174 Virus della diarrea virale bovina (BVDV) tipo 3: una ... · ta riscontrata nei confronti dello stipite BVDV-3 tailandese Th/04_KhonKaen, mentre le identità con stipiti BVDV-1

Virus della diarrea virale bovina (BVDV) tipo 3:una minaccia emergente per i bovini?

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RIASSUNTOIn questa nota si riportano i dati clinici, patogenetici ed immunologici relativi all’infezione causata da un nuovo pestivirus,Hobi virus o virus della diarrea virale bovina (BVDV) tipo 3, in Italia. Questo pestivirus emergente, identificato quasi dieci an-ni fa in un lotto di siero fetale bovino di provenienza brasiliana, fino a pochi anni fa era stato isolato solo in Sud America edAsia. Nel 2010 stipiti BVDV-3 sono stati identificati in Italia in bovini con malattia respiratoria e, successivamente, in abortiosservati in un allevamento di bovine da latte della Calabria. Da una manza con sintomatologia respiratoria è stato possibileisolare sia il biotipo non citopatogeno (ncp) che quello citopatogeno (cp) di BVDV-3, i quali differivano per la presenza in que-st’ultimo di un inserto sovrapponibile a sequenze di origine bovina, associate in precedenza a stipiti cp di BVDV-1 e BVDV-2.Indagini condotte sugli animali presenti in allevamento hanno permesso di identificare un vitello con infezione persistente(PI), che è stato monitorato per circa sei mesi sia per gli aspetti clinici che per gli aspetti virologici. L’infezione sperimentale dianimali appartenenti a specie tradizionalmente sensibili ad altri pestivirus ha dimostrato che bovini ed ovini sono in grado diinfettarsi, sviluppando una forma clinica di tipo respiratorio ed eliminando il virus con secreti ed escreti, mentre i suini siero-convertono in assenza di sintomatologia e di escrezione virale. La scarsa cross-reattività sierologica esistente tra BVDV-3 eBVDV-1, valutata nel modello ovino, ha suscitato preoccupazioni sulla possibile mancata o incompleta protezione conferitadai vaccini attualmente in commercio (allestiti con BVDV-1) nei confronti dell’infezione sostenuta da questo pestivirus emer-gente. Infine, è stato messo a punto un test diagnostico (nested PCR) per la identificazione e simultanea caratterizzazione mo-lecolare di tutte le specie BVDV attualmente conosciute in campioni clinici. Indagini future dovranno accertare la reale circo-lazione di questo pestivirus nella popolazione bovina italiana valutando l’impatto dello stesso sulle produzioni zootecniche.

PAROLE CHIAVEBovino, diarrea virale bovina, Hobi pestivirus (BVDV-3).

N. DECARO1, V. MARI1, M.S. LUCENTE1, R. SCIARRETTA1, M. LOSURDO1, G. ELIA1,I. PADALINO2, V. MARTELLA1, N. CAVALIERE2, P. CORDIOLI3, C. BUONAVOGLIA1

1 Dipartimento di Medicina Veterinaria - Università degli Studi di di Bari, Valenzano (BA)2 Istituto Zooprofilattico Sperimentale di Puglia e Basilicata, Foggia3 Istituto Zooprofilattico Sperimentale di Lombardia ed Emilia Romagna, Brescia

Autore per la corrispondenza:Nicola Decaro ([email protected]).

INTRODUZIONE

Nei ruminanti domestici le infezioni da pestivirus sono asso-ciate ad una varietà di forme cliniche che includono infezio-ni subcliniche, immunodepressione, forme respiratorie, ga-stroenterite, turbe della riproduzione, forme emorragiche emalattie sistemiche come la malattia delle mucose1,2.I pestivirus (famiglia Flaviviridae, genere Pestivirus) sonovirus ad RNA monocatenario, a polarità positiva, codifican-te per una poliproteina, che è scissa, ad opera di proteasi cel-lulari e virali, in proteine strutturali (C, Erns, E1, E2) e nonstrutturali (Npro, NS2-3, NS4A, NS4B, NS5A, NS5B)3. In ba-se all’attuale classificazione dell’International Committeeon Taxonomy of Viruses (http://www.virustaxonomyonline.com), il genere Pestivirus comprende quattro specie ri-conosciute: virus della diarrea virale bovina tipo 1 (BVDV-1), virus della diarrea virale bovina tipo 2 (BVDV-2), virusdella border disease (BDV), virus della peste suina classica

(CSFV). A queste è stato proposto di aggiungere una quintaspecie, Pestivirus della giraffa. Attualmente, pertanto, i pe-stivirus dei ruminanti comprendono due specie di BVDV,BVDV-1 e BVDV-2, differenziabili su base genetica ed anti-genica e, una sola specie di BDV, cui appartengono numero-si sottogruppi.Recentemente nella specie bovina sono stati descritti diversipestivirus emergenti. Un pestivirus atipico è stato isolato daun lotto di siero fetale bovino originario del Brasile4. Questovirus, D32/00_“HoBi” è stato proposto come una nuova spe-cie del genere Pestivirus, BVDV-35. Altri due pestivirus Ho-bi-like, ceppi CH-KaHo/Cont e Brz buf 9, sono stati identifi-cati in Sud America rispettivamente in una coltura cellulareprobabilmente contaminata da siero fetale bovino infetto enel sangue di una bufala6. Fino a poco tempo fa, esistevaun’unica sequenza del genoma completo di un pestivirusHoBi-like, ceppo Th/04-KhonKaen, isolato da un siero bovi-no durante un’indagine epidemiologica per BVDV in Tailan-dia. Tuttavia, anche in questo caso non è noto se il virus eraassociato o meno a manifestazioni cliniche7.Nella presente nota vengono riportati i dati clinici, patoge-netici ed immunologici relativi all’infezione da BVDV-3 inItalia.

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BVDV-3 E MALATTIA RESPIRATORIA

Il focolaio di malattia respiratoria è stato osservato in un al-levamento di bovine da latte della Calabria nel periodo com-preso tra dicembre 2009 e febbraio 20108. L’allevamento, nelquale si sono verificati anche i casi clinici riportati nei suc-cessivi paragrafi, era costituito da circa 600 soggetti di razzafrisona. Gli ultimi ingressi di animali si riferivano a 10 man-ze importate dalla Germania 22 mesi prima dell’insorgenzadella forma respiratoria. In allevamento venivano regolar-mente somministrati interventi vaccinali per la profilassi diclostridiosi, rotavirosi e coronavirosi, mentre non era effet-tuata alcuna vaccinazione per BVDV. Successivamente, subi-to dopo la diagnosi di infezione da pestivirus Hobi-like, si èdato inizio ad un piano di profilassi specifica per BVDV.Questo è stato attuato sia mediante la vaccinazione sistema-tica di tutto l’effettivo che mediante uno screening ripetutodegli animali con lo scopo di identifcare ed abbattere gli im-munotolleranti, principali diffusori del virus in allevamento.I segni clinici hanno interessato 26 vitelli di 6-7 mesi di età,su un totale di circa 100 soggetti della stessa età, i quali pre-sentavano febbre (39,4-40,1°C), tosse, tachipnea e presenzadi scolo nasale sieromucoso. Gli esami ematologici condottisu sei vitelli con sintomi hanno evidenziato una modestaleucopenia, con valori compresi tra 2,55 e 3,52 × 109 leuco-citi/l (valori di riferimento 4-12 × 109 leucociti/l). Da questianimali sono stati prelevati tamponi nasali per gli esami vi-rologici e batteriologici. La maggior parte degli animali èguarita progressivamente nell’arco di due settimane a segui-to della somministrazione di terapia di supporto (antibioticie fluidoterapia). Due vitelli di 6 mesi con sintomatologia piùgrave sono morti e l’esame autoptico ha evidenziato la pre-senza di broncopolmonite apicale e tracheite con presenza diessudato catarrale. I lobi polmonari con lesioni sono statiprelevati per le successive analisi. Tutti i campioni analizzati sono risultati positivi al test ne-sted PCR per la ricerca di pestivirus9 e sono stati caratteriz-zati come BVDV-2. Gli esami virologici, batteriologici e pa-rassitologici hanno escluso la presenza negli stessi campionidi altri patogeni, ad eccezione dei polmoni dei vitelli dece-duti dai quali sono stati isolati Streptococcus bovis e Vibriospp. L’analisi di sequenza del frammento del gene Erns ampli-ficato in nested PCR ha evidenziato una identità nucleotidi-ca tra gli stipiti BVDV identificati nell’allevamento pari al99,8-100%. Tuttavia, dall’analisi mediante BLAST è emersoche l’identità nucleotidica con gli stipiti BVDV-2 maggior-mente correlati non superava il 74%, mentre una più strettacorrelazione genetica (più del 90% di identità nucleotidica)è stata dimostrata nei confronti del pestivirus atipico ‘Hobi’-like Th/04_KhonKaen, proposto come nuova specie BVDV-3. Mediante real-time RT-PCR specifica per BVDV-3, i cam-pioni sono risultati contenere titoli di RNA virale compresitra 2,57 × 103 e 5,48 × 105 per µl di estratto. Gli stipiti BVDVidentificati nei polmoni dei vitelli morti sono stati isolati consuccesso su cellule MDBK, come dimostrato dalla positivitàal test di immunofluorescenza indiretta (IFI) effettuato conun anticorpo monoclonale panpestivirus. Mediante prove diRT-PCR e successivo sequenziamento, è stato possibile de-terminare quasi per intero il genoma dello stipite Italy-1/10-1, rappresentativo dei ceppi circolanti in allevamento. La se-quenza ottenuta (12.104 nucleotidi) è stata depositata inGenBank con il numero di accesso HQ231763.

L’analisi comparativa ha dimostrato che lo stipite BVDV-3isolato possiede la stessa organizzazione genomica degli altrimembri del genere Pestivirus, rappresentata da una ORF di11.700 nucleotidi fiancheggiata da due regioni non codifi-canti (UTR). La più elevata identità nucleotidica (90%) è sta-ta riscontrata nei confronti dello stipite BVDV-3 tailandeseTh/04_KhonKaen, mentre le identità con stipiti BVDV-1 eBVDV-2 si sono attestate su valori molto più bassi, rispetti-vamente del 66,2-67% e del 67,1-67,4%. Valori simili sonostati ottenuti dal confronto con ceppi BDV e CSFV di riferi-mento. Analizzando le regioni E2, 5’ UTR e Npro, lo stipiteItaly-1/10-1 è sempre stato caratterizzato come BVDV-3, male correlazioni genetiche più elevate sono state evidenziatenei confronti dei ceppi sudamericani D32/00_‘Hobi’ e CH-KaHo/cont, dei quali sono disponibili solo sequenze parzialidi alcune regioni.Mediante analisi filogenetica ottenuta con il metodo neigh-bor-joining sulla sequenza dell’intero genoma dello stipiteItaly-1/10-1 e di stipiti pestivirus di riferimento, risultanoevidenti sei cluster monofiletici (Fig. 1): BVDV-1, BVDV-2,BVDV-3, BDV, CSFV e Pestivirus della giraffa. Nell’ambito diquesto albero, lo stipite Italy-1/10-1 ricade nello stesso grup-po del virus Th/04_KhonKaen, che risulta nettamente sepa-rato dagli altri membri del genere Pestivirus. L’analisi dellesingole regioni ha prodotto una segregazione sovrapponibi-le, nella quale lo stipite italiano segrega con gli stipiti suda-mericani. La stessa topologia è stata ottenuta con il metododella parsimonia in tutte le regioni analizzate.

Figura 1 - Albero filogenetico costruito con il metodo neighbor-joi-ning sull’intero genoma dei membri del genere Pestivirus. I seguen-ti stipiti sono stati utilizzati per l’analisi filogenetica (numeri di ac-cesso GenBank indicati in parentesi): BDV H2121, Gifhorn, X818,Reindeer; CSFV Brescia X, HCLV, Brescia, Alfort-A19, Shimen/HVRI,Riems, CZ-J-2008; BVDV-1 ILLNC, ZM-95, Oregon-C24V, CP7-5A,SD1, Singer_Arg, KE9, NADL, VEDEVAC; BVDV-2 JZ05-1, NewYork’93, XJ-04, C413, Hokudai Lab/09; BVDV-3 Th/04_KhonKaen,Italy 1/10-1, Italy-83/10ncp, Italy-83/10cp; Pestivirus della giraffa 1-H138. La barra rappresenta il numero di sostituzioni nucleotidicheper sito.


Questo studio ha chiaramente evidenziato che BVDV-3 nonè presente solo nei continenti americano ed asiatico, ma cir-cola anche in Italia, per cui si tratta del primo focolaio clini-co segnalato nel continente europeo. Per la prima volta è sta-ta dimostrata una chiara associazione tra uno stipite BVDV-3 e la comparsa di sintomatologia clinica (malattia respirato-ria). Infatti, le precedenti segnalazioni, pur se relative ad in-fezioni naturali, non avevano messo in evidenza alcuna asso-ciazione con manifestazioni cliniche10. Dal punto di vista ge-netico, lo stipite italiano è risultato maggiormente correlatoai ceppi sudamericani piuttosto che al prototipo tailandeseTh/04_KhonKaen. Poiché la maggior parte delle segnalazio-ni riguarda la identificazione di questi virus in lotti di sierofetale bovino contaminati, è verosimile che l’introduzione diquesto nuovo BVDV nel continente europeo sia legata al-l’impiego di vaccini o altri prodotti preparati con siero bovi-no infetto. Esistono, infatti, precedenti segnalazioni di infe-zione da BVDV conseguente all’impiego di prodotti immu-nizzanti contaminati11-13.

BVDV-3 E TURBE RIPRODUTTIVE

Gli aborti sono stati osservati in giugno 2011 nello stesso al-levamento di bovine da latte della Calabria già interessatodalla malattia respiratoria. L’episodio ha riguardato 8 bovinepluripare gravide di 4-6 mesi, su un totale di 98 animali gra-vidi, le quali non hanno manifestato alcun segno prodromi-co prima dell’aborto, né sequele dopo l’aborto stesso14. Duefeti abortiti (280/11-A e 280/11-B) sono stati inviati ai nostrilaboratori, dove sono stati prelevati frammenti degli organiinterni per le prove diagnostiche. Tutti i campioni analizzati sono risultati positivi a due di-stinti test RT-PCR per la ricerca di pestivirus9,15 e sono staticaratterizzati come BVDV-3 con un protocollo diagnosticorecentemente messo a punto per la identificazione di tutte etre le specie BVDV15 (Fig. 2A). I titoli virali, calcolati me-diante real-time RT-PCR specifica16, erano compresi tra 4,31× 102 (rene del feto 280/11-B) e 5,78 × 104 (polmone del fe-to 280/11-B) copie di RNA per µl di estratto. Gli esami mo-lecolari hanno escluso la presenza negli stessi campioni di al-tri agenti abortigeni. In sezioni al criostato degli organi con-tenti i titoli virali più elevati (polmone e milza) sottoposte atest di immonufluorescenza indiretta (IFI) con anticorpimonoclonali anti-NS3, è stata evidenziata una marcata pre-senza di antigeni virali (Fig. 2B). L’isolamento virale è statotentato dal polmone del feto 280/11-A utilizzando cellule inlinea continua di rene bovino MDBK. Le colture inoculatenon hanno mostrato effetto citopatico, ma la replicazione vi-rale è stata dimostrata mediante test IFI con anticorpo mo-noclonale anti-NS3 e mediante real-time RT-PCR BVDV-3specifica (Fig. 2C).Mediante analisi di sequenza delle regioni E2, 5’ UTR e Npro,lo stipite Italy-280/11-A è risultato strettamente correlato alprototipo italiano Italy-1/10-1, isolato oltre un anno primanello stesso allevamento. L’analisi filogenetica ottenuta con ilmetodo neighbor-joining sulle sequenze ottenute e su analo-ghe sequenze di stipiti pestivirus di riferimento ha confer-mato tale correlezione genetica, evidenziando per il virusisolato dall’aborto lo stesso pattern filogenetico dello stipiteisolato dai casi di patologia respiratoria (dati non mostrati). Prima della segnalazione in Italia, sequenze ‘Hobi’-like erano

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Figura 2 - Identificazione di BVDV-3 in feti bovini abortiti. A) Elet-troforesi in gel di agarosio dei prodotti di amplificazione ottenuti me-diante protocollo nested PCR di caratterizzazione15. Corsia 1,marker GeneRuler 100bp DNA Ladder (MBI Fermentas GmbH, St.Leon-Rot, Germany); corsia 2, BVDV-1 stipite NADL; corsia 3,BVDV-2 stipite 232/02; corsia 4, BVDV-3 stipite Italy-1/10-1; corsie5-9, campioni tissutali (placenta, polmone, milza, fegato, rene) delfeto 280/11-A; corsie 10-14, campioni tissutali (placenta, polmone,milza, fegato, rene del feto 280/11-B; corsia 15, controllo negativo(milza di vitello negativo per BVDV). B) Polmone del feto 280/11-A:test di immunofluorescenza. C) Cellule MDBK inoculated con il pol-mone del feto 280/11-A: test di immunofluorescenza.

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state identificate in due feti abortiti in Brasile, ma nulla è no-to riguardo i dati anamnestici e la caratterizzazione di questovirus17. La possibilità che BVDV-3 rappresenti un’ulterioreminaccia per l’apparato genitale della bovina rende quantomai urgente l’adozione di misure specifiche di profilassi, pre-disposte sulla base delle caratteristiche patogenetiche ed im-munologiche di questo virus ed attuate utilizzando test dia-gnostici specifici.

BVDV-3 E BIOTIPO CITOPATOGENO

In base alla capacità di indurre effetto citopatico sulle coltu-re cellulari infette, sono noti due distinti biotipi di pestivirus,citopatogeno (cp) e non citopatogeno (ncp). Nella specie bo-vina, entrambi i biotipi sono coinvolti nella patogenesi dellamalattia delle mucose (MD), una forma clinica grave, ad esi-to letale, tipica dei vitelli persistentemente infetti (PI) e im-munotolleranti per BVDV ncp18. Un bovino con MD è, in ge-nere, infetto da entrambi i biotipi. Le analisi molecolari han-no dimostrato che il biotipo cp deriva dal biotipo ncp a se-guito di eventi ricombinanti con sequenze di origine cellula-re, duplicazioni o delezioni di sequenze virali19,20, oppuremutazioni puntiformi nel gene NS221. Il risultato finale èsempre la produzione massiva di proteina NS3 libera, la qua-le rappresenterebbe un segnale apoptotico per le cellule in-fette22. Stipiti cp sono stati segnalati per BVDV-1, BVDV-2,BDV e pestivirus della giraffa, mentre, al momento, solo cep-pi ncp sono stati identificati per BVDV-34,7,8.Nel mese di marzo del 2010, una manza di 13 mesi (Italy-83/10), su un totale di 70 animali della stessa età, apparte-nenti al medesimo allevamento interessato dalla forma re-spiratoria e, in un tempo successivo, dagli aborti, è decedutadopo aver manifestato febbre (40,3°C), moderato scolo nasa-le, tosse secca e grave dispnea23. Le indagini ematologicheavevano evidenziato grave leucopenia (2,87 × 109 leucociti/l,valori di riferimento 4-12 × 109 leucociti/l). All’esame necro-scopico erano evidenti tracheite e broncopolmonite catarra-le. Dalla carcassa sono stati prelevati campioni di polmone edi feci per le successive analisi virologiche e batteriologicheper evidenziare i principali agenti causali di malattia respira-toria nel bovino. Le indagini di laboratorio hanno permessodi identificare uno stipite pestivirus caratterizzato comeBVDV-3. Mediante real-time RT-PCR, i polmoni della man-za sono risultati contenere 7,98 x 106 copie di RNA virale perµl di estratto. Gli esami virologici e batteriologici hanno for-nito esito costantemente negativo per i patogeni di rilevanzaclinica del bovino. Le cellule MDBK inoculate con i campio-ni positivi per BVDV-3 hanno mostrato fluorescenza cito-plasmatica al test IFI (Fig. 3A). Nelle cellule infette, tuttavia,sono state osservate alterazioni morfologiche (effetto citopa-tico) caratteristiche della replicazione dei pestivirus cp (Fig.3B). In base a queste osservazioni era stata ipotizzata la con-temporanea presenza nei campioni esaminati di una coppia‘Hobi’-like cp e ncp. I due distinti stipiti cp e ncp (Italy-83/10cp e Italy-83/10ncp) sono stati effettivamente separatimediante passaggi seriali su cellule utilizzando il metodo del-le placche e della diluizione finale.L’analisi del genoma dei virus Italy-83/10cp e Italy-83/10ncp(numeri di accesso GenBank JQ612704 e JQ612705) ha evi-denziato un’organizzazione genomica sovrapponibile aglialtri membri del genere Pestivirus. Gli stipiti cp e ncp sono

risultati essere strettamente correlati dal punto di vista ge-netico (identità nucleotidica del 97%), differenziandosiquasi esclusivamente per la presenza di una inserzione nelgene NS2-3. Tale inserzione è altamente simile ad una se-quenza genomica della specie bovina (Bos taurus) denomi-nata J-domain protein interacting with viral protein (Jiv)(Fig. 3C). Mediante analisi filogenetica, gli stipiti Italy-83/10cp e Italy-83/10ncp ricadono nel cluster dei pestivirus‘Hobi’-like e risultano maggiormente correlati ai ceppi diorigine sudamericana, esattamente come il prototipo italia-no Italy-1/10-1 (Fig. 1).Diverse mutazioni sono state associate all’insorgenza di sti-piti BVDV cp a partire da stipiti ncp. La maggior parte diqueste mutazioni sono situate all’interno della regione NS2-3 ed esitano nella abnorme produzione di NS3 libera, la qua-le è associata alla esaltazione della replicazione virale me-diante aumento della produzione di complessi della replica-si. Un meccanismo particolare è rappresentato dall’inserzio-ne di sequenze Jiv all’interno del gene NS2 poco prima del si-to di clivaggio tra NS2 ed NS3. Le sequenze Jiv agiscono in-ducendo il cambiamento conformazionale del complessoNS2-3 e la successiva attivazione dell’autoproteasi NS224. Se-quenze Jiv sono finora state identificate nella regione NS2 didiverse specie di pestivirus, ma non del virus emergente Ho-bi-like. Pertanto, la segnalazione italiana è la prima ad averriportato l’isolamento e la caratterizzazione di uno stipiteBVDV-3 cp. La stretta correlazione genetica tra i due virussuggerisce che lo stipite cp sia insorto a seguito di mutazione(inserzione della sequenza Jiv per ricombinazione con se-quenze cellulari) dello stipite ncp.Le coppie BVDV cp e ncp sono di solito isolate a partire daanimali con MD. In base alle attuali conoscenze la MD si ma-nifesta in bovini persistentemente infetti (detti anche immu-notolleranti) ed è caratterizzata da lesioni di tipo emorragi-co e/o ulcerativo-necrotico. Risulta quindi interessante l’iso-lamento della coppia BVDV-3 da un soggetto che aveva pre-sentato solo sintomi di tipo respiratorio. I risultati del pre-sente lavoro aprono scenari interessanti in merito al poten-ziale patogeno di stipiti BVDV-3 ed alla loro capacità di in-durre il fenomeno dell’immunotolleranza e sindromi clini-che analoghe alla MD. Solo il continuo monitoraggio epide-miologico negli allevamenti e gli studi di infezione speri-mentale potranno chiarire in futuro tali aspetti ancora nonadeguatamente conosciuti.

BVDV-3 ED INFEZIONE PERSISTENTE

I pestivirus sono in grado di indurre il fenomeno dell’im-munotolleranza in vitelli infettati in utero tra i due ed iquattro mesi di gravidanza. I vitelli immunotolleranti perBVDV sono anche definiti persistentemente infetti (PI), inquanto risultano costantemente viremici ed incapaci di pro-durre anticorpi verso il virus responsabile dell’immunotol-leranza nell’intero arco dello loro esistenza. I vitelli PI pos-sono apparire normali o avere dimensioni ridotte alla nasci-ta, scarso accrescimento ponderale, mantello arruffato e di-somogeneo, forme respiratorie, gastroenteriche e neurologi-che. Queste forme cliniche sono indotte direttamente dallareplicazione virale oppure da agenti patogeni opportunistiche si virulentano a seguito del grave quadro di immuno-soppressione virus-indotta25. Infezioni persistenti sono ri-


portate per BVDV-1, BVDV-2, BDV e CSFV, mentre, al mo-mento, non ci sono segnalazioni per quanto riguardaBVDV-3. Nella manza con forma respiratoria da cui era sta-ta isolata la coppia di virus cp/ncp23 non era stato possibilevalutare lo stato di immunotolleranza.In ottobre 2011, nell’allevamento dove era già stato isolatoBVDV-3, è nato un vitello con peso alla nascita inferiore al-la norma e con ridotto indice di accrescimento rispetto adaltri soggetti della stessa età26. All’età di 4 mesi il vitello pre-sentava pelo arruffato, sintomi respiratori (tosse e scolo na-sale) ed aree alopeciche su testa, collo, spalla e grassella de-stre, indicative di micosi cutanea. Le successive indagini dilaboratorio hanno evidenziato che il vitello era sieronegati-vo per BVDV sia al test ELISA commerciale (BVDV-AbSVANOVIRTM ELISA test, Svanova Biotech AB, Uppsala,

Svezia) che al test di virusneutralizzazione (VN). I test viro-logici, effettuati su campioni di sangue intero15,16, hanno in-vece dimostrato che lo stesso animale era costantemente vi-remico per BVDV-3, dato che è stato confermato nei prelie-vi successivi. Lo stipite BVDV-3 responsabile dello stato diPI è stato isolato su cellule MDBK senza indurre la compar-sa di effetto citopatico anche dopo numerosi passaggi seria-li. L’assenza di inserzioni nella regione NS2-3 ha conferma-to che si trattava di uno stipite BVDV-3 ncp. Mediante ana-lisi di sequenza del gene E2, il virus è risultato strettamentecorrelato agli altri stipiti BVDV-3 isolati nello stesso alleva-mento8,14,23, mostrando un’identità genetica compresa tra il99,2% ed il 99,6%.A marzo 2012 il vitello è stato trasferito nell’unità di isola-mento del Dipartiemnto di Medicina Veterinaria dell’Uni-


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Figura 3 - Identificazione e caratterizzazione del biotipo cp di BVDV-3. A) Isolamento di BVDV-3 su cellule MDBK: fluorescenza citopla-smatica ottenuta utilizzando un anticorpo monoclonale anti-NS3. B) Isolamento di BVDV-3 su cellule MDBK: effetto citopatico caratterizza-to da vacuolizzazione citoplasmatica e lisi del monostrato. C) Allineamento delle inserzioni Jiv di 15 stipiti pestivirus messe a confronto conla analoga sequenza cellulare del bovino (Bos taurus, numero di accesso Genbank AY027882). I punti indicano residui conservati rispetto alJiv cellulare. I seguenti stipiti sono stati utilizzati per l’allineamento: BDV Cumnock (U43603), Moredun (U43602); BVDV-1 NADL (AJ133738),MD1 (Z54332), Indiana (Z54331); BVDV-2 125c (U25053), 296c (AF268172), 5912c (AF268179), 6082c (AF268180), Galena (AF268176),ND8799c (AF268175); 297c (AF268177), Pestivirus della giraffa 1-H138 (AF268178); BVDV-3 Italy-83/10cp (JQ612705).

C



versità degli Studi di Bari, dove è stato sottoposto a monito-raggio clinico, ematologico, biochimico, virologico e siero-logico fino a settembre dello stesso anno. Al momento dellastesura del presente lavoro l’animale era ancora in vita. A di-stanza di due giorni dal trasferimento, l’animale ha manife-stato diarrea e persistenza dei sintomi respiratori. Mediantecolorazione di Ziehl-Neelsen e metodo della flottazione consoluazione satura di cloruro di sodio è stato possibile evi-denziare la presenza nelle feci di Cryptosporidium parvumper oltre un mese, nonostante un trattamento di due setti-mane con alofunginone lattato (500 µg/kg, PO, q 24 h). Laforma respiratoria è stata trattata con enrofloxacin (10mg/kg, SC, q 24 h for 10 days), mentre una soluzione ioda-ta al 2% di acido salicilico è stata utilizzata per il trattamen-to topico della dermatomicosi. A fine aprile la sintomatolo-gia respiratoria si è aggravata e dai campioni clinici è statoisolato in brodo Hayflick un micoplasma27, successivamentecaratterizzato come Mycoplasma bovirhinis mediante PCRad ampio spettro28. A seguito di questo isolamento è statasomministrata ossitetraciclina cloridrato (11 mg/kg, PO, q12 h per 7 giorni). I trattamenti farmacologici sono stati ri-petuti periodicamente in coincidenza con l’esacerbarsi dellasintomatologia. Le condizioni cliniche sembravano miglio-rare durante la terapia, per riprecipitare nei periodi di so-spensione. Ad un anno di età il vitello presentava ancora ri-dotto accrescimento e pelo arruffato (Fig. 4A). Il peso e l’al-tezza al garrese si attestavano su valori di 204 kg e 102 cm,rispettivamente, a fronte di misurazioni medie di vitelli del-la stessa età e della stessa azienda rispettivamente di 380 kge 135 cm.Campioni di sangue intero, siero ed urine sono stati preleva-ti ad intervalli di due settimane, da marzo a settembre 2012,per le succesive analisi. Nonostante lo stato di PI, il vitellonon ha presentato, in questo periodo, alcuna significativa al-terazione dei parametri ematologici e biochimici, ad eccezio-ne di una lieve linfopenia osservata in maggio (2,6 × 109

linfociti/l; limite di riferimento minimo 3,0 × 109 linfociti/l). BVDV-3 è stato rilevato in maniera continua per l’intero pe-riodo di osservazione, mentre anticorpi specifici non sonomai stati evidenziati nei campioni di siero dell’animale me-diante ELISA o VN. Di particolare interesse è il rilevamentoad alto titolo del virus nelle urine (titoli mediani pari a 2,01× 106 copie di RNA µl-1 di estratto), mentre titoli inferiori so-no stati osservati nel sangue (8,51 × 105 copie RNA) e neitamponi nasali (2,92 × 105 copie di RNA) e solo tracce diRNA virale erano presenti nelle feci (6,06 × 103 copie di RNAµl-1 di estratto) (Fig. 4B).Questo studio, oltre a segnalare per la prima volta l’esistenzadi animali PI anche in riferimento all’infezione sostenuta daBVDV-3, ha evidenziato una elevata escrezione virale me-diante le urine, un riscontro che potrebbe avere importantiimplicazioni diagnostiche e profilattiche qualora confermatoda successivi studi. In effetti, gli studi sperimentali finoracondotti29 hanno riguardato solo animali con infezione acu-ta, non persistente, e non hanno comunque preso in consi-derazione l’escrezione virale mediante le urine. I vitelli PI peraltri BVDV possono sviluppare forme di MD a seguito di su-perinfezione da parte di virus cp originato dal ceppo ncp re-sponsabile dell’infezione persistente. Sebbene il vitello PI perBVDV-3 non abbia sviluppato forme cliniche di MD nei seimesi di osservazione, non si può escludere che tali formepossano insorgere in futuro.

BVDV-3 E SPETTRO D’OSPITE

Per valutare lo spettro d’ospite in vivo di BVDV-3 sono stateeffettuate prove di infezione sperimentale di vitelli, agnelli esuinetti29. Utilizzando lo stipite prototipo Italy-1/10-1, isola-to dal focolaio di malattia respiratoria in Calabria (8), al ter-zo passaggio su cellule MDBK (titolo pari a 106 TCID50 ml-1).Gli animali sottoposti ad infezione sperimentale, tutti siero-negativi e virus negativi per pestivirus, includevano: 7 vitellidi 6 mesi di età, 7 agnelli di 5 mesi di età e 7 suinetti di 2 me-si di età. Per ciascuna specie animale, 5 soggetti sono stati in-fettati per via oronasale con 5 ml di virus, mentre i restanti 2animali sono stati utilizzati come controlli. Tutti gli animalisono stati monitorati per 28 giorni valutando: 1) la compar-sa di eventuali segni clinici (febbre, diarrea, sintomi respira-tori ed altri segni tipici delle infezioni da BVDV); 2) gli in-crementi ponderali; 3) i parametri ematologici; 4) l’escrezio-ne virale; 5) la sieroconversione. I controlli di tutte le specie animali utilizzate non hanno ma-nifestano alcun sintomo clinico, né alterazioni ematologiche,escrezione virale o sieroconversione per BVDV. Nei vitelli in-fetti sono stati osservati sintomi clinici lievi, rappresentati daipertermia a 3 (40,5°C) e 7 (39,7°C) giorni post-infezione(gpi) e comparsa di scolo nasale mucosieroso da 5 a 11 gpi.Una lieve leucopenia è stata rilevata da 3 a 10 gpi, anche se le

A

B

Figura 4 - Identificazione di soggetto con infezione persistente (PI)da BVDV-3. A) Ridotte dimensioni del vitello PI. B) Viremia edescrezione di BVDV-3 mediante urine, secrezioni nasali e feci dellostesso anmale. I titoli di RNA virale sono stati calcolati con real-timeRT-PCR e sono espressi come numero di copie µl-1 di estratto.



A B

C D

Figura 5

conte leucocitarie non sono mai scese al di sotto del 50% ri-spetto a quelle registrate prima dell’infezione. Nello stesso pe-riodo i leucociti hanno oscillato tra il 41,7% e l’81,6% rispet-to ai valori di base. La viremia è stata rilevata da 5 a 24 gpi el’escrezione virale si è manifestata da 5 a 21 gpi per via nasalee da 7 a 21 gpi per via fecale. I titoli virali calcolati mediantereal-time RT-PCR specifica16 sono risultati generalmente bas-si. La risposta anticorpale, comparsa a 14 gpi, ha raggiunto imassimi livelli a 21-28 gpi, attestandosi su titoli mediani in VNpari a 1:512. Mediante ELISA (BVDV-Ab SVANOVIRTM ELI-SA test, Svanova Biotech AB, Uppsala, Svezia), invece, sonostati ottenuti valori di densità ottica solo leggeremente supe-riori rispetto al valore soglia o cut-off del test (Fig. 5).Gli agnelli infetti hanno manifestato una sintomatologia re-spiratoria leggeremente più evidente, con abbondante scolonasale osservato per 19 giorni (mediana delle rilevazionicomplessive), mentre non si è verificato alcun incrementodelle temperature. Le conte leucocitarie e linfocitarie hannopresentato un lieve decremento tra 5 e 10 gpi, mantenendo-si però sempre al di sopra del 60% rispetto ai valori registra-ti prima dell’infezione. In questi animali la viremia è com-parsa a 5 gpi ed è durata fino al termine del periodo di os-servazione (28 giorni), ma i titoli virali registrati sono statipiù bassi rispetto a quelli osservati nei vitelli. Anche se solo 3su 5 agnelli erano viremici a 28 gpi, in questi animali è stataregistrata una viremia di più lunga durata rispetto ai vitelli,nei quali l’RNA virale è stato rilevato fino ad un massimo di24 gpi. Gli agnelli hanno eliminato il virus per via nasale e fe-cale tra 5 e 21 gpi e 7 e 18 gpi, rispettivamente, ma in alcunisoggetti l’escrezione è risultata intermittente. Anticorpi perBVDV-3 sono stati evidenziati solo mediante test VN (titoli

mediani pari a 1:64 rilevati a 21-28 gpi), mentre non è stataosservata alcuna reattività al test ELISA (Fig. 6).I suinetti inoculati non hanno presentato sintomi per l’inte-ro periodo di osservazione; i parametri ematologici nonhanno subito significative fluttuazioni rispetto alla baseline enon sono state registrate né viremia né escrezione virale. Tut-tavia, tutti i soggetti hanno prodotto una debole risposta an-ticorpale evidenziabile esclusivamente mediante VN a 21-28gpi (titoli mediani pari a 1:4) (Fig. 7).Al momento l’ospite naturale di BVDV-3 non è noto concertezza, anche se i casi sporadici di infezione naturale sonostati finora descritti in bovini e bufali7,8,14,23,26. In base alle se-gnalazioni di infezione naturale ed agli studi sperimentali èprobabile che l’ospite primario di BVDV-3 sia il bovino, seb-bene altre specie (bufali, pecore) siano risultate sensibili al-l’infezione con sviluppo di forme cliniche.

BVDV-3 E CROSS-REATTIVITÀ CON BVDV-1

Per ampliare le conoscenze attualmente disponibili sulla cor-relazione immunologica tra BVDV-3 e gli altri stipiti BVDV,sono state effettuate delle prove di immunizzazione in vivonelle specie ovina30. Allo scopo sono stati utilizzati gli stipiticitopatogeni BVDV-1 NADL e BVDV-3 Italy-83/10cp (23)coltivati su cellule MDBK. Gli stock virus (titolo pari a 105.50

TCID50 ml-1 di sospensione virale) sono stati inattivati conuna soluzione 1:2000 di betapropiolattone (0,05% v/v) edemulsionati inTween-80 (4,1% v/v) e, successivamente, conun mix di tre adiuvanti a base di oli minerali (50% v/v):



Montanide ISA 563 (Seppic Inc., Parigi, Francia), Marcol 52(Esso Italiana S.r.l., Roma, Italia) e Montane 80 (Seppic Inc.,Parigi, Francia) nella proporzione 30:63:7 (27). I vaccini so-no stati aliquotati in dosi da 5 ml e conservati a +4°C.Lo studio sperimentale è stato effettuato su 14 pecore di etàcompresa tra 2 e 3 anni, sieronegative per pestivirus, suddi-vise in due gruppi di 7 animali. Cinque pecore di ciascungruppo sono state inoculate per via intramuscolare con duedosi di vaccino (BVDV-1 o BVDV-3, rispettivamente), som-ministrate a distanza di 4 settimane, mentre i restanti dueanimali per gruppo sono stati utilizzati come controlli. Laproduzione di anticorpi è stata monitorata mediante testELISA (BVDV-Ab SVANOVIRTM ELISA test, Svanova Biote-ch AB, Uppsala, Svezia) e VN7,29 ed i dati sono stati sottopo-sti ad analisi statistica con il test Mann-Whitney (R software,versione 2.8.1). Tutti gli animali inoculati con i vaccini han-no mostrato risposta anticorpale sia mediante ELISA chemediante VN, mentre nei controlli non è stato registrato al-cun movimento anticorpale. Il test ELISA è stato in grado disvelare la presenza di anticorpi per pestivirus a 14 gpi in en-trambi i gruppi di pecore (immunizzate per BVDV-1 e perBVDV-3). I livelli anticorpali hanno raggiunto un picco a 42gpi (Fig. 8A). Non è stata registrata alcuna differenza signifi-cativa tra i livelli anticorpali indotti da BVDV-1 e da BVDV-3 (p = 0,84). Mediante test VN, nelle pecore immunizzate perBVDV-1 la risposta anticorpale omologa (per BVDV-1) edeterologa (per BVDV-3) è comparsa a 28 gpi (media geome-trica di 512 e 27,9, rispettivamente), per aumentare progres-sivamente fino al termine dello studio (media geometrica di4705 e 128, rispettivamente, Fig. 8B). La differenza tra i tito-li omologhi ed eterologhi è risultata statisticamente signifi-

cativa. Allo stesso modo, le pecore inoculate con BVDV-3hanno prodotto anticorpi VN a 28 gpi, raggiungendo la mas-sima risposta a 42 gpi. I titoli anticorpali omologhi sono au-mentati da 255,6 a 2702,3 (medie geometriche), mentre glieterologhi sono risultati significativamente più bassi dalpunto di vista statistico (p = 0,0092), con medie geometrichepari a 9,6 e 147,2 a 28 e 42 dpi, rispettivamente (Fig. 8C).Studi preliminari avevano già in parte evidenziato la presenzadi una scarsa cross-reattività immunologica tra BVDV-3 ed al-tri pestivirus31,32. Il presente studio ha ulteriormente confer-mato che BVDV-1 induce una risposta anticorpale in grado dineutralizzare solo parzialmente BVDV-3, rinforzando le pre-cedenti preoccupazioni sulla capacità dei vaccini attualmentein uso di conferire protezione nei confronti dell’infezione so-stenuta da virus Hobi-like. Per acquisire dati definitivi su que-sta delicata questione sono tuttavia necessari studi di cross-protezione su bovini, effettuando prove di challenge di anima-li vaccinati. Un altro elemento interessante è rappresentato da-gli elevati titoli anticorpali osservati non solo mediante VN maanche con un test ELISA allestito con antigene BVDV-1. Nelleprove di infezione sperimentale, lo stesso test (BVDV Ab SVA-NOVIRTM ELISA test) aveva rilevato anticorpi per pestivirus abassissimo titolo nei bovini, mentre gli ovini erano risultaticompletamente negativi, anche a fronte di discreti titoli anti-corpali VN29. Una possibile spiegazione per tali risultati, soloapparentemente contrastanti, risiede nella diversa modalità diinoculazione (oronasale o intramuscolare). È infatti noto che,in corso di infezione naturale, BVDV riesce ad interferire conlo sviluppo di una risposta immune rapida ed efficace, per cuigli anticorpi raggiungono titoli elevati a distanza di molte set-timane dall’infezione. Nel presente studio l’antigene è stato

A B

C D

Figura 6


combinato con un potente adiuvante ed inoculato per via in-tramuscolare: queste due condizioni potrebbero aver esaltatola produzione anticorpale, rendendola svelabile con un test al-trimenti poco sensibile. Non è, infine, da trascurare il diversobiotipo utilizzato nei diversi esperimenti, in quanto nelle pro-ve di infezione è stato utilizzato uno stipite ncp, mentre quel-le di immunizzazione sono state condotte impiegando unostipite cp, il quale è in grado di esprimere elevate quantità diproteina NS3 libera. Occorre, pertanto, evidenziare che i testELISA allestiti con antigene BVDV-1 potrebbero avere unacerta utilità per la ricerca di anticorpi nei confronti di BVDV-3 in animali inoculati per via parenterale (qualora siano svi-luppati vaccini specifici), ma non con infezione naturale.Questo dato sottolinea ulteriormente la necessità di attrezza-re i sistemi diagnostici in modo specifico nei confronti diBVDV-3.

TEST MOLECOLAREPER L’IDENTIFICAZIONE ECARATTERIZZAZIONEDEI PESTIVIRUS BOVINI

L’identificazione di BVDV-3, dapprima in lotti commercialidi siero fetale bovino e, successivamente, in focolai di infe-

zione naturale, ha posto seri problemi riguardo la disponibi-lità di test diagnostici che siano, allo stesso tempo, sensibili especifici per questo pestivirus emergente. A parte la scarsasensibilità dei test sierologici basati sulle metodiche ELISA,probabilmente a causa della bassa correlazione antigenicaesistente tra BVDV-3 e le altre specie BVDV, le metodichemolecolari attualmente utilizzate nell’ambito dei programmidi sorveglianza e controllo sono risultate totalmente incapa-ci di rilevare il nuovo virus o, comunque, poco sensibili4,7,10.Il test maggiormente utilizzato nei laboratori per la caratte-rizzazione dei pestivirus dei ruminanti9 ha erroneamente ti-pizzato i virus Hobi-like come BVDV-28. Il problema oppo-sto è stato, invece, osservato con un test real-time RT-PCRappositamente sviluppato per l’identificazione di BVDV-3, ilquale reagisce in maniera non specifica anche con stipitiBVDV-2 ad elevato titolo e, comunque, non è in grado di ri-levare simultaneamente BVDV-1 e BVDV-216.Per superare i limiti dei test attualmente in uso è stato mes-so a punto un protocollo di nested PCR per la simultaneaidentificazione e caratterizzazione molecolare di tutte le spe-cie BVDV, inclusi gli emergenti stipiti Hobi-like15.I primer per le amplificazioni in RT-PCR e nested PCR sonostati disegnati mediante software Primer3, versione 0.4.0(http://frodo.wi.mit.edu/primer3/), su un allineamento mul-tiplo dei genomi di stipiti di riferimento BVDV-1, BVDV-2,


A B

C D

Figura 7

Figura 5, 6, 7 - Infezione sperimentale di vitelli (Fig. 5), agnelli (Fig. 6) e suinetti (Fig. 7) con BVDV-3. Gli animali, inoculati per via oro-nasale con lo stipite Italy-1/10-1 sono stati monitorati per 28 giorni per la valutazione di temperatura rettale (A), formula leucocitaria (B), vi-remia ed escrezione virale (C) e risposta anticorpale (D). Le temperature sono presentate come gradi Celsius (°C) mediani, mentre le conteleucocitarie totali e differenziali sono presentate come percentuali mediane rispetto al tempo 0. I titoli mediani di RNA virale sono stati calco-lati con real-time RT-PCR e sono espressi come numero di copie µl-1 di estratto. La risposta anticorpale è presentata come mediane dei tito-li osservati in virus neutralizzazione (VN) e delle densità ottiche (OD) ottenute in ELISA.



BVDV-3, BDV e CSFV disponibili in GenBank, in modo da se-lezionare le regioni conservate (per la prima amplificazione) edifferenziali (per la nested PCR) tra le diverse specie virali. Iprimer per la RT-PCR amplificano un frammento di 1013 ba-si appaiate (bp) comprendente le regioni genomiche 5’ UTR,Npro e C, mentre gli oligonucleotidi utilizzati in nested PCR so-no rappresentati dal primer reverse della prima amplificazio-ne e da un set di tre primer forward specie-specifici (Tabella1). Le reazioni di prima (RT-PCR) e seconda (nested PCR)amplificazione sono state condotte rispettivamente con i kitSuperScriptTM One-Step RT-PCR for Long Templates (LifeTechnologies, Invitrogen, Milan, Italy) e AmpliTaq Gold (Ap-plera Italia, Monza, Italy). Le condizioni termiche dei due pro-tocolli sono riportate in Tabella 1.La prima amplificazione ha prodotto amplificati delle dimen-sioni attese in tutti i pestivirus di referenza, inclusi BDV eCSFV. Mediante nested PCR gli stipiti BVDV-1, BVDV-2 eBVDV-3 sono stati caratterizzati correttamente, dando ampli-ficati di 501, 829 e 210 bp, rispettivamente (Fig. 9). Non è sta-ta osservata alcuna cross-reazione tra le diverse specie BVDVe nessun amplificato è stato ottenuto dagli stipiti di referenzaBDV e CSFV. Un protocollo di nested PCR messo a punto ne-gli anni ’90 (prima quindi dell’insorgenza di BVDV-3) per lacaratterizzazione dei pestivirus dei ruminanti9 ha invece rico-nosciuto correttamente BVDV-1 e BVDV-2, mentre BVDV-3è stato erroneamente riconosciuto come BVDV-2.Per la validazione del nuovo protocollo sono stati testaticampioni clinici raccolti nel periodo 2005-2011. L’analisi di94 campioni bovini (9 aborti, 17 campioni respiratori, 2campioni fecali e 66 campioni di sangue intero) e di dueaborti caprini, che erano stati precedentemente analizzaticon il vecchio protocollo di tipizzazione molecolare9, ha evi-denziato una concordanza tra le due metodiche per 91 cam-pioni. Dei restanti 5 campioni, tutti tipizzati come BVDV-2con il vecchio protocollo, 3 sono stati riconosciuti comeBVDV-3 dal nuovo test, mentre altri due, corrispondenti agliaborti caprini, hanno prodotto amplificati in RT-PCR manon in nested PCR, e non sono stati riconosciuti comeBVDV. L’analisi di sequenza dei prodotti ottenuti in primaamplificazione ha dimostrato la corretta tipizzazione dei trestipiti BVDV-3, mentre per i campioni caprini si trattava distipiti BDV (negativi, pertanto, in nested PCR).

CONCLUSIONI

Le infezioni da pestivirus hanno ripercussioni negative sulleproduzioni zootecniche e causano ingenti perdite economiche.I dati relativi ai danni economici provocati dall’infezione dapestivirus in Italia, anche se ritenuti molto elevati, sono fram-mentari e non bene definiti. Un recente studio sull’impattoeconomico da infezioni da pestivirus nella specie bovina, effet-tuato in Danimarca, ha dimostrato che le perdite sono com-prese tra 10 e 40 milioni di dollari per milione di nuovi nati33.Nonostante l’impiego estensivo dei programmi di profilassisia diretta (identificazione ed abbattimento degli animali PI)che indiretta (vaccinazione delle manze prima dell’accoppia-mento), le infezioni da pestivirus nei ruminanti sono ancoramolto diffuse. Mentre nel caso di BDV, questo sicuramente èlegato alla mancanza in commercio di vaccini specifici, perquanto riguarda BVDV i dati disponibili indicano che i vac-cini in uso possono essere uno strumento efficace, ma la lo-

A

B

C

Figura 8 - Prove di cross-neutralizzazione tra BVDV-1 e BVDV-3(Hobi-like) in pecore inoculate con antigeni inattivati ed adiuvati. A)Valori medi di densità ottica (OD) osservati nei sieri degli animali ino-culati con BVDV-1 o BVDV-3 mediante test BVDV Ab SVANOVIR™ELISA. B) Titoli di anticorpi VN (medie geometriche) omologhi edeterologhi nei sieri di pecore inoculate con BVDV-1. C) Titoli di an-ticorpi VN (medie geometriche) omologhi ed eterologhi nei sieri dipecore inoculate con BVDV-3. Per ciascun valore sono riportate ledeviazioni standard.


a La posizione degli oligonucleotidi si riferisce alla sequenza genomica di BVDV-1 stipite NADL (numero di accesso GenBank M31182).b Il primer reverse è comune a RT-PCR e nested PCR.

ro efficacia deve essere prontamente migliorata per conferireuna protezione più completa34. Le prove di cross-neutraliz-zazione hanno dimostrato l’esistenza di notevoli differenzeantigeniche tra la nuova specie BVDV-3 ed i più classiciBVDV-1/BVDV-2. Vitelli infettati sperimentalmente conBVDV-3 hanno mostrato titoli anticorpali elevati con provedi neutralizzazione nei confronti del virus omologo, ma nondi quello eterologo (BVDV-1). Inoltre, i valori di densità ot-tica erano solo leggermente al di sopra del valore sogliaquando si utilizzava un kit ELISA commerciale con antigeneBVDV-1. Questo ha posto alcune preoccupazioni circa l’effi-cacia dei programmi di controllo per BVDV-3, considerandoche, utilizzando i comuni protocolli diagnostici, gli anticorpi

per questo virus potrebbero non essere rilevati29,30. Da tuttociò nasce l’esigenza di affrontare il problema sviluppandonuovi sistemi di diagnosi sierologica finalizzati a monitorarele infezioni da BVDV e consentendo, nel contempo, di siero-tipizzare le infezioni sostenute dalle diverse specie virali.Le differenze genetiche ed antigeniche dimostrate tra gli sti-piti Hobi-like ed i classici stipiti BVDV-1/BVDV-2 sollevanoanche notevoli perplessità circa l’efficacia dei vaccini dispo-nibili in commercio nei confronti di BVDV-3 e suggerisconodi sviluppare vaccini specifici contro questo nuovo virus.L’abilità dei pestivirus di modulare la risposta immunitariadell’ospite probabilmente è variabile tra i diversi isolati. Èstato infatti ipotizzato che l’elevata diversità genetica esisten-te tra i virus possa avere importanti implicazioni nello svi-luppo di vaccini, poiché la risposta immunitaria indotta daun ceppo potrebbe conferire solo protezione parziale neiconfronti di un ceppo differente, anche all’interno dello stes-so genotipo. Nuovi vaccini e strategie di vaccinazione sonoquindi sempre importanti in questo campo. L’esigenza dimettere a punto vaccini innovativi ed universalmente effica-ci nei confronti dei pestivirus in generale e di BVDV-3 inparticolare rappresenta, quindi, una stimolante sfida sul pia-no scientifico ed una risposta di alto profilo alle richieste chegiungono dal mondo produttivo zootecnico.

RINGRAZIAMENTI

Le attività di ricerca sono state supportate da finanziamentierogati dal Ministero della Salute (Ricerca corrente 2011,progetto “Epidemiologia del virus della diarrea virale bovinatipo 3 (BVDV-3) nel Sud Italia”) e dal Ministero dell’Istru-zione, dell’Università e della Ricerca (PRIN 2010-2011, pro-getto “Pestivirus dei ruminanti: virus emergenti, aspetti dia-gnostici e profilattici”).


Tabella 1 - Oligonucleotidi utilizzati nei test nested PCR per la caratterizzazione dei pestivirus.

RiferimentoDimensoni

bibliograficoTest Target Primer Sequenza (da 5’ a 3’) Senso Posizionea Specificità amplificato Protocollo termico

(bp)

P1 AACAAACATGGTTGGTGCAACTGGT + 1424-1448

P2b CTTACACAGACATATTTGCCTAGGTTCCA – 2222-2250

TS1 TATATTATTTGGAGACAGTGAATGTAGTAG + 1684-1713 BDV 566

nPCR TS2 TGGTTAGGGAAGCAATTAGG + 1802-1821 BVDV-2 448

TS3 GGGGGTCACTTGTCGGAGG + 2027-2045 BVDV-1 223

9

RT-PCR

Erns

BVDV, BDV,CSFV

50°C per 30 min,94°C per 2 min; 45 cicli a

94°C per 30 sec, 55°Cper 30 sec, 68°C per

1 min; 68°C per 10 min

94°C per 10 min; 25 cicli a94°C per 30 sec, 50°C per

30 sec, 72°C per 1 min;72°C per 10 min

50°C per 30 min, 94°Cper 2 min; 45 cicli a 94°C

per 30 sec, 50°C per30 sec, 68°C per 1 min;

68°C per 10 min

PanBVDVpcrF CTCTGCTGTACATGGCACATG + 368-388

PanBVDVpcrRb CGTCGAACCAGTGACGACT – 1364-1383

BVDV1npcrF TTTCAAGCTGCTCHGAYAC + 879-897 BVDV-1 501

nPCR BVDV2npcrF ATCCTGACCAATGCTAGGTCC + 551-571 BVDV-2 829

BVDV3npcrF TCCTGTGGCAACCGGTAGGT + 1173-1192 BVDV-3 210

15

BVDV, BDV,CSFV

94°C per 10 min; 25 cicli a94°C per 30 sec, 50°C per

30 sec, 72°C per 1 min;72°C per 10 min

RT-PCR

826

1013

5’ UTR,Npro, C

Figura 9 - Elettroforesi in gel di agarosio dei prodotti ottenuti in RT-PCR (corsie 2-5) e nested PCR (corsie 7-10) per l’identificazione e lacaratterizzazione dei pestivirus bovini. Corsia 1, marker GeneRuler100bp DNA Ladder (MBI Fermentas GmbH, St. Leon-Rot, Germany);corsia 6, marker GeneRuler 1kb DNA Ladder (MBI FermentasGmbH); corsie 2, 7, BVDV-1 stipite NADL; corsie 3, 8, BVDV-2 stipi-te 232/02; corsie 4, 9, BVDV-3 stipite 1/10-1-Italy; corsie 5, 10, con-trollo negativo (sangue di vitello negativo per pestivirus).



❚ Bovine viral diarrhoea virus type 3: a new threat to italian cattle industry?

SUMMARYWe report the clinical, pathogenetic and immunological fea-tures of the infection caused by a novel bovine pestivirus, na-mely Hobi virus or bovine viral diarrhea virus (BVDV) type3, in Italy. This emerging pestivirus, first detected more than10 years ago in a commercial batch of foetal bovine serumproduced in Brazil, has been reported so far only in southernAmerica and Asia. In 2010, Hobi-like viruses were detectedin Italy in association with outbreaks of respiratory diseaseand reproductive failures occurring in a cattle herd of theCalabria region. A virus pair consisting of cytopathogenic(cp) and noncytopathogenic (ncp) BVDV-3 was isolatedfrom a heifer dead as a consequence of respiratory distress.At the genetic level the two viruses differed for the presencein the cp strain of an insertion displaying high similarity toa bovine sequence previously associated to other cp BVDVs.By screening the cattle herd affected by clinical forms indu-ced by the novel pestivirus, a BVDV-3 persistently infected(PI) calf was detected, which was monitored for about 6months with regards to clinical conditions, viremia and viralshedding. Experimental infection of cattle, sheep and swineshowed that BVDV-3 is able to infect all those species,although only ruminants displayed clinical signs and virusshedding. The poor serological cross-reactivity existingbetween BVDV-1 and BVDV-3, which was assessed in thesheep model, raised some concerns about the ability of cur-rently available vaccines, mostly containing BVDV-1, to pro-tect effectively against the new pestiviral species. To overco-me the limitations of available diagnostic assays, a new tool(nested PCR) was developed which ensures unambiguousmolecular characterisation of all BVDV species, includingBVDV-3, in clinical samples. Future studies will assess thereal circulation of this pestivirus in Italian cattle herds andevaluate the BVDV-3 impact on animal productions.

KEY WORDSCattle, bovine viral diarrhoea, Hobi pestivirus (BVDV-3).

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174 Virus della diarrea virale bovina (BVDV) tipo 3: una ... · ta riscontrata nei confronti dello stipite BVDV-3 tailandese Th/04_KhonKaen, mentre le identità con stipiti BVDV-1