PARA QUE?

En algunas especies los pares cromosmicos no pueden diferenciarse claramente considerando slo sus componentes distintivos en sentido longitudinal;

se debe recurrir a tcnicas citolgicas especiales para la tincin de los cromosomas,

Se evidencian "bandas" transversales (oscuras y claras) que corresponden a los distintos tipos de cromatina.

TECNICAS MAS USADAS

Bandeo G

Bandeo Q

Bandeo R

Bandeo C

Bandeo NOR

BANDEO G

Se utiliza tratamiento con tripsina previo a la

utilizacion de Giemsa ya que la tripsina

degrada la proteinas y da lugar a bandas

claras y oscuras.

Bandas Oscuras: Regiones de ADN ricas en

A-T y pobres en genes constitutivos.

Bandas Claras: Regiones de ADN con G-C Y

en genes constitutivos

Regiones A-T son resistentes a la tripsina lo cual genera una

coloracin oscura en el bandeamiento.

Mayor nivel de bandas = Mayor calidad del

estudio

BANDEO Q

Se basa en el uso de colorantes fluorescentes como la quinqcrina. Dando a lugar bandas

brillantes y oscuras. Tcnica similar al bandeo

G

Bandas Brillantes: Contienen regiones ricas

en A-T.

Bandas oscuras: G-C

Regiones con G-C reprimen la fluorescencia y por eso no se tien, al contrario que las regiones con A-T

No es muy frecuentemente utilizada

BANDEO R

Tcnica opuesta al bandeamiento y se utiliza el calor como desnaturalizante o BrdU

Bandas oscuras: G-C

Bandas claras: A-T

El calor desnaturaliza las regiones ricas en A-T por eso se visualizan

mas las regiones con G-C

BANDEO C

Marcan las regiones Centromericas y

pericentromericas.

Permite la tincin de la heterocromatina

constitutiva.

Se utiliza hidroxido de sodio e hidroxido de

bario para desnaturalizar el ADN.

Se usa principalmente para los cromosmas 1, 9

y 16

BANDEO NOR

Marcan las regiones de los

organizadores nucleolares

acrocentricos.( regiones cromosmicas

que forman y mantienen el nuclolo)

BASES MOLECULARES DEL

BANDEO CROMOSOMICO.

CLASIFICACIN

BANDEOS CROMOSOMICOS

MORFOLOGICOS

QFQ

GTG

RFA

RHG

THG

CBG

DINAMICOS

GBG

RBA

RBG

GB-AAu

RB-AAu

Se basan en tcnicas inherentes a la heterogeneidad de la cromatina.

Importante la relacin con protenas(histnicas y no histnicas) e interacciones ADN.

Se subclasifican en:

1. Tcnicas de tincin diferencial

2. Mtodos de tincin selectiva

3. Coloraciones con fluoroeromos especficos aislados o combinados con colorantes no fluorecentes

4. Tinciones con anticuerpos fluorecentes.

Nomenclatura Bandeos

Morfologicos QFQ: Bandas Q por fluorecencia usando

quinacrina.

GTG: Bandas G por tratamiento enzimtico con tripsina utilizando Giemsa.

RFA: Bandas R por fluorecencia usando naranja de acridina.

RHG: Bandas R mediante desnaturalizacin trmica utilizando Giemesa.

THG: Bandas T por desnaturalizacin trmica empleando Giemesa.

CBG: Bandas C por hidrxido de bario utilizando Giemesa.

1) tipo de bandeo

2) tcnica de

deteccin

empleada

3) tipo de tincin.

Incorporacin de una base analoga, (BrdU), en el ADN durante la fase S del ciclo celular. Se denomina tambin bandeo de replicacin debido a la relacin existente entre el tiempo de incorporacin del BrdU y el patrn de replicacin.

Si se incorpora BrdU durante la fase de replicacin temprana se obtiene un patrn de bandeo R destacndose las regiones ricas en G-C.

Si se incorpora la base anloga durante la fase tarda de replicacin se obtiene un patrn de bandas G, destacndose las zonas de predominio de secuencias A-T.

Los cromosomas pueden visualizarce utilizando distintos mtodos de tincin como Giemesa o el naranja de acridina o utilizando anticuerpos especficos

Nomenclatura Bandeos

Dinamicos GBG: Bandas G por incorporacin de BrdU

utilizando Giemesa.

RBA: Bandas R por incorporacin de BrdU empleando naranja de acridina.

RBG: Bandas R por incorporacin de BrdU utilizando Giemesa.

GB-AAu: Bandas G por incorporacin de BrdU empleando anticuerpos especficos unidos a partculas deoro coloidal.

RB-AAu: Bandas R por incorporacin de BrdU usando anticuerpos especficos unidos a partculas deoro coloidal.

Bromo desexiuridina (BrdU) Anlogo mutagnicamente activo de la timina, en que el

grupo -CH3 en posicin 5' se reemplaza por Br.

Tratamiento e investigacin del cancer debido a que aumenta la susceptibilidad de las clulas a la radioterapia porque inhibe la reparacin de roturas causadas por la radiacin en la doble cadena de ADN

Agente mutagenico:

altera los patrones de transcripcin

Aumenta la afinidad de las proteinas cromosomales por las zonas de la cadena que contengan BrdU,

Altera la unin de protenas reguladoras a la cadena de ADN,

Inhibe la expresin de algunas funciones de diferenciacion celular

Provoca alteraciones en la membrana plasmatica.

PROCEDIMIENTO

BANDAS G 1. Envejecer las preparaciones en estufa a 65C / 14h o 3 dias

a temperatura ambiente

Bandeo GTG

Tripsina desnaturaliza proteinas de cromosomas

Tincion Giemsa o Leishman

Bandeo G con colorante Wright

Protocolo mas usado.

Se introduce la preparacion en solucion salina de 2SSC (Citrato trisodico disuelto en NaCl 0,3M) durante 1 minuto a 65C. Esto permite que se abra la hebra de ADN

Lavar la preparacion con agua destilada y secar al aire.

Teir con colorante Wright al 0.25% y tampon Sorensen en proporcion 1 a 3 duraten 3 minutos

PROCEDIMIENTO BANDA

C CBG bandas C obtenidas con hidroxido Barico usando Giemsa

1. Introducir la preparacion en una cubeta con HCL 0.02N a temperatura ambiente por 10 minutos, lavar con agua y dejar secar al aire

2. Introducir la preparacion en una cubeta a 60C con Ba(OH)2 saturado durante 1 minuto. Esto despuriniza y desnaturaliza el ADN.

3. Lavar con agua destilada y metanol para eliminar restos de bario dos veces

4. Dejar secar e incubar en 2xSSC a 65C / 15 min

5. Lavar la preparacion y dejar secar

6. Teir con colorante Leishman al 20% o Giemsa durate 5 a 10 minutos

Esta tecnica degrada un 50% del material cromosomico lo que dificulta la aplicacin posterior de otras tecnicas.

El unico material que queda teido es la heterocromatina constitutiva porque resiste a la degradacion

Procedimiento bandas NOR

1. Aadir 0.2uL de solucion de nitrato de

plata al 50% filtrada a la preparacion

2. Adicionar 6 a 8 gotas de formaldehido

al 0.3% (acelera la tincion)

3. Incubar a 37C durante 24h protegido

de la luz

BIBLIOGRAFIA

http://www.oocities.org/researchtriangle/lab/2513/bandeos.htm

Cristina Hernando Davalillo, Caracterizacion de Anomalias cromosomicas en diagnostico prenatal y postnatal mediante tecnicas de citogenetica molecular, Tesis Doctoral 2005.

http://docentes.cs.urjc.es/~odeluis/Docencia/Genetmed/Bloque_1_2p.pdf

http://geneticahumana.tripod.com/libros/page201.html

http://www.fmed.uba.ar/depto/histo1a/genetica/adm/sg2.pdf