GENSKE MUTACIJE

• Mutacija – termin koji je prvi koristio De Vries• Evolucijski napredak ovisi o povremenoj sposobnosti gena da

mutiraju• Sve nasljedne varijabilnosti u živih bića, i dobre i loše, imaju izvor

u mutacijama genetičkog materijala• Genske ili točkaste mutacije nastaju u somatskim i generativnim

stanicama• Somatske mutacije uzrokuju neke bolesti (tumori), mozaicizam:

npr. mozaičnost šarenice oka, šarolikost listova i cvijetova• Mutantni aleli su najčešće recesivni, jer je većina divljih alela

selekcionirana kao dominantna

Somatska mutacija tijekom razvitka oka smeđe boje

Šarenica oka smeđe boje sa plavim dijelovima

• Genske mutacije vrlo su štetne, većina ih je letalna –geni utječu na ekspresiju svojstava i na biokemijske putove

• Mutacije su najčešće recesivne jer je u heterozigotaprisutan i normalni alel gena, pa je mutirani alelsakriven iza funkcije normalnoga

• Mutacije nastaju spontano ili su inducirane• Spontane mutacije nastaju zbog grešaka u replikaciji

DNA (tautomerne promjene baza)• Inducirane mutacije: djelovanjem fizikalnih i kemijskih

mutagena

Normalni i tautomernioblici baza

Imino oblikAminooblik

Ketooblik

Enolnioblik

Tautomerni oblici adenina: amino oblik sparuje se sa timinom; iminooblik sparuje se sa citozinom

Tranzicija – zamjena jednog para purin-pirimidin drugim parom purin pirimidin zbog tautomerne promjene

Spontane i inducirane mutacije imaju istu molekularnu osnovu: mogu nastati supstitucijom, insercijom ili delecijom nukleotida

• Supstitucija je zamjena jednog nukleotida i njegovog para u komplementarnom lancu

• Posljedica supstitucije je:

ISTOVJETNA (TIHA) MUTACIJA POGREŠNA MUTACIJA (srpastaanemija)BESMISLENA (prerani završetak translacije)

Srpasti eritrociti

Insercija je umetanje jednog ili više nukleotidaDelecija je gubitak jednog ili više nukleotidaInsercija i delecija izazivaju FRAME-SHIFT MUTACIJU ili POMAK OKVIRA ČITANJA

Delecija

Pomak okvira čitanja nastaje delecijom ili insercijomjednog ili dva nukleotida

Insercijom ili delecijom 3 nukleotida nema pomaka okvira čitanja

Mutacije idu u oba smjera: i naprijed (iz normalnog u mutirano) i natrag (iz mutiranog u normalno, tzv. povratna mutacija)A ------ a; a ------- A (povratne mutacije su rijeđe)

Intragenska supresija – unutar jednog gena dolazi do adicije i delecije; rezultat je dvostruka mutanta koja ima originalni fenotip

Uvjetna letalnost – mutanta koja je letalna u jednim uvjetima, a u drugima nije: dobar primjer su auksotrofne mutante za različite prehrambene dodatke; temperaturno-osjetljive mutante

INTERGENSKA SUPRESIJAMUTATOR i ANTIMUTATOR MUTACIJE

• Kada dođe do mutacije u kodonu, postoji nekoliko putova za opstanak jedinke; jednostavna povratna mutacije (reverzija), intragenska supresija i intergenska supresija

• Intergenska supresija – povratak funkcije mutiranog gena promjenom drugog gena kojeg nazivamo supresor gen. Supresor geni su najčešće geni za tRNA. Kada mutiraju oni mijenjaju način na koji se čita kodon.

• Npr. tRNA koju stvara nonsense supresor gen čita stop kodon kao kodon za neku aminokiselinu, tako da nema prestanka translacije; postoje najmanje tri supresora za stop kodon UAG u E. coli

• Mutator i antimutator mutacije povećavaju ili smanjuju stopu mutacije u stanici; to su najčešće mutacije DNA-polimeraze i to njene egzonukleazne aktivnosti (korekcija krivo sparene baze njezinim izrezivanjem)

STOPA MUTACIJA ili kako često geni mutiraju

• Broj mutacija po genu u određenom vremenu, ako se vrijeme mjeri staničnim diobama

• Češće se u praksi koristi termin učestalost mutacija – učestalost javljanja određene mutacije u uzorku stanica ili jedinki, a izražava se kao broj mutacija na milijun gameta

• Stopa mutacija jako varira od organizma do organizma, i od gena do gena

• Spontane mutacije su vrlo rijetke (1-10 na milijun gameta), no ne treba ih podcijeniti jer viši organizmi imaju tisuće genskih lokusa

• Npr. u vinske mušice u jednoj generaciji se mutacija javlja u 5% gameta

• Učestalost mutacija u odnosu na spolni (životni) ciklus: vinska mušica – 10 dana; čovjek – 20-30 godina; stopa mutacija u organizama s kratkim životnim ciklusom veća nego u vrsta s duljim životnim ciklusom

• Stopa mutacija je genetička karakteristika ovisna o životnom ciklusu vrste

ČIMBENICI KOJI UTJEČU NA STOPU MUTACIJA

• Veličina gena – što je gen veći veća je mogućnost za mutaciju• Genotip – gen R u kukuruza mutira 3x češće u sorte CORNEL

nego u sorte COLUMBIA. Geni mutatori povećavaju stopu mutacija ostalih gena

• Pokretni genetički elementi – transpozoni i retrotranspozoni• Temperatura – povišena (u vinske mušice je stopa mutacija na

27 °C 2-3X veća nego na 17 °C)• Starenje • Mutageni – čimbenici iz okoliša: zračenja i kemijske

supstance induciraju mutacije čija je stopa viša od stope spontanih mutacija. Zračenje primjerice štetnije utječe na stanice koje se aktivno dijele jer su njihovi kromosomi kondenzirani (npr. stanice koštane srži ili tumorske stanice)

DETEKCIJA MUTACIJA

Mutacije u haploidnom organizmu lako se otkrivaju jer su sve (i dominantne i recesivne) izražene u fenotipu.

U diploida dominantna mutacija u gameti pojavit će se u fenotipu potomstva, dok recesivna mutacija neće biti vidljiva u prvoj generaciji (ukoliko nije spolno-vezana).

“Replica plating” tehnika za detekciju otpornosti na antibiotike u bakterija

Selektivne podloge s antibiotikom

Tri mutantnekolonije

Mnoštvo kolonija na agarskoj ploči

Prijenos kolonija pomoću baršunastog jastučića

• Testovi za detekciju mutagenosti: bakterijskim testovima može se detektiratii mutageni potencijal neke kemikalije –najpoznatiji i najčešće upotrebljavan je AMES-ov test (Bruce Ames)

• Postavlja se pitanje da li je u odgovoru bakterijski test izjednačen sa testom na stanicama sisavaca?

• Bakterijski testovi razlikuju kancerogene od nekancerogenas vrlo velikom točnošću (oko 90%)

• Bakterijski test je puno jeftiniji od testova na životinjama• Daje rezultate u kratkom periodu (2 dana)• Može otkriti slabo kancerogene supstance• Kada se supstanca okarakterizira potencijalnim mutagenom

pomoću Ames-testa, njen mutageni (kancerogeni) potencijal istražuje se dalje na sisavcima

AMES-OV TEST

• Osnova testa je utvrđivanje genske mutacije koja se javlja kao odgovor na djelovanje neke supstance

• Koristi bakteriju Salmonella typhimurium koja normalno živi u debelom crijevu čovjeka

• Bakterija nosi mutaciju u genu za sintezu histidina, dakle ona je auksotrof za histidin (his-)

• His- sojevi nose supstituciju baza (tranzicija ili transverzija) ili frame-shift mutaciju

• Sposobnost neke kemikalije da izazove povratnu mutaciju (his- u his+) uzima se kao njen mutageni, odnosno kancerogeni potencijal

• His- sojevi nose mutaciju koja uzrokuje defekt u mehanizmu popravka DNA, te mutaciju koja čini stijenku bakterije propusnijom za kemikalije

• Svi mutageni nisu ujedno i kacerogeni, ali je korelacija vrlo visoka. Ako je neka supstanca mutagena vjerojatnost da je i kancerogena je 90%.

AMES-OV TEST

- dodatak jetre štakora; nisu sve supstance kancerogene, ali neke metaboliziranjem u jetri postaju kancerogene i obrnuto. Enzimi jetreštakora djeluju jednako kao i enzimi jetre čovjeka pretvarajući nekancerogene supstance u potencijalne kancerogene (ili obrnuto)

Salmonellatyphimurium his-

Podloga bez histidina

INDUCIRANE MUTACIJE

Muller 1927. – X-zrake povećavaju stopu mutacija u vinske mušiceStadler 1928. – X-zrake induciraju mutacije u kukuruzu

MUTAGENI

ZRAČENJE1. Ionizirajuća zračenja – X-zračenje, svemirsko zračenje i

zračenja iz različitih radioaktivnih izvora. Uzrokuju lomove u molekuli DNA ili u drugim molekulama (npr. molekula vode) koje postaju reaktivne (slobodni radikali) i oštećuju DNA. To su zračenja kraće valne duljine pa su stoga i prodornija

2. Neionizirajuća zračenja – UV-zračenje. To je zračenje manje prodorno od ionizirajućeg i najčešće ne pogađa stanice germinativne linije. UV zračenje uzrokuje pirimidinske dimere u lancu DNA na mjestima gdje su dva pirimidina jedan do drugog. Pirimidinski dimeri narušavaju helikalnu strukturu i narušavaju vezu s komplementarnim bazama.

S povećanjem doze zračenja veći je broj jednostrukih i dvostrukih lomova u molekuli DNA

KEMIJSKI MUTAGENI

• Otkriveni za vrijeme II svj. rata (mustard gas – alkilirajući agens koji djeluje na bazu gvanin – ima zakašnjeli učinak: mutacija ne nastaje u stanici izloženoj mutagenu već u stanicama kćerkama)

• Alkilirajući agensi mogu promijeniti specifičnost sparivanja baza• N-metil-N-nitrozourea, etilmetansulfonat, etiletansulfonat,

nitrozogvanidin (alkilirajući agensi) – uklanjanje purinskih prstena što uzrokuje gubitak baza (AP mjesta: apurinska i apirimidinskamjesta)

• Analozi baza – spojevi strukture slične bazama u DNA pa se ugrađuju umjesto njih - najčešće uzrokuju tranziciju: npr. 5-bromouracil – analog pirimidina ili 2-aminopurin – analog purinu

• nitritna kiselina (HNO2) – uzrokuje deaminaciju G, C i A• Akridinske boje – ugrađuju se između dvije baze u lancu DNA

“Mustard gas” – alkilirajući agens; uzrokuje eliminaciju baze gvanin; prazno mjesto može ispuniti bilo koja od 4 baze; nakon replikacije dolazi do tranzicije ili transverzije

Transverzija – zamjena para purin- pirimidin parom pirimidin-purin (ili obrnuto)

Djelovanje alkilirajućeg agensa EMS-a

5-bromouracil kao mutagen

Nitritna kiselina kao mutagen: uklanja slobodne amino skupine; adenin --- hipoksantin; citozin --- uracil

• Molekulu DNA svakodnevno oštećuju zračenje, kemijski mutageni, toplina i drugo (enzimske greške, spontani gubitak baza: dnevno nekoliko tisića baza u svakoj stanici sisavca)

• Evolucija nastoji maksimalno reducirati efekt mutacije i stoga su stanice razvile različite mehanizme za popravak oštećene ili krivo replicirane DNA

• Tri su glavna sistema popravka: vraćanje na staro (“damagereversal”); ekscizijski popravak i postreplikacijski popravak

• “Damage reversal”: npr. fotoreaktivacija ili direktni popravak O6-metilgvanina uz pomoć enzima metiltransferaze koji uklanja metilnu skupinu

POPRAVAK

1. Fotoreaktivacija – enzim koji se u mraku veže za dimere. Kada taj kompleks bude izložen vidljivoj svjetlosti enzim koristi energiju vidljive svjetlosti te prekida dimersku vezu

2. Ekscizijski popravak – izrezivanje krivo sparenih baza, oštećenih baza i nukleotida iz molekule DNA, jedan lanac je kalup za popravak komplementarnog lanca; obavljaju endonukleaze, egzonukleaze i drugi enzimi

3. Postreplikacijski popravak: recA protein; SOS odgovor

Fotoreaktivacija (vrsta popravka u bakterija) – enzim (fotoliaza) za popravak veže se u tami za timinskidimer; izlaganje plavoj svjetlosti aktivira enzim koji cijepa vezu između dva timina; DNA segment je popravljen, enzim se oslobađa.

Ekscizijski popravak

Popravak izrezivanjem baze

Popravak izrezivanjem nukleotida

Xeroderma pigmentosum –nasljedna kožna bolest – nastaje zbog nefunkcioniranja enzima za popravak

• izrazita osjetljivost na Sunčevu svjetlost – UV zračenje

• veliki rizik od nastanka raka kože

Postreplikacijski popravak –Rec A ovisan

• DNA polimeraza III preskače timinskidimer za vrijeme replikacije

• Rec A protein veže se za jednolančanu DNA s dimerom i pomaže njegov napad na sestrinsku dvolančanu molekulu

• Endonukleaza zareže novi duplex sa obje strane timinskog dimera oslobađajući ga te ostavljajući jednolančani dio

• DNA polimeraza i ligaza ispune prazninu

SAŽETAK

• Mutacija je promjena u molekuli DNA (genotip)• Može biti spontana ili inducirana (mutageni)• Genske mutacije nastaju supstitucijom, insercijom ili delecijom

nukleotida• Neke mutacije su tihe što znači da nemaju utjecaja na krajnji

produkt gena (degenerativnost koda)• Mutacija drugog slova koda (kodona) je najčešće pogrešna mutacija• Mutacija može biti germinativna (prenosi se na potomstvo preko

gameta koje nastaju mejozom) ili somatska (prenosi se na stanice kćerke koje nastaju mitozom; mozaicizam)

• Točkaste mutacije: tranzicija; transverzija; pogrešne, besmislene, pomak okvira čitanja

• Mutageni (zračenja i kemijske supstance) povećavaju stopu mutacija; istraživači ih koriste kako bi u što kraćem periodu dobili mutante za istraživanje genske funkcije