Chương 5PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH VI SINH VẬT TRONG NƯỚC

VÀ THỰC PHẨM

1. PHƯƠNG PHÁP LẤY MẪU THỰC PHẨM

1.1 Kế hoạch lấy mẫuMật độ các vi sinh vật trong thực phẩm được qui địnhgiới hạn với một số lượng nhật định

tuỳ theo từng nhóm vi sinh vật cần phân tích và yêu cầu của từng đối tượng thực phẩm cũng như các luật về vệ sinh an toàn thực phẩm. Đối với các vi sinh vật gây bệnh thông thường yêu cầu không được hiện diện trong một khối lượng thực phẩm xác định. Số lựơng vi sinh vật được xác định trong thực phẩm có thể không bao giờ phản ánh chính xác số lượng vi sinh vật thực tế có trong mẫu, vì thế một khoảng giới hạn theo thông lệ được thiết lập để nhận biết các mẫu thực phẩm đạt hay không đạt yêu cầu vi sinh vật. Thông thường các khoảng giới hạn mật độ vi sinh vật trong thực phẩm được xác định bằng các khoảng như sau: Khoảng chấp nhận khi mật độ vi sinh vật nằm dưới một thông số chấp nhận (m), khoảng sát mép giới hạn khi mật độ vi sinh này lớn hơn giới hạn chấp nhận nhưng nhỏ hơn giới hạn trên (M). Khoảng không chấp nhận khi mật độ này cao hơn giới hạn trên M. Giới hạn M thường cao hơn ít nhất 10 lần so với thông số giới hạn m. Ví dụ tổng số vi sinh vật trong sản phẩm trứng được thanh trùng Pasteur có yêu cầu như sau:

n = 5, c = 2, m = 5 x 104, M = 106

Trong đó n là số mẫu thử nghiệm, c là số mẫu được phép nằm trong khoảng sát mép giữa m và M.

Kế hoạch lấy mẫu loại 2 được dùng cho các thử nghiệm phân tích vi sinh vật gây bệnh. Theo kế hoạch này, số mẫu được lấy có thể 5,10, 20, 25 hay nhiều hơn để phân tích định tính nhằm phát hiện có hay không có sự hiện diện các vi sinh vật trong khối lượng mẫu thử nghiệm như trên. Sẽ không chấp nhận nếu có một trong số các mẫu trên có sự hiện diện của các vi sinh vật gây bệnh (n = 5,10,20 hay nhiều hơn, c = 0 và n = 0). Số lượng mẫu thử phụ thuộc vào mối nguy hiểm của từng loại thực phẩm nếu có sự hiện diện của vi sinh vật gây bệnh. Thực phẩm có mối nguy hiểm cao là những loại thực phẩm không qua gia nhiệt trước khi sử dụng hay những thực phẩm có tính nhạy cảm cao, ví dụ thực phẩm dành cho người già và trẻ em …

Lấy mẫu cho việc phân tích Salmonella:Số lượng đơn vị mẫu để phân tích Salmonella phụ thuộc vào các yếu tố đặc trưng của từng

loại thực phẩm, có thể chia thành 3 nhóm thực phẩm chính như sau:- Nhóm thực phẩm dùng cho các đối tượng nhạy cảm với Salmonella nhưng không qua quá

trình chế biến trước khi sử dụng, ví dụ thực phẩm dành cho người già, dành cho người bệnh hay dành cho trẻ em. Trong nhóm này số lượng đơn vị mẫu phải lấy khoảng 60 đơn vị mẫu.

- Nhóm thực phẩm dành cho người trưởng thành. Số lượng đơn vị mẫu được lấy thường là 30 đơn vị.

- Nhóm thực phẩm mà trong chế biến quá trình có qua giai đoạn có thể tiêu diệt Salmonella. Bước chế biến này có thể diển ra trong quá trình sản xuất hay chế biến tại gia đình. Trong nhóm này, số lượng mẫu được lấy thường là 15 đơn vị.

Mỗi đơn vị mẫu được lấy ít nhất 100g, thông thường được lấy nguyên một đơn vị sản phẩm. Đơn vị mẫu được lấy ngãu nhiên sao cho mẫu đó đại diện cho cả lô sản phẩm. Trong trường hợp phải tách mẫu vào trong các vật dụng lấy mẫu phải luôn lấy một mẫu kiểm chứng để đảm bảo điểu kiện bảo quản mẫu tương tự với điều kiện khi lấy mẫu. Nếu một đơn vị sản phẩm không đủ khối

53

lượng mẫu cần thiết, như trong trường hợp đơn vị sản phẩm được đóng gói nhỏ hơn 100g, khi đó mỗi đơn vị mẫu phải lấy nhiều hơn một đơn vị sản phẩm.

Tại phòng thí nghiệm, các chuyên viên phân tích sẽ lấy đại diện 25g (hay khối lượng theo yêu cầu phân tích) từ các đơn vị mẫu để phân tích Salmonella. Trong trường hợp số đơn vị sản phẩm nhiều hơn số đơn vị mẫu, các đơn vị sản phẩm sẽ được tổ hợp một cách vô trùng và phân tích viên sẽ lấy đại diện khối lượng mẫu phân tích.

1.2 Phương pháp lấy mẫu và bảo quảnGiá trị của kết quả được phát hành bởi các phòng thí ngiệm phân tích phụ thuộc rất nhiều

vào phương pháp và qui trình lấy mẫu. Kế hoạch lấy mẫu được áp cho từng trường hợp cụ thể để mẫu được mang vể phòng thí nghiệm phản ánh đúng tình trạng sản phẩm cần phân tích. Trong các nhà máy sản xuất, thông thường mẫu được lấy với một khối lượng nhỏ tại nhiều thời điểm và công đoạn khác nhau trong quá trình sản xuất, không nên lấy một khối lượng lớn mẫu tại cùng một vị trí hay một công đoạn. Có thể tập trung lấy mẫu tại công đoạn thành phẩm nhiều hơn, nhưng trong một số trường hợp cần thiết có thể tập trung lấy mẫu tại một vài công đoạn trọng yếu trong quá trình sản xuất.

Dụng cụ lấy mẫu và thùng chứa mẫu: Thường sử dụng các bình nhựa có nắp bằng nhôm hay bằng chất dẻo, báo bao nylon để chứa mẫu. Không nên sử dụng các bình bằng thuỷ tinh để chứa mẫu bởi vì có thể bị vở gây nhiễm mẫu hay gây tại nạn cho người phân tích.

Dụng cụ lấy mẫu thường làm bằng các loại chất liệu khác khác nhau như vật dụng dùng để lấy mẫu đông lạnh là các khoan tay đã được vô trùng, hay các dao được rửa trong các dung dịch tẩy trùng. Không nên lấy vào các mảng băng. Sử dụng các thìa, kéo … để cho mẫu vào trong bình chứa. Đối với các thực phẩm đã đóng gói, lấy mẫu từ các gói lớn từ đó lấy ra các đơn vị bao gói nhỏ hơn.

Mẫu phải được lấy ít nhất khoảng 100-250g cho mỗi mẫu tuỳ theo các yêu cầu phân tích, phải lấy tại nhiều vị trí trên sản phẩm hay trong cùng một công đoạn sao cho một khối lượng nhỏ mẫu cũng đại diện cho sản phẩm đó.

Đối với các loại mẫu thịt hay cá, nơi nhiễm vi sinh chủ yếu là trên bể mặt, vì thế có thể sử dụng các dụng cụ lấy mẫu bể mặt để quét trên bể mặt sản phẩm hay cắt mẫu trên bể mặt với độ dày khoảng 2-3mm.

Vận chuyễn và bảo quản mẫu: Các mẫu sau khi lấy được bảo quản một các độc lập với nhau trong các thùng bảo quản mẫu, làm lạnh bằng các bao nước đá. Nước đá phải không được tan chảy trong suốt quá trình vận chuyển mẫu đến phòng thí nghiệm. Tại phòng thí nghiệm mẫu được chuyển vào trong tủ đông hay được phân tích ngay trong thời gian có thể.

Nếu không thể phân tích ngay, mẫu phải được bảo quản ở –20oC cho đến khi phân tích. Nếu các mẫu không thể bảo quản đông, thì phải bảo quản trong tủ lạnh 0-4oC không được quá 36 giờ. Các loại thực phẩm như đồ hộp, thực phẩm có độ ẩm thấp, hay thực phẩm khó hư hỏng có thể bảo quản ở nhiệt độ phòng cho đến khi phân tích.

1.3 Rã đông trước khi phân tíchPhải sử dụng kỹ thuật rã đông trong điểu kiện vô trùng trước khi phân tích mẫu. Trong

trường hợp phải phối trộn mẫu trước khi phân tích, mẫu phải được rã đông trong các dụng cụ chứa như khi mang đến phòng kiểm nghiệm. Tránh các trường hợp chuyển mẫu sang các bình chứa thứ hai khi rã đông. Thông thường nhiệt độ rả đông là 2-5oC trong khoảng 18 giờ, nếu cần phải rã đông nhanh có thể thực hiện ở 45oC trong vòng 15 phút. Khi rã đông ỡ nhiệt độ cao, phải liên tục lắc bình chứa mẫu để tăng tốc độ rã và nhiệt độ của mẫu được đồng nhất.

54

1.1 Đồng nhất mẫuSự phân phối của các vi sinh vật trong mẫu không đồng đều nhau. Để đảm bảo tính đồng

nhất trong các mẫu phân tích, các mẫu lỏng được lắc kỹ trước khi phân tích. Các mẫu rắn được lắc hay đão trộn bằng các dụng cụ chuyên dùng trong điều kiện vô trùng. Sau khi đảm bảo mẫu được đồng nhất, lấy một lượng mẫu xác định để phân tích tùy theo yêu cầu của từng chỉ tiêu cụ thể, ví dụ đối với các chỉ tiêu định lượng trong 1 gam, khối lượng mẫu trích ra để phân tích là 10g, đối với các chỉ tiêu định tính như Salmonella khối lượng mẫu trích ra là 25 gam …

1.2 Cân mẫuCân một lượng mẫu xác định để phân tích tuỳ theo từng chỉ tiêu yêu cầu như trên, cân chính

xác khối lượng mẫu nhất định, sai số của phép cân này là ±0.1g. Lượng mẫu trích để phân tích được cho vào trong các bình chứa bằng nhựa hay các bao nhựa vô trùng.

2. LẤY VÀ BẢO QUẢN MẪU NƯỚC

Tiêu chí của việc lấy mẫu là mẫu phải đại diện mức cao nhất của nước cần phân tích. Để đạt được mục đích này, người lấy mẫu cần phải tuân thủ các qui định và qui trình trong việc lấy mẫu và phân tích.2.1 Dụng cụ chứa mẫu

Các dụng cụ lấy mẫu nhằm để phân tích vi sinh vật là những chai lọ đã đã được súc rửa cẩn thận, tráng lại lần cuối cùng bằng nước cất và khử trùng trước khi sử dụng đế lấy mẩu. Có thể sử dụng các túi nhựa đã được khử trùng để làm dụng cụ chứa mẫu.

Khử chlorin và độc tính kim loại trong mẫu nướcThêm một nhân tố có tính khử vào trong trong các chai lọ dùng đẩ chứa mẫu để khử

chlorin hay các halogen khác. Trong trường hợp không có các tác nhân khử trong các lọ lấy mẫu, sau khi thu những mẫu nước có chứa chlorin các chai lọ lấy mẫu không được đóng nắp. Nhân tố khử thường được sử dụng đế khử chlorin trong nước là sodium thiosulphate, chất này trung hoà và khử các các haologen trong nước nhằm ngăn cản sự tác động của chúng lên các vi sinh vật trong mẫu trong thời gian vận chuyển. Sự loại bỏ các nhân tố tác động lên vi sinh vật trong quá trình vận vận chuyển và bảo quản mẫu để sau khi phân tích quả số lượng vi sinh vật phản ánh đúng mật độ của chúng ngay khi lấy mẫu.

Hàm lượng sodium thiocianate được cho vào trong các lọ sao cho sau khi lấy mẫu chúng phòng thích vào trong nước với nồng độ 100mg/l. Trong chai lấy mẫu có thể tích 120ml thêm vào 0,1ml dung dịch Na2S2O3 10% sẽ trung hoà hết chlorin trong mẫu với nồng độ 15mg/l. đối với nước uống hàm lượng chất khử chlorin có thể sử dụng thấp hơn, khoảng 0,1ml dung dịch Na 2S2O3

nồng độ 3% trong lọ chứa 120ml mẫu. Nồng độ chất khử này phóng thích vào trong mẫu nước là 18ml/l sẽ trung hoà nổng độ chlorin trong mẫu là 5ml/l. Trong trường hợp mẫu nước được khử trùng với hàm lượng chlorin cao, nồng độ các chất cho vào trong các lọ lấy mẫu phải đạt 100ml/l. Các tác nhân khử chlorin được cho vào trong các lọ lấy mẫu trước khi khử trùng. Có thể sử dụng phương pháp khử trùng ướt hay khử trùng khô đối với các dụng cụ lấy mẫu. Ngày nay có các túi lấy mẫu chứa sằn các tác nhân khử chlorin được bán tại các của hàng vật tư phòng thí nghiệm.

Trong trường hợp mẫu nước chứa các kim loại như đồng, kẽm và các kim loại nặng … với hàm lượng cao hay nước thải, trong các dụng cụ lấy mẫu phải cho vào các tác nhân khử độc tính của các kim loại này. Tác nhân này đặc biệt cần thiết khi thời gian vận chuyển mẫu trên 4 giờ. Chất khử độc tính của kim loại nặng được sử dụng là muối sodium của EDTA (ethylenediaminetetraacetic acid) với hàm lượng phóng thích vào trong mẫu là 372ml/l. EDTA

55

được điều chỉnh vể pH 6,5 trước khi dùng. EDTA cũng được cho vào trong các dụng cụ lấy mẫu trước khi khử trùng, hàm lượng cho vào là 0.3ml dung dịch EDTA 15% đối với chai lấy 120ml mẫu. Có thể kết hợp sodium thiocianat với EDTA trong cùng một dụng cụ lấy mẫu.Qui trình lấy mẫu

Mẫu được lấy vào trong các dụng cụ lấy mẫu, không được lấy đầy chai mà mà phải chừa một khoảng không trong chai chứa mẫu để đảm bảo mẫu được trộn đều bằng cách lắc trước khi phân tích. Mẫu được lấy phải đại diện cho nước được thử nghiệm, phải sử dụng các biện pháp vô trùng để tránh các trường hợp mẫu bị nhiễm từ bên ngoài hay nhiễm chéo giữa các mẫu với nhau. Trong quá trình lấy mẫu, giữ chặc chai cho đến khi nước đầy chai, giữ các nút hay nắp chai không được nhiễm trong khi lấy mẫu. Sau khi lấy đầy mẫu phải nút miệng chai ngay.

Cách thực lấy mẫu được tiến hành như sau: - Lấy mẫu từ các nguồn là sông, suối, hồ chứa bằng cách cầm chai lấy mẩu trong tay, gần

vị trí đáy chai, đưa cổ chai hướng xuống dưới và đưa sâu vào dưới mặt nước. Xoay nhẹ để cổ chai hơi nghiên lên bề mặt nước và miệng chai hường về phía dòng chảy. Trong trường hợp không có dòng chảy như nước trong hồ hay trong các bồn chứa phải tạo ra một dòng chảy nhân tạo bằng cách xoay chai theo hướng nằm ngang và đẩy chai di chuyển về phía theo hương miệng chai. Trong trường hợp lấy mẫu khi đi trên thuyền, mẫu phải được lấy ở phía trước mũi thuyền. Nếu không thể lấy bằng cách thức này, có thể buộc một vật nặng vào bên dưới đáy chai rồi đưa từ từ vào trong nước. Trong mọi trường hợp đều tránh chai lấy mẫu tiếp xúc với bờ hay đáy của suối hai bồn chứa.

- Có các dụng cụ đặc biệt cho phép mở nắp và lấy mẫu bên dưới mặt nước được sử dụng để lấy các mẫu nước sâu trong các hồ hay các bồn chứa. Có rất nhiều bình lất mẫu sâu hoạt động theo nhiều cách khác nhau như phổ biến nhất là bình lấy mẫu ZoBell-J-Z. Các dụng cụ lấy mẫu nước tự động theo yêu cầu ngày nay cũng đã được bán tại các của hàng vật tư phòng thí nghiệm.

- Lấy mẫu nước sinh hoạt: Nếu lấy mẫu nước từ các vòi của hệ thống cấp nước dịch vụ, chọn những vòi cấp nước trực tiếp từ các đường ống chính, không nên lấy từ các thùng hay bồn chứa. Mở vòi nước thật lớn và để chảy ra ngoài từ 2-3 phút, trong thời gian này nhằm đề rửa sạch hệ thống vòi nước trước khi lấy mẫu, giảm vòi nước để lấy mẫu vào trong các bình chứa. Trong một số trường hợp cần phải làm sạch vòi trước khi lấy mẫu, dung dịch sodium hypochorite được cho chảy qua vòi trước khi lấy mẫu, sau khi khử trùng, phải mở nước vòi cho chảy khoàng 2-3 phút trước khi lấy mẫu vài chai. Không lấy mẫu từ các dòng nước chảy tràng bên ngoài vòi. Để ngăn ngừa các dòng nước chảy tràn từ bên ngoài vòi vào trong mẫu, có thể dùng dụng cụ phễu lọc để ngăn ngừa các dòng nước tràn từ bên ngoài vào trong bình chứa mẫu. Cũng có thể loại bỏ sự nhiễm từ bên ngoài do các dòng nước chảy tràn, cho nước nóng chảy qua vòi khoảng hai phút, làm lạnh từ 2-3 phút sau đó lấy mẫu vào bình.

Nếu lấy mẫu nước từ các giếng bơm tay, bơm nước để rửa vòi giếng khoảng 5 phút trước khi lấy mẫu. Nếu giếng đào được trang bị máy bơm, cũng trực hiện tương tự như trên sau khi khời động máy. Trong trường hợp các giếng đào không có trang bị máy bơm, mẫu được lấy trực tiếp từ giếng bằng cách buộc chai lấy mẫu vào một vật nặng ở bên dưới đáy. Phải thật cẩn thận để tránh sự nhiễm bẩn từ vật nặng hay nước trên bề mặt giếng.

Trong trường hợp lấy mẫu nước uống, phải lấy mẫu ở giai đoạn cuối của quá trình sản xuất, các vị trí phân phối mẫu nước uống phải được chọn lọc để đảm bảo sự tích lũy có hệ thống trong suối mỗi tháng. Phải xem xét thật kỹ càng vị trí của hệ thống phân bổ mẫu, ngay cả tại các điểm chiết để đảm bảo chất lượng vi sinh vật thông qua toàn bộ hệ thống để đảm bào rằng không có các vị trính nhiểm vi sinh vật hay nhiểm chéo do qua trình tiên tục của hệ thống như hiện tượng bể ống hay giảm áp lực trong qua trình khử trùng hay một nguyên nhân nào đó khác. Vị trí lấy mẫu có thể

56

là vòi nước công cộng, các nơi kinh doanh ngành thực phẩm, nhà hàng hay giếng nước các nhân … Nhưng đặc biệt quan trọng khi lấy mẫu tại các mạng lưới cung cấp nước cho cộng đồng. Sự lấy mẫu, kế hoạch cũng như tầng suất và vị trí lấy mẫu phải được lên chương trình có sự tham vấn của các chuyên gia vệ sinh y tế công cộng, và ngành cấp nước.

- Lấy mẫu tại các nguồn cấp nước: Mẫu được lấy trực tiếp từ các từ sông, suối, lạch, ao, các giếng hay các hồ chứa sao cho chúng đại diện cho nguồn nước cung cấp cho con người sử dụng. Mẫu không nên lấy quá gần bờ hay quá xa nơi đặt ống bơm nước, cũng không nên lấy mẫu quá sâu hay quá cạn so với vòi ống bơm. Mẫu được lấy càng gần miệng ống bơm, càng đại diện cho nguồn chất lượng của nguồn cấp nước.

Kích cở mẫu: Thể tích mẫu phải đủ để đáp ứng các yêu cầu phân tích tại phòng thí nghiệm. Thể tích mẫu phải lấy không được nhỏ hơn 100ml.

Mẫu sau khi lấy phải ghi đầy đủ và chính xác về ký hiệu, tên và các dữ liệu được mô tả. Không tiến hành phân tích các mẫu không đầy đủ các dữ liệu yêu cầu.

Thời gian và nhiệt độ bảo quản mẫu: Nếu có thể, phân tích các chỉ tiêu vi sinh ngay sau khi lấy mẫu để tránh những sự thay đổi

không lường trước được. Nếu mẫu không thể phân tích ngay trong vòng 1 giờ sau khi lấy mẫu, phải bảo quản trong các thùng lạnh trước khi vận chuyển đến các phòng thí nghiệm. Nếu kết quả phân tích có liên quan đến pháp luật, phải sử dụng một phương tiện vận chuyển đặc biệt để chuyển mẫu đến phòng thí nghiệm trong khoảng thời gian 6 giờ với một qui trình bảo quản đặc biệt.

Nhiệt độ bảo quản nước uống, nước suối, hay nước bị ô nhiễm là dưới 10oC và thới gian vận chuyển không quá 6 giờ. Bảo quản trong tủ lạnh tại các phòng thí nghiệm cũng không dược quá 2 giờ. Trong điều kiện bắt buộc không thể vận chuyển mẫu về phòng thí nghiệm nhanh hơn 6 giờ, phải xem xét đến việc trang bị các phương tiện phân tích ngay tại vị trí lấy mẫu hoặt sử dụng qui trình ủ chờ. Tuy nhiên các yêu cầu như trên khó được đáp ứng. Trên thực tế các chỉ tiêu yêu cầu thới gian vận chuyển và bào qu ản không quá 24 giờ. Không chấp nhận các mẫu khi gởi đến phòng thí nghiệm bằng đường bưu điện và không được bảo quản theo các yêu cầu. Thời gian và nhiệt độ bảo quản mẫu phải được lưu trữ đế sau khi phân tích dùng vào việc xử lý số liệu.

3. ĐỊNH LƯỢNG TỔNG SỐ VI SINH VẬT HIẾU KHÍ

3.1. Định nghĩaVi sinh vật hiếu khí: là nhưng vi sinh vật phát triển để hình thành khuẩn lạc trong điều kiện

có sự hiện diện của ôxy phân tử.Số đơn vị hình thành khuẩn lạc (cfu – colony forming unit) là số khuẩn lạc xuất hiện trong

môi trường nụôi cấy. Số lượng đơn vị hình thành khuẩn lạc cho phép ước đoán được số lượng vi sinh vật trong một đơn vị khối lượng thực phẩm.3. 2. Nguyên tắc

Để xác định số lượng vi sinh vật trong một đơn vị khối lượng thực phẩm bằng phương pháp đếm số lượng khuẩn lạc phải qua quá trình đồng nhất, pha loãng mẫu thành các nồng độ xác định. Chuyển một thể tích xác định các độ pha loãng đã đồng nhất vào trong môi trường nuôi cấy. Các khuẩn lạc được hình thành trong môi trường sau khi ủ được xem như là chúng hình thành từ một tế bào đơn lẻ.

Tuỳ theo các yêu cầu cụ thể trong việc phân tích, các đĩa môi trường sau khi cấy mẫu được ủ ở các điều kiện nhiệt độ và thời gian khác nhau. Theo yêu cầu của các tiêu chuẩn của nhiều quốc

57

gia, chỉ tiêu này được ủ ở 30oC trong khoảng thời gian khoảng 3 ngày. Tuy nhiên một số yêu cầu khác có thể ủ ở nhiệt độ 20 - 22oC trong cùng thời gian trên.

Đếm tất cả các khuẩn lạc xuất hiện trên đĩa, căn cứ vào độ pha loãng cũng như thể tích cấy để qui về tổng số vi sinh vật trong một đơn vị khối lượng mẫu thực phẩm. Chỉ tiêu tổng số vi sinh vật hiếu khí được dùng để đánh giá chất lượng của mẫu về khía cạnh vi sinh vật, qua đó đánh giá khả năng hư hỏng, cũng như thời hạn bảo quản các sản phẩm thực phẩm. Tổng số vi sinh vật hiếu khí còn là chỉ tiêu đánh giá mức độ vệ sinh trong quá trình chế biến, bảo quản thực phẩm, nước uống hay các sản phẩm khác.3.3. Môi trườnng và vật liệu phân tích- Môi trừơng Plate Count Agar có pH 7.0 ± 0.2. Môi trường được phân phối vào trong các bình

thuỷ tinh hay trong các ống nghiệm. Hấp khử trùng ở 121oC trong 15 phút. Bảo quản ở trong tủ lạnh từ 2–8oC. Trước khi sử dụng môi trường phải được đun chảy và làm nguội ở 45oC trong bể điều nhiệt.

- Dung dịch pha loãng saline pepton water: gồm 8.5 gam NaCl và 1.0gam pepton. Dung dịch được phân phối vào trong các bình chứa 0.5-1.0 lít và phân phối vào trong các ống nghiệm với thể tích chính xác 9.0ml sau khi khử trùng

3.4 Chuẩn bị mẫu trước khi phân tích- Dùng các dụng cụ như kéo, kẹp đã được khữ trùng cân chính xác 10.0g mẫu vào trong bao PE. Tất cả các điều kiện làm việc và thao tác phải tiến hành trong điều kiện vô trùng. Thêm vào lượng mẫu này 90 ml dung dịch pha loãng Saline Pepton Water. Sau khi đồng nhất nhận được dung dịch mẫu có độ pha loãng 10-1.- Đồng nhất mẫu bằng máy dập mẫu, thời gian dập mẫu phụ thuộc vào tính chất cơ lý của mẫu, nhưng không quá 2,5 phút. - Dịch mẫu ngay sau khi đồng nhất được pha loãng theo dãy thập phân bằng cách dùng pipet vô trùng chuyển 1 ml dịch mẫu vào ống nghiệm chứa 9 ml dung dịch pha loãng Saline Pepton Water , tránh tiếp xúc pipet với dung dịch pha loãng, đồng nhất mẫu trong ống nghiệm bằng máy lắc hoặc dùng pipet vô trùng khác hút đảo dịch mẫu lên xuống 5 -10 lần. Dùng pipet đó chuyển 1 ml dịch mẫu vào ống thứ hai chứa 9 ml dung dịch pha loãng. Tiếp tục như vậy sẽ có các dung dịch mẫu với các độ pha loãng 10-2; 10-3; 10-4; …cho đến khi có đủ các nồng độ pha loãng cần thiết. 3.5. Cấy mẫu Chọn hai hay ba độ pha loãng liên tiếp sao cho trong 1 ml chứa 25-250 tế bào vi sinh vật để cấy. Dùng pipet vô trùng chuyển 1 ml dịch mẫu pha loãng đã chọn vào giữa đĩa petri vô trùng. Mỗi nồng độ cấy ít nhất vào 2 hay 3 đĩa. Sau khi cấy, đổ vào mỗi đĩa 10-15 ml môi trường Plate Count Agar đã được đun chảy và để ổn định ở 45oC.Trộn đều dịch mẫu với môi trường bằng cách lắc tròn đĩa petri xuôi và ngược chiều kim đồng hồ, mỗi chiều 3-5 lần ngay sau khi đổ môi trường. Đặt các đĩa trên mặt phẳng ngang cho agar đông đặc. Lật ngược và ủ các đĩa trong tủ ấm ở nhiệt độ 30.0±1.0oC (hay yêu cầu nhiệt độ khác) trong thời gian 72 giờ. Trong một số yêu cầu, nhiệt độ ủ đĩa và thời gian ủ có thể thay đổi.3.6. Đếm kết quả

Đếm tất cả số các khuẩn lạc xuất hiện trên các đĩa sau khi ủ. Chọn các đĩa có số đếm từ 25 đến 250 để tính kết quả. Số lượng tổng số vi sinh vật trong 1 gam mẫu được tính như sau:

NA = (cfu/g)

n1 x V1 x f1 + … + ni x Vi x fi

Trong đó: A: số lượng vi sinh vật trong 1 gam mẫuN: tất cả các khuẩn kạc đếm được trên các đĩa đã chọn.ni: số lượng đĩa cấy tại độ pha loãng thứ iV: thể tích dịch mẫu cấy vào trong 1 đĩa.

58

fi: độ pha loãng tương ứng.Ví dụ trong một trường hợp phân tích mẫu cụ thể nhận được kết quả như sau:

Nồng độ pha loãng 10-3 10-4

Kết quả: Đĩa 1 Đĩa 2

235246

2621

235 + 246 + 26A = ≅ 2.4 x 105(cfu/g)

2 x 1 x 0,001+ 1 x 1x 0.0001

Các kết quả tổng số vi sinh vật hiếu khí thường được biểu diển dưới dạng số mũ cùa cơ số thập phân.

Trường hợp có các vi sinh vật mọc loang, tính mỗi vết loang là 1 khuẩn lạc. Nếu số khuẩn lạc loang chiếm hơn 1/3 đĩa thì phải ghi nhận điều này và đánh dấu kết quả nhận được.Nếu ở độ pha loãng cao nhất, số khuẩn lạc đếm được trên 1 đĩa >250, ví dụ ở nồng độ 10-5 số đếm lớn hơn 250, kết quả được ghi: >2.5 x 107 CFU/g. Nếu ở độ pha loãng thấp nhất, số khuẩn lạc đếm được trên 1 đĩa <25, ví dụ ở nồng độ 10-1 số đếm nhỏ hơn 25, kết quả được ghi: <2.5 x102 CFU/g.

4. XÁC ĐỊNH TỔNG SỐ COLIFORMS VÀ COLIFORM PHÂN BĂNG PHƯƠNG PHÁP ĐẾM KHUẨN LẠC

4.1. Định nghĩaColiforms là nhóm vi sinh vật chỉ thị vì số lượng hiện diện của chúng trong thực phẩm,

nước hay các loại mẫu môi trường được dùng như dấu hiệu chỉ thị khả năng hiện diện của các vi sinh vật gây bệnh khác. Các nhà nghiên cứu đều cho thấy rằng với số lượng cao của coliform trong thực phẩm thì khả năng hiện diện của các vi sinh vật gây bệnh khác cao. Tuy nhiên mối liên hệ giữa vi sinh vật gây bệnh và vi sinh vật chỉ thị còn có nhiều tranh cãi.

Coliform tổng số là nhóm vi sinh vật hiếu khí tuỳ nghi, thuộc nhóm vi khuẩn gram âm, không sinh bào tử, có hình que, lên men lactose và sinh hơi từ nguồn carbon này trong vòng 24-48 giờ ờ nhiệt độ 37oC.

Khi nâng cao nhiệt độ nuôi cấy lên 44oC có thể phân biệt Coliform phân với nhóm Coliform tổng số và nhóm không phải Coliform. Coliform được định nghĩa như sau: Coliform phân là nhóm vi sinh vật hiếu khí và kỵ khí tuỳ ý, thuộc nhóm vi sinh vật gram âm, không sinh bào tử và có khả năng lên men lactose và sinh hơi trong khoảng thời gian nuôi cấy 24-48 giờ ở nhiệt độ 44oC.

Nhóm Coliform phân là một phần của hệ vi sinh ruột đường ở người và các động vật máu nóng khác, các nhóm vi sinh vật sau được liệt vào nhóm Coliform phân: Escherichia; Klebsiella, Citrobacter và Enterobacter. Nhóm vi sinh vật này được sử dụng như yếu tố chỉ thị mức độ vệ sinh trong quá trình chế biến, bảo quản và vận chuyển thực phẩm, nước uống và môi trường. Các đặc điểm sinh hoá khác nhau để phân biệt các thành viên trong nhóm coliform phân như sau:4.3. Nguyên tắc

Cấy một lượng mẫu xác định trên môi trường thạch chọn lọc. Sau khi ủ ở 37,0 + 1,0oC 24 - 48 giờ, đếm số lượng khuẩn lạc Coliforms điển hình. Xác định lại bằng các phản ứng đặc trưng. Môi trường chọn lọc cho Coliform là môi trường chứa lactose, đây nguồn carbon duy nhất, đồng thời trong môi trường còn chứa muối mật là tác nhân chỉ chọn lọc cho vi khuẩn gram âm, chứa các tác nhân chỉ thị các dấu hiện điển hình khi vi sinh vật trao đổi các thành phần trong môi trường

59

như neutral red, hay crystal violet. Khẳng định các dòng vi khuẩn cho hình dạng khuẩn lạc điển hình băng các môi trường canh chọn lọc như Brilliant green bile lactose.

Để chọn lọc đối với các nhóm Coliform phân nhiệt độ nuôi cấy là 44oC trong 24-48 giờ. Đếm các khuẩn lạc đặc trưng cho Coliform phân, ngoài việc khằng định khả năng sinh hơi từ lactose bằng các môi trường canh còn được khằng định khả năng tạo indol trong môi trường canh chứa trypton ở 44oC.

Để tránh các trường hợp không phát hiện được số lượng tế bào Coliform bị tổn thương hay suy yếu trong quá trình chế biến hay bảo quản thực phẩm, khi tiếp xúc với môi trường chọn lọc chùng sẽ bị chết hay không thể phát triển thành khuẩn lạc, một môi trường không chọn lọc nhưng không chứa một nguồn carbon khác được sử dụng như Trypton Soy Agar. Môi trường này được cho vào sau khi cấy mẫu và ủ nhiệt độ 20-25oC (nhiệt độ phòng) trong thời gian 1-2 giờ nhằm khôi phục những tế bào bị suy yếu trước khi cho môi trường chọn lọc vào đĩa.

Số lượng Coliform hay Coliform phân được xác định bằng số lượng khuẩn lạc điển hình đếm được, hệ số xác nhận và độ pha loãng mẫu trước khi cấy vào đĩa.4.4. Môi trường

- Tryptone Soya Agar (TSA) được chuẩn bị trong các bình hay chai thuỷ tinh, khử trùng ở nhiệt độ 121oC trong 15 phút bằng nồi hấp. Bảo quản ở nhiệt độ 4-8oC. Trước khi sử dụng, môi trường được đun chảy và làm nguội ở 45oC trong bể điều nhiệt.

- Violet Red Bile Agar (VRB) được chuẩn bị vô trùng trong các chai thuỷ tinh,đun chảy và làm nguội ở nhiệt độ 45oC trong bể điều nhiệt trước khi sử dụng. Có thể sử dụng các môi trường khác như Desoxycholate agar cũng được chuẩn bị như trên.

- Brilliant Green Bile Lactose Broth (BGBL) được phân phối vào trong các ống nghiệm, mỗi ống 10ml và có ống Durham đặt ngược bên trong. Khử trùng ở 121oC trong 15 phút. Sau khi khử trùng phải đảm bảo không có bọt khí trong các ống Durham ngược.

- E.C broth: được chuẩn bị tương tự như môi trường BGBL.- Canh trypton: được phân phối vào trong các ống nghiệm, mỗi ống 5ml. Môi trường khử

trùng ở 121oC trong 15 phút.- Thuốc thử Kovac’s hay Ehrlish

4. 5. Qui trình phân tíchChuẩn bị mẫu: Quá trình chuẩn bị mẫu tương tự như phần định lượng tổng số vi sinh vật hiếu khí. Nhưng

quá trình pha loãng mẫu sao cho trong 1ml dung dịch pha loãng chứa khoảng <100 tế bào Coliform.

Cấy mẫu và đổ môi trườngCấy chuyển 1 ml dịch pha loãng mẫu đã chọn vào đĩa petri, mỗi nồng độ cấy ít nhất vào hai

đĩa petri, chọn 2 nồng độ pha loãng liên tiếp để cấy sao cho sau khi ủ mỗi đĩa xuất hiện dưới 100 khuẩn lạc.

Cho vào mỗi đĩa đã cấy mẫu khoảng 5ml môi trườngTSA đã được đun chảy và ổn định trong bể điều nhiệt ở 45oC, trộn đều dịch mẫu với môi trường bằng cách lắc tròn đĩa petri xuôi và ngược chiều kim đồng hồ, mỗi chiều 3-5 lần ngay sau khi đổ môi trường và để ổn định ở nhiệt độ phòng trong 1-2 giờ nhằm phục hồi các tế bào bị tổn thương hay các tế vào bị suy thoái do quá trình chế biến. Đổ thêm 10-15 môi trường VRB lên trên môi trường TSA. Chờ cho môi trường trong đĩa đông đặc, lật ngược đĩa và ủ ở 37.0 + 1.0oC trong 24 -48 giờ. Đếm kết quả

Chọn các đĩa có số đếm từ dưới 100 khuẩn lạc Coliforms để tính kết quả. Khuẩn lạc Coliforms có màu đỏ đến màu đỏ đậm và có đường kính > 0.5 mm, xung quanh khuẩn lạc có vùng tủa của muối mật.

60

Giai đoạn xác địnhTrong trường hợp phân tích các mẫu thực phẩm có chứa các nguồn carbon khác không phải

lactose, để tránh các trường hợp vi sinh vật sử dụng các nguồn carbon trong mẫu để lên men và có biểu hiện hình dạng khuẩn lạc tương tự Coliform, giai đoạn khẳng định là cần thiết. Qui trình khẳng định được tiến hành như sau: chọn ít nhất 5 khuẩn lạc nghi ngờ đã đếm với các hình dạng khác nhau, cấy chuyển sang các ống có chứa môi trường khẳng định. BGBL được sử dụng khi khẳng định Coliform tổng số, E.C được sử dụng để khằng định Coliform phân. U các ống nghiệm BGBL đã cấy ở nhiệt độ 37.0 + 1.0oC và các ống nghiệm E.C broth ở 44oC trong thời gian 24-48 giờ. Kết quả dương tính khi vi khuẩn phát triển và sinh hơi trong môi trường nuôi cấy, hơi tạo ra được giữ lại trong các ống Durham ngược hay tụ lại trên bề mặt ống nghiệm. Tỉ lệ xác nhận là tỉ số giữa khuẩn lạc cho kết quả dương tính với số khuẩn lạc khẳng định.

Trong trường hợp khẳng định Coliform phân, các khuẩn lạc sinh hơi trong môi trường E.C broth được thử nghiệm indol ở 44oC. Tỉ lệ dương tính chỉ được tính cho các khuẩn lạc có khả năng sinh hơi và phản ứng indol dương tính.

Báo cáo kết quả N

A(coliform/coliform phân) = x R (cfu/g(ml)) n1v1f1 + … + nivifi

Trong đó: N : tổng số khuẩn lạc đếm đượcni : số đĩa có số khuẩn lạc được chọn tại mỗi độ pha loãngv : Thể tích cấy vào mỗi đĩafi : Độ pha loãng có số khuẩn lạc được chọn tại các đĩa đếmR : Tỉ lệ xác nhận

Kết quả coliform hay coliform phân được làm tròn chẵn chục và được biểu diện dưới dạng số mũ có cơ số thập phân.

5. ®Þnh tÝnh ESCHERICHIA COLI trong thc phm

5. 1 Ph¹m vi ¸p dơngPh¬ng ph¸p nµy (tham chiu theo TCVN 5287, t¸i b¶n lÇn th 2, n¨m 1994) ®ỵc ¸p dơng cho

tt c¶ c¸c lo¹i thc phm (®Ỉc biƯt lµ thc phm thđy s¶n ®«ng l¹nh) ®Ĩ x¸c ®Þnh s hiƯn diƯn cđa Escherichia coli.5.2 §Þnh ngha

Escherichia coli lµ d¹ng Coliform c ngun gc t ph©n, ph¸t triĨn ®ỵc 440C, sinh Indol, sinh axit, kh«ng sinh acetoin vµ kh«ng sư dơng citrat lµm ngun Cacbon. Escherichia coli ®ỵc ph¸t hiƯn do kh¶ n¨ng lªn men lactose vµ sinh h¬I 440C, c kt qu¶ nghiƯm ph¸p IMViC ++ --.5.3.Nguyªn t¾c

Ph¬ng ph¸p nµy dng ®Ĩ ®Þnh tÝnh vµ kt lun ph¸t hiƯn hay kh«ng ph¸t hiƯn E.coli trong mt khi lỵng mu x¸c ®Þnh.

Cy mu vµo m«i trng t¨ng sinh (BGBL), ph©n lp trªn m«i trng ph©n lp (EMB) vµ kh¼ng ®Þnh b»ng c¸c thư nghiƯm sinh ha ph hỵp (nghiƯm ph¸p IMViC) . 5.4. DÞch pha lo·ng vµ m«i trng:

- Dung dÞch Saline Pepton (SPW)- Brilliant green bile lactose broth (BGBL)

61

- Th¹ch Eosin Methylene Blue Lactose agar (EMB)- Canh Methyl Red Voges Proskauer (MR-VP)- Canh Tryptone (hoỈc peptone)- Th¹ch Simmons Citrat- Thuc thư Methyl red 0.2%- Dung dÞch KOH 40%- Thuc thư -naphtol 5% - Thuc thư Kovac’s

5.5. Thit bÞ chÝnh- Tđ m 37.0 + 1.00C.- Tđ m 44.0 + 0.50C.

5.6. Quy tr×nh Chun bÞ mu:Chun bÞ mu vµ pha lo·ng t¬ng t nh ®Þnh lỵng Coliforms

T¨ng sinh:Cy 1ml dÞch mu c nng ® 10-1 vµo ng nghiƯm c cha 10ml m«i trng t¨ng sinh (BGBL), đ 44.0 + 0.50C/24 gi.

Ph©n lpSau 24 gi, chn ng nghiƯm c ph¶n ng d¬ng tÝnh (lµm ®ơc m«i trng vµ sinh h¬i), cy sang

m«i trng ph©n lp (EMB), đ 37.0 + 1.00C/24 gi.Nhn d¹ng khun l¹c E.coli: Trªn m«i trng EMB: khun l¹c mµu tÝm, ¸nh kim, trßn, b ®Ịu, ®ng

kÝnh kho¶ng 0.5mm.Kh¼ng ®Þnh

Nh÷ng khun l¹c nghi ng ®ỵc thc hiƯn qua c¸c thư nghiƯm sinh ha (thc hiƯn nghiƯm ph¸p IMViC)

Chn Ýt nht 2 khun l¹c ®iĨn h×nh hay nghi ng m«i trng ph©n lp, cy chuyĨn sang m«i trng r¾n kh«ng chn lc (TSA) , đ 37.0 ± 1.0OC trong 18-24 gi.Thư nghiƯm sinh ha

C¸c thư nghiƯm sinh ha ®ỵc dng ®Ĩ kh¼ng ®Þnh E.coli nh b¶ng díi ®©yTT Thư nghiƯm sinh ha Kt qu¶1234

IndolMethyl redVoges ProskauerKh¶ n¨ng sư dơng citrat

++--

B¸o c¸o kt qu¶Ph¸t hiƯn hay kh«ng ph¸t hiƯn E.coli trong 10g mu.

6. ĐỊNH LƯỢNG ESCHERICHIA COLI TRONG THỰC PHẨM

6.1 Định nghĩaE.coli là loài vi sinh vật thuộc nhóm Coliform phân, có hình que, gram âm, di động, có khả

năng lên men và tạo acid và sinh hơi từ đường lactose ở 44oC hay nhiệt độ thấp hơn, có khả năng sinh indol ở 44oC và 37oC, có phản ứng Voges Proskauer âm tính, không có khả năng sử dụng citrate như nguồn car bon duy nhất.

Trong một số phương pháp kiểm nghiệm thực phẩm, có những định nghĩa phân biệt số lượng E.coli khẳng định và số lượng E.coli giả định. Số lượng E.coli giả định được coi là những

62

Coliform phân, chúng có phản ứng Indol dương tính, không tiến hành khẳng định các phản ứng khác.

E.coli còn được gọi là faecal coli, chúng hiện diện thường xuyên trong ruột người và các loài động vật. Chúng phân bố rộng khắp trong tự nhiên, mặt dù có nguồn gốc từ phân, nhưng sự hiện diện của chúng với một số lượng nhỏ trong thực phẩm không có nghĩa là thực phẩm đó bị nhiễm phân. Sự hiện diện của vi sinh vật trong thực phẩm, nước uống là dấu hiệu chỉ thị sự kém chất lượng về mặt vệ sinh.

Khi xâm nhiễm một liều lượng lớn vào trong cơ thể ngưới và động vật, E.coli là loài phổ biến nhất gây viêm nhiễm đường tiểu, thỉnh thoảng có thể tìm thấy chúng gây lở loét và tạo mủ, nhiễm trùng máu và có thể tìm thấy vi sinh vật này gây viêm não.

Cho đến nay người các nhà khoa học đã tìm được ít nhất 4 loài gây bệnh đường ruột cho người. Theo phân loại của Gorbach chúng được chia thành: enterobathogenic (EPEC); enterotoxigenic (ETEC), enteroinvasive (EIEC), và verotoxigenic (ETEC). Các kiểu huyết thanh của các dòng E.coli gây bệnh được liệt trong bảng 26.36.2 Nguyên tắc

Cấy một thể tích xác định các nồng độ pha loãng thích hợp lên môi trường chọn lọc. Sau khi ủ ở 44oC trong khoảng thời gian 24 giờ, đếm các khuẩn lạc có hình dạng đặc trưng của Coliform. Xác nhận các khuẩn lạc đã đếm bằng các phản ưng sinh hoá. E. coli có các phản ứng sinh hoá đặc trưng như sau: indol dương tính, methyl red dương tính; Vogesproskauer âm tính và citrat âm tính. 6.3Môi trường

Tryptone soya agar ( TSA ) (chuẩn bị tương tự phần coliform)Violet red bile agar ( VRB ) (chuẩn bị tương tự phần coliform)Escherichia coli broth (EC broth): được phân phối trong các nghiệm, mỗi ống chứa 10ml,

cho vào bên trong ống durham ngược, hấp khử trùng bằng nồi hấp và làm nguội từ từ để không còn các bọt khí trong ống durham. Bảo quản các ống môi trường ở nhiệt độ 2-8oC cho đến khi sử dụng.

Lactose tryptone lauryl sulphate broth (LST Broth ): (Chuẩn bị tương tự như EC broth).Tryptone broth (chuẩn bị tương tự phần coliform)Thuốc thử Kovac’s MR-VP broth: phân phối vào trong các ống nghiệm, mỗi ống 5ml. Hấp khử trùng bằng nồi

hấp. Bảo quản 2-8oC cho đến khi sữ dụng.Simmon citrate: được chuẩn bị như là như là các môi trường thạch nghiêng trong các ống

nghiệm. Môi trường sau khi pha chế có màu xanh lục.6.4 Qui trình cấy mẫu

Chuẩn bị và cấy mẫu:Tương tự như phần chuẩn bị mẫu cho kiểm nghiện coliform và coliform phân.

Đọc kết quả: Chọn các đĩa có từ 10 - 100 khuẩn lạc. Đối với những đĩa có số khuẩn lạc nhiều thì kích thước các khuẩn lạc thường nhỏ và không rõ. Đếm những khuẩn lạc màu đỏ đến đỏ sậm và có đường kính lớn hơn 0.5 mm, xung quanh có vùng tủa của muối mật.

Giai đoạn xác định: Đối với mỗi dạng khuẩn lạc, chọn 5 khuẩn lạc nghi ngờ cấy chuyển sang canh thang EC. U ở 44.0± 0.5oC trong khoảng 24 giờ, kết quả dương tính khi vi sinh vật có khả năng sinh sinh hơi trong môi trường, được biểu hiện bằng bọt khí được giữ lại trong các ông durham hay đọng lại trên bề mặt môi trường.

Chọn các ống canh thang EC có sinh hơi để cấy chuyển sang các môi trường sau: canh thang Tryptone, canh thang MRVP, simmoncitrate. U các môi trường trên ở 44,0± 0.5oC trong

63

khoảng 24 giờ. Thử phản ứng indol, methylred; vogesposkauer, citrate (xem phần thử nghiệm các phản ứng sinh hoá). Tỉ lệ xác nhận số lượng khuẩn lạc thử nghiệm cho kết quả đúng là E.coli bằng tỉ số giữa số lượng khuẩn lạc xác nhận ban đầu và số lượng khuẩn lạc cho kết quả là E.coli.

Số lượng E.coli được tính như sau:

NSố CFU E.coli = x R

n x V x fTrong đó: N: số lượng khuẩn lạc coliform đã đếm

V: thể tích mẫu cấy vào đĩan: số lượng đĩa cấy cho một mẫuf: độ pha loãng của mẫuR: tỉ lệ xác nhận của E.coli

Có thể tính số lượng E.coli giả định bằng cách tính tỉ lệ số lượng khuẩn lạc cho phản ứng indol dương tính, công thức tính tương tự như trên.

Báo cáo kết quả: Kết quả E.coli được thể hiện bằng số lượng đơn vị hình thành khuẩn lạc E.coli trong một gram hay mililitre mẫu.

Các phương pháp khác dùng trong định lượng E. coli:Ngoài phương pháp nuôi cấy theo qui trình như trên, E.coli còn được định lượng bằng

phương phương pháp màng lọc nuôi cấy trên các môi trường chuyên biệt hay phương pháp MPN. Đến nay có những phương pháp màng lọc có thể phân biệt được số lượng E.coli trong tổng số coliform. Các phương pháp miễn dịch học hay sinh học phân tử có thể phân biệt các loài E.coli gây bệnh với các loài không gây bệnh khác.

7. ĐỊNH LƯỢNG STAPHYLOCOCCUS AUREUS BẰNG PHƯƠNG PHÁP ĐẾM KHUẨN LẠC

7.1Định nghĩaStaphylococcus aureus là vi khuẩn hiếu khí hay kỵ khí tuỳ nghi, có hình cầu, gram dương,

có phản ứng đông huyết tương dương tính do chúng tiết ra enzyme coagulase. Ngoài ra còn các đặc điểm như có phản ứng Dnase, phosphatease dương tính, có khả năng lên men và sinh acid từ mannitol, trehalose, sucrose. Tất cả các dòng S. aureus đều nhạy với novobiocine, có khả năng phát triển trong môi trường chứa đến 15% muối NaCl.

Một số dòng S. aureus có khả năng gây tan máu trên môi trường thạch máu, vòng tan máu phụ thuộc vào từng chủng nhưng chúng đều có vòng tan màu hẹp so với đường kính của khuẩn lạc. Hầu hết các vi sinh vật này đều sản sinh sắc tố vàng. Nhưng các sắc tố này ít thấy khi quá trình nuôi cấy còn non, sắc tố này thường thấy rõ sau 1-2 ngày nuôi cấy ở nhiệt độ phòng. Sắc tố được tạo ra nhiều hơn khi trong môi trường có hiện diện của lactose hay các nguồn carbohydrate khác mà vi sinh vật này có thể bẻ gảy và sử dụng chúng

Hầu hết các dòng thuộc loài này có thể tổng hợp enterotoxin. Ngoài ra các loài S. intermedius, và S.hyicus cũng có thể tạo enterotoxin, nhưng hai loài này có phản ứng coagulase âm tính. Độc tố được sản sinh chỉ khi vi sinh vật phát triển trong môi trường có nhiệt độ trên 15oC, độc tố được sản sinh nhiều nhất khi chúng phát triển trong nhiệt độ 35-37oC.

S. aureus phân bố khắp nơi, nhưng chủ yếu phân lập được từ da, màng nhầy của người và động vật máu nóng. Trong thực phẩm vi sinh vật được nhiễm vào chủ yếu qua con đường chế biến

64

có các công đoạn tiếp xúc trực tiếp với người. Nều có sự hiện diện với mật độ cao của sinh sinh vật này trong thực phẩm cho thấy điều kiện vệ sinh của quá trình chế biến kém, kiểm soát nhiệt độ trong các công đoạn chế biến không tốt. 7.2 Nguyên tắc

Cấy trang một lượng mẫu xác định trên bề mặt môi trường thạch chọn lọc. Sau khi ủ, đếm số khuẩn lạc có những đặc điểm đặc trưng và không đặc trưng của Staphyloccocus aureus. Xác nhận các khuẩn lạc đã đếm bằng phản ứng coagulase và các phản ứng đặc trưng khác. Kết quả được xác định bằng số lượng khuẩn lạc đã đếm, thể tích cấy, độ pha loãng và hệ số xác nhận.7.3 Môi trường

Môi trường thạch máuCác thành phần cơ bản của môi trường được hoàn tan trong nước, đun cho đến khi các

thành phần hoà tan hoàn toàn. Khử trùng ở nhiệt độ 121oC trong 15 phút. Làm nguội môi trường đến 45-50oC trong bể điểu nhiệt. Thêm vào 5% thể tích máu cừu hay bê non dưới 5 tháng tuổi đã được loại bỏ các sợi máu hay máu được thêm chất chống đông citrat. Hoàn tan đều máu vào trong môi trường. Phân phối vào trong đĩa petri. Môi trường phải được pha chế trước ít nhất 2 ngày trước khi sử dụng để kiểm tra khả năng bị nhiễm. Môi trường thạch máu không nên đổ quá dày để có thể nhận rỏ các vòng tan máu.

Môi trưìơng thạch Baird Parker: Môi trường này có chứa lòng đỏ trứng tươi và potassium tellurite, đây là hai thành phần

không chịu nhiệt, vì thể phải bổ sung vào môi trường sau khi khử trùng và làm nguội đến khoảng 60oC. Sau khi bổ sung đầy đủ các thành phần, môi trường được phân phối vào trong đĩa petri. Sau khi pha chế đĩa môi trường phải có màu vàng đục.

Huyết tương thỏ (thử phản ứng đông huyết tương) Huyết tương thỏ được cố định với 0.1% EDTA hay cố định trong sodium oxalate. Phân

phối vào trong các ông nghiệm nhỏ, mỗi ống 0,.3 ml. Có thể thử phản ứng này trên lam kính.7.4 Tiến hành

Xử lý và pha loãng mẫu: Cân 10,0± 0,1 gram mẫu trong túi vô trùng, thêm 90 ml dung dịch pha loãng, đồng nhất bằng máy dập mẫu khoảng 30 giây. Chuẩn bị dãy pha loãng thích hợp tùy theo mức nhiễm của từng loại mẫu sao cho khi cấy một thể tích xác định lên đĩa BP sau khi ủ có khoảng <100 khuẩn lạc xuất hiện trên đĩa.

Cấy mẫu: Cấy 0,1ml mẫu nguyên hoặc đã pha loãng vào đĩa môi trường Baird Paker Agar, nếu mật độ S.aureus trong mẫu thấp có thể cấy 1ml dung dịch pha loãng phân phối vào 3 đĩa môi trường BP, dùng que cấy tam giác trang đều trên bề mặt cho đến khi khô mặt. Thực hiện tương tự như trên với môi trường thạch máu. Lật ngược đĩa, ủ ở 37.0oC± 1.0oC trong thời gian 24-48 giơ đối với môi trtường Baird Parker, 24 giờ với môi trường thạch máu.

Đọc kết quả: Sau 24 giờ, trên môi trường Baird Paker Agar, khuẩn lạc Staphyloccus aureus có đường kính khoảng 0.5 - 1mm, lồi, đen bóng có vòng sáng rộng khoảng 1 - 2 mm bao quanh. Đánh dấu trên mặt đáy của đĩa các khuẩn lạc có đặc điểm như trên và tiếp tục ủ đến 48 giờ. Sau 48 giờ khuẩn lạc S. aureus có đường kính khoảng 1 - 1.5 mm, màu đen bóng, lồi, có vòng trắng đục hẹp và vòng sáng rộng khoảng 2 - 4 mm bao quanh. Có một số dòng S. aureus cho khuẩn lạc không đặc trưng (không tạo các vòng quanh khuẩn lạc như miêu tả trên). Cần đếm và đánh dấu cả hai dạng khuẩn lạc.

Trên môi trường thạch máu sau 24 giờ ủ S. aureus cho khuẩn lạc bóng loáng, đục, lồi có màu xám hay vàng nhạt. Đường kính khuẩn lạc khoảng 1-2 mm. Hầu hết S.aureus có vùng tan huyết, tuy nhiên một số dòng có không có vòng tan huyết này.7.5 Khẳng định

65

Trên môi trường BP: Cấy 5 khuẩn lạc đặc trưng và 5 khuẩn lạc không đặc trưng từ môi trường Baird Parker vào môi trường TSA. ủ ở 37,0oC ± 1,0oC trong 24 giờ. Cấy vi khuẩn từ môi trường TSA vào các ống nghiệm chứa huyết tương đã rã đông, ủ ở 37,0 ± 1,0oC. Theo dõi kết quả phản ứng đông huyết tương sau các khoảng thời gian 2, 4, 6, 8 và 24 giờ. Tính tỉ lệ khẳng định trên các khuẩn lạc đặc trưng và không đặc trưng.

Thực hiện tương tự với các khuẩn lạc đặc trưng trên môi trường thạch máu.Kết quả phản ứng:

- Dương tính: Có khối đông huyết tương hình thành. Mọi mức độ đông kết đều được coi là dương tính.

- Âm tính: Không có khối đông, hỗn dịch vẫn đồng nhất như ống không cấy.Ngoài S. aureus, chỉ có S. intermedius và một số ít S. hyicus cho phản ứng đông huyết

tương dương tính. Không giống như S. aureus và S. intermedius, đa số loài S. hyicus subsp hyius cho phản ứng dương tính chậm và yếu. S. intermedius và S. hyius subsp hyius có phản ứng dương tính nhưng có khuẩn lạc nhỏ không đặc trưng trên môi trường Baird Parker Agar, không có vòng tan máu và không sinh sắc tố trên môi trường thạch máu.7.6Tính kết quả

Số lượng S.aureus trong mẫu được tính như sau: 10

Số S. aureus [CFU/g(ml)] = (Nt x Ht +Na x Ha) F1 + F2

Trong đó: F: độ pha loãngNt: tổng số khuẩn lạc đặc trưngNa: tổng số khuẩn lạc không đặc trưmg

Số khuẩn lạc đặc trưng cho kết quả ĐHT dương tínhHt = Số khuẩn lạc đặc trưng

Số khuẩn lạc không đặc trưng cho kết quả dương tínhHa =

Số khuẩn lạc không đặc trưng

8. PHƯƠNG PHÁP MPN ĐỊNH LƯỢNG S. AUREUSPhương pháp này được dùng để định lượng S.aureus trong các mẫu có mật S. aureus thấp

và có mật độ vi sinh vật cạnh tranh cao, khó có thể xác định bằng phương pháp đếm khuẩn lạc. Dung dịch mẫu được pha loảng theo hệ số thập phân với ba độ phaloãng liên tiếp sao cho trong chuỗi pha loãng này sau khi cấy vào các môi trường canh vừa cho các kết quả âm tính vừa cho kết quả dương tính, thường sử dụng các độ pha loảng 10-1; 10-2,10-3.

Tuỳ theo mức độ yêu cầu của kết quả phân tích, có thể sử dung phương pháp MPN với hệ thống:

3 ống mổi ống cấy 1ml dung dịch pha loãng 10-1

3 ống mổi ống cấy 1ml dung dịch pha loãng 10-2

3 ống mổi ống cấy 1ml dung dịch pha loãng 10-3

Hay hệ thống 5 ống mổi ống cấy 1ml dung dịch pha loãng 10-1

5 ống mổi ống cấy 1ml dung dịch pha loãng 10-2

5 ống mổi ống cấy 1ml dung dịch pha loãng 10-3

66

Môi trường canh được sử dụng là Mannitol Salt Broth hay Tryptose Soy Broth có 10% muối NaCl. Sau khi cấy, ủ ở nhiệt độ 37oC trong 48±2 giờ. Chọn các ống dương tính, khi có các vi sinh vật phát triển làm đục canh trường để phân lập trên môi trường BP, các đĩa môi trường BP được ủ ở 37oC trong 48 giờ. Chọn các khuẩn lạc đặc trưng trên môi trường BP để xác nhận S. aureus. Các đĩa cho kết quả S. aureus dương tính được đối chiếu với các ống nghiệm trong hệ thống các dãy cấy ban đầu. Tra bảng MPN để có kết quả định lượng S. aureus trong mẫu.

9. PHÁT HIỆN SALMONELLA TRONG THỰC PHẨM9.1 Định nghĩa

Salmonella là trực trùng gram âm, hiếu khí và kỵ khí tùy nghi, có khả năng di động (trừ S. gallinarum và S.pullorum ), sinh acid từ glucose và mannitol nhưng không lên men sacharose và lactose, không sinh indole và không phân giải ure. Hầu hết các chủng đều sinh H2S ( trừ S. typhi).

Cho đến nay giống Salmonella có hơn được phát hiện có hơn 2300 serotypes. Các serotype này được chia theo hệ thống của Kaffmann – White dựa trên công thức kháng nguyên O (kháng nguyên somatic) và kháng nguyên lông H (flagella). Trong số các serotype trên, có một số serotype được đặc tên như Enteritidis, Typhi, Paratyphi, Typhimurium … hầu hết serotype không có tên được biểu diển dưới dạng công thức kháng nguyên.9.2 Nguyên tắc

Phương pháp được mô tả sau đây nhằm định tính Salmonella, kết quả được báo cáo là có hay không có Salmonella trên lượng mẫu được kiểm nghiệm. Để đạt hiệu quả cao, quy trình kiểm tra Salmonella bắt buộc phải qua giai đoạn tiền tăng sinh. Điều này cần thiết vì Salmonella thường có mặt trong mẫu với số lượng nhỏ, bị tổn thương nặng qua quá trình chế biến và sự tồn tại một số lượng lớn các loại vi khuẩn khác thuộc họ Enterobateriaceae, các dòng này cạnh tranh và ức chế sự phát triển của Salmonella. Bốn giai đoạn cần tiến hành để phát hiện Salmonella: tiền tăng sinh, tăng sinh chọn lọc, phân lập và khẳng định. Việc khẳng định dựa trên các kết quả thử nghiệm sinh hóa phù hợp đạc trưng cho Salmonella spp.9.3 Dung dịch pha loãng và môi trường nuôi cấy

- Nước peptone đệm (Buffered peptone water) - Canh Rappaport-Vassiliadis soya pepton - Canh Selenite Cystein broth- Thạch Xylose lysine desoxycholate (XLD) - Thạch Brilliant green phenol red Thạch Triple sugar iron (TSI) - Canh Urea- Canh Lysine decarboxylase - Canh Ornithine decarboxylase - Canh Manitol (Phenol red broth base)- Canh Sucrose (Phenol red broth base)- Canh sorbitol (Phenol red broth base)- Canh Tryptone Thuốc thử Kovac’s Indole - Kháng huyết thanh Salmonella đa giá.

9.4 Qui trình phân tíchTiền tăng sinhCân 25 g mẫu trong túi vô trùng, Thêm 225ml nước peptone đệm, đồng nhất mẫu. Thời

gian đồng nhất mẫu (15 hoặc 30 giây) tùy thuộc vào loại thực phẩm. ủ ở 37.0oC±1.0oC/18-24 giờ.Tăng sinh

67

Trộn đều canh thang tiền tăng sinh trước khi chuyển 0,1ml sang 10ml canh thang tăng sinh chọn lọc Rappapport-vassliadis soya pepton. Trước khi cấy mẫu, canh thang tăng sinh phải được ủ ấm đến nhiệt độ 42oC, nhiệt độ này là yếu tố quan trong cho việc tăng sinh tối ưu. U mẫu trong bể điều nhiệt ở 42,0oC ±0,2oC trong18-24h (có thể kéo dài thời gian ủ thêm 24 giờ nữa nếu thấy cần thiết).

Cấy và đọc kết quả trên đĩaDùng khuyên cấy tròn ria dịch mẫu từ canh thang tăng sinh lên đĩa thạch XLD và thạch

Brilliant green-phenol red để tạo những khuẩn lạc riêng rẽ. ủ ở 37.0oC±1.0oC trong khoảng 18-24 giờ.

Trên thạch XLD: Khuẩn lạc điển hình trong suốt, hơi nhuốm đỏ, tâm đen, thường có vùng đỏ hồng bao quanh, đặc biệt khi Salmonella phát triển mạnh.

Trên thạch Brilliant green-phenol red: Khuẩn lạc điển hình trong, có vùng đỏ hồng bao quanh.

Khẳng địnhKhuẩn lạc nghi ngờ là Salmonella phải được kiểm tra sinh hóa và kháng huyết thanh. Từ

mỗi môi trường phân lập (XLD hay thạch Briliant green-phenol red) cấy chuyển ít nhất 5 khuẩn lạc nghi ngờ sang môi trường không chọn lọc (TSA). ủ ở 37.0oC ±1.0oC trong khoảng 18-24 giờ.

- Khẳng định bằng thử nghiệm sinh hóa:Dùng các thử nghiệm sinh hóa để khẳng định Salmonella. Các thử nghiệm chính gồm

glucose, lactose, saccharose, H2S (trên thạch TSI hay KIA), urea, indol, VP, ornithine decarboxylase (ODC), lysine decarboxylase (LDC), mannitol, sorbitol.

Thử nghiệm trên môi trường TSI hay KIA :Dùng kim cấy nhọn cấy vi sinh vật đã được làm thuần vào trong phần nghiêng và phần sâu của môi trường. ủ ở 37.0 ±1.0oC trong khoảng 18-24 giờ. Nắp ống nghiệm không nên vặn quá chặt để duy trì tình trạng hiếu khí và tránh lượng H 2S ứ đọng quá nhiều. Sau khi nuôi cấy, Salmonella chuyển pH của môi trường sang kiềm trên phần nghiêng (màu đỏ) và sang acid ở phần sâu (màu vàng), có hay không có H 2S (xuất hiện những vệt màu đen trong môi trường).

Thử nghiệm Lysin Decarboxylase: Cấy vi sinh vật đã được làm thuần vào môi trường canh Lysin decarboxylase. Vặn chặt nắp và nuôi ủ ở 37.0 ±1.0oC trong khoảng thời gian 48 giờ nhưng phải kiểm tra sau 24 giờ. Salmonella làm kiềm môi trường Lisin decarboxylase, giữ nguyên màu tím của môi trường (phản ứng dương tính). Phản ứng âm tính khi môi trường chuyển thành màu vàng.

Thử nghiện Urease: Dùng kim cấy vô trùng cấy vi sinh vật đã được làm thuần vào môi trường canh urea phenol red broth. Nuôi ủ ở 37.0±1.0oC trong khoảng 24 giờ kèm theo ống môi trường đối chứng không cấy vi sinh vật. Salmonella cho phản ứng âm tính với môi trường canh urea (không chuyển sang màu đỏ).

Thử nghiệm trên môi trường Mannitol phenol red : Cấy vi sinh vật đã được làm thuần vào canh Mannitol phenol red. Không nên vặn chặt nắp ống nghiệm. Nuôi ủ ở 37.0±1.0oC trong khoảng 48 giờ, nhưng phải kiểm tra sau 24 giờ. Salmonella làm acid hóa môi trường qua sự xuất hiện màu vàng (phản ứng dương tính).

Thử nghiệm Indol: Cấy một lượng nhỏ vi sinh vật đã được làm thuần vào ống canh Tryptone. ủ ở 37.0±1.0 oC /24 giờ. Chuyển 5 ml canh dịch sang 1 ống nghiệm khác. Thêm vào 0.2 - 0.3 ml thuốc thử Kovac’s. Hầu hết Salmonella cho phản ứng âm tính, không có sự xuất hiện màu đỏ trên bề mặt môi trường nuôi cấy.

Thử nhiệm phản ứng Voges- Proskauer: Cấy vi sinh vật đã được làm thuần vào ống nghiệm chứa canh MR-VP và ủ ở 37.0±1.0oC trong khoảng 24 giờ. Chuyển 1ml sang ống nghiệm

68

có kích cở 13x100 mm. Thêm 0.6 ml (-napthol và 0.2 ml KOH 40%, lắc đều. để yên trong hai giờ. Salmonella cho phản ứng VP âm tính (không có sự xuất hiện màu đỏ hồng trong ống nghiệm).

Khẳng định bằng thử nghiệm kháng huyết thanhThử nghiệm kháng huyết thanh phải được tiến hành song song với mẫu trắng (dung dịch nước

muối sinh lý) nhằm loại trừ khả năng ngưng kết giả. Dùng kháng huyết thanh Salmonella polyvalent O và Salmonella polyvalent H.9.5 Trình bày kết quả: Không có (hoặc có) Salmonella được phát hiện trong 25g mẫu.9.6 An toàn Salmonella là vi khuẩn gây bệnh.

Khi làm việc với các chủng chứng dương, kiểm nghiệm viên cần thận trọng và tuân thủ các qui định về an toàn phòng thí nghiệm để tránh nhiễm bệnh hoặc làm lây lan mầm bệnh.

10. XÁC ĐỊNH SHIGELLA TRONG THỰC PHẨM

10.1 Định nghĩaShigella là trực khuẩn gram âm, hiếu khí và kỵ khí tùy nghi, Catalase dương (trừ Shigella

dysenteriae), oxidase âm, lactose âm (trừ một vài chủng) và H2S âm. Hầu như các chủng Shigella không sinh hơi từ glucose. Ngoài ra hầu hết các loài thuộc giống Shigella không thể lên men và tạo acid từ Duciltol, không có enzym lisine decarboxylase.

Giống Shigella gồm 4 loài như sau:Shigella dysenteriae: thuộc nhóm kháng huyết thanh A, trong đó có 10 serovar. Các dòng

trong nhóm này không lên men được mannitol.Shigella flexneri thuộc nhóm kháng huyết thanh B bao gồm 6 serovar. Có thể chia thành

nhiều subserovar khác nhau, tuỳ theo sự hiện diện của các nhân tố kháng nguyên khác nhau trong nhóm này.

Shigella boydii thuộc nhóm kháng huyết thanh C. Bao gồm 15 serovar. Tất cả các dòng trong nhóm này đều lên men cà sinh acid từ mannitol.

Shigella sonnei nhóm kháng huyết thanh D chỉ có một serovar khác biệt. Nhóm này lên men được mannitol.

Shigella là vi sinh vật gây nên bệnh Shigellosis, đây là một bệnh nguy hiểm có thể lan truyền rất nhanh trong cộng đồng. Sự lan truyền phổ biết nhất là từ người sang ngưới. Những trẻ em có điều kiện vệ sinh cá nhân kém, sống trong điều kiện thiếu thốn phương tiện vệ sinh là điều kiện để lan tuyển dịch bệnh này. Shigella cũng được lan truyền qua đường thực phẩm và nước uống. Nguồn nhiễm Shigella vào thực phẩm thực chủ yếu là từ nguyên liệu, từ nước, hay từ công nhân chế biến. Các loại thực phẩm thường xuyên phân lập được Shigella là các món salad, thịt băm thủy sản …

Liều lượng gây ngộ độ thực phẩn do Shigella rất thấp, có thể 10 tếbào/g sản phẩm củng có nguy cơ gây ngộ độc. Vì vậy việc kiểm soát Shigella ytrong thực phẩm phải rất nghiêm ngặt, đòi hỏi phương pháp kiểm nghiệm phải rất nhạy, các qui trình thực hiện phải kiểm soát chặt chẻ.10.2 Nguyên tắc

Một lượng mẫu xác định được tăng sinh trong môi trường lỏng không chọn lọc, sau đó được chuyển vào môi trường tăng sinh chọn lọc, dịch khuẩn sau khi tăng sinh chọn lọc được cấy phân lập trên ít nhất 2 đĩa môi trường thạch đĩa với mức độ chọn lọc khác nhau. Khuẩn lạc nghi ngờ được kiểm tra bằng thử nghiệm sinh hóa và kháng huyết thanh.10. 3. Thuốc thử và môi trường3 Môi trường chọn lọc và không chọn lọc:

- Canh Tryotose soya

69

- Canh Gram negative Môi trường chọn lọc:- Thạch MacConkey - Thạch Xylose lysine desoxycholate - Thạch Hektoen enteric Môi trường và thuốc thử sinh hoá:- Thuốc thử Oxidase - Thuốc thử catalase- Thạch Triple sugar iron- Môi trường thử nghiệm tính di động- Mannitol phenol red broth- Duciltol phenol red broth- Lisine decarboxylase brothKháng huyết thanh: bao gồm các loại huyết thanh như sau: polyvalent A; B; C; D

10.4 Qui trình phân tích tiến hànhTiền tăng sinhLấy 25g mẫu cho vào túi dập mẫu, thêm 225ml canh Tryptone soya. Sau khi đồng nhất

mẫu, đo pH và nếu cần chỉnh về pH 7.0 ±0,2. Buộc chặt miệng túi và ủ ở 37.0 oC trong khoảng thời gian 16 - 20 giờ. Có thể cho mẫu vào trong các bình tam giác, sau khi chỉnh pH ủ các bình này trong điều kiện kỵ khí ở nhiệt độ và thời gian như trên.

Tăng sinh chọn lọcChuyển 0,1ml dịch tiền tăng sinh sang 10ml canh thang tăng sinh GN. ủ ở 37.0oC trong

thời gian 16 - 20 giờ.Phân lập: Dùng khuyên cấy cấy từ canh thang tăng sinh lên các môi trường thạch đĩa chọn lọc. Vi

khuẩn Shigella là vi sinh vật rất nhạy cảm với điều kiện môi trường nuôi cấy vì thế đế có thể phát hiện được Shigella với hiệu suất cao nhất, nên sử dụng ít nhất hai loại môi trường phân lập khác nhau. Có các loại môi trường phân lập có cường độ chọn lọc khác nhau được sử dụng cho Shigella như: Tergitol – 7 agar, XLD (Xylose lisine desoxycholate agar), Hektoen Enteric agar và MAC (Macconkey agar). Sau khi cấy, ủ các đĩa môi trường ở nhiệt độ 37.0oC trong thới gian 24-48 giờ.

Biểu hiện của Shigella trên các môi trường phân lập như sau:Trên môi trường Tergitol – 7 agar: môi trường sau khi pha chế có màu xanh hơi vàng nhẹ,

có màu đục sữa. Khuẩn lạc xuất hiện trên môi trường này có màu xanh nhạt.Trên môi trường MacConkey agar: Khuẩn lạc có màu nâu đỏ, trong suốt.Trên môi trường XLD: Khuẫn lạc Shigella có màu đỏ, trong suốtTrên môi trường Dexoxycholate citrate agar, môi trường có màu đỏ cam, hơi đục. Khuẩn

lạc Shigella trên môi trường này có màu đỏ nhạt.- Trên Hektoen entric agar: Khuẩn lạc có màu xanh nhạt, trong xuốt.

10.5 Khẳng định bằng trắc nghiệm sinh hóaTừ các khuẩn lạc nghi ngở trên môi trường phân lập, chọn ít nhất 5 khuẩn lạc cấy lên môi

trường không chọn lọc (như TSA), ủ ở nhiệt độ 37oC trong thới gian 20-24 giờ. Các khuẩn lạc xuất hiện trên môi trường này được sử dụng để thử nghiệm sinh hoá và kháng huyết thanh.

Thử nghiệm sàn lọcCác dòng được nghi ngờ là Shigella được cấy vào môi trường TSI, ủ ở 37oC trong 24 giờ.

Shigella cho phản ứng kiềm trên mặt nghiên và acid ở phần sâu. Không sinh hơi và không có H 2S

70

được tạo thành trong môi trường. Các dòng có phản ứng như trên được thử nghiệm để khẳng định Shigella

Thử nghiệm khẳng địnhPhản ứng đạc trưng của các dòng Shigella được thể hiện trong bảng sau:

TT Thử nghiệm sinh hoá Phản ứng12345678911121314

Simmon citrateArginine decarboxylaseLisine decarboxylaseUreaseMalonate MRVPSalicineXyloseCellobioseAdonitol Ducitol Inositol

-----+-------

Bảng 1: Các phản ứng sinh hoá đạc trưng của Shigella spp

Các vi sinh vật có các phản ứng sinh hoá đạc trưng như trên được khẳng định là Shigella spp. Để xác định loài Shigella nhiễm vào trong mẫu, các phản ứng sinh hoá đạc trưng của từng loài như bảng sau:

S. dysenteriae S. flexneri S. boydii S. sonneiSinh gas từ Glucose

- - -1 -1

Beta Galactose +/-1 - +/- +Ornithin decarboxylase

- - -1 +

Indol +/-2 +/-2 +/- -Acid fromDulcitol -4 -4 - -Lactose - -1 -1 +3

Mannitol - + + +Raffinose - +/- - +3

Saccharose - - - +3

Xylose - - +/- -1: Các dòng S.dysenteriae 1 và S.sonnei phản ứng dương tính2: S.dysenteriae 1; S. flexneri 6 luôn cho phản ứng âm tính; S.dysenteriae 2 có phản ứng dương tính3: Phản ưng dương tính chỉ biểu hiện khi thời gian nuôi cấy quá 24 giờ.4: S.dysenteriae và S.flexneri 6 có thể cho phản ứng dương tính.

Phản ứng sinh hoá phân biệt các loài Shigella

Xác định bằng thử nghiệm huyết thanh kháng: Thực hiện thử nghiệm kháng huyết thanh bằng huyết thanh đa giá A, B,C,D từ các lứa cấy trên môI trường thạch không chọn lọc. Phải tiến

71

hành các đối chứng ấm tính trên nước muối sinh lý để tránh hiện tượng ngưng kết giả có thể diễn ra.

Trong một số trường hợp Shigella tạo thành kháng nguyên bề mặt (kháng nguyên K) có thể làm che mất kháng nguyên O và làm cho phản ứng ngưng kết không diễn ra. Vì thế khi không có biểu hiện ngưng kết, đun sôi dịch vi khuẩn trong khoảng 30 phút để loại bỏ kháng nguyên bề mặt. Sau đó tiến hành thử nghiệm ngưng kết trở lại.10.5 Báo cáo kết quả

Phát hiện hay không phát hiện Shigella trong 25g mẫu. 10.6 Biện pháp an toàn

Shigella là vi khuẩn gây bệnh rất nguy hiểm, có thể biểu hiện bệnh khi mật độ xâm nhiễm rất thấp. Vì thế khi làm việc với các chủng đối chứng dương tính người phân tích cần phải thận trọng, các môi trường, mẫu vật sau khi nuôi cấy phải được hấp tiệt trùng trước khi rửa hay thải vào môi trường.

11. Vibrio cholerae vµ Vibrio parahaemolyticus

11.1 Ph¹m vi ¸p dơngPh¬ng ph¸p nµy (tham chiu theo Sỉ tay ph©n tÝch vi sinh cđa FDA t¸i b¶n lÇn th 8 n¨m

1995) dng ®Ĩ ph¸t hiƯn Vibrio cholerae vµ Vibrio parahaemolyticus trong thc phm. Ph¬ng ph¸p nµy kh«ng ¸p dơng cho hµu (Oyster).11.2 Nguyªn t¾c

Ph¸t hiƯn Vibrio cholerae vµ Vibrio parahaemolyticus trong thc phm ®ỵc thc hiƯn b»ng c¸ch c©n 1 lỵng mu , nu«i đ trong m«i trng lng chn lc. T m«i trng nµy, cy chuyĨn sang m«i trng r¾n chn lc. Nh÷ng khun l¹c ging Vibrio cholerae vµ Vibrio parahaemolyticus s ®ỵc thư nghiƯm sinh ha. 11.3 M«i trng vµ thuc thư

- Th¹ch Thiosulphate citrate Bile salt sucrose (TCBS agar)- Peptone kiỊm c 1% NaCL- M«i trng di ®ng - TSA + 1,5% NaCl- Th¹ch Triple sugar iron - ONPG- Thuc thư Oxydase - O/129 Vibriostaticum dics containing 150 and 10 µg 2,4-diamino-6,7-di- isopropylpteridine.- Thuc thư Cytochrome oxidase - Arginine decarboxylase- Lysine decarboxylase- Fermentation: - Sucrose, lactose, mannitol- Urea phenol red broth- Na desoxycholate 5% (String test solution)- KOH

11.4 Thit bÞ chÝnh- Tđ m 37.0 ± 1.0oC

11.5 Quy tr×nhT¨ng sinh: C©n 25g mu cho vµo tĩi v« trng, thªm vµo 225ml APW. Dp mu trong 2 phĩt, đ

37.0± 1.0oC trong 16 – 18 gi .

72

§ỉ ®a vµ ®c kt qu¶ trªn ®a: T m«i trng t¨ng sinh, cy ria lªn m«i tr¬ng th¹ch TCBS, đ trong 18-24h 37.0 ± 1.0oC.

Trªn m«i trngTCBS agar:Khun l¹c V.cholera trßn, lín c ®ng kÝnh 2-3mm, mµu vµngKhun l¹c V.para trßn, lín c ®ng kÝnh 3-4mm, mµu xanh.

11.6 Thư nghiƯm sinh ha T c¸c khun l¹c nghi ng trªn TCBS, cy chuyĨn sang m«i trng TSA c bỉ sung 1.5% NaCl, đ

37.0± 1.0oC trong 12-24 gi. Thư nghiƯm s¬ b

Thử nghiệm Vibrio parahaemolyticus

Vibrio cholerae

Thử nghiệm TSI K/A - - K/A - -Tính di động + +Oxydase + +KOH + +Thử nghiệm khẳng định

Thử nghiệm Vibrio parahaemolyticus

Vibrio cholerae

Khả năng phát triển 0% NaCl6% NaCl8% NaCl10% NaCl

-++-

++--

Tạo Acid từ :SucroseLactoseManinitol

--+

+-+

ONPG - +ADH - -LDC + +Urease + +Nhạy cảm với:10 µg O/129150 µg O/129

RS

SS

Thử nghiệm kháng huyết thanh với V. choleraeV. cholerae đa giá O1 và non – O1V. cholerae đơn giá: Inaba, Ogawa, Hikojimanon-O1 group:O139

12. ĐỊNH TÍNH LISTERIA MONOCYTOGENES TRONG THỰC PHẨM

1.2 Định nghĩaListeria monocytogenes có hình gậy ngắn, mảnh, gram dương trong lứa cấy 20 giờ, phản

ứng catalase dương tính, oxidase âm tính, chuyển động xoay tròn thành đợt trong tiêu bản giọt treo và di động tạo hình dù trong phép thử tính di động (ở 20-25oC). Có khả năng thủy giải esculin và khả năng làm tan huyết (trên môi trường thạch máu. Listeria monocytogenes tạo acid từ đường

73

rhamnose, nhưng không tạo acid từ đường xylose. Cho phản ứng CAMP dương tính với Staphylococcus aureus, và âm tính với Rhodococcus equi.

Listeria monocytogenes thường được tìm thấy trong thực ăn gia súc, trong nước, nước thải. Đây là một vi sinh vật gây bệnh rất nguy hiểm, bệnh do chúng gây ra được gọi là Listeriosis, bệnh này có tỉ lệ tử vong rất cao, đối với người lớn tỉ lệ này khoảng 30-35 %, đối với trẻ em tỉ lệ này lên đến 70%, các biểu hiện của loại bệnh này như sau: nhiễm trùng máu, sẩy thai ở phụ nữ, viêm màng não, gây tử vong thai nhi. Vi sinh vật này đặc biệt nguy hiểm trong các loại thực phẩm đã qua gia nhiệt. Các qui định về an toàn vệ sinh thực phẩm thường không cho phép sự hiện diện của Listeria monocytogenes trong 25g thực phẩm qua gia nhiệt nhưng cho phép 100 cfu/g đối với thực phẩm phải gia nhiệt trước khi sử dụng.12.2 Nguyên tắc

Qui trình định tính Listeria monocytogenes được thực hiện qua quá trình tăng sinh hai giai đoạn. Mẫu được cân vào trong túi chứa vô trùng, đồng nhất mẫu với môi trường tăng sinh sơ cấp. Sau khi ủ 24 giờ, dịch nuôi cấy được chuyển vào môi trường tăng sinh thứ cấp và nuôi ủ tiếp 24 giờ nữa. Hiện nay đã có qui trình cải tiến của qui trình trên, chỉ sử dụng quá trình tăng sinh một giai đoạn nhưng thời gian tăng sinh vẩn kéo dài 48 giờ. Qui trình tăng sinh một giai đoạn được thực hiện khi các mẫu có mật độ vi sinh vật nhiễm vào nhỏ. Trong khi đó qui trình tăng sinh hai hai giai đoạn nên sử dụng trong việc phân tích các mẫu có mật độ vi sinh vật lôn.

Trong một số trường hợp có thể yêu cầu định lượng hay bán định lượng mật độ vi sinh vật này trong mẫu.

Sau giai đoạn tăng sinh, canh khuẩn được chuyển sang giai đoạn phân phân lập trên môi trường chọn lọc đặc trưng. Khằng định các khuẩn lạc nghi ngờ bằng các đặc tính hình thái, sinh lý và sinh hoá và miễn dịch bằng các thử nghiệm đặc trưng.

Chủng vi sinh vật khác được dùng để đối chứng và thử nghiệmListeria monocytogenesListeria innocuaStaphylococcus aureus, dung huyết β yếuRodococcus equi.

12.3 Môi trường và thuốc thửGiai đoạn tăng sinh:Canh tăng sinh sơ cấp LBI (Listeria enrichment broth I): được chuẩn bị trong các bình chứa

lớn để đồng nhất với mẫu.Canh tăng sinh thứ cấp LBII (Listeria enrichment broth II): được chuẩn bị trong các ống

nghiệm, mỗi ống 10ml.Môi trường EB (enrichment broth): là môi trường cải biên từ môi trường LB được sử dụng

trong qui trình tăng sinh một giai đoạn.Môi trường phân lập : Oxford agar được chuẩn bị trên các đĩa.Các môi trường và thuốc thử dùng trong các thử nghiệm sinh hoá:Thạch máu (Blood Agar): nên sử dụng máu cừu hay máu của bê non dưới 5 tháng tuổi để

pha chế môi trường.Môi trường thạch mềm dùng trong thử tính di động: Môi trường BHI được bổ sung 3-5g

agar/lit. phân phối vào trong các ống nghiệm, mỗi ống 5ml. Rhamnose phenol red broth và Xylose phenol red broth.Thuốc thử catalaseThuốc thử oxydase

12.4 Dụng cụ và thiết bị

74

Tủ ấm: 25oC, 30.0oC, và 37oC .Phiến kính giọt treo.

12.5 Tiến hành thử nghiệmTăng sinh: Lấy 25 gam mẫu, thêm vào 225ml môi trường tăng sinh LBI. Đồng nhất mẫu 30

giây. ủ 30oC trong thới gian 24 giờ, chuyển 0,1 ml LBI sang 10 ml LBII, ủ 30C trong 24giờQui trình tăng sinh một giai đoạn: Cân 25 gam mẫu, thêm vào 225 ml canh EB. Canh EB

phải được làm ấm ở 45oC nếu mẫu thử là các sản phẩm của sữa và 30oC đối với các sản phẩm khác trước khi cho vào mẫu. Đồng nhất mẫu 30 giây. U 30oC trong 48 giờ

Phân lập:Dùng tăm bông vô trùng thấm dịch mẫu từ ống tăng sinh, cấy trang sang 1/2 đĩa môi trường Oxford agar, từ những vệt cấy này dùng que cấy vòng ria sang 1/2 đĩa còn lại. ủ ở 37oC/24 - 48 giờ. Trên môi trường Oxford agar khuẩn lạc Listeria spp. đặc trưng, có màu xám hay nâu được bao quanh bởi vòng đen, khuẩn lạc lõm, nhỏ, khoảng 1mm

Khẳng địnhThử khả năng tan huyết: Chọn khuẩn lạc nghi ngờ trên môi trường thạch Oxford cấy

chuyển sang môi trường thạch máu. ủ 370C 24-48 giờ. Trên môi trường thạch máu khuẩn lạc L. monocytogenes được bao quanh bởi vòng tan huyết hẹp do hiện tượng dung huyết dạng β. Trước khi tiến hành phép thử khẳng định L.monocytogenes, Chuyển khuẩn lạc nghi ngờ L.monocytogenes sang môi trường canh thang không chọn lọc, ủ 25oC trong khoảng 20 giờ.

Thử catalase:Listeria monocytogenes catalase dương tính.Nhuộm gram:Listeria spp. Gram dương.Thử khả năng di động phương pháp giọt treo: Listeria spp. chuyển động nhào lộn trong

canh trùng ủ ở 25oC. Thử tính di động trong ống nghiệm: Cấy vi trùng bằng cách đâm sâu vào thạch mềm trong

ống nghiệm. ủ 25oC trong khoảng 40 giờ hoặc lâu hơn. Kiểm tra sự phát triển xung quanh đường cấy đâm sâu. Listeria spp. di động tạo hình chiếc dù cách bề mặt thạch vài mm

Khả năng biến dưỡng đường: ủ các ống canh trùng thử khả năng lên men đường ở 37oC trong vòng 7 ngày. Kết quả dương tính (màu vàng) thường quan sát được trong vòng 24 - 48 giờ. L.monocytogenes lên men đường rhamnose nhưng không có khả năng lên men đường xylose.

75

S. aureus R. equi

L. monocytogenes

L. innocua

Chủng kiểm tra

Sơ đồ thử phản ứng CAMP

Thử phản ứng CAMP: Trên đĩa thạch dùng để thử phản ứng CAMP, cấy một đường cấy mỏng chủng S.aureus song song và cách 4 cm với đường cấy của chủng R.equi. Cấy chủng nghi ngờ Listeria ở giữa, gần nhưng không chạm vào hai đường cấy trên. Một đĩa có thể cấy một hoặc nhiều dòng vi khuẩn nghi ngờ L.monocytogenes. Cấy chủng dương và L.innocua. ủ ở 37oC trong khoảng 20-36 giờ. Phản ứng dương tính khi xuất hiện vùng cộng hưởng tan huyết ngay tại ranh giới của chủng thử và S.aureus hoặc R.equi. Phản ứng CAMP dương tính với R.equi sẽ tạo vùng dung huyết rộng (5 – 10 mm) và có hình dạng đầu mũi tên. Phản ứng dương tính giữa L.monocytogenes với S.aureus thường tạo vùng tan huyết hẹp (khoảng 2mm) có dạng hình tròn. L.monocytogenes cho phản ứng CAMP dương tính với S.aureus và âm tính với R.equi, kết qủa phản ứng CAMP có thể rất khác nhau giữa các chủng L.monocytogenes, L.innocua có phản ứng CAMP âm tính với cả hai loài S.aureus và R.equi.

12.6 Kết quả:Báo cáo phát hiện hoặc không phát hiện L.monocytogenes trong 25 g mẫu.12.7 Biện pháp an toàn: L.monocytogenes là nguyên nhân gây ra một số bệnh đặc biệt nguy hiểm. Nhân viên đang mang thai, người suy yếu hệ miễn dịch,... không nên trực tiếp làm việc với các vi sinh vật này.Khi tiến hành thử nghiệm Listeria, các thao tác phải hết sức cẩn thận. Tốt nhất, nên phân khu vực dành riêng cho các hoạt động thử nghiệm Listeria. Các sản phẩm hau dụng cụ sau khi nuôi cấy phải được hấp tẩy trùng khươc khi rửa hay loại bỏ

13. XÁC ĐỊNH ENTEROCOCCUS TRONG THỰC PHẨM

13.1 Định nghĩaEnterococcus là vi khuẩn có hình cầu, hay hình oval kéo dài, gram dương, thường tụ tập

thành từng đôi hay từng chuổi. Chúng không di động, không sinh bào tử, một số dòng có tạo vỏ nhầy. Hầu hết các loài thuộc nhóm này sống hiếu khí tuỳ nghi như ng phát triển tốt trong điều kiện kỵ khí. Enterococcus phát triển trong môi trường nuội cấy, các vi sinh vật khác sẽ bị ức chế do có sự tạo thành bacteriocine.

Khi nuôi cấy trong môi trường có cơ chất azide tetrazolium, khuẩn lạc hình thành có màu hồng đến màu đỏ đậm do có sự khử triphenyl tetrazolium chloride. Để đảm bảo các khuẩn lạc hình thành trên môi trường chọn lọc có hình hình dạng đặc trưng, các khuẩn lạc này phải không nằm quá gần nhau.

Enterococcus không có enzym catalase, và không các cytochrom C (phản ứng oxydase âm tính) chúng có thể phát triển được trong môi trường có 6.4% muối NaCl ở pH 9.6 khi nuôi cấy ở nhiệt độ 45oC. Theo phương pháp này, các loài thuộc nhóm Enterococcus thuộc nhóm D được phát hiện, các loài này bao gồm: Enterococcus faecalis; E. faecicum, E.avium và E.durans.

Các đặc điểm sinh hoá quan trọng được thể hiện như sau:

Loài Phát triển được ở ADH Có khả năng sinh acid từ các nguồn carbohydrate10oC 44oC Mannito

lSorbitol Sucrose arabinos

eAdonotol

E.faecalis + + + + + + - -E.faecicum

+ + + + v + + -

E.durans + + + - - - - -

76

E.avium v* + - + + + v +v: phản ứng không ổn định (variable)

E. faecalis: đây là vi sinh vật thường xuyên được tìm thấy trong ruột già của người, chúng được coi là nhân tố chỉ thị ô nhiễm phân. Thỉnh thoảng tìm thấy vi sinh vật này trong ruột gà nhưng ít khi tìm thấy trong động vật khác. Chúng có thể phát triển được trong môi trường có 0.03% potassium tellurite.

S. faecicum: chúng thường hiện diện trong ruột lợn và các vật khác. Đây là một trong những vi sinh vật gây hư hỏng các sản phẩm như jambon và thịt nguội. Không thể phát triển trong môi trường có có 0.03% potassium tellurite. Đây là loài vi sinh có khả năng kháng kháng sinh cao nhất so với các loài khác trong nhóm Enterococcus.

S. durans: thường được tìm thấy trong sữa và các sản phẩm của sữa, không tìm thấy trong các mẫu bệnh phẩm.

S. avium: hiện diện trong ruột gà và một số động vật khác. Vi sinh vật không tìm thấy trong các mẫu bệnh phẩm.13.2 Nguyên tắc

Sự hiện diện của Enterococcus được coi như là một nhân tố chỉ thị chất lượng vệ sinh của thực phẩm. Số lượng Enterococcus được xác định bằng cách cấy một lượng mẫu biết trước lên bề mặt môi trường chọn lọc cho Enterococcus, sau khi ủ đếm các khuẫn lạc đặc trưng, khẳng định các khuẩn lạc đã đếm bằng các thử nghiệm sinh hoá. Trong trường hợp nghi ngờ các vi sinh vật bị thương tổn trong quá trình chế biến hay bảo quản, cấy mẫu vào trong môi trường không chọn lọc, ủ ở 37oC trong 2 giờ, sau đó phủ một lớp môi trường chọn lọc lên trên. Cac đĩa môi trường sau khi cấy được ủ ở 44oC trong khoảng 48 giờ.13.4 Môi trường và thuốc thử

- Enterococcus agar được chuẫn bị trên các đĩa petri, làm khô bề mặt trước khi sử dụng.- Tryptose soy agar - Brain heart infusion chứa 6.5% NaCl được phân phối vào trong các ông nghiệm, mỡi ống

5ml.- Brain heart infusion có pH 9.6 được phân phối vào trong các ông nghiệm, mỡi ống 5ml- Thuốc thử catalase (H2O2)- Thuốc thử oxydase: N,N,N’,N’-tetramethyl-p-phenylenediamine

13.5 Thiết bị- Tủ ấm 37oC- Tủ ấm 44oC

13.6 Phương pháp thực hiện.Chuẩn bị mẫu: Mẫu được chuẩn bị và pha loãng thành các nồng độ phù hợp bằng dung

dịch pha loãng sao cho sau khi cấy 0.1 ml vào đĩa sẽ xuất hiện 100-150 khuẩn lạc.Cấy mẫu: cấy 0.1 ml lên bền mặt môi trường chọn lọc Enterococcus agar , trang đều khắp

bề mặt đĩa bằng que trang tam giác.Trong trường hợp nghi ngờ các vi sinh vật trong mẫu bị yếu hay thương tổn do quá trình

chế biến và bảo quản, cấy 1ml mẫu vào trong đĩa petri trống, đổ 5-6ml môi trường tryptose soy agar đã được làm nguội trong bể điều nhiệt đến 45oC, lắc để mẫu phân tán đều vào trong môi trường, ủ ở 37oC trong khoảng 2 giờ. Đổ 10-12ml môi trường enterococcus agar lên trên mặt.

Lật ngược đĩa petri và ủ ở 44oC trong khoảng thới gian 2 ngày.Đếm tất cả các khuẩn lạc có màu hồng đến màu đỏ đậm, có thể có một vòng không màu

xung quanh khuẩn lạc, kích thước các khuẩn lạc này khoảng 0.5-3mm, không đến các khuẩn lạc không có màu.

77

Khẳng định: Chọn ít nhất 5 khuẩn đã đếm cấy chuyển vào môi trường TSA, ủ qua đêm ở 37oC. Sinh khối vi khuẩn trên môi trường STA được cấy chuyển vào các môi trường thử nghiệm sinh hoá như BHI chứa 6.5% NaCl, BHI có pH 9.6, thử nghiệm catalase, oxydase …

Enterococcus có phản ứng catalase và oxydase âm tính, nhưng chúng phát triển được trong các môi trường BHI chứa 6.5% NaCl và BHI có pH 9,6.

14. NẤM MEN VÀ NẤM MỐC

14.1 Định nghĩaNấm men và nấm mốc là nhóm vi sinh vật rất đa dạng, cho đến nay có hơn 400 000 loài

nấm nen và nấm mốc đã được mô tả. Đây là nhóm vi sinh vật nhân thật, có vách tế bào là lớp vỏ chitin, có nhân và các bào quan khác. Tất cả các loài men và mốc đều thuộc nhóm vi sinh vậ dị dưỡng, chúng cần nguồn dịnh dưỡng cung cấp năng lượng từ môi trường bên ngoài, vì thế vi sinh vật này thường xuyên được phân lập từ thực phẩm hay các nguồn giàu dinh dưỡng khác. Phân biệt nấm men và nấm mốc theo khái niệm đơn giản như sau:

Nấm mốc là vi nấm dạng sợi, sinh sản bằng bào tử hoặc khuẩn ty.Men là những tế bào đơn tính phát triển theo kiểu nảy chồi. Thỉnh thoảng có thể nhìn thấy

các tế bào kết nhau thành chuổi.Đơn vị hình thành khuẩn lạc của mốc và men là mầm tạo nên một khuẩn lạc khi nuôi cấy trong

môi trường. Mầm có thể là một bào tử, một tế bào hay một đoạn của khuẩn ty.Trong thực phẩm, khi có sự hiện diện của mốc và men, chúng phát triển làm thay đối màu

của thực phẩm, gây mùi hay vị lạ, làm hư hỏng hay thay đổi cơ cấu của thực phẩm. Một số loài có thể tạo độc tố gây ngộ độc thực phẩm.14.2 Các yêu cầu về môi trường cho sự tăng trưởng và phát triển của nấm men và nấm mốc

Quá trình tăng trưởng của nấm men và nấm mốc phụ thuộc vào rất nhiều yếu tố từ môi trường. Sự tác động đầu tiên đến quá trình phát triển của vi sinh vật này là nhiệt độ, hầu hết các loài thuộc nhóm này đều thuộc nhóm vi sinh vật ưa mát, nhiệt độ thích hợp cho sự phát triển của chúng trong khoảng 20-28oC, một số ít trong nhóm này ưa lạnh hay ưa nóng. Tuy nhiên trong các điều kiện nhiệt độ lạnh hay nóng quá ngững phát triển, các vi sinh vật này không phát triển nhưng có thể tồn tại dưới dạng tìm sinh.

Hoạt tính nước cũng là một nhân tố ảnh hưởng rất nhiều đến quá trình phát triển của mốc và men. hầu các loài mốc và men phát triển tốt trong cơ chất có hoạt tính nước khoảng 85% hay lớn hơn nhưng cũng có một số ít loài có thể phát triển trong cơ chất có hạt tính nước thấp hơn, có thể 60-70%.

pH cũng là nhân tố tác động trực tiếp đến quá trình tăng trưởng của nấm mốc và men. Trong dải pH từ 2-9 vi sinh vật này đều phát triển. Tuy nhiên khoảng pH thích hợp nhất cho nấm mốc và men nằm trong khoảng 4-6.5.

Nhân tố quan trọng khác tác động lên quá trình phát triển của nấm mốc và men là oxy phân tử. hầu hết các loài vi sinh vật nhóm này đểu thuộc nhóm hiếu khí bắt buộc, mặt dù một số trong nhóm này có thể phát triển trong điểu kiện hàm lượng oxy thấp vi hiếu khí, một số loài có thể tiếp nhận oxy nguyên tử từ cơ chất của chúng, nhưng dù ở dạng nào, oxy vẫn là nguyên tố cần thiết cho quá trình phát triển của mốc và men.14.3 Nguyên tắc

Xác định số lượng mốc hay men trong mẫu bằng kỹ thuật pha loãng và đổ đĩa, một khối lượng mẫu xác định được cấy trang trên môi trường DG 18 (Dichloran Glycerol Agar) hay DRBC

78

(Dichloran Rose Bengal Chloramphenicol Agar). Sau khi ủ 25oC trong 5-7 ngày, đếm số khuẩn lạc nấm men và nấm mốc riêng biệt.14.4 Môi trường và thuốc thử

Dung dịch pha loãng: chứa 1 gam pepton trong 1000ml nước cất.Môi trường Dichloran glycerol agar (DG18): được sữ dụng cho các loại mẫu thực phẩm có

hoạt tính nước thấp như các loại thực phẩm khô như gạo ngu, cốc, tiêu, hay các loại thực phẩm có dầu, có hàm lượng đường hay muối cao.

Môi trường Dichloran rose Bengal agar (DRBC): được sử dụng cho các mẫu có hoạt tính cao như sửa và các sản phẩm của sửa, các loại rau quả và trái cây tươi, các loại đồ hộp …

Các loại môi trường trên được chuẩn bị trên các đĩa petri, làm khô mặt trước khi sử dụng. Các loại môi trường này chứa các thành phần nhạy cảm cới ánh sáng, vì thế cần bào quản trong tối cho đến khi sử dụng.14.5 Thiết bị

- Kính hiển vi - Tủ ấm 25oC

14.6 Phương pháp phân tíchChuẩn bị mẫu: Cân 10g mẫu và thêm 90 ml dung dich pha loãng. Ngâm mẫu khô trong dung

dịch khoảng 30 phút. Dập 2 phút trong máy dập mẫu. Pha loãng thành các nồng độ thích hợp. Cấy: Cấy trang 0,1 ml trên các đĩa môi trường DBRC hoặc DG 18. Nều mật độ nấm men và

nấm mốc trong mẫu thấp, có thể cấy 1 ml vào 3 đĩa môi trường, trang đều khắp bề mặt đĩa môi trường cho đến khi khô mặt bằng que cấy tam giác. Đặt ngửa đĩa trong bao nylon và để hở miệng bao khi đem ủ.

U: ủ ở nhiệt độ 25oC trong thời gian 5-7 ngày, đặt ngửa đĩa để tạo độ ẩm thích hợp cho sự phát triển của nấm men mốc và hạn chế làm khô thạch.

Đếm khuẩn lạc: Đếm và tính số lượng khuẩn lạc nấm mốc và nấm men trên tất cả các đĩa cấy, khi cần thiết phải quan sát bằng kính hiển vi để phân biệt khuẩn lạc nấm men hay nấm mốc. Kết quả được ghi nhận bằng đơn vị Cfu/g. Nếu có yêu cầu phân loại hay định danh các loài nghi ngờ sinh độc tố, các khuẩn lạc được cấy chuyển vào trong các ống nghiệm chứa môi trường Sabouraud agar nghiêng để gởi đến các phòng thí nghiệm chuyên định danh và phân loại nấm.14.7 Ghi chú:

Trong thời gian nuôi cấy, nấm mốc có thể tạo bào tử và phát tán vào trong môi trường nuôi cấy tạo nên các khuẩn lạc mới. Để hạn chế hiện tượng này, trong suốt thới gian nuôi cấy, không di chuyển hay động vào các đĩa cho đến khi đếm kết quả, không mở đĩa để hạn chế sự phân bố của bào tử vào trong không gian làm việc, gây nhiễm vào trong mẫu hay môi trường nuôi cấy khác.

15. ĐỊNH LƯỢNG COLIFORMS, COLIFORMS CHỊU NHIỆT, E. COLI GIẢ ĐỊNH VÀ E. COLI TRONG SẢN PHẨM THỦY SẢN BẰNG PHƯƠNG PHÁP MPN.

Phương páhp này được áp dụng để định lượng các vi sinh vật với mật độ thấp trong các mẫu thực phẩm.15.1 Định nghĩa

Trong phương pháp này, Coliforms được hiểu là những vi sinh vật sinh hơi trong môi trường canh Lauryl Sulphate Broth và canh Brilliant Green Lactose Bile Salt broth, nuôi ủ ở 37oC trong khoảng thời gian 48 giờ. Coliforms chịu nhiệt là những vi sinh vật sinh hơi trong môi trường canh EC nuôi ủ ở 44. trong thời gian 24 giờ. Coliforms phân (E. coli giả định) là Coliforms chịu

79

nhiệt sinh indole trong canh trypton nuôi ủ ở 44.5oC trong khoảng 24 giờ. E.coli là Coliforms phân cho kết quả theo nghiệm pháp IMViC là ++ - - 15.2 Nguyên tắc

Số lượng Coliforms, Coliforms chịu nhiệt, E.coli giả định (Coliforms phân) và E.coli được xác định bằng phương pháp MPN, phương pháp này dựa vào nguyên tắc mẫu được pha loãng thành một dãy thập phân (hai nồng độ kế tiếp chênh nhau 10 lần) và đưa vào các ống nghiệm có chứa môi trường thích hợp, ủ và đọc số ống cho kết quả dương tính. Số ống nghiệm cho phản ứng dương tính của các nồng độ pha loãng được tra theo bảng MPN để xác định tổng số Coliforms trong 1 gam (hoặc 1 ml) sản phẩm. 15.3 Môi trường và thuốc thử

Canh Lauryl sulphate (sodium dodecyl sulphate - LSB) Canh Brilliant green lactose bile salt (BGBL) Canh EC (E.coli medium)(Các môi trường canh trên được chuẩn bị trong các ống nghiệm, có ống durham ngược, chỉ

sử dụng các ống khi không còn bọt khí đọng trong các ống durham)Canh Tryptone Thuốc thử Kovac’s Canh MR-VP Thuốc thử Methyl red. Thuốc thử Alpha napthol. Thạch Simmon citrate(Xem phương pháp chuẩn bị các môi trường thuốc thử trên ở phương pháp định lượng coliform, E.coli )

15.4 Các thiết bị chínhBể điều nhiệt 44oC ± 0.5 oCTủ ấm 37.oC ±1.0oC

15.5 Qui trình cấy mẫu và đọc kết quảColiforms: Cấy 1 ml dịch mẫu đã pha loãng 1:10 vào dãy 5 ống nghiệm, mỗi ống chứa 10

ml canh Lauryl sulphate. Thực hiện tương tự với dịch mẫu đã pha loãng 1:100 và 1:1000. Nếu nghi ngờ lượng vi sinh vật trong mẫu quá cao, phải tăng độ pha loãng mẫu. U ở 37.0 oc + 10C/48 giờ. Ghi nhận số ống có sinh hơi. Dùng khuyên cấy cấy chuyển dịch mẫu từ các ống LSB dương tính sang các ống có chứa canh Brilliant green lactose bile salt. ủ ở 37.0oC±1.oC trong thời gian 48 giờ. Ghi nhận số ống có sinh hơi. Đọc số lượng các ống cho kết quả dương tính. Số ống nghiệm cho phản ứng dương tính của các nồng độ pha loãng được tra theo bảng MPN để xác định tổng số Coliforms trong 1g (hoặc 1 ml) sản phẩm.

Coliforms chịu nhiệtDùng khuyên cấy cấy chuyển dịch mẫu từ các ống canh Lauryl sulphate có sinh hơi sang

môi trường canh EC, ủ ở 44.5oC ±0.2 oC trong thời gian 24 giờ. Đếm số lượng các ống cho kết quả dương tính. Số ống nghiệm cho phản ứng dương tính của các nồng độ pha loãng được tra theo bảng MPN để xác định tổng số Coliforms chịu nhiệt trong 1 g (hoặc 1 ml) sản phẩm.

Coliforms phânDùng khuyên cấy vòng cấy chuyền từ các ống có sinh hơi trên môi trường canh EC sang

môi trường thạch đĩa EMB. U các đĩa này ở 37oC trong thời gian 24 giờ. Chọn các khuẩn lạc tròn,

80

dẹt có hình đĩa và có ánh kim tím, đường kính khoảng lớn hơn 1mm. Các khuẩn lạc nghi ngờ này được cấy chuyển vào môi trường canh Trypton, ủ ở 44.5oC± 0.2oC trong khoảng 24 giờ. Nhỏ thuốc thử Kovac’s vào các ống nghiệm đã ủ. Phản ứng dương tính khi có màu đỏ xuất hiện trong môi trường trong vòng vài phút. Đọc số lượng các ống cho kết quả dương tính. Số ống nghiệm cho phản ứng dương tính của các nồng độ pha loãng được tra theo bảng MPN để xác định tổng số Coliforms phân trong 1g (hoặc 1 ml) sản phẩm.

E. coli Dùng khuyên cấy phân lập chuyển dịch mẫu từ các ống có sinh hơi trên môi trường canh

EC sang môi trường thạch đĩa EMB. U các đĩa này ở 37oC trong thời gian 24 giờ. Chọn các khuẩn lạc tròn, dẹt có hình đĩa và có ánh kim tím, đường kính khoảng lớn hơn 1mm. Các khuẩn lạc nghi ngờ này được cấy chuyển vào môi trường canh Trypton, ủ ở 44.5oC± 0.2oC trong khoảng 24 giờ đồng thời cấy vào các môi trường MRVP, simmoncitrate agar để thực hiện các phản ứng trong nghiệm pháp IMViC

E.coli được xác định khi nghiệm pháp IMViC cho kết quả phù hợp (++ - -). Đếm số lượng các ống cho kết quả IMViC ++ - - từ các đĩa cho các khuẩn lạc nghi ngờ. Số ống nghiệm cho kết quả IMViC phù hợp của các nồng độ pha loãng được tra theo bảng MPN để xác định tổng số E.coli trong 1 g (hoặc 1 ml) sản phẩm. 15.6 Biểu diễn kết quả

Số lượng coliforms, coliforms chịu nhiệt, E. coli giả định và E. coli được biểu diễn với đơn vị MPN/g (ml). Trong trường hợp nồng độ cấy vào dãy đầu tiên có sự pha loãng nhỏ hơn 10 -1

kết quả thu được là số liệu từ bảng MPN nhân với hệ số pha loãng so với nồng độ 10-1

81