-7 belum dapat ditentukan. Hasil penelitian kemungkinandipengaruhi oleh karakteristik sel uji yang digunakan. Doxorubicin diketahui mampumenginduksi jalur survival apoptosis Akt pada sel MCF-7, sehingga sel tersebut menjadiresisten terhadap doxorubicin.

Kata kunci: Sel kanker payudara MCF-7, Doxorubicin, ekstrak etanolik daunSambung Nyawa, ko-kemoterapi.

senyawa kemoprevensi yang bersifatnontoksik atau lebih tidak toksikdikombinasikan dengan agen ke-moterapi untuk meningkatkanefikasinya dengan menurunkantoksisitasnya terhadap jaringan yangnormal. Dengan perspektif inidilakukan penelitian terhadap agen-agen kemoprevensi untuk mencarikandidat yang memiliki efek sinergisdalam kombinasi dengan obatantikanker.

Salah satu agen kemoprevensiyang dapat digunakan adalah daunGynura procumbens (Lour.) Merr. atauyang lebih dikenal dengan daunSambung Nyawa. Tanaman ini me-rupakan salah satu tanaman Indone-sia yang digunakan secara empirisoleh masyarakat untuk mengobatikanker. Daun Sambung Nyawa jugatelah banyak diteliti aktivitas bio-loginya sebagai tanaman yangmemiliki efek kemopreventif. Sugi-yanto, et al. melaporkan adanya efekpenghambatan karsinogenitas

Sudah dipresentasikan di Kongres Ilmiah ISFI XV, 17-19 Juni 2007, Jakarta.

MAJALAH ILMU KEFARMASIAN134

benzo(a)piren oleh ekstrak etanolikdaun Sambung Nyawa (ESN) padapertumbuhan tumor paru mencit (2).Penelitian terakhir mengenai ESNmenyatakan bahwa fraksi XIX-XXESN memiliki efek sitotoksik ter-hadap sel kanker serviks, HeLa,dengan IC50 119 g/ml (3). Fraksitersebut juga menghambat proliferasisel HeLa dan dapat menginduksiterjadinya apoptosis. Berdasarkanhasil-hasil penelitian tersebut tam-paknya tanaman G. procumbensmempunyai potensi yang besar untukdikembangkan sebagai ko-kemo-terapi bersama agen kemoterapi yangtelah luas digunakan dalam terapikanker.

Beberapa agen kemoterapi di-laporkan efektif baik sebagai agentunggal maupun kombinasi untukpengobatan berbagai jenis kanker.Kombinasi kemoterapi memberikanhasil yang lebih efektif dibandingkanketika diberikan dalam bentuk agentunggal dan bahwa kombinasi yangmengandung Dox lebih efektifdibandingkan dengan regimen lain(4). Penelitian ini akan mengujiapakah G. procumbens mempunyaiefikasi yang sinergis dengan agenkemoterapi Dox sehingga dapatmenurunkan dosis efektifnya yangberarti pula mengurangi toksisitasagen kemoterapi tersebut?

METODOLOGI

BahanDoxorubicin dipeoleh dari

Ebewe, PT. Ferron Par Pharmaceuti-

cal. Ekstrak etanolik daun G. pro-cumbens diperoleh dengan meng-ekstraksi serbuk kering daun yangdidapatkan dari Balai PenelitianTanaman Obat (BPTO), Karang-anyar, Surakarta, dengan etanol 96%.Ekstrak etanol ini dilarutkan denganDimethyl Sulfoxide (DMSO) (Sigma).Sel kanker payudara MCF-7 diper-oleh dari Prof. Tatsuo Takeya (NaraInstitute of Science and Technology,Jepang). Kultur sel ditumbuhkandalam media penumbuh Dulbeccosmodified Eagles medium (DMEM) yangmengandung Foetal Bovine Serum(FBS) 10% (v/v) (Gibco), penisillin-streptomisin 1% (v/v) (Gibco). Selainbahan-bahan di atas juga digunakan0,05% trypsin-EDTA (Gibco) dalamHBSS tanpa Ca2+/Mg2+untuk melepassel yang melekat pada flask maupunplate, PBS tanpa Ca2+/Mg2+. UjiMTT. MTT [3-(4, 5-dimetiltiazol-2-il)-2, 5-difeniltetrazolium bromida](Sigma), dengan konsentrasi 5 mg/ml. Stopper yang digunakan adalahisopropanol asam yaitu HCl 4Ndalam isopropanol dengan perban-dingan 1:100. Bahan-bahan yangdigunakan selama penelitian apabilatidak dikatakan lain berarti ber-derajat pro analisis.

Uji ko-kemoterapi menggunakanmetode MTT

Sel MCF-7 dengan konsentrasi5 x 103 sel/sumuran didistribusikanke dalam plate 96 sumuran dan diin-kubasi selama 24 jam untuk ber-adaptasi dan menempel di sumuran.Keesokannya media diambil, dicuci



PBS, kemudian ditambahkan 100 lmedia kultur yang mengandungDMSO 0,5% v/v saja (kontrol) atausampel baik dalam bentuk tunggalyaitu ekstrak atau dox saja maupungabungan keduanya (kombinasi),inkubasi selama 48 jam. Pada akhirinkubasi, media kultur yangmengandung sampel dibuang, dicucidengan 100 l PBS. Kemudian kedalam masing-masing sumuranditambahkan 100 l media kulturyang mengandung MTT 5 mg/ml,inkubasi lagi selama 4 jam pada suhu370C. Sel yang hidup akan bereaksidengan MTT membentuk kristalformazan berwarna ungu. Setelah 4jam, media yang mengandung MTTdibuang, dicuci dengan PBS, kemu-dian ditambahkan larutan asam iso-propanol untuk melarutkan kristalformazan. Digoyang di atas shakerselama 10 menit kemudian dibacadengan dengan ELISA reader padapanjang gelombang 550 nm.

Analisis hasilData yang diperoleh berupa

absorbansi masing-masing sumurandikonversi ke dalam persen sel hidupdan dianalisis untuk mengetahuisignifikansi perbedaan antara kelom-pok kontrol dengan kelompok per-lakuan. Persen sel hidup dihitungmenggunakan rumus:

Kemudian dihitung konsentrasiIC50 yaitu konsentrasi yang menye-babkan kematian 50% populasi selsehingga dapat diketahui potensisitotoksisitasnya. Selanjutnya diana-lisis dengan tes Anova, dilanjutkandengan tes Tukey dan student ttestmenggunakan SPSS 11.0, untukmengetahui signifikansinya dengankontrol. Sitotoksisitas sinergistikditetapkan dengan menghitungindeks kombinasi (IK atau Combina-tion Index, CI) antara agen kemo-terapi dengan ekstrak SambungNyawa, menggunakan persamaan:

CI= (D)1/(Dx)1 + (D)2/(Dx)2Dimana Dx adalah konsentrasi

dari satu senyawa tunggal yangdibutuhkan untuk memberikan efek(dalam hal ini adalah IC50 terhadappertumbuhan sel kanker payudara)dan (D)1, (D)2 adalah besarnyakonsentrasi kedua senyawa untukmemberikan efek yang sama (5).Angka CI atau indeks kombinasi yangdiperoleh diinterpretasikan sebagaiberikut:

< 0.1 sinergis sangat kuat0.10.3 sinergis kuat0.30.7 sinergis0.70.9 sinergis ringan-sedang0.91.1 mendekati additif1.11.45 antagonis ringan-sedang1.453.3 antagonis> 3.3 antagonis kuat-sangat kuat

% Hidup =Absorbansi Sel Dengan Perlakuan - Absorbansi Kontrol MediaAbsorbansi Kontrol Sel - Absorbansi Kontrol Media x 100 %



HASIL DAN PEMBAHASAN

Uji Ko-kemoterapi Ekstrak EtanolikDaun G. procumbens (ESN) danDoxorubicin (dox) Terhadap SelMCF-7

Sel MCF-7 merupakan sel kankerpayudara yang mengekspresikanreseptor estrogen (ER +) dengan wildtype p53 sehingga sensitif terhadapagen kemoterapi (6), oleh karenanyaingin diketahui terlebih dahulu bagai-mana respon sel MCF-7 terhadapperlakuan ko-kemoterapi ekstraketanolik daun G. procumbens (ESN)dan doxorubicin (dox). Pada aplikasitunggal nampak perlakuan ESN (10-300 g/ml) belum mampu meng-hambat pertumbuhan sel MCF-7,demikian pula pada aplikasi tunggaldox (1,8-90 nM) (Gambar 1).

Selanjutnya dilakukan uji ko-kemoterapi untuk melihat efikasikombinasi keduanya terhadap peng-hambatan pertumbuhan sel MCF-7,yaitu apakah sinergis, aditif atauantagonis. Hasilnya menunjukkanbahwa kombinasi ESN (75, 150, dan250 g/ml) dan dox (1,8, 9, dan 18nM) belum mampu menghambatpertumbuhan sel MCF-7.

Uji Ko-kemoterapi Fraksi Etil AsetatEkstrak Etanolik Daun G. procum-bens (FES) dan Doxorubicin (dox)Terhadap Sel MCF-7

Ekstrak kemudian difraksinasidengan etil asetat untuk medapatkangolongan flavonoid yang terkandungdi dalamnya. Fraksi etil asetatdiharapkan mampu meningkatkanefikasi dox karena diketahui bahwa

Gambar 1. Aplikasi tunggal ESN dan dox pada sel MCF-7. Untuk melihat efikasiESN dan Dox sebagai agen tunggal pada sel MCF-7, sel ditanam sebanyak 5000sel/sumuran dalam plate 96 sumuran, kemudian diberi perlakuan baik dengan ESN(10-300 g/ml) maupun Dox (1,8-90 nM) (dalam bentuk tunggal) sebagaimanadijelaskan dalam metodologi. Baik ESN maupun Dox belum mampu menghambatpertumbuhan sel MCF-7, tidak ada perbedaan yang signifikan (P>0,05) antaraperlakuan dengan kontrol (DMSO 0.3% v/v). Grafik merupakan nilai rata-rata + SDdari 3 percobaan.



flavonoid mampu mensensitisasi selkanker melalui penghambatanPgp.(7). Sebelum diaplikasikan untukuji kokemoterapi, masing-masingfraksi yang diperoleh (yaitu fraksiheksan, etil asetat dan air) diujisitotoksisitas terlebih dahulu untukmembandingkan potensinya pada selMCF-7. Berdasarkan nilai IC50 yangdiperoleh tampak bahwa fraksi etilasetat (FES) merupakan fraksi yangpaling poten di antara ketiganya(Tabel 1). Oleh karena itu fraksi etilasetat yang diteruskan untuk diujiaplikasi kokemoterapinya.

Aplikasi tunggal FES (5-250 g/ml) mampu menghambat pertum-

Gambar 2. Efek aplikasi ko-kemoterapi ESN-Dox pada sel kanker payudaraMCF-7. Pengamatan efek kombinasi ESN (75-250 g/ml)-Dox (1,8-18 nM) terhadapsel MCF-7 dilakukan sebagaimana yang dijelaskan pada metodologi. Kombinasikeduanya belum mampu menghambat pertumbuhan sel MCF-7. Ini menunjukkanbahwa ESN tidak meningkatkan efikasi Dox pada sel kanker payudara MCF-7.

buhan sel MCF-7 sebesar 15-76%namun aplikasi dox (10-100 nM)belum menunjukkan efek peng-hambatan (Gambar 3). Lebih lanjut,hasil uji aplikasi ko-kemoterapikeduanya ternyata tidak menun-jukkan efikasi yang sinergis (Gambar4).

Tabel 1. Potensi fraksi heksan, etilasetat, dan air terhadap penghambatan

pertumbuhan sel MCF-7

No Fraksi Nilai IC50 (mg/ml)

1. Heksan 942. Etil asetat 853. Air > 300



Gambar 3. Aplikasi tunggal FES dan dox pada sel MCF-7. Untuk melihat efikasiFES dan Dox sebagai agen tunggal pada sel MCF-7, sel ditanam sebanyak 5000sel/sumuran dalam plate 96 sumuran, kemudian diberi perlakuan baik dengan FES(5-250 g/ml) maupun Dox (10-100 nM) (dalam bentuk tunggal) sebagaimanadijelaskan dalam metodologi. FES mampu menghambat pertumbuhan sel MCF-7dengan IC50 sebesar 85 g/ml, sedangkan aplikasi Dox belum menunjukkan efekpenghambatan. Tanda bintang (*) menunjukkan perbedaan yang signifikan terhadapkontrol (DMSO 0,25% v/v) dengan taraf kepercayaan 95% (P


responsif terhadap stimulasi estro-gen. Penelitian Welshons et al. me-nyebutkan bahwa phenol red suatuindikator pH yang terdapat mediapenumbuh kultur sel bersifat estro-genik dan terhadap stimulasi estro-gen dari phenol red ini

MCF-7 lebih responsif daripadaT47D (sel kanker payudara lain yangjuga ER +)(9).

Di samping itu stimulasi estrogenternyata meningkatkan konsentrasiP-gp pada MCF-7 namun tidak demi-kian pada sel T47D (10). Hal tersebutdiduga berkaitan dengan subtipe darireseptor estrogen yang diekspresikanoleh kedua sel. MCF-7 mengekspre-sikan reseptor estrogen subtipe alpha

Gambar 4. Efek aplikasi ko-kemoterapi FES-Dox pada sel kanker payudara MCF-7. Pengamatan efek kombinasi FES (5-40 g/ml)-Dox (10-75 nM) terhadap sel MCF-7 dilakukan sebagaimana yang dijelaskan pada metodologi. Kombinasi keduanyabelum mampu menghambat pertumbuhan sel MCF-7. Ini menunjukkan bahwa FEStidak meningkatkan efikasi Dox pada sel kanker payudara MCF-7.

(ER), sedangkan T47D subtipe ERbeta (ER). Perbedaan karakteristikmolekuler di tingkat subtipe reseptorestrogen ternyata mampu menim-bulkan respon yang berbeda. LevelP-gp mempengaruhi sensitifitas selkanker terhadap kemoterapi karenaP-gp akan memompa keluar obat/kemoterapi dari sel. Berdasarkantemuan-temuan hasil penelitiantersebut diduga resistensi MCF-7terhadap dox disebabkan olehadanya peningkatan konsentrasi Pgppada sitoplasma sel MCF-7 yangtimbul karena adanya stimulasi estro-gen dari phenol red yang terdapatdalam media penumbuh kultur sel.



KESIMPULAN

Fraksi etil asetat ekstrak etanolikdaun G. procumbens belum mampumeningkatkan efikasi dox terhadapsel kanker payudara MCF-7. Bahkanefikasi dox tunggal terhadap selMCF-7 belum dapat ditentukan (nilaiIC50-nya lebih besar dari konsentrasiyang dicobakan pada penelitian). Halini terutama dipengaruhi oleh karak-teristik sel MCF-7, yang pada akhir-nya mengurangi sensitivitas seltersebut terhadap agen kemoterapi.Aplikasi kokemoterapi G. procumbensperlu diteliti lebih lanjut terhadap selkanker payudara yang lain sehinggadapat dibandingkan hasilnya dandipelajari mekanisme aksinya.Masing-masing sel kanker memilikikarakteristik molekuler yang ber-beda, oleh karena itu sangat mungkinrespon yang timbul akibat aplikasiko-kemoterapi juga berbeda.

UCAPAN TERIMAKASIH

Terimakasih disampaikan ke-pada seluruh anggota Cancer Che-moprevention Research Center (CCRC)Fakultas Farmasi Universitas GadjahMada yang telah mendukung danmembantu kelancaran penelitian ini.

DAFTAR ACUAN

1. Wattanapitayakul SK, L Chula-rojmontri, A Herunsalee, SCharuchongkolwongse, S Nium-sakul, JA Bauer. 2005. Screeningof Antioxidants from Medicinal

Plants for Cardioprotective Ef-fect against Doxorubicin Toxic-ity, Basic & Clinical Pharmacology& Toxicology, vol. 96, 80.

2. Sugiyanto, B Sudarto, E Mei-yanto, AE Nugroho, UA Jenie.2003. Aktivitas AntikarsinogenikSenyawa yang Berasal dariTumbuhan, Majalah Farmasi Indo-nesia, 14 (4):216-225.

3. Meiyanto E and EP Septisetyani.2005. Efek Antiproliferatif danApoptosis Fraksi Fenolik EkstrakEtanolik Daun Gynura procumbens(Lour.) Merr. terhadap Sel HeLa,Artocarpus, Vol. 5, No.2, Hal. 74- 80.

4. Sharma G, AK Tyagi, RP Singh,DCF Chan, R Agarwal. 2004.Synergistic Anti-Cancer Effect ofGrape Seed Extract and Conven-tional Cytotoxic Agent Doxoru-bicin Against Human Breast Car-cinoma Cells, Breast Cancer Re-search and Treatment, 85:1-12.

5. Reynolds CP, BJ Maurer. 2005.Evaluating Response to Antine-oplastic Drug Combinations inTissue Culture Models, MethodsMol. Med., 110: 173-183.

6. Crawford KW and WD Bowen.2002. Sigma-2 Receptor AgonistsActivate a Novel Apoptotic Path-way and Potentiate Antineoplas-tic Drugs in Breast Tumor CellLines, Cancer Research, 62, 313-322.

7. Kitagawa S. 2006. Inhibitory Ef-fect of Polyphenols on P-Glyco-protein-Mediated Transport,Biol. Pharm. Bull., 29(1), 1-6.



8. Amundson SA, TG Myers, DScudiero, S Kitada, JC Reed, AJFornace Jr. 2000. An InformaticsApproach Identifying Markers ofChemosensitivity in Human Can-cer Cell Lines, Canc. Res., 60,6101-6110.

9. Welshons WV, MF Wolf, CSMurphy, VC Jordan. 1988. Estro-genic activity of phenol red, MolCell Endocrinol, 57(3):169-78.

10. Zampieri L, P Bianchi, P Ruff, PArbuthnot. 2002. Differentialmodulation by estradiol of P-gly-coprotein drug resistance proteinexpression in cultured MCF7 andT47D breast cancer cells, Antican-cer Res., 22(4): 2253-9.


Documents

1219-2521-1-SM (1)