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7/24/2019 1350-Tese CCD Dias Nelson Aranha 2005
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Nelson Aranha Dias
ESTUDO SISTEMTICO DA REDUO DE NITRATO POR
HIDRAZINA PARA DETERMINAO DE NITRATOS EM
GUAS E ADITIVOS ALIMENTCIOS, EM FLUXO.
Dissertao apresentada ao Programa de Ps-Graduao em
Cincias da Coordenadoria de Controle de Doenas da
Secretaria de Estado da Sade de So Paulo, para obteno
do ttulo de Mestre em Cincias.
rea de concentrao: Pesquisas Laboratoriais em Sade
Pblica
Orientador: Prof. Dr. Jaim Lichtig
SO PAULO
2005
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FICHA CATALOGRFICA
Preparada pelo Centro de Documentao Coordenadoria de Controle de Doenas/SESreproduo autorizada pelo autor
Dias, Nelson AranhaEstudo sistemtico da reduo de nitrato por hidrazina para determinao de nitratos emguas e aditivos alimentcios, em fluxo / Nelson Aranha Dias So Paulo, 2005.
Dissertao (mestrado)Programa de Ps-Graduao em Cincias da Coordenadoria deControle de Doenas da Secretaria de Estado da Sade de So Paulo.
rea de concentrao: Pesquisas Laboratoriais em Sade PblicaOrientador: Jaim Lichtig
1. Nitratos/anlise 2. Nitritos/anlise 3. Aditivos alimentares 4. gua 5. Cdmio6.Anlise de injeo de fluxoSES/CCD/CD-090/05
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SUMRIO
1. INTRODUO...............................................................................................
1.1. OCORRNCIA NATURAL...........................................................................
1.2. UTILIZAO DOS NITRITOS E NITRATOS COMO ADITIVOS
ALIMENTCIOS...................................................................................................
1.2.1. Sabor..............................................................................................
1.2.2. Cor ................................................................................................
1.2.3. Atividade antibacteriana.................................................................
1.3 ASPECTOS TOXICOLGICOS DOS NITRATOS E NITRITOS.............
1.3.1. Metemoglobinemia.........................................................................
1.3.2. Nitrosaminas..................................................................................
2. OBJETIVOS...................................................................................................
2.1. OBJETIVO GERAL......................................................................................
2.2. OBJETIVO ESPECFICO............................................................................
3. REVISO DA LITERATURA..........................................................................
3.1. MTODOS PARA A DETERMINAO DE NITRITOS E NITRATOS........
3.2. O MTODO ESPECTROFOTOMTRICO..................................................
3.2.1 Reao de diazotao...................................................................
3.2.2. Reao de copulao....................................................................
3.3. AS ETAPAS ................................................................................................
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3.3.1. As reaes colorimtricas..............................................................
3.3.1.1. Reao de diazotao com sulfanilamida........................
3.3.1.2. Reao de copulao com NED......................................
3.3.1.3. A nitrosao do cido sulfanlico......................................
3.3.1.4. A nitrosao do 1-naftilamina..........................................
3.3.2. As reaes de reduo de ons nitrato..........................................
3.3.3. As interferncias............................................................................
3.3.3.1. Nas reaes colorimtricas..............................................
3.3.3.2 Nas reaes de reduo...................................................
4. MATERIAIS E MTODOS..............................................................................
4.1. MTODO COM O USO DA COLUNA DE CDMIO....................................
4.1.1. Reagentes e solues....................................................................
4.1.2. Aparelhos e materiais acessrios..................................................
4.1.3. Coluna de Cdmio.........................................................................
4.1.3.1. Preparo da Coluna de Cdmio........................................
4.1.4. Determinao da capacidade redutora da coluna de cdmio .......
4.1.5. Regenerao da coluna de cdmio...............................................
4.1.6. Curva de calibrao do nitrito........................................................
4.1.7. Determinao do nitrito em amostras de aditivos..........................
4.1.8. Determinao do nitrato em amostras de aditivos.........................
4.2. MTODO COM SULFATO DE HIDRAZINA................................................
4.2.1. Reagentes e Solues...................................................................
4.2.2. Aparelhos e materiais acessrios..................................................
4.2.3. Programa FIA LAB for windows-nitrito...........................................
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4.2.4. Programa FIA LAB for windows-nitrato..........................................
4.2.5. Curva de calibrao do N- nitrito (N-NO2-).....................................
4.2.6. Curva de calibrao do N-nitrato(N-NO3-)......................................
4.2.7. Avaliao da taxa de converso....................................................
4.2.8. Determinao do N-nitrito (N-NO2-)...............................................
4.2.9. Determinao do N- nitrato (N-NO3-).............................................
4.2.10. Amostras......................................................................................
4.2.10.1. guas (AG).....................................................................
4.2.10.2. Aditivos (AD - sais de cura) formulaes declaradas
pelos fabricantes...........................................................................
5 - RESULTADOS E DISCUSSO....................................................................
5.1. OTIMIZAO DO MTODO.......................................................................
5.2. INFLUNCIA DA TEMPERATURA NA PORCENTAGEM DE
CONVERSO.....................................................................................................
5.3. ESTABILIDADE DA SOLUO REDUTORA.............................................
5.4. DETERMINAO DA CAPACIDADE REDUTORA DA COLUNA DE
CDMIO.............................................................................................................
5.5. DETERMINAO DA TAXA DE CONVERSO DE NITRATO A NITRITO
COM SULFATO DE HIDRAZINA/ SULFATO DE COBRE.................................
5.6. CURVAS DE CALIBRAO........................................................................
5.6.1 Curva de calibrao do nitrito de sdio Mtodo com a coluna
de cdmio ................................................................................................
5.6.2. Curvas de calibrao mtodo com sulfato de hidrazina/sulfato
de cobre (SIA)..........................................................................................
5.6.2.1. Curva de calibrao do N-NO2-em condies no
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redutoras.......................................................................................
5.6.2.2. Curva de calibrao do N-NO2-em condies redutoras
5.6.2.3 Curva de calibrao do N-NO3-em condies redutoras
5.7. LINEARIDADE, LIMITE DE DETECO E LIMITE DE QUANTIFICAO
5.7.1. Linearidade....................................................................................
5.7.2.Limite de Deteco (LD) e Limite de Quantificao (LQ)...............
5.8 DETERMINAO DE NITRATO E NITRITO EM GUAS..........................
5.9. DETERMINAO DE NITRATO E NITRITO EM ADITIVOS......................
5.10.ESTUDO DE RECUPERAO..................................................................
6. CONCLUSES...............................................................................................
7. REFERNCIAS BIBLIOGRFICAS..............................................................
8. ANEXOS.........................................................................................................
ANEXO 1: SIAGRAMA DA CURVA DE CALIBRAO DO N-NO2- NO
PROGRAMA FIALAB FOR WINDOWS
NITRITO...........................................
ANEXO 2:PARTE 1- SIAGRAMA DA CURVA DE CALIBRAO DO N-NO2-
NO PROGRAMA FIALAB FOR WINDOWS
NITRATO....................................
ANEXO 2:PARTE 2- SIAGRAMA DA CURVA DE CALIBRAO DO N-NO3-
NO PROGRAMA FIALAB FOR WINDOWS NITRATO..
................................
ANEXO 3: FOTOS ILUSTRATIVAS DA APARELHAGEM DE ANLISE
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POR INJEO SEQENCIAL (SIA).
.........................................................................
Foto ilustrativa do aparelho de anlise por injeo seqencial
(SIA), destacando o aparelho, o espectrofotmetro, o registrador
e acima o computador .
............................................................................................
Foto ilustrativa do aparelho de anlise por injeo seqencial
(SIA), destacando o pisto, a seringa e a vlvula rotatr ia seletora.
................
Foto ilustrativa do computador destacando na tela do monitor o
programa FIALAB for
windows................................................................
Foto ilustrativa da coluna de cdmio........................................................
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Lista de Tabelas
Tabela 1: Limites mximos permitidos de nitritos e nitratos em alimentos,
segundo a legislao brasileira. ........................................................................
Tabela 2:Variao da absortividade acom o pH no intervalo 1,0 -
4,4.......................................................................................................................
Tabela 3: Variao da porcentagem de converso de nitrato a nitrito com o
tempo de reao, por SIA ..................................................................................Tabela 4: Aumento na porcentagem de converso de nitrato a nitrito em
relao ao tempo inicial de 40s (em.%)..............................................................
Tabela 5: Comparao da altura de pico para avaliao do desempenho do
mtodo por SIA a dois tempos de reao;40 e 60 s...........................................
Tabela 6: Variao da porcentagem de converso de nitrato a nitrito com o
tempo de reao por SIA....................................................................................
Tabela 7: Aumento na porcentagem de converso de nitrato a nitrito em
relao ao tempo inicial de 40s (em %).............................................................
Tabela 8: Acrscimo da porcentagem de converso de nitrato a nitrito com o
tempo de reao por SIA....................................................................................
Tabela 9: Variao da porcentagem de converso de nitrato a nitrito com o
tempo de reao entre 39,5oe 40,5oC por SIA.................................................
Tabela 10: Avaliao da estabilidade da soluo redutora de sulfato de
hidrazina/ sulfato de cobre com o tempo por SIA...............................................
Tabela 11:Avaliao da capacidade redutora das colunas de
cdmio..................................................................................................................
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Tabela 12:Avaliao da taxa de converso de nitrato a nitrito com sulfato de
hidrazina/ sulfato de cobre por SIA.....................................................................
Tabela 13:Anlise de Varincia para modelo de regresso da
concentrao de nit rito total e absorbncia
lida.........................................................................
Tabela 14:Concentraes, respectivas absorbncias e desvios padres
uti lizados na curva de calibrao da Figura
4.....................................................
Tabela 15:Anlise de Varincia para modelo de regresso da
concentrao de ni trognio/nitrito (mg.L-1)e absorbncia
lida..................................................
Tabela 16: Concentraes, respectivas absorbncias e desvios padres
uti lizados na curva de calibrao da Figura
5.....................................................
Tabela 17:Anlise de Varincia para modelo de regresso da
concentrao de nitrognio /nitrito (mg.L-1) e absorbncia
lida.................................................
Tabela 18: Concentraes, respectivas absorbncias e desvios padres
utilizados na curva de calibrao da Figura 6.....................................................
Tabela 19:Anlise de Varincia para modelo de regresso da concentrao
de nitrognio /nitrato (mg.L-1) e absorbncia lida................................................
Tabela 20: Concentraes, respectivas absorbncias e desvios padres
utilizados na curva de calibrao da Figura 7.....................................................
Tabela 21:Concentraes, respectivas absorbncias e desvios padres
utilizados na curva de calibrao da Figura 8.....................................................
Tabela 22: Limites de deteco e quantificao calculados para o mtodo
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com sulfato de hidrazina/ sulfato de cobre (SIA)................................................
Tabela 23:Limites de deteco e quantificao calculados para o mtodo
com a coluna de cdmio......................................................................................
Tabela 24: Teores de N-NO2- total nas amostras de guas (AG) obtidos pelos
2 mtodos : coluna de cdmio e hidrazina(SIA)..................................................
Tabela 25: Teores de N-NO2- total nas amostras de aditivos (AD) obtidos
pelos 2 mtodos : coluna de cdmio e sulfato de hidrazina (SIA).......................
Tabela 26: Teores de N-NO2-nas amostras de aditivos (AD) obtidos pelos 2
mtodos: coluna de cdmio e sulfato de hidrazina (SIA)....................................
Tabela 27: Teores de N-NO3-nas amostras de aditivos (AD) obtidos pelos 2
mtodos: coluna de cdmio e sulfato de hidrazina (SIA)....................................
Tabela 28: Resultados dos estudos de recuperao..........................................
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Lista de Figuras
Figura 1: Diagrama esquemtico do Sistema de Injeo Sequencial (SIA)........
Figura 2: Representao grfica do aumento na porcentagem de converso
de nitrato a nitrito segundo a Tabela 4.................................................................
Figura 3: Representao grfica do aumento na porcentagem de converso
de nitrato a nitrito segundo a Tabela 7. ...............................................................
Figura 4: Curva de calibrao da concentrao de nitrito em mg.L-1e
absorbncia com seus respectivos intervalos de confiana (IC) e predio (IP)
Figura 5: Curva de calibrao da concentrao de nitrognio/nitrito em mg.L-1
e absorbncia com seus respectivos intervalos de confiana (IC) e predio
(IP)........................................................................................................................
Figura 6: Curva de calibrao da concentrao de nitrognio/nitrito em mg.L-1
e absorbncia com seus respectivos intervalos de confiana (IC) e predio
(IP).......................................................................................................................
Figura 7: Curva de calibrao da concentrao de nitrognio/nitrato em mg.L-1
e absorbncia com seus respectivos intervalos de confiana (IC) e predio
(IP)........................................................................................................................
Figura 8: Curva de calibrao da concentrao de nitrognio/nitrato em mg.L-1
e absorbncia com seus respectivos intervalos de confiana (IC) e predio
(IP)........................................................................................................................
Figura 9: Representao grfica da correlao entre os resultados de N/nitrito
total obtidos dos mtodos com a coluna de cdmio e com sulfato de hidrazina
para amostras de guas......................................................................................
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Figura 10: Representao grfica da correlao entre os resultados de
N/nitrito total obtidos dos mtodos com a coluna de cdmio e com sulfato de
hidrazina para amostras de
aditivos.....................................................................
Figura 11: Representao grfica da correlao entre os resultados de
N/nitrito obtidos dos mtodos com a coluna de cdmio e com sulfato de
hidrazina para amostras de
aditivos.....................................................................
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AGRADECIMENTOS ESPECIAIS
Agradeo a Deus pela vida
a meus pais por terem-na continuado
e aos que me cercam por terem-na enriquecido.
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Agradecimentos
s bancas de qualificao e defesa, pelas excelentes sugestesapresentadas
que, na medida do possvel, foram aqui incorporadas.
Ao meu orientador, Prof. Dr. Jaim Lichtig pelo tema, por ter acreditado nele
nos momentos mais difceis, que no foram poucos e por seu imenso
conhecimento transmitido.
Ao diretor da Diviso de Bromatologia e Qumica do IAL, Prof. Dr. OdairZenebon
e ao diretor do Servio de Qumica Aplicada, mestre Paulo Tiglea, peloinsistente
incentivo, sem o qual esta dissertao provavelmente no existiria.
Ao Prof. Dr. Jorge C. Masini da USP, pela cesso de seu laboratrio,
equipamentos e todo seu conhecimento sobre FIA/SIA, partes integrantesdeste
trabalho.
chefe da Seo de guas do IAL, Maria Anita Scorsafava, pelofornecimento
das amostras de gua empregadas nesta dissertao, evitando assim otrabalho
da coleta.
chefe e s colegas da Seo de leos do IAL, pelo emprstimo de umacoluna
de cdmio, o que permitiu fazer as replicatas simultaneamente.
chefe da Seo de Laticnios do IAL, mestra Marilda Duarte, pelofornecimento
de farto material sobre validao de metodologias.
colega Dra. Cristiane Bonaldi Cano, pelo espontneo e muito til auxlio
no
tratamento estatstico dos dados.
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s mestras Maria de Ftima Henriques Carvalho e Viviane Emi Nakano
Fukasawa, muito mais que colegas do IAL, pelo auxlio no trabalho dedigitao,
formatao de tabelas e grficos que deixaram a apresentao, no mnimo,
muito
bonita.
colega Iracema de Albuquerque Kimura, tambm mestra, pelo auxlio no
espectrofotmetro e no computador, toda vez que a urgncia exigiu.
s bolsistas Alexandra Hissae Rocha Shoshima e Priscila Martin Biegun por
terem dedicado com eficincia vrios sbados, domingos e feriados sanlises
das amostras pelo mtodo da coluna de cdmio, o que apressou muito a
concluso da parte prtica.
colega Clia Maria Pompeu Mome, chefe da Seo de Desenho, peloexcelente
e paciente trabalho de computao grfica nos siagramas das curvas de
calibrao.
Finalmente, sem citar nomes, a todos os colegas do IAL que incentivaram,
torceram e acreditaram na existncia desta dissertao, s vezes contraminhas
prprias expectativas.
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Resumo
Os nitratos e nitritos so substncias que entram no corpo
humano atravs de alimentos de origem animal, vegetal ou da gua.Tambm so introduzidos como aditivos alimentcios (conservadores)
que, apesar de evitarem o desenvolvimento do Clostridium botulinum
em produtos crneos, apresentam os riscos de ocorrncia de
metemoglobinemia e formao de nitrosaminas cancergenas. Isto tudo
just if ica o seu contro le analt ico pelas autoridades sanitrias.
O mtodo oficial (AOAC) recomenda o uso da reao de
diazotao/copulao de Griess com deteco colorimtrica para o
nitrito, sendo o nitrato reduzido a nitrito em coluna de cdmio e
detectado como on nitrito. Este mtodo gera ons Cd+2 altamente
txicos com implicaes sade ocupacional e ambiental.
O mtodo proposto visa substituir o redutor Cd pelo sulfato de
hidrazina/sulfato de cobre. A tcnica empregada com o redutor
invest igado fo i a anlise por injeo seqencial (SIA).
Foram analisadas amostras de guas e aditivos alimentcios para
a comparao da eficincia dos dois mtodos de reduo.
Os resultados analticos mostraram boa correlao entre os dois
mtodos tanto para as amostras de guas como para os aditivos.
Os estudos de eficincia da reduo revelaram equivalncia
entre os redutores Cd e sulfato de hidrazina.
Alm desses resultados, foram realizados estudos de
recuperao do mtodo proposto em guas e aditivos, com valores
prximos de 100 %.
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O mtodo apresentou linearidade at 3,5 mg.L -1 de N-NO3- e
limites de deteco (L.D.) 0,06 e 0,08 mg.L -1 para o N-NO2- e N-NO3
-
respectivamente. Os limites de quantificao (L.Q.) foram 0,08 e 0,25
mg.L-1para o N-NO2-e N-NO3
-respectivamente.
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Abstract
Nitrate and nitrite ons are present in the human bodies through
foods and water, and as additives, added to some foods with the
purpose to avoid the development of Clostridium botulinum in meats
products, but they bring the risk of nitrosamines formation and of
methemoglobinemie. Considering these factors, there is the need of an
analytical control of nitri te and nit rate ions added to the foods.
The official method recommends the use of the diazotization
(Griess method), using cadmium as reductor of ni trate, resulting nitri te,
which is determined.
Our method has the purpose to use hydrazine sulfate as reductor
instead of cadmium which results Cd+2 extremely toxic to human
beings and to the environment.
The use of hydrazine sulfate was made by SIA (sequential
injection analysis) in waters and food additives. The analyses were
compared with those using cadmium reductor and the results showed
good correlation between the two methods.
The reduction step with cadmium column and hydrazine sulfate
showed good efficiency. The recovery tests showed results near 100 %
for both methods.
The method using SIA showed linearity to 3.5 mg.L -1N-NO3-and
detection limits 0.06 and 0.08 mg.L -1for N-NO2-and N-NO3
-, respectively.
The quantification limits found were 0.08 and 0.25 mg.L -1for N-NO2-and
N-NO3-, respectively.
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1 - INTRODUO
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1. INTRODUO
A determinao de nitritos e nitratos realizada quase sempre conjuntamente
devido a suas propriedades qumicas estarem muito ligadas, ou seja, um raramente
encontrado sem o outro. De fato, a sua interconverso, particularmente a reduo
qumica do nitrato ao mais reativo nitrito freqentemente o nico modo no qual o
relativamente inerte on nitrato pode ser detectado. A deteco e especiao
simultnea desses ons tm ganho crescente interesse em processos ambientais.
1.1 OCORRNCIA NATURAL
Os nitratos e nitr itos presentes em nossa dieta podem se originar
de vrias fontes, entrando na cadeia alimentar atravs de alimentos de
origem vegetal, animal ou da gua.
Com relao aos produtos de origem vegetal, a concentrao de nitratos em
vegetais como repolho, couve-flor, espinafre, cenoura, alface, etc., alta, atingindo
at 5800 mg.Kg-1, enquanto que o teor de nitritos normalmente encontrado bem
menor, alcanando at 100 mg.Kg-1 (1).
Entre os produtos de origem animal, o leite outra fonte de nitrato, embora
com valores baixos, normalmente no ultrapassando 5 mg.L-1. A concentrao de
nitrato em soros bem maior que a do leite atingindo 2800 mg.L -1, podendo ocorrer
tambm a presena de nitritos chegando a 140 mg.L-1; nos queijos os nitratos e
nitritos aparecem como aditivos (2).
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A adio de nitritos e nitratos em queijos evita o chamado estufamento tardio,
defeito este que aparece depois de duas ou trs semanas de fabricao. causado, nagrande maioria, por Clostridium tyrobutyricum cuja presena causa a fermentao do
lactato na massa do queijo produzindo cido butrico, gs carbnico e hidrognio,
alterando, tambm, o odor e o sabor.
A gua tambm outra fonte destes dois nions, sendo a gua de poos a que
contm os maiores teores de nitratos atingindo concentraes maiores que 200 mg.L-
1 (3). O nvel de nitrato em gua poder ser um indicativo de poluio, pois sua
presena est condicionada ao estgio final da oxidao de compostos orgnicos
nitrogenados, sugerindo que ela esteve em contacto com material protico em
decomposio.
Quanto gua tratada, apenas nitrato pode ser encontrado, uma vez que o
nitrito destrudo pela adio do cloro.
1.2 UTILIZAO DOS NITRITOS E NITRATOS COMO ADITIVOS
ALIMENTCIOS
So tambm utilizados como aditivos alimentcios (categoria conservadores)
na forma de seus sais de sdio ou potssio em produtos crneos curados e em
queijos.
O emprego usual como aditivo alimentcio se d como sais de cura simples
que so formados por cloreto de sdio, nitrito e nitrato de sdio, ou misturas destes
sais, estabilizantes (fosfatos, polifosfatos) e antioxidantes (cido ascrbico, seus
ismeros ou seus sais).
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De acordo com a legislao brasileira, os limites mximos permitidos em
alimentos encontram-se na Tabela 1:
Tabela 1: Limites mximos permitidos de nitritos e nitratos em alimentos, segundo alegislao brasileira.
Alimentos em que podem ser tolerados Limite mximo (mg.Kg-1)/(mg.L-1)
Produtos crneos curados (4) 150 NO2-em NO 2
-
300 NO3- em NO 2
-
Queijos (5) 50 em NO 3-
guas (6) 10 NO3-em N
1 NO2-em N
A adio de nitratos e nitritos em alimentos est relacionada com a obteno
de sabor, cor, e tambm com a atividade antibacteriana.
1.2.1 Sabor
A base qumica do sabor de carnes curadas ainda desconhecida. Acredita-se
que a inibio de oxidao dos lipdeos, que ocorre na presena de nitritos, seja
importante no sabor caracterstico de carnes curadas.
1.2.2 Cor
Com a adio de nitrito a carnes, a mioglobina (vermelho prpura) que d a
colorao caracterstica de carnes frescas, transformada em nitrosomioglobina
(vermelha), responsvel pela cor caracterstica das carnes curadas.
A nitrosomioglobina insolvel em gua. O aquecimento converte a
nitrosomioglobina em nitroso-hemocromo (rosa), responsvel pela colorao rsea
caracterstica de carnes cozidas (7).
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1.2.3 Atividade antibacteriana
Os nitritos so de grande importncia na conservao de alimentos porque eles
podem ajudar a evitar o crescimento da bactria que causa o botulismo (Clostridium
botulinum) freqentemente fatal. O nitrato, por si s no tem nenhuma ao inibitria
contra estas bactrias, tendo um papel incerto. Acredita-se que possa ser um
reservatrio de nitrito proveniente da reduo do nitrato pelos microorganismos
presentes em alimentos.
O mecanismo preciso da inibio de bactrias por nitritos desconhecido: sabe-
se que no evita a germinao dos esporos, mas evita o crescimento dos esporos
germinados (7).
1.3 ASPECTOS TOXICOLGICOS DOS NITRATOS E NITRITOS
Os maiores riscos provenientes da ingesto dos nitratos e nitritos so de
ocorrncia da metemoglobinemia e a formao de nitrosaminas.
1.3.1 Metemoglobinemia
O nitrito, ingerido ou formado no intestino por bactrias, pode
passar para a corrente sangunea, convertendo a hemoglobina das
clulas sanguneas metemoglobina (por oxidao do on ferroso
frrico), que incapaz de transportar oxignio. A proporo normal de
metemoglob ina e hemoglobina no sangue humano de 1:99%
respectivamente. Com a absoro dos nitri tos, ocorre um aumento no
teor de metemoglobina. Atingindo 10% pode aparecer cianose
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assintomtica, entre 20% e 30% h o aparecimento de cianose, com
sinais de hipoxia, astenia, dispnia de esforo, cefalia, taquicardia e
inconscincia. Concentraes superiores a 50% podem ser fatais.
As crianas so bem mais susceptveis a metemoglobinemia do que os
adultos, devido a menor acidez gstrica que favorece a proliferao de
microrganismos redutores de nitratos a nitritos (7).
1.3.2 Nitrosaminas
O cido nitroso formado em meio cido pode reagir com aminas secundrias
que ocorrem naturalmente em alimentos. As reaes so as seguintes:
H+ H +
NO2-
HNO 2 R2NH + HNO2 R 2N N = O + H 2O
Nitrito cido nitroso amina secundria nitrosamina
Muitas das nitrosaminas so carcinognicas. Algumas podem induzir a
formao de tumor, mesmo aps uma nica dose. Outras so teratognicas, isto ,
podem cruzar a barreira da placenta, produzindo tumores em fetos. Traos de
nitrosaminas foram detectados em carnes curadas, peixes curados e bacon frio.
Pesquisas em vrios laboratrios estabeleceram que a adio de antioxidantes como
tocoferol, cido ascrbico e seus sais ismeros, podem inibir a formao de
nitrosaminas(4).
A Organizao Mundial de Sade (FAO/WHO)(8) fixou uma ingesto diria
aceitvel (IDA) de 0-5 mg.Kg-1 de peso corpreo para o NaNO 3 e de 0-0,2 mg.Kg-1
peso corpreo para o NaNO2 .
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Tendo em vista os riscos apontados, da ingesto de nitritos e nitratos, os
valores relativamente baixos dos limites mximos de uso, permitidos pela legislao
brasileira e os valores igualmente baixos de suas IDAs, pode-se perceber a
importncia da fiscalizao pelos rgos pblicos competentes.
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2 - OBJETIVOS
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2. OBJETIVOS
2.1 OBJETIVO GERAL
O presente trabalho tem por objetivo o estudo da reduo de ons nitrato por
hidrazina em substituio ao uso da coluna de cdmio.
2.2 OBJETIVO ESPECFICO
Implementao desta substituio atravs da determinao de nitratos e
nitritos em aditivos alimentcios e guas, validao e comparao dos resultados
analticos dos mtodos de reduo com coluna de cdmio e com hidrazina.
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3 - REVISO DA LITERATURA
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3. REVISO DA LITERATURA
3.1 MTODOS PARA A DETERMINAO DE NITRITOS E NITRATOS
Diversos mtodos foram desenvolvidos para a determinao de nitritos e
nitratos em alimentos e outras matrizes.
As tcnicas mais utilizadas foram:
EspectrofotometriaUV/VIS (9,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19,20,21,22,23)
Cromatografia gasosa (24,25,26,27)
Cromatografia lquida de alto desempenho (HPLC)
(28,29,30,31,32,33,34,35,36,37,38,39,40,41,42,43)
Cromatografia de ons (44,45,46,47)
Potenciometria (eletrodo seletivo) (48,49,50,51,52,53)
Eletroforese capilar (54,55,56)
Amperometria (57,58,59,60)
Anlise por injeo em fluxo (FIA) (61,62,63,64,65,66,67,68,69,70,71)
Anlise por injeo seqencial (SIA) (72,73,74)
A tcnica mais amplamente utilizada dentre estas, a espectrofotometria na
regio do visvel, devido aos excelentes limites de determinao obtidos, a facilidade
de procedimentos e baixo custo, havendo cerca de 52 mtodos utilizando esta tcnica
(75).
O mtodo espectrofotomtrico no UV empregado na anlise de sais de cura
simples, formados por cloretos, nitritos e nitratos, nos quais os primeiros no
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absorvem nos mesmos comprimentos de onda dos ltimos (23). de fcil e rpida
execuo, porm limitado s amostras citadas.
A cromatografia gasosa (CG) tambm utilizada, recorre etapa da derivao,
atravs da reao do nitrato com benzeno formando o nitrobenzeno (24), ou com 2,4-
xilenol formando o 6-nitro-2,4-xilenol (27). O nitrito oxidado a nitrato atravs da
reao com permanganato de potssio ou perxido de hidrognio e submetido
mesma derivao. O derivado produzido extrado com solvente orgnico
apropriado e injetado no cromatgrafo.
Outra variao desta tcnica a reao do nitrito com hidralazina (1-
hidroxiftalazina) para formar a tetrazolftalazina (25,26), tambm extrada com
solvente orgnico e injetada. Nesses casos o nitrato reduzido nitrito antes da
derivao.
Alm da introduo da etapa da derivao, a cromatografia gasosa tem a
desvantagem da necessidade de uso de detectores muito especficos, como captura de
eltrons (ECD) (24,25,27) ou analisador de energia trmica (TEA) (24).
A cromatografia lquida de alta eficincia (HPLC) comparada ao mtodo
espectrofotomtrico, apresenta as seguintes vantagens:
embora a deteco seja no UV, o risco de interferncias de outras
espcies absorventes menor devido separao dos picos.
o tempo de anlise menor por HPLC; numa nica corrida determina-se
simultaneamente nitrito e nitrato, no havendo a necessidade da etapa de
reduo, o que ocorre na espectrofotometria onde so determinados
individualmente em anlises separadas.
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a cromatografia lquida aplicvel para rotina com grande nmero de
amostras; a espectrofotometria limitada ao nmero de colunas redutoras
disponveis.
na espectrofotometria, a coluna de cdmio perde a eficincia aps a
passagem de vrias amostras, necessita ser regenerada e testada com
padres, o que consome tempo. Na cromatografia basta lavar a coluna
com a prpria fase mvel.
As desvantagens que a cromatografia lquida apresenta so a utilizao de um
aparelho de alto custo e reagentes de alta pureza, grau HPLC, mais caros.
Outra variante cromatogrfica, a cromatografia de ons (CI), emprega colunas
de troca inica (46,47)no processo de separao, e deteco no UV (44,46,47), com
seletividade e sensibilidade comparveis anlise por injeo em fluxo (FIA). A
sensibilidade ser alta, especialmente se for acrescentada coluna pr-concentradora.
A vantagem da cromatografia de ons sobre a gasosa est em no requerer
qualquer pr-tratamento de derivao da amostra; a desvantagem est no emprego de
colunas muito caras e tempo de corrida maior que o de outras tcnicas, como por
exemplo a eletroforese capilar (EC).
A potenciometria faz uso de eletrodos que, embora chamados seletivos,
tambm respondem ao on cloreto, um interferente comum. O eletrodo cerca de 100
vezes mais sensvel ao nitrato do que ao cloreto; ocorre que s vezes esta
sensibilidade insuficiente para baixos teores de nitrato, sendo necessrio adicionar
sulfato de prata para precipitar o cloreto. O eletrodo cerca de 100.000 vezes menos
sensvel ao on sulfato introduzido. O on nitrito tambm interfere e eliminado com
adio de cido sulfmico (50,52).
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Pode ser efetuada a determinao simultnea de nitrato e nitrito; o potencial
da soluo medido antes e depois do nitrito ser oxidado a nitrato com
permanganato de potssio (53). A tcnica apresenta simplicidade, maior rapidez que
o mtodo colorimtrico com a coluna de cdmio, requerendo apenas um tratamento
prvio da amostra. A interferncia do on cloreto ocorre para concentraes maiores
que 50 g.m L-1, quando aplicado o mtodo em guas minerais (49).
A eletroforese capilar (EC) uma tcnica de separao baseada na migrao
diferenciada de compostos inicos ou ionizveis, em um campo eltrico. Utiliza
coluna capilar de slica fundida, soluo de eletrlitos, modificador de fluxo
eletrosmtico e deteco no UV. Sua alta resoluo resulta em um tempo de anlise
menor, sendo mais rpido que a cromatografia de ons (CI).
Apresenta ainda um custo muito mais baixo, tanto do equipamento quanto da
coluna e dos reagentes.
Porm, apresenta falta de sensibilidade e especificidade, no sendo indicado
na presena de concentraes altas de cloretos, que nesses casos necessita ser
removido (54,56).
Na amperometria o mtodo baseado na oxidao do on iodeto pelo on
nitrito formando o on I3- (58,59,60), sendo a corrente proporcional quantidade do
on I3-formado, conforme a equao:
2 HNO2 + 3 I-+ 2 H + 2 NO + I 3
-+ 2 H 2O
A deteco pode ser biamperomtrica em fluxo, com dois eletrodos de platina
polarizados a 100 mV em excesso de iodeto (58), ou amperometricamente em fluxo
com eletrodos de grafite teflonizado ou fio de platina polarizada com voltagem de
100 mV (60).
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O on nitrato pode ser fotoreduzido pela radiao UV com lmpada de
mercrio (58), e o nitrito total (inicial + fotoreduzido) empregado na reao acima.
Pode ser tambm reduzido a nitrito em coluna de cdmio cobreado (60)e detectado
da mesma forma. O mtodo simples, de baixo custo e seletivo.
O grande interferente neste mtodo o oxignio, que pode reagir com o
monxido de nitrognio segundo a equao:
2 NO + O2 2 NO2
O dixido de nitrognio formado pode desproporcionar em cido nitroso
(HNO2) e cido ntrico (HNO3) ou reagir, posteriormente, com excesso de iodeto
formando, outra vez, o monxido de nitrognio, segundo a equao:
2 NO2 + 6 I-+4 H + 2 I3
- + 2 NO +2 H2O
Em vista disso, as condies precisam ser estritamente controladas.
Um outro modo de deteco emprega eletrodo de carbono vtreo revestido
com um filme eletrostaticamente preparado de cobalto porfirina tetrarutenada / meso-
tetra(sulfonatofenil)porfirinato de zinco(II) (57). O revestimento impede o
envenenamento da superfcie do eletrodo e a estabilidade dura vrias semanas. O
mesmo detector utilizado para a determinao do nitrato aps a reduo a nitrito
em coluna redutora de cdmio cobreado. Os maiores interferentes neste eletrodo
modificado para nitrito so os nions capazes de serem oxidados neste potencial de
trabalho, entre eles, brometo e iodeto. Uma vez que o nitrato e o oxignio no so
eletroatrativos nas condies do mtodo, no causam interferncia na anlise do
nitrito.
A anlise por injeo em fluxo (FIA) um mtodo baseado na injeo de uma
amostra lquida em um fluxo contnuo no segmentado de um lquido adequado. A
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amostra injetada forma uma zona, que , ento, transportada por meio de um detector
que, continuamente, registra a absorbncia, o potencial de eletrodo ou qualquer outro
parmetro fsico, que muda, continuamente, como resultado da passagem da
amostra pela clula de fluxo. Utiliza, na maioria dos casos, a reao de reduo do
nitrato a nitrito com coluna de cdmio cobreado. O nitrito total (inicial + reduzido)
determinado, colorimetricamente, pela reao de desenvolvimento de cor ou de
decrscimo de cor.
Como exemplos do primeiro caso, temos a clssica reao de diazotao e
copulao de Griess (65,66), reao do nitrito com o floroglucinol(67), a nitroanilina
(70), o sulfato de proflavina (71).
Como exemplos do segundo caso, temos o efeito cataltico do nitrito na
oxidao do violeta cristal pelo bromato de potssio, cujo decrscimo da absorbncia
monitorado espectrofotometricamente (68) ou pelo mesmo efeito do nitrito na
oxidao da galocianina pelo mesmo bromato (61), do verde de naftol B com o
bromato (62)ou do nitrito com o molibdnioVI (69). A frequncia varia de 20 a 90
amostras por hora, dependendo do mtodo, com amostras de guas, carnes, farinhas e
queijos.
A anlise por injeo seqencial (SIA), mantm os mesmos princpios do
FIA, como controle da disperso, controle do tempo e injeo da amostra, porm, o
sentido do fluxo pode ser programadamente invertido. Tambm emprega a reao de
reduo do nitrato e o nitrito total (inicial + reduzido) determinado atravs da
clssica reao de Griess.
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O mtodo de reduo emprega a coluna de cdmio cobreado (72,73) ou
reduo com sulfato de hidrazina/sulfato de cobre (74), que o tema central deste
trabalho, ou seja, a comparao da eficincia dos dois mtodos de reduo.
Com relao ao redutor utilizado, a coluna de cdmio cobreado pode ser
recondicionada durante o processo para a redeposio do cobre sempre que
necessrio.
Porm, apresenta problemas de desativao devido ao envenenamento da
coluna pelos componentes de algumas amostras como gua de esgoto (matria
orgnica, on fosfato,etc.), recomendando-se outros redutores (73).
O redutor sulfato de hidrazina/sulfato de cobre alm de no necessitar
manuteno da coluna, no tem problemas de interferncia de alguns componentes
da amostra como o on fosfato, apresentando boa recuperao at com gua de
esgoto (74).
As vantagens da injeo seqencial (SIA) sobre a injeo em fluxo (FIA) so
a reduo do consumo de reagentes, estimado em um dcimo, reduo conseqente
do volume de descarte, importante no caso de produtos qumicos caros e/ou txicos.
Pode ser automatizado, sendo empregado para diferentes anlises sem
necessidade de mudana na configurao fsica do sistema; para alterar os volumes
dos reagentes ou da amostra basta mudar o percurso do pisto e, para alterar a
seqncia da mistura ou da reao, basta mudar a posio da vlvula seletora, que
controlado por computador.
Uma aparente desvantagem apresentada que a injeo seqencial (SIA)
possui freqncia de amostragem inferior injeo em fluxo (FIA), mas, mesmo
assim, bem atraente.
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3.2 O MTODO ESPECTROFOTOMTRICO
O mtodo clssico para a determinao colorimtrica de nitrito deve-se a
Griess (76), por meio da reao deste on com o cido sulfanlico (cido 4-amino-
benzenosulfnico) e naftilamina (1-aminonaftaleno) em cido sulfrico. O mtodo
foi modificado posteriormente por Ilosvay (77) com a substituio do cido sulfrico
por cido actico, que aumenta muito a velocidade de desenvolvimento de cor.
As reaes envolvidas podem ser representadas pelas seguintes equaes:
3.2.1 Reao de diazotao
NH2
SO3H
+ NO2- + 2H+
N+ N
SO3H
cido sulfanlico on diaznio
3.2.2 Reao de copulao
+ NH2 SO3H
NN
NH2
+ H+
on diaznio -naftilamina azocomposto
N+ N
SO3H
(cido alfa-naftilamina- p-azobenzeno-p-
sulfnico)
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O conjunto dessas duas reaes chamado de diazoconjugao. Vrios pares
de reagentes, seguindo ou no o modelo de diazoconjugao de Griess-Ilosvay,
foram testados conforme levantamento realizado por Sawicki et al. (75).
Reagentes como o -naftol e -naftilamina por serem carcinognicos (78)
tem sido substitudos por outros reagentes.
Bratton e Marshall (79), investigando novos reagentes para a
diazoconjugao encontraram o par sulfanilamida (4-amino-benzenosulfonamida) e
NED [dicloridrato de N-(1-naftil)etilenodiamina] como o mais satisfatrio, sendo
este ltimo (NED) citado por Sen e Donaldson (80) por no ter sido encontrado
nenhum relato sobre efeitos txicos dos mesmos.
Este par, sulfanilamida/NED, o adotado pela Comunidade Europia (81) e
tambm foi o utilizado no presente trabalho.
3.3 AS ETAPAS
A quantificao de nitritos e nitratos passa por duas etapas igualmente
importantes, as reaes de reduo de ons nitrato e as reaes colorimtricas.
3.3.1 As reaes color imtr icas
O mecanismo de reao de Griess a nitrao do cido sulfanlico para
formar o sal de diaznio do cido sulfanlico o qual copula com -naftilamina para
formar o azo composto rosa brilhante, conforme mostram as equaes dos itens 3.2.1
e 3.2.2.
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Substituindo o par cido sulfanlico/ -naftilamina pelo par sulfanilamida/NED,
as equaes das reaes ficam assim escritas:
3.3.1.1 Reao de diazotao com sulfanilamida
NH 2
SO2NH2
+ NO2-
+ 2H+
N+
N
SO2NH2
+ 2 H2
O
3.3.1.2 Reao de copulao com NED
N+ N
SO2 NH2
+
H-N-CH2-CH2-NH2-2HCl
+ H+
NN
SO2NH2 H-N-CH2-CH2-NH2-2HCl
Como podemos verificar, apesar dos radicais serem diferentes, o mecanismo da
reao o mesmo e nele vemos a importncia do pH.
Alta acidez aumenta a velocidade de diazotao e diminui a velocidade de
copulao. Baixa acidez diminui a velocidade de diazotao e aumenta a velocidade
de copulao. Este fato previsto pela lei da ao das massas na primeira equao na
qual o on H+ um reagente e na segunda equao o mesmo um dos produtos.
Rider e Mellon (82)estudaram detalhadamente esta reao de diazoconjugao
para determinar o efeito de vrios fatores, como concentrao dos reagentes, ordem
de adio dos reagentes, pH, temperatura, luz, concentrao de nitrito, alm de ons
interferentes. Eles chegaram a quatro concluses principais:
I. A diazotao deve ser efetuada em soluo fortemente cida (pH=1,4).
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II. A diazotao deve ser efetuada em soluo to fria quanto praticvel (~20C).
III. A copulao no deve ser tentada antes da diazotao estar completada.
IV. A copulao deve ser efetuada em uma acidez to baixa (pH=2,0-2,5) quanto
for consistente com a estabilidade colorimtrica.
Davis et al. (81)estudaram especificamente o efeito do pH na absorbncia do
azo corante formado na reao entre o nitrito e o par sulfanilamida/NED.
A justificativa do estudo foi que vrios corantes indicadores so dependentes
do pH, ento o azo composto tambm deveria ser. Assim sendo, poderiam surgir
resultados errados se a curva padro fosse desenvolvida em um determinado pH e
empregada na anlise de uma amostra em um pH diferente.
Foi desenvolvida, por estes autores, uma equao que relaciona absortividade e
pH:
a= B + C . 10E . (pH D)
1 + 10 E . (pH D)
onde a= absortividade efetiva mxima, B, C, D e E so constantes para um dado
comprimento de onda cujos valores so: B= 0,7818; C= 0,3568; D= 2,713 e E=
1,164.
Com esses dados foi construda a Tabela 2 a seguir:
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Tabela 2: Variao da absortividade a com o pH no intervalo 1,0 - 4,4 (81).pH a pH a pH a pH a pH a1,0 0,778 1,7 0,755 2,4 0,654 3,1 0,468 3,8 0,3791,1 0,776 1,8 0,748 2,5 0,628 3,2 0,447 3,9 0,3741,2 0,775 1,9 0,739 2,6 0,601 3,3 0,430 4,0 0,3701,3 0,772 2,0 0,727 2,7 0,573 3,4 0,415 4,1 0,3671,4 0,770 2,1 0,713 2,8 0,545 3,5 0,403 4,2 0,3651,5 0,766 2,2 0,696 2,9 0,517 3,6 0,393 4,3 0,3631,6 0,761 2,3 0,676 3,0 0,491 3,7 0,385 4,4 0,361
Davis et al (81) sugeriram ento: a) medir o pH da soluo colorida final eutilizar a absortividade a correspondente para calcular a concentrao de nitrito. b)
ajustar o pH da soluo colorida final no intervalo 1,2-1,3 para a mxima
sensibilidade. A segunda alternativa por ser mais simples foi a recomendada.
Nicholas e Fox (83) tambm investigaram essa reao para determinar se a
adio de nitrito aos reagentes de Griess separadamente ou em mistura produziria
resultados diferentes.
Mostramos abaixo as duas possibilidades de primeira etapa de reao, por eles
considerada:
3.3.1.3 A nitrosao do cido sulfanlico
NH3+ + HONO -O3S- O 3S N N+ + 2 H2O
on diaznio
3.3.1.4 A ni trosao do 1-naftilamina
NH3+
+ HONO
N N+
+ 2H2O
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A prxima etapa seria a copulao do on diaznio com 1-naftilamina para
formar, ou 1-sulfanilazonaftilamina ou 1-naftilazonaftilamina. O primeiro um
produto colorido rosa com um mximo de absoro a 525 nm; o segundo insolvel
em gua. Desde que ou o cido sulfanlico ou 1-naftilamina podem reagir com nitrito
na mistura, a quantidade relativa de intermedirios e conseqentemente, os produtos
finais, dependem da velocidade relativa de reao e da concentrao.
Se a segunda opo fosse predominante, a quantidade do produto rosa deveria
ser reduzido, isto a segunda reao deveria interferir com o desenvolvimento
normal de cor. Tal interferncia deveria ser reduzida pela pr-incubao do cido
sulfanlico com nitrito seguido pela adio de 1-naftilamina.
O nitrito foi adicionado ao cido sulfanlico e a mistura foi deixada em
repouso por 20 minutos antes de ser adicionado a 1-naftilamina. A quantidade
resultante de azo corante foi a mesma que aquela formada quando o nitrito foi
adicionado mistura de cido sulfanlico e 1-naftilamina.
Ficou claro que a velocidade da reao do item 3.3.1.3 muito mais rpida
que a reao do item 3.3.1.4 nas condies de anlise dos reagentes de Griess.
Esta constatao importante foi aplicada na determinao de nitritos e nitratos
atravs da anlise por injeo seqencial (SIA) em que os reagentes sulfanilamida e
NED so adicionados na forma de soluo nica.
Nicholas e Fox (83) estudaram tambm o efeito da diluio do reagente de
Griess adotada no mtodo oficial. Nesta diluio, 1:25, para uma concentrao acima
de 5g N-NO-2/50 mL (7,14 M) onde ainda havia absoro a concentrao de cido
sulfanlico era 326M (~45vezes) e a de 1-naftilamina era 87,2M (~12vezes).
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54
Os mesmos autores observaram, experimentalmente, que nesta diluio a
reao era incompleta, alm de requerer mais tempo e havendo o risco do azo
composto descolorir. Sugeriram, ento, a diluio 1:10, com maior rendimento e
menor tempo de reao.
Fox Jr., (84) estudando a cintica e mecanismo da reao de Griess,
enumerou uma seqncia de reaes crticas para a formao do produto final, aqui
apresentada:
a.
R*
+HNO2
R*
N N+
b.
NN
R
+
+
NH2
R R
NH2
N N
R
c.
HNO2 + RdH RdNO (nitroso)
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d.
+
+
R
N N
Rd H OxRd +
R
NHNH
e.
NH2
R
+ HNO2
N
NH2
R
O
f.
+
R
N N
+
N
R
H2 H2
R
N
N N
R
Onde R= -SO2H; SO2NH2; Cl; NH2OH e qualquer combinao deles, Rd=redutor,
OxRd= forma oxidada.
Fox Jr.(84) concluiu que a quantidade de diazopigmento formado da
reao de uma variedade de anilinas e derivados da anilina com nitrito
dependente de uma srie de fatores, a saber:
I. Tipo e concentrao dos reagentes usados, incluindo a posio dos
substituintes do anel.
II. Combinaes especficas e concentraes relativas das espcies nitrosveis e
reagentes copulantes.
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III. Reao do nitrito com outros substituintes do anel alm do grupo amino.
IV. Reao do nitrito com o reagente copulante.
V. Formao de mais de um pigmento.
VI. Oxidao do on diaznio intermedirio.
VII. Oxidao do pigmento.
VIII. xidos de nitrognio no ar.
IX. Reduo do on diaznio pelos redutores residuais.
X. Formao de intermedirios nitroso-redutores semiestveis.
XI. Pr reao da espcie nitrosada e o nitrito.
A reao de diazoconjugao para o on nitrito tem sido indicada como tendo
especificidade qumica, minimizando o efeito de interferncias, sendo deste modo
explicada a grande popularidade do mtodo de Griess.Todas as referncias at aqui foram para o nitrito, no tendo sido considerado
o on nitrato. Este por sua vez, por falta de uma reao to especfica e sensvel, tem
sido determinado como nitrito, aps uma reao de reduo.
3.3.2 As reaes de reduo de ons nitrato
O mtodo espectrofotomtrico para a determinao simultnea de nitritos e
nitratos baseia-se em trs etapas:
I. Reao direta do nitrito presente na amostra com os reagentes colorimtricos
e leitura espectrofotomtrica contra um branco, utilizando-se a curva de
calibrao.
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II. Reduo do nitrato por ao de um redutor e determinao
espectrofotomtrica do nitrito total (nitrito inicialmente presente + nitrito
proveniente do nitrato reduzido).
III. Determinao do nitrato por diferena (nitrito total- nitrito inicialmente
presente = nitrato).
Do exposto percebe-se que estamos determinando sempre nitrito, que o nion
que desenvolve cor com os reagentes colorimtricos, uma vez que o nitrato no reage
com eles.
comum nos trabalhos consultados expressar o resultado em nitrognio
colocando-se ao lado a sua fonte, como N-NO-3 e N-NO2-evitando-se assim fatores de
converso.
Embora, no caso do nitrato, a etapa da reduo preceda a determinao
espectrofotomtrica, deixamos este item para depois em virtude de ser o ponto
central deste trabalho, isto , a substituio do agente redutor.
O mtodo oficial para a determinao de nitrato {AOAC(1984)24.044-24.045}
baseia-se nas trs etapas j descritas (I, II, III) atuando como redutor a coluna de
cdmio, preparada pela reao entre o sulfato de cdmio em soluo e o zinco em
basto.
As reaes do item II so:
Cd - 2e- Cd 2+
H2O + NO3-+ 2e - NO 2
- + 2 OH-
H2O + Cd + NO 3- Cd 2++ NO 2
- + 2 OH-
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Durante o funcionamento esta coluna libera ons Cd2+, altamente txicos,
alm de problemas com o descarte.
Estes ons permanecem em soluo, j que o mtodo oficial recomenda a
adio de EDTA para complexar os ons Cd2+,evitando que reaja com os ons OH -
provenientes da reduo do nitrato e conseqentemente precipitao de Cd(OH)2 na
superfcie da coluna, reduzindo a sua eficincia (85).
A reao pode ser assim representada:
NO3- + H2O + (EDTA)
-4 + Cd NO 2- + 2 OH- + Cd(EDTA) -2 (EDTA) -4
=(OOCCH2)-2N(CH2)2N(CH2COO)
-2
(EDTA) -2=(HOOCCH 2)2N(CH2)2N(CH2COO)-2
A produo de ons Cd2+ na coluna redutora muito maior que aquela
causada somente pela reduo do nitrato.
Nydall (85) chamou a ateno para o fato de que o oxignio dissolvido rpida e
quantitativamente reduzido de acordo com a reao:
2Cd + O2 + 4H+ 2Cd+2 + 2H2O
De acordo com o autor, mesmo a uma elevada vazo na coluna de 33
volumes-leito por minuto, 98,5% do oxignio reduzido.
Como visto na equao desta reao, a reduo do oxignio deve remover
dois ons H+ para cada tomo de oxignio. Isto corresponde adio de 1 meq de
base por litro de soluo, assim deve ocorrer um aumento do pH em solues no
tamponadas.
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Ento, deve-se tambm considerar que a reduo do nitrato dependente do
pH.
Isto pode ser verificado atravs das equaes:
a. NO3- + 2H + + 2e - NO 2
- + H 2O
b. HNO2 + 5H+ + 4 e - NH 3OH
+ + H 2O
hidroxilamina
c. HNO2 + 7H+ + 6 e - NH 4
+ + 2H 2O
Uma certa concentrao hidrogeninica necessria para a reduo
quantitativa do nitrato a nitrito (reao a); concentraes hidrogeninicas muito
elevadas podem causar a reduo do nitrito formado (reaes b e c).
Segundo experimentos do mesmo autor, o nitrato rapidamente reduzido pelo
cdmio a hidroxilamina e pequenas quantidades de amnia a baixo pH (1,0-3,0). No
intervalo de pH 3,0 a 5,0 a velocidade desta reao decresce ntida e rapidamente e a
reduo tende a parar na formao do nitrito.
Com respeito ao pH adequado, Nydall (85) cita vrios outros autores que
observaram que o pH do tampo cloreto de amnio empregado podia variar entre 5,0
e 10,0 sem efeito na reduo do nitrato a nitrito. Alguns recomendam o pH 9,6(86).
A reduo do nitrato a nitrito pode ser obtida pelo emprego de vrios agentes
redutores, tais como cobre, zinco, cdmio em p, cdmio esponjoso, cdmio
cobreado, cdmio prateado, cdmio amalgamado, cdmio eletroliticamente
precipitado e sulfato de hidrazina (78,85).
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O cdmio eletroliticamente precipitado, devido ao seu mtodo de preparao,
tem porcentagem baixa de impurezas metlicas; o cdmio em p e o esponjoso tm
essa porcentagem de impurezas maior.
Quando o cdmio preparado pela reao de precipitao entre uma soluo
de sulfato de cdmio e zinco metlico h a possibilidade de formao de clulas
galvnicas pelos metais mais nobres que podem estar presentes no zinco (impurezas)
e no so removidos.
Este fato foi aproveitado para intencionalmente tratar o cdmio com uma
soluo de sulfato de cobre; este precipitado e parcialmente adere ao cdmio como
uma camada porosa. Uma cela galvnica formada com o cobre como ctodo.
O potencial padro de reduo do par Cd/Cd2+ 0,403V, o do par Cu/ Cu2+
+0,337V e o potencial da cela resultante ser 0,740V; seu poder redutor muito
maior que o do cdmio sozinho.
Cerd et al (73)utilizaram uma coluna de cdmio cobreado na determinao
de nitratos e nitritos empregando a tcnica de anlise por injeo seqencial (SIA).
Se a coluna redutora contm partculas de diferentes tamanhos, as menores,
empacotadas nos interstcios entre as maiores, so consumidas primeiro e a rea
superficial do leito redutor diminuda. Esta pode ser uma causa que contribui para o
decrscimo gradual de eficincia da coluna observada por vrios autores. Outra causa
e provavelmente a principal pode ser a precipitao de partculas de hidrxido de
cdmio na superfcie.
Alm de homogeneidade das partculas, para um bom rendimento da coluna
redutora necessrio um controle da vazo ou tempo de escoamento.
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Quando a coluna utilizada em vrias redues sucessivas e assumindo que o
sistema deve ser lavado com duas vezes seu volume livre entre as amostras, o tempo
t em minutos, requerido por cada amostra, obtido pela equao:
t = (1/ F) x (Vs/Vb + 2Vf/Vb)
Onde
F= velocidade de fluxo em volume-leito/min.
Vs=volume da amostra
Vb=volume do leitoVf=volume livre da coluna
Bajic e Jaselkis (87)empregaram uma coluna redutora de zinco amalgamado
(redutor de Jones) para determinar nitratos e nitritos em guas. O mtodo baseia-se
na formao de hidroxilamina, resultante da reduo inicial do nitrato ou nitrito, a
qual reage com o Fe3+ e ferrozina [sal disdico do cido 3-(2-piridil)5,6-difenil-
1,2,4-triazinap,p-disulfnico, trihidratado] para formar o complexo fortemente
colorido Fe2+ -ferrozina cuja intensidade proporcional quantidade de nitrato ou
nitrito.
A absortividade molar aparente do complexo 4,21 x104 L.mol-1.cm-1. No
intervalo de pH 3,2-3,5 tanto nitrato como nitrito so reduzidos primariamente a
hidroxilamina e em alguma extenso amnia. A hidroxilamina, nesta determinao,
oxidada pelo Fe3+ a xido nitroso enquanto que a amnia no oxidada. Em pH
elevado a reduo do nitrato incompleta, em pH baixo a formao de amnia
favorecida; por esta razo o pH tem que ser mantido no intervalo citado.
Para a determinao do nitrato adicionado azida sdica amostra para
eliminao do nitrito e este obtido por diferena.
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Lambert e Zitomer (88)tambm utilizaram o zinco para a reduo do nitrato.
A reao efetuada em soluo amoniacal de pH 10,8 em presena de hidrxido
manganoso.
De acordo com esses autores, menos de 70% de recuperao obtida quando
a reao efetuada na ausncia de hidrxido manganoso. Provavelmente, a poro
no recuperada posteriormente reduzida estados de oxidao mais baixos do
nitrognio e possivelmente amnia.
A funo do hidrxido manganoso pode ser a de formar um complexo de
nitrito que estvel a posterior reduo nesta temperatura. A reduo a temperaturas
maiores, evidentemente, vai alm do estgio nitrito.
Para a determinao colorimtrica emprega-se a reao de diazoconjugao
com o on (4-aminofenil) trimetil amnio como diazotante e N, N-dimetil-1-
naftilamina como copulante. A absortividade molar do corante formado 26,2 x103.
As reaes so as seguintes:
NO3- + Zn + 4NH3 + H2O NO2
- + Zn (NH3)42+ + 2 OH-
HNO + H+ + (CH3 )3 N+ NH2 (CH3)3N+ N N+ + 2H2O2
+N N (CH 3)3 N + +
N (CH3)2
(CH3)3N+ N N N (CH3 )2 + H2O
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A injeo de um lquido redutor na amostra pode parecer intuitivamente ser
prefervel ao contato da amostra com um slido redutor, cuja atividade poderia
mudar com o tempo e com a composio da amostra.
Um promissor lquido redutor encontrado foi a soluo de hidrazina. Mullin e Riley
(89)mostraram que a hidrazina em soluo alcalina produzia um bom rendimento de
nitrito a partir do nitrato.
Quando este reagente foi aplicado na determinao de nitrato em gua
destilada, verificou-se que o rendimento de nitrito variava de dia para dia. Esta
conduta irregular foi investigada e verificou-se a presena de quantidades variveis
de ons cobre na gua destilada utilizada.
O efeito do cobre na reduo foi investigado realizando a reao na presena
de quantidades conhecidas de ons cobre.
Os resultados indicaram que na ausncia de cobre no ocorria a produo de nitrito.
A presena de somente 0,025 mg. L-1 de cobre era suficiente para iniciar a reao.
Com concentraes de cobre superiores a 0,5 mg.L-1 ocorria visvel precipitao de
xido cuproso.
Kamphake et al. (90) tambm verificaram experimentalmente que o on cobre
necessrio para a reao de reduo.
A reduo baseada na converso do nitrato a nitrito pelo sulfato de
hidrazina, na presena de Cu2+,sob condies alcalinas e a temperaturas elevadas.
As reaes provveis do item 3.3.2. II, so:
N2H4.H2SO4 + 6OH- N2 + SO 4
-2 + 6H 2O + 4e-
4Cu+2
+ 4e-
4Cu+
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N2H4.H2SO4 + 6OH- + 4Cu+2 N 2 + SO 4
-2 + 6H 2O + 4Cu+
4Cu+ 4Cu +2 + 4e -
2NO3- + 2H2O + 4e
- 2NO 2- + 4OH -
2NO3- + 2H2O + 4Cu
+ 2NO2- + 4OH - + 4Cu+2
Uma vez que a reduo deve ser efetuada em meio alcalino, torna-se obvio
que essencial controlar o pH, j que o on H+ liberado do sulfato de hidrazina
durante a reao pode diminuir o pH para abaixo de 7, nessas condies o nitrito
rapidamente destrudo pela hidrazina (90).
O primeiro uso da hidrazina para reduo do nitrato foi o relatado por Mullin
e Riley (89). Aps este, vrios outros autores, entre eles Kamphake et al (90),
desenvolveram e automatizaram o mtodo manual original para diminuir a
inconfiabilidade da reao devido s variaes de rendimento acima citadas.
Os fatores responsveis por essas variaes tais como concentrao dos
reagentes, o pH, tempo de reduo e temperatura, que influenciam fortemente a taxa
de converso, foram examinados por vrios pesquisadores tendo sido encontradas
grandes variaes entre eles.
Segundo Cerd et al. (73, 74) os resultados na determinao de ons nitrato
com hidrazina e Cu ++ foram bons para amostras de guas. Porm, no foram
reprodutveis em nosso laboratrio.
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3.3.3 As interferncias
3.3.3.1 Nas reaes colorimtricas
As reaes colorimtricas so comuns a ambos os mtodos. Norwitz e
Keliher (91) realizaram um estudo com 82 possveis interferentes na determinao
espectrofotomtrica utilizando 3 pares de reagentes: sulfanilamida/NED, cido
sulfanlico/NED e 4-nitroanilina/NED. Evidentemente, o de maior interesse o
primeiro par por ter sido o empregado neste trabalho.
Os autores classificaram as substncias inorgnicas segundo o limite de
tolerncia (limite alm do qual a substncia produzia um erro maior que 0,015
unidades de absorbncia) em 5 tipos de interferncias:
Interferncia devido ao efeito salino:
A razo para o efeito dos sais vem ser as diferentes dependncias das
velocidades de diazotao e copulao com a fora inica.
Interferncia pela mudana da acidez da soluo (hidrlise) ou pela sua ao
tamponante:
A interferncia calculada na base do sal total ao invs do nion.
Interferncia pela precipitao:
Prata e mercrio (I), interferem pela precipitao como cloretos. A fonte de
cloreto o cido clordrico do reagente sulfanilamida que dissovido neste
cido. O bismuto (III) tambm precipita como oxicloreto.
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Interferncia de ons coloridos
Cromo (III), nquel e especialmente cobalto interferem em razo da cor de seus
ons. Este efeito pode ser eliminado pela adio destes ons ao branco, na mesma
quantidade que contem a amostra, o que pode ser problemtico.
Interferncia de substancias oxidantes e redutoras.
Embora este efeito seja complexo, certamente deve envolver a oxidao ou
reduo do nitrito.
Todavia a oxidao ou a reduo do nitrito usualmente no ocorre em soluo
neutra; requer a presena de cido ou base. possvel que no ocorra em grande
extenso at que os reagentes sulfanilamida e NED sejam adicionados.
Norwitz e Keliher (92)realizaram tambm o mesmo estudo com interferentes
orgnicos, agrupados em aminas alifticas, aminas aromticas, compostos fenlicos e
miscelnea de compostos orgnicos.
Destes ltimos, o que mais tem merecido ateno o cido ascrbico, em
razo de ser comumente empregado em sais de cura com a inteno de reduzir a
quantidade de nitrito necessrio para a cura e diminuir a probabilidade de formao
de nitrosaminas carcinognicas (93).Norwitz e Keliher (93) publicaram um trabalho especialmente dedicado a
interferncia do cido ascrbico na determinao do nitrito.
Citando outros autores que investigaram a reao do cido ascrbico e o
nitrito no intervalo de pH 0,1-5, eles estabeleceram que dentro desta faixa de pH,
ocorre a reao:
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O C
C
C
CH2OH
HO
HO
HOCH
HC
O + 2 HNO2 O
HC
HOCH
CH2OH
C
C
CO
O
O
cido L-ascrbico cido L-dehidroascrbico
A pH 0,1, a etapa determinante da velocidade envolve o cido ascrbico no
dissociado e o on H2NO2+ (HNO2 + H
+ H2NO2+)
A pH 2 a etapa determinante a reao de uma concentrao de equilbrio de
trixido de dinitrognio (2HNO2 N2O3 + H2O) com cido ascrbico no
dissociado e o on ascorbato, sendo este ltimo muito mais reativo.
No intervalo de pH 35, a etapa determinante da velocidade de reao a
formao de trixido de dinitrognio e a velocidade independente da concentrao
de cido ascrbico, predominantemente na forma de nion.
Riise e Berg-Nielsen (94)propuseram a adio de enzima ascorbato oxidase
para diminuir a interferncia deste cido na determinao do nitrito.
3.3.3.2 Nas reaes de reduo
A principal interferncia em ambos os mtodos de reduo de ons nitrato o
oxignio do ar. O redutor cdmio reage com o oxignio segundo a reao:
2Cd + O2 + 4H+ 2Cd+2 + 2H2O
Alm de o oxignio consumir o cdmio necessrio para a reduo do nitrato,
competindo com ele, ocorre uma interferncia no pH pelo consumo de H+.
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Kempers e Luft (95)tambm investigaram a possibilidade de interferncia do
oxignio na reduo do nitrato pela hidrazina.
Segundo os autores, em solues aquosas a hidrazina reage com o oxignio
para formar perxido de hidrognio o qual ento reduzido:
N2H4+ 2O 2 2 H 2O2 + N 2
N2H4+ 2H 2O2 N 2 + 4H 2O
A presena de ons metlicos catalisa esta reao (96).
4 - MATERIAIS E MTODOS
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4. MATERIAIS E MTODOS
4.1 MTODO COM O USO DA COLUNA DE CDMIO
4.1.1 Reagentes e solues
Utilizar reagentes grau analtico.
Utilizar gua destilada (destilador Marconi MA 078/5) ou desionizada
no preparo das solues a seguir:
Soluo de tetraborato de sdio decahidratado (Na2B4O7.10H2O) (Riedel-
de Han ou Merck) a 5% m/v.
Soluo de EDTA (C10H14N2Na2O8.2H2O) (Mallinckrodt) a 5% m/v.
Soluo tampo pH 9,6-9,7.
Diluir 20 mL de cido clordrico em 500 mL de gua. Adicionar 50 mL de
hidrxido de amnio, acrescentar gua at prximo de 1000 mL e homogeneizar.
Medir o pH ajustando para 9,6-9,7 com HCl ou NH4OH se necessrio e completar
o volume para 1000,0 mL com gua destilada ou desionizada.
Soluo tampo pH 9,6-9,7 diluda (1+9)
Tomar 100,0 mL da soluo tampo pH 9,6-9,7 e diluir para 1000,0 mL.
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Soluo de sulfanilamida (C6H8N2O2) (Mallinckrodt) a 5% m/v
Dissolver 1,25 g de sulfanilamida em soluo de HCl (1:1) completando para
250,0 mL com esta ltima. A soluo estvel por 1 a 2 meses.
Soluo de dicloridrato de N-(1-naftil) etilenodiamina (NED)
(C12H16Cl2N2) (Merck) a 5% m/v
Dissolver 0,5 g de NED em gua suficiente para 100,0 mL. Armazenar em
frasco mbar sob refrigerao. Desprezar quando apresentar alterao de colorao.
A soluo estvel pelo menos por uma semana.
Soluo padro de nitrito de sdio (NaNO2) (Merck)
Pesar, exatamente, 0,2000 g de nitrito de sdio previamente seco por 1hora a
105C, transferir para balo volumtrico de 1000,0 mL e completar o volume. Esta
soluo estvel pelo menos por 2 semanas se mantida a 4C.
Soluo de trabalho de nitrito de sdio
Transferir 10,0 mL da soluo padro de nitrito de sdio para balo
volumtrico de 250,0 mL e completar o volume; 1,0 mL desta soluo contem 8,0 g
de NaNO2.
Soluo padro de nitrato de sdio (NaNO3) (Merck)
Pesar, exatamente, 0,1000 g de nitrato de sdio previamente seco por 1h a
105C, dissolver em gua, adicionar 50 mL da soluo tampo pH 9,6-9,7 e
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completar para 100,0 mL. Esta soluo estvel pelo menos por 2 semanas se
mantida a 4C.
Soluo de trabalho de nitrato de sdio.
Transferir 1,0 mL da soluo padro de nitrato de sdio para balo volumtrico
de 100,0 mL e completar o volume; 1,0 mL desta soluo contm 10,0 g de NaNO3.
Preparar no momento da anlise.
Soluo de cido clordrico 0,1 M.
Diluir 8,3 mL de cido clordrico d=1,19 a 37% em gua e completar o volume
at 1000,0 mL.
Soluo de cido clordrico 2,0 MDiluir 166 mL de cido clordrico d=1,19 a 37% em gua e completar o volume
at 1000,0 mL.
Soluo de sulfato de cdmio (3CdSO4.8H2O) a 20% m/v.
Zinco metlico em basto.
4.1.2 Aparelhos e materiais acessrios
Espectrofotmetro UV/VIS Hitachi U2000
pHmetro Micronal B474 com solues tampo para acerto de pH
Balana analtica Mettler AE 200
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Balana semi-analtica Mettler P-1200
Estufa Fanem 315/2
Coluna de vidro afilada na extremidade inferior (110 x 11 mm)
Funil de separao de 60 mL com haste comprida e rolha de silicone
afilada
Peneira de 20-40 mesh
Liquidificador
Papel de filtro qualitativo 18,5cm de dimetro
Balo volumtrico de 50,0; 100,0; 200,0; 250,0 e 1000,0 mL
Pipeta volumtrica de 1,0; 2,0; 3,0; 5,0; 10,0 e 20,0 mL
Bureta de 10,0 mL
Provetas de 25 e 50 mL
Bquer de 100 e 200 mL
Erlenmeyer de 250 e 500 mL
Funil
Pipeta graduada de 5 mL
4.1.3 Coluna de Cdmio
4.1.3.1 Preparo da Coluna de cdmio
Colocar trs bastes de zinco em um bquer de 250 mL contendo 100 mL
da soluo de sulfato de cdmio.
Remover o depsito esponjoso de cdmio que se forma aps 2 a 3 horas
de imerso, com um basto de vidro ou esptula plstica, transferindopara outro bquer contendo gua destilada.
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Transferir o cdmio formado com 200 mL de gua destilada para um
liquidificador e triturar por aproximadamente 5 segundos.
Passar o triturado em peneira de 20 a 40 mesh, tomando o cuidado de
mante-lo sempre em contato com gua.
Transferir o cdmio para um bquer com cido clordrico 2,0 M e deixar
repousar por 2 minutos.
Retirar o cido clordrico e substituir por gua destilada.
Colocar um chumao de l de vidro na extremidade afilada da coluna,
seguido de 1 cm de areia.
Transferir o cdmio com gua at que este atinja a altura de
aproximadamente 6 cm. Completar at o topo com gua.
Adaptar imediatamente o funil de separao de 60 mL coluna atravs da
rolha de silicone, evitando a entrada de ar na coluna e mantendo-a sempre
com gua.
4.1.4 Determinao da capacidade redutora da coluna de cdmio
Misturar em bquer de 100 mL; 20,0 mL da soluo de trabalho de
nitrato de sdio (10 g/mL), 5 mL da soluo tampo pH 9,6-9,7 e 2
mL da soluo de EDTA a 5%.
Passar pela coluna de cdmio a uma vazo no superior a 5 mL/minuto
recolhendo diretamente em balo volumtrico de 100,0 mL.
Lavar o bquer com 3 pores consecutivas de 15 mL de gua, passando-
as pela coluna de cdmio.
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Continuar a passagem de gua pela coluna at completar o volume de
100,0 mL no balo. Homogeneizar.
Pipetar 10,0 mL para um balo volumtrico de 50,0 mL.
Adicionar ao balo 5,0 mL da soluo de sulfanilamida a 0,5% e agitar.
Aps 3 minutos adicionar 3,0 mL da soluo de NED a 0,5% e completar
o volume com gua. Homogeneizar.
Aps 15 minutos fazer a leitura espectrofotomtrica a 542nm contra um
branco dos reagentes, utilizando a curva de calibrao.
Se a recuperao for inferior a 90%, deve-se rejeitar a coluna de cdmio.
Se a recuperao for inferior a 95%, deve-se regenerar a coluna de
cdmio.
4.1.5 Regenerao da coluna de cdmio
Regenerar a coluna de cdmio no incio de cada dia de utilizao e aps at 4
redues.
Adicionar coluna, com vazo aproximada de 10 mL/minuto, pela ordem:
25 mL de HCl 0,1 M
50 mL de gua destilada
25 mL de soluo tampo pH 9,6-9,7 diluda (1+9)
Reavaliar a capacidade redutora da coluna de cdmio como no item anterior
(4.1.4).
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4.1.6 Curva de calibrao do ni tri to
Tomar com bureta, alquotas de 0,5; 1,0; 2,0; 3,0; 4,0 e 6,0 mL da soluo de
trabalho de nitrito de sdio a 8,0 g/mL para bales volumtricos de 50,0 mL.
Adicionar a cada um, 5,0 mL de solues de sulfanilamida a 0,5% e agitar.
Aguardar 3 minutos e adicionar 3,0 mL de soluo de NED a 0,5%, completar o
volume com gua e homogeneizar.
Aps 15 minutos, ler espectrofotometricamente a 542nm contra um branco dos
reagentes.
Construir a curva de calibrao absorbncia x concentrao (g/50,0 mL).
Figura 4.
4.1.7 Determinao do ni tri to em amostras de adit ivos
Pesar, exatamente, cerca de 0,5 g se for aditivo formulado, dissolver em gua e
completar para 200,0 mL.
Retirar uma alquota de 10,0 mL para balo volumtrico de 50,0 mL.
Adicionar 5,0 mL de soluo de sulfanilamida a 0,5% e deixar reagir por 3
minutos.
Adicionar 3,0 mL de soluo de NED a 0,5%. Completar o volume com gua e
homogeneizar.
Deixar em repouso por 15 minutos e ler no espectrofotmetro a 542nm contra
um branco dos reagentes, utilizando a curva de calibrao. Se a absorbncia
obtida estiver fora do intervalo da curva de calibrao, efetuar as diluies
necessrias.
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4.1.8 Determinao do ni trato em amostras de aditivos
Retirar uma alquota de 20,0 mL do balo volumtrico de 200,0 mL do item
anterior (4.1.7) para um bquer de 100 mL.
Adicionar 5,0 mL da soluo tampo pH 9,6-9,7 e 2,0 mL de soluo de EDTA
a 5%.
Passar pela coluna de cdmio a uma vazo no superior a 6 mL/minuto
recolhendo diretamente em balo volumtrico de 100,0 mL.
Lavar o bquer com 3 pores consecutivas de 15 mL de gua, passando as
pela coluna de cdmio.
Continuar a passagem de gua pela coluna at completar o volume de 100,0 mL
no balo. Homogeneizar.
Pipetar 10,0 mL para um balo volumtrico de 50,0 mL.
Adicionar ao balo 5,0 mL da soluo de sulfanilamida a 0,5% e agitar.
Aps 3 minutos adicionar 3,0 mL da soluo de NED a 0,5% e completar o
volume com gua. Homogeneizar.
Aps 15 minutos fazer a leitura espectrofotomtrica a 542nm, contra um branco
dos reagentes, utilizando a curva de calibrao. Se a absorbncia obtida
estiver fora do intervalo da curva de calibrao, efetuar as diluies
necessrias.
O resultado refere-se ao teor de nitritos totais e deste deve ser subtrado o teor
de nitrito encontrado no item anterior (4.1.7) para obter-se o teor de nitrato.
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4.2 MTODO COM SULFATO DE HIDRAZINA
4.2.1 Reagentes e solues
Utilizar reagentes grau analtico.
Utilizar gua destilada ou desionizada no preparo das solues a seguir:
Soluo de hidrxido de sdio NaOH 0,1 M (20 g.L-1)
Soluo de sulfato de hidrazina/sulfato de cobre
Pesar, exatamente, 0,0200 g de sulfato de cobre CuSO4.5H2O em um bquer
de 250 mL adicionando gua destilada ou desionizada suficiente para sua dissoluo.
Pesar em outro bquer de 250 mL, 3,0 g de sulfato de hidrazina N2H4.H2SO4
e adicionar gua destilada ou desionizada suficiente para sua dissoluo.
Juntar as duas solues para um balo volumtrico de 1000,0 mL. Completar
o volume com gua e homogeneizar. Manter em geladeira e utilizar dentro de 30
dias.
Soluo de sulfanilamida/NED
Pesar 10 g de sulfanilamida (C6H8N2O2) em um bquer de 250 mL, adicionar
50 mL de gua e em seguida 62 mL de cido clordrico (HCl) agitando at dissoluo
total. Acrescentar 0,25 g de dicloridrato de N-(1-naftil)etilenodiamina (NED)
(C12H16Cl2N2) levar para um balo volumtrico de 500,0 mL, completar o volume e
homogeneizar.
Soluo padro de nitrito de sdio (NaNO2) 25 mg.L-1 expresso em
N
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Pesar, exatamente, 0,1232 g de nitrito de sdio
previamente seco por 1h a 105C, transferir para um
balo volumtrico de 1000,0 mL, completar o volume
com gua e homogeneizar. Manter em geladeira e
utilizar dentro de 30 dias.
Solues de trabalho de nitrito de sdio
Transferir, com pipetador automtico, 0,1; 0,3; 0,5; 0,7; 0,9 e 1,1 mL da
soluo padro de nitrito de sdio para bales volumtricos de 25,0 mL,
completar o volume com gua e homogeneizar. Estas solues contm,
respectivamente, 0,10; 0,30; 0,50; 0,70; 0,90 e 1,10 mg.L-1 de nitrito de sdio
expresso em N. Conservar e utilizar como na soluo padro.
Soluo padro de nitrato de sdio (NaNO3) 25,0 mg.L-1 expresso
em N.
Pesar, exatamente, 0,1518 g de nitrato de sdio previamente seco por 1h a
105C, transferir para um balo volumtrico de 1000,0 mL, completar o volume
com gua e homogeneizar. Manter em geladeira e utilizar dentro de 30 dias.
Solues de trabalho de nitrato de sdio
Transferir, com pipetador automtico, 0,1; 0,3; 0,5; 0,7; 0,9 e 1,1 mL da
soluo padro de nitrato de sdio para bales volumtricos de 25,0 mL,
completar o volume com gua e homogeneizar. Estas solues contm,
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respectivamente, 0,10; 0,30; 0,50; 0,70; 0,90 e 1,10 mg.L-1 de nitrato de sdio
expresso em N.
4.2.2 Aparelhos e materiais acessrios
Sistema automatizado FIALAB 3500(Alitea USA, Medina,WA) para
anlise por injeo seqencial (SIA)
Espectrofotmetro UV/VIS Micronal modelo B382
Registrador XT Hitachi modelo 56
Balana analtica Mettler AE 200
Balana semi-analtica Mettler P-1200
Estufa Fanem 315/2
Balo volumtrico de 25,0; 500,0 e 1000,0 mL
Pipetador automtico de 1000 e 5000 L com respectivas ponteiras.
Proveta de 100 mL
Bquer de 250 mL
Balo volumtrico de 500,0 e 1000,0 mL.
4.2.3 Programa FIA LAB for windows-nitrito
Para a determinao de nitritos, a amostra analisada na ausncia do agente
redutor e, a concentrao deste analito calculada pela curva de calibrao. O
programa FIA LAB for windows-nitrito consiste em mistura sandwich dos
reagentes e amostra, programada por computador, na seqncia a seguir:
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Fixar vazo (L.seg-1) 200
Aspirar (L) 2500
Fixar posio da vlvula 3
Fixar vazo (L.seg-1) 200
Aspirar (L) 500
Fixar posio da vlvula 6
Dispensar (L) 1000
Fixar vazo (L.seg-1) 100
Fixar posio da vlvula 5
Aspirar (L) 100
Fixar posio da vlvula 3
Aspirar (L) 50
Fixar posio da vlvula 5
Aspirar (L) 100
Fixar posio da vlvula 1
Fixar vazo (L.seg-1) 100
As posies da vlvula correspondem aos seguintes terminais:
Posio Terminal
1 Espectrofotmetro UV/VIS
2 Sol. Sulfato de hidrazina/sulfato de cobre
3 gua, ou solues de trabalho de nitrito
ou amostra
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4 Sol. de hidrxido de sdio 0,5 M
5 Sol. de sulfanilamida/NED
6 Bobina reatora
8 Descarte
Figura 1: Diagrama esquemtico do Sistema de Injeo Sequencial (SIA).
4.2.4 Programa FIA LAB for w indows-ni trato
Para a determinao de nitratos, a amostra analisada na presena do agente
redutor e a concentrao deste analito calculada pela curva de calibrao. O
programa FIA LAB for windows-nitrato consiste em uma mistura sandwich dos
reagentes e amostra, programada por computador, na seqncia a seguir:
Fixar vazo(L.seg-1) 200
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Aspirar (L) 4300
Fixar posio da vlvula 3
Fixar vazo (L.seg-1) 100
Aspirar (L) 400
Fixar posio da vlvula 8
Dispensar (L) 1000
Fixar posio da vlvula 2
Aspirar (L) 40
Fixar posio da vlvula 3
Aspirar (L) 20
Fixar posio da vlvula 4
Aspirar (L) 40
Fixar posio da vlvula 2
Aspirar (L) 40
Fixar posio da vlvula 3
Aspirar (L) 20
Fixar posio da vlvula 4
Aspirar (L) 40
Fixar posio da vlvula 2
Aspirar (L) 40
Fixar posio da vlvula 3
Aspirar (L) 20
Fixar posio da vlvula 4
Aspirar (L) 40
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Fixar posio da vlvula 6
Dispensar (L) 350
Espera (seg.) 60
Fixar posio da vlvula 5
Aspirar (L) 160
Fixar posio da vlvula 6
Aspirar (L) 300
Fixar posio da vlvula 5
Aspirar (L) 160
Fixar posio da vlvula 1
Dispensar (L) 2500
Fixar posio da vlvula 8
Fixar vazo (L.seg-1) 250
As posies das vlvulas correspondem aos mesmos terminais do programa
FIA LAB for windows-nitrito.
4.2.5 Curva de calibrao do N-nitrito (N-NO2-)
Esta curva de calibrao realizada dentro do programa FIA LAB for
windows-nitrito atravs da introduo no aparelho, p