日皮会誌：94 (6), 717―726, 1984 (昭59）

免疫不全マウスマク1==･ファージからのH202産生機序

　　　　　　　　加　藤　　英　行

　　　　　　　　　　要　　旨

　ヒトの免疫不全症を理解する上での実験モデルとな

る免疫不全マウスの腹腔マクロファージを使い，易感

染性についての検討をH202産生のphenol red酸化を

指標として行なった. C3H/HeJ CLPS-non-respon-

der）,ＣＢＡ/Ｎ（Ｂcelldefect), beige (murin Chediak-

Higashi syndrome)マウスを使用したところ，正常形

質マウスと比較し, C3H/HeJマウスではフェノール

抽出ＬＰＳには反応しないがBoivin抗原, MDPには

反応し, CBA/N ＦＩ雄マウスでは全ての膜刺激物に対

して低い反応性を示し, beigeマウスではH202産生は

充分に行なわれるがその産生が持続しないこどがわ

かった．これらの事実が免疫不全マウスの易感染性の

原因のひとつではないかと思われた．

　　　　　　　　　　緒　　言

　生体は病原菌などの外敵の侵入に対して種々の防御

機構を有しているが，その中でも食細胞のもつ貪食殺

菌作用は，一次的防御機構の中心をなすと考えられて

いる．食細胞には好中球を代表とする穎粒球，単球お

よび単球由来の組織マクl=1ファージが含まれ，いづれ

も細菌を貪食し殺菌消化する能力を有しているI)~3)

　細菌，原虫などの徹生物の他にマクロファージを活

性化させる物質には，生体内ではマクロファージ活性

化因子，イソターフェロソ，コロニー形成刺激因子な

どが知られている4)が，種々の膜作用物質を用いるこ

とによりマクロファージを活性化することができ

る5)6)その代表的なものとしてグラム陰性菌の細胞壁

外層構成成分であるlipopolysaccharide (LPS),グラ

ム陽性菌細胞壁成分であるpeptidoglycanや結核菌体

最小活性単位であるmuramyl dipeptide (ＭＤＰ)があ

る7)-9)

自治医科大学皮膚科学教室（主任　矢尾板英夫教授）

Hideyuki Kato : Hydrogen peroxide release from

　peritoneal　macrophages　of　immunodefective

　mice

昭和59年２月16日受理　特掲

別刷請求先:（〒329-04)栃木県河内町薬師寺3311

　自治医科大学皮膚科学教室

　マクロファージは活性化するにつれ形態，代謝，機

能の面で種々の変化を示すようになる．その変化は生

体における活性化マクロファージの役割と密接に結び

ついている．たとえば，細胞内寄生性細菌に対する感

染防御においては，細菌を貪食，殺菌するために

superoxide ａｎｉｏｎ（Oi），過酸化水素（H202）などの活

性酸素の産生が充進している薦

　一方，ヒトの免疫不全症の本質を理解する上でよい

実験材料となる遺伝的欠損に基づく免疫不全マウスが

知られている．たとえば, C3H/HeJマウスはＬＰＳに

対しnon-responderであり，サルモネラ感染に対して

高い感受性を示すことかよく知られているU)また

ＣＢＡ/ＮマウスはＸ･linked　B　cell defectとしてＢ

cellの成熟化が遅れ，やはりサルモネラ感染に対して

高い感受性をもつことが報告されている12)さらに,ヒ

トChediak･Higashi症候群の動物モデルとしての

beigeマウスもまた食細胞の殺菌能が低下し自然感染

を受け易いといわれている13)

　そこで，これらの遺伝的欠損に基づく免疫不全マウ

スの腹腔マクロファージからのH202の産生能を正常

形質マウスと比較したところ，興味ある所見が得られ

たのでここに報告する．

　　　　　　　　実験材料および方法

　１．マウス

　BALB/c, C3H/He, C3H/HeJ, C57BL/6由来beige

mutant, C57BL/6, (beige female XC57BL/6 male)

F1および（ＣＢＡ/Ｎ female x BALB/c male) Fl male

and　femaleの8～12週齢のニマウスを使用した.

BALB/c, C3H/He, C57BL/6は東大医科研, C3H/HeJ

は北里大学，ＣＢＡ/Ｎおよびbeigeマウスは米国NIH

より提供され，本学微生物学教室にて自家繁殖したも

のである．

　２．マクロファージ

　各マウス当り2.5mlのチオグリコレート培地（栄研，

東京）を腹腔に注射，３～４日後に腹腔内より抗凝固

剤は使用せずに浸出細胞を集めた．これらの腹腔浸出

細胞はHank･ｓ balance salt solution（HBSS）（日水

製薬，東京）で３回洗浄.1×106個/mlを10％非勧化

（56℃for 30min.)ウシ胎児血清(FCS)加HBSSに

718 加藤　英行

浮遊.細胞は, 16mm径のplastic culture well (Falcon

4070)にlml/wellづっ注ぎ，37℃5％Ｃ０２･95%air

chamber内に３時間静置，各well表面にマクロ

ファージを接着させた．３時間後，非付着細胞を除き，

付着細胞は37℃に暖めたEarle･Ｓ balance salt solu-

tion (EBSS) (phenol red は含まないもの）で２回洗

浄．この付着細胞をmacrophage monolayer として使

用した. initial　1×106個/m1/ｗellは以上の操作より

final 6.8-7.2×105個/wellとなった．いずれのマウス

の系においてもほぼ同様の値が得られた．

　３．培養

　macrophage monolayerに, 10%FCS加HBSSに

細胞膜刺激物質としての種々endotoxinを加えたも

の，また対照として無添加のものを37℃5％Ｃ０２･95％

air chamber内で1～24時間培養とした．

　４．刺激剤

　細胞膜刺激物質としてのLPS, lipid A， lipid A-

Bovine Serum Albumin(BSA)-complex, Boivin抗原

は以下の方法で抽出作製した.

　ＬＰＳはWestphalの方法“）に従いhot-phenol･

water法によりＳａｌｍｏｎｅｌｌａ　tｙｂｈｉｍｕｒiｕｍＬＴ２より抽

出した. lipid　AはこのＬＰＳから1 % acetic　acid

100℃4時間で加水分解して得た. lipid A･BSA-com･

plexはGalanosの方法15)16)に従い合成した. Boivin

抗原はtrichloroacetic acidでＳ｡ｔｖphimｕｒｉｕｍＬＴ２よ

り抽出した17)合成ＭＤＰ（Ｎ･acetyl-muramyl-L-

alanyl-D･isoglutamine)とその誘導体であるMDP-lys

(L18) (N-acetyl･muramyl･Ｌ･alanyl･Ｄ･isoglutamyl-

Ｌ･stearoyl-lysine)は第一製薬から分与されたものを

使用した．これらの物質は生理食塩水に溶かし（ｍｇ/

ml) 4℃に保存，使用時にHBSSに適当濃度に調整し

た．しかしlipid A については不溶性でsonicateでも

不溶であった．

　５．試薬

　Phenolsulfonphthalein (sodium salt) (Sigma社，

U.S.A.)はHBSSで溶解(O.lg/litter) 4℃に保存，

使用前に37℃5％Ｃ０２･95%air chamber 内１時開静置

平衡とし, horseradish peroxidase (HRPO) (Sigma

社, U.S.A.)を加え(165u/ml) phenol red solution

（ＰＲＳ）とした．

　６．Ｈ２０２の測定

　H202の定量は, Pick and Keisariの方法18）に準じ

phenol red の酸化を測定した．

　膜刺激物質を加えたculture well をそれぞれの刺激

時間(1, 3, 6, 24時間）後に取り出し, warm EBSS

で２回洗浄．このmacrophage monolayerに1.55ml

phenol red 十〇.05ml ＨＲＰＯ液を加える．再び37℃

5 %CO2-95% air chamber内に入れ, 10, 20, 30, 40

分毎にculture well の上清1mlを取り１Ｎ NaOH ０.01

ml加の10×75mmガラス管に入れ反応を止める．これ

らのサンプルは吸光光度計(UV-200, Shimadzu) 610

nmで吸光度を測定した．

　また標準曲線は,PRSとH202溶液を最終10～1,000

nmol濃度にしたものを同様の方法で測定し描いた.

　H202産生量は４サンプルすなわち10, 20, 30, 40分後

の産生の合計を出し〔total yields of HzOj/total

period of incubation (lOOmin) /4wells〕，次にｎ mol.

H2O2/25min/culture=―Tqq""と×25として表示し

た．平均値および標準偏差値は各々３回以上の独立し

た実験系により得たものである．

　　　　　　　　　　結　　果

　1. LPS刺激によるBALB/cマウスマクロファー

ジからのH202産生(Fig. 1)

　免疫不全マウスからのH202産生を検討する前に

種々の条件を決める為正常形質マウスとしてBALB/

ｃマウスを使用した．ＢＡＬＢ／ｃマウスは，免疫学的に

正常といわれている. LPS無刺激では，ＢＡＬＢ/Ｃマク

ロファージからのH202産生はわずかであった. LPS

0.01～100μg/mlの濃度で刺激した場合，十分量の産

生が得られた．すなわち，１～３時間までの刺激では，

その産生量は多く，６時間以後では減少していた．ま

たＬＰＳ濃度であるが，0.01～10μg/mlまではdose-

dependentに産生量の増加がみられたが, 100μg/ml

ではむしろ10μg/mlより劣っていた．これは恐らく

ＬＰＳの高濃度では細胞毒性に働くものと思われる．ち

なみにマウス１匹当りのLD5oは250μgといわれてい

る．以上より, LPS 10μg/mlが刺激量として至適濃度

であり，１～３時間でH202産生が持続することがわ

かった．

　２．各種endotoxinによる比較(Fig. 2)

　次に，各種endotoxinによる比較を行なった.

phenol-extracted　LPS (LPS), TCA-extracted

Boivin antigen (Boivin抗原), lipid A, artificiallipid

A･BSA-complexによりBALB/cマクロファージを

刺激し, H2O2産生量を比較した.Fig. 2に示すごとく，

LPS, Boivin抗原, lipid A-BSA complex の刺激では，

１～３時間でH202の産生が認められた．しかしlipid

　　　　　０　　　　　　　０　　　５

　　　　　０　　　　　　　５　　　２

　　　　　１

{ａ.mｈｔtp：／／ｗww.／ioinｕ}

ｕｏｔｑ-Ｄｎｐｏｊｄ

　^ｎ＾Ｈ

０

Fig. 1.

｡／9

免疫不全マウスのH202産生機序

１５０

　　　　1

0　　　　　　　5

(ＢＪＴ＼＾ｒｎｓ／ｕＴ＼iiC7／ｘｏuiｕj

ａｏｘtiｏ

　rり

○

　八

コ

２５

control range　　　　　　　　　　　　　‾

　　　t　　　　　3　　　　　6　　卜¬Ｆ

LPS-induced Ｈ２０２productioｎ　in　ｖitｒｏ０f

peritoneal exudate macrophages obtained from

BALB/c mice. Thioglycollate-induced macro･

phages were cultured in the presence or absence

of LPS. At the times indicated on the abscissa,

the amounts of H202 in the supematants of cul-

tures were determined. LPS added to cultures :

▲,0.01μg/ml;△, 0.1μg/ml;□，1μg/ml; O, 10

μg/ml and ●，100μg/ml.ﾌｱｱ｀:range of Ｈ２０２

yield in the supematants of cultures in the

absence of LPS.

Ａ単独では十分な産生は得られなかった．このこと

は, Boivin抗原, lipid A･BSA complex はＬＰＳと同

様H202産生のための膜刺激物質として有効であり，

これら３つの共通部分はlipid Aであるから, lipid A

が, active principle であるといえる9いしかし, lipid

Aは，不溶性であるため単独では十分な効果を出しえ

ないことを示している．

　3. MDPによる産生(Fig. 3)

　ＭＤＰとその誘導体であるMDP-lys (L18)による

ＢＡＬＢ/ｃマクロファージからのH202産生を比較し

た. MDPでは, 100μg/mlで，１～３時間にH202の

産生がみられた. MDP １０μg/mlやＭＤＰ･lys (L18)

では安定したH202の産生がられなかった．このこと

からMDP 100μg/mlを至適濃度として使用すること

にした.

　4. C3H/HeとC3H/HeJマクロファージにおけ

るH2O2産生の比較(Fig. 4)

　C3H/HeJマウスはＣ３Ｈ/Ｈｅ系より得られた

０

control range

１３

６ ｈ「

719

Fig. 2. Endotoxin-induced Ｈ２０２　production　加

　z虜抑　of　peritoneal　ｅχudate　macrophages

　obtained from BALB/c mice. ThioglycoUate･in･

　duced macrophages were culturedin the presence

　or absence of endotoxins. At the times indicated

　on the abscissa, the amounts of H202 in the

　supematants were determined. Endotoxins (10

　μg/ml) added to cultures；O, LPS; ･, Boivin

　antigen; ■, lipid A･ＢＳＡ･complex and □, lipid

　A,ﾌﾌ万:range of H.O. ｙie】din the supematants

　of culturesin the absence of endotoxins.

mutantであり, LPSに対してｎｏｎ･respenderである

点を除いて，遺伝的にはC3H/Heと同様である．それ

ゆえ, C3H/HeJはＬＰＳ･non responderで, C3H/He

はＬＰＳ･responderとして，種々の実験系モデルとして

有名である19)しかしC3H/HeJはlipid A を結合した

蛋白を有する種々のendotoxinに対しては反応する

といわれている19)34)そこでC3H/HeJマクｇファー

ジからのH202産生をLPS, Boivin抗原,ＭＤＰで刺激

し, C3H/Heと比較検討した. Fig. 4に示すように，

C3H/HeはＬＰＳに反応し十分量のH202を産生した

が, C3H/HeTはほとんど反応しなかった．そこで

Boivin抗原で刺激したところC3H/Heは当然反応

し，またＬＰＳでは反応しないC3H/HeJも十分量の

H202を産生した．同様のことがＭＤＰにても観察され

た．このことから，H202の産生においてC3H/HeJは

ＬＰＳに対し反応しないが, Boivin抗原や他の膜刺激

物質では十分反応することがわかった.

　5 . CBA/N defective macrophaee におけるＨ2

720

150

　　　　10

0　　　　　　　5o

fajni[nD/u111152/ｌｏｍu]

ｕoLionpoJdｏｈ

25

０

control range

6 h「

Fig. 3. MDP･induced HoO, production in vit・ａof

　peritoneal exudate macrophages obtained from

　BALB/c mice. ThioglycoUate･induced macro-

　phages were cultured in the presence or absence

　of MDP. At the times indicated on the abscissa,

　the amunts of H202 in the supematants were

　determined. MDP and its derivative added to

　cultures:O, MDP (10μg/ml) ; ･, MDP (100μｇ/

　ml);△, MDP-lys (L18) (10μg/ml) ;▲,MDP･lys

　(L18)(100μｇ/ml).‾ｱｱｱ‾:range of H2O2 yield in

　the supematants of cultures in the absence of

　MDP.

加藤　英行

02の産生(Fig. 5)

　ＣＢＡ/ＮマウスはX-linked B cell defectとして，

Ｂ cellの成熟化が遅れ，すなわちＬＰＳに対してlow-

responderであり抗体産生能が低下しているマウスで

ある12)このようにＢ cell defect の代表的モデルであ

るがマクロファージにっいての検討は少なく，正常で

あるとの報告もみられる37)そこで我々は（ＣＢＡ/Ｎ

female xBALB/c　male) Fl　maleすなわちim･

munodefective　mice　macrophageとFl　female

phenotypically normal mice macrophageからのH2

02の産生量を比較検討した. Fig. 5に示すように，

ＣＢＡ/Ｎ･defective Fl male･macrophageではＬＰＳ刺

激に対し，低い反応性を示した．またBoivin抗原や

ＭＤＰに対しても, LPSと同様phenotypically　nor-

mal Fl female macrophage に比し，H202の産生は低

く十分な反応は認められなかった．このことは, CBA/

N-defective mice macrophageはendotoxinや他の

膜刺激物質に関係なく反応性が低く，マクロファージ

そのものの機質的欠損が考えられる.

　6. beigeマクロファージからのH202の産生の検

討(Fig. 6)

　Chediak-Higashi症候群の食細胞は殺菌能の低下と

走化能の低下があることはよく知られている20)12)こ

の欠損は細胞内の機能によるものでリソソームなどの

細胞内小器官の融合の不全によるものと考えられてい

る. beigeマウスはChediak-Higashi症候群の動物モ

デルとして注目されている．そこで我々は各種ｅｎ･

dotoxinによりbeige (bg/bg)マウスマクロファージ

を刺激し,H202産生を測定することがChediak･Higa･

Shi症候群のマクロファージ機能を知る上で意義のあ

ることと思い, (beige xC57 ＢＬ/6)F1(bg/十)とＣ５７

ＢＬ/6(十/十)をコントロールとし，比較検討した.

Fig. 6に示すようにＬＰＳ刺激１時間後では. bg/bg

マクロファージもコソトロールも十分量のH202を産

生することができた.同様のことがBoivin抗原,MDP

やlipid A-BSA complex, MDP-lys (L18)において

も産生がみとめられた2慌　しかし刺激３時間後におい

てコントｐ－ルのH202の産生は持続するが, bg/bg

マクロファージでは，急激に産生が低下することがわ

かった．これらの結果からbg/bgマクロファージは膜

刺激物質によりH202を産生することができるが，そ

の持続の点で著しく異なっていることがわかった．

　　　　　　　　　　考　　按

　生体内に細菌などの異物が侵入すると食細胞の多形

白血球やマクロファージがまず第一次の感染防御機構

として働く．すなわち，食細胞の殺菌機構は細菌の貪

食に際しての接触刺激により引き起こされる種々の殺

菌因子の産出，放出に基づいている1)2)これらの因子

の中で, superoxide anion (O;),過酸化水素(H202)，

水酸化ラジカル(･ＯＨ),一重項酸素(102)などの活性

酸素が重要な働らきを演じていることが明らかにされ

てきた10)23)これら活性酸素は,細胞の貪食時だけでな

く種々の膜刺激物質によって産生される5)6)

　一方，貪食機能，殺菌能を欠く疾患が報告されてい

る．たとえば,慢性肉芽腫症患者の場合24)25)その白血

球は貪食あるいは膜刺激物質のいずれの刺激において

も活性酸素の産生がみられない．本症の好中球の走化

能，貪食能，脱穎粒はほぼ正常であるが，貪食時に酸

素消費の増大やhexose monophosphate pathway活

性の増大がみられず，0iやH202の産生も認められな

い．病因についてはまだよく知られていないが，0iの

生成に必要なＮＡＤＰＨ酸化酵素は存在するので,酵素

{ａｊrtq.|_no/ｕ!.ui92/－§

－50

　～７り名２｀Ｊ

{９ｊｎ;

ｉｎａ/ｕiiQCZ／ｉｏｍｕ}

ｕｏt:ｉ３ｎｐｏａｄ　＾ｏ＾Ｈ

０

A｡　　　　　　　　　｜

　J一汗一二

免疫不全マウスのH202産生機序

○≪

二万ア▽てて

１

control range

Ｂ

h『

Fig. 4. LPS, Boivin antigen or MDP induced Ｈ２０２production in vitro of

　peritoneal exudate macrophages obtained from C3H/He or C3H/HeJ mice.

　ThioglycoUateヽinduced macrophages were cultured in the presence or absence

　of stimulaters. At the times indicated on the abscissa, the amounts of Ｈ２０２in

　the supernatants were determined. In panel A.macrophages from C3H/HeJ （●

　－●）ｏrＣ３Ｈ/Ｈｅ（○－○）ｗith LPS （10μg/ml). In panel Ｂ, macrophages from

　Ｃ３Ｈ/ＨｅＪ（・―■) or C3H/He （ローロ) with Boivin antigen （10μg/ml). In

　panel Ｃ, macrophages from C3H/HeJ （▲－▲）ｏrＣ３Ｈ/He（△－△) with MDP

　(100μg/ml).ﾌｱｱ‾:range of H,0, yield in the supemants of cultures in the

　absence of stimulaters.

０

Ａ

control range

-1　　　3

Ｂ

。

１≫

⊃

　　７　control range

h「 6 h『

Fig. 5. LPS, Boivin antigen or MDP induced H202 production j･？1ひitれ）０１

　peritoneal exudate macrophages obtained from （ＣＢＡ/Ｎfemale X BALB/c

　male)Fl mice. ThioglycoUate･induced macrophages were culturedin the pres-

　ence or absence of stimulaters. At the time indicated on the abscissa. the

　amounts of Ｈ２０２in the supematants were determined. In panel Ａ,macrophages

　from CBA/N-defect （●－●）ｏｒphenotypically normal Fl female （○－○）

　with LPS （10μg/ml). In panel B, macrophages from CBA/N-defect （●－■）ｏｒ

　phenotypically normal Fl female (ローロ) with Boivin antigen（10μg/ml). In

　panel Ｃ，macrophages from ＣＢＡ/Ｎ･defect(▲－▲）ｏrphenotypically normal

　Fl female （△－△) with MDP (100μg/ml). 777: range of Ｈ２０２yield in the

　supematants of culturesin the absence of stimulaters.

721

722

７j.ｎ'iｉｎｏ/ｕLiuｑ?/iQijjｕl　ｕoL^ｌｏｎｐｏａｄ

ＯＨ

３ 6 h「

B｡

加藤　英行

control range

Ｃ

Fig. 6. LPS, Boivin antigen or MDP induced Ｈ２０２production 加vitrりof

　peritoneal exudate macrophages obtained from beige (bg/bg) or control (bg/十

　〇ｒ十/十) mice. ThioglycoUate･induced macrophages were cultured in the pres-

　ence or absence of stimulaters. At the time indicated on the abscissa, the

　amounts of H202 in the supematants were determined. In panel A, macrophages

　from beige （●－●）ｏｒ control （○－○）ｗith LPS 【10μｇ/ｍ】).In panel Ｂ，

　macrophages from beige （■－■）ｏｒ control （ローロ) with Boivin antigen （10

　μg/ml). In panel C, macrophages from beige （▲－▲）ｏｒ control （△－△) with

　ＭＤＰ（100μg/ml).フフミrange of Ｈ２０２yield in the supematants of cultures in

　the absence of stimulaters.

の賦活障害説が有力である26)またChediak-Higashi

症候群においては，乳幼児期からの毛髪，皮膚の部分

的白子症や羞明を伴う眼底白子症とともに，皮膚・呼

吸器，中耳炎などの細菌感染を反復罹患する予後不良

の疾患である．本症の病因についてもまだ十分解明さ

れていないが，細胞膜可変能が悪く，加うるにcyclic

ＧＭＰ合成障害による微小管の集合障害によると考え

られている．この結果，走化能障害や食胞内へのリソ

ソーム顎粒放出障害がおこり，細胞内殺菌能が障害さ

れると考えられている26)これらの好中球機能異常症

では，単球系にも殺菌能の低下があることが報告され

ている27)

　このような易感染性をもつ免疫不全の病態の動物モ

デルとして,それぞれの実験マウスが開発されている．

とくに今回我々の使用したC3H/HeTマウスは, LSP

に対しｎｏｎ･responderであるためＣ３Ｈ/Ｈｅ系の

ＬＰＳ･responderマウスに比しサルモネラ菌に対する

感受性が高いことが報告され11),ＣＢＡ/Ｎマウスは,Ｘ-

linked B cell defect としてLyb 5＋Ｂ細胞の成熟化が

遅れ，やはりサルモネラ菌に対する感受性が高いこと

が示されている12〉. beigeマウスは，ヒトChediak-

Higahi症候群に似て食細胞のリソソーム酵素の漏出

のため殺菌能が低下し，生後６ヵ月を経過すると自然

感染を受け易いことが報告されている13)

　今回我々は，易感染性の機序を知るために，マクロ

ファージのH202産生能についての検討を行なった

が，マクロファージ活性化物質としてグラム陰性菌の

細胞壁構成成分であるＬＰＳとその同族体とグラム陽

性菌および結核菌体のアジュバソト活性の最小活性単

位であるＭＤＰとその誘導体を細胞膜刺激物質として

使用した. Fig. 2に示すように，免疫学的に正常であ

るＢＡＬＢ/ｃマクロファージではLPS, Boivin抗原，

lipid A-BSA･complexの刺激に対し十分量のH202の

産生をみた．しかしlipid A単独では産生はみられな

かった．このことは, LPSは特にそこに含まれるlipid

Aの作用に基づくと考えられており9)，lipid A 自体は

水に不溶性のため活性が弱いが，多糖，蛋白(lipid A-

associated protein)が結合すると強力な活性を示すと

いう事実に合致する15)16)

　免疫不全マウス群と正常形質マウスマクロファージ

からのH202産生量を比較した結果前者の免疫不全マ

ウスのそれぞれの系統では，いずれも膜刺激物質に対

免疫不全マウスのH202産生機序

して正常な反応を示さなかった. C3H/HeJはＬＰＳに

対してｎｏｎ･responderであるが，蛋白を含んだen-

dotoxinには反応するといわれ19)またmacrophage

mediated tumor lysis, LPS induced lethality, pros･

taglandin, lymphocyte activating factorの産生など

の点で, LPSに対し反応性がないと報告されてい

る28)゛34).ＰａｂＳt　and　Johnsonら35)もすでに, LPS-

primed　HeJ　macrophageのphorbol　mycerate

acetate刺激によるOiの産生が，正常C3Heb/FeTマ

クロファージと比較し低下していると報告している．

今回の我々の実験でもＣ３Ｈ/ＨｅＪマクロファージH2

02産生能は, LPSには反応を示さなかったが，脂質，

多糖，蛋白を含むBoivin抗原に対しては反応を示し

た(Fig. 4).このことは, C3H/HeTマクロファージは

その細胞表面に，蛋白に対するレセプターは有してい

ることが推測される36)

　X-liked B cell defect であるＣＢＡ／Ｎマウスのマク

ロファージにおいてもFig. 5に示すように，種々の

膜刺激物質に対してもH202の産生が低下しているこ

とがわかった．従来の報告では，このマクロファージ

はほぼ正常といわれている3馬しかし,我々の結果は全

ての刺激に対してlow response であった.今回の実験

結果が正しいとすれば，ＣＢＡ／Ｎマクロファージは，

H202産生に関していえば, C3H/HeJのようなLPS

に対する細胞表面のレセプターの欠如ではなく，細胞

内機能の欠損によることが考えられる．この点につい

ては，より多くの膜刺激物質による活性酸素の測定や

他のマクｇファージ産生物質の測定を今後検討してい

く予定である.

　Chediak･Higashi症候群のモデルであるbeigeマウ

スマクロファージからのH202産生もまた障害されて

いることが明らかとなった(Fig. 6).とくにその時間

的変化において，他の系と明らかに異なっていた．刺

激後早期，１時間では正常形質マウスとほぼ同様の

H202産生があったが,その産生は持続しないという点

である. Chediak-Higashi症候群では好中球や単球の

走化能，殺菌能が低下しているが，これらの異常は細

胞骨格のひとつである微小管の異常によるといわれて

いる20)すなわち，微小管集合の障害に始まる走化能，

酵素遊出の障害は，膜の粘性の上昇，流動性の低下と

関係あると思われる38)このことからbeigeマクロ

ファージは，膜刺激物質に対してのH202産生能は正

常に保持しているが，膜の流動性の低下が同じく膜に

存在するＮＡＤＰＨ酸化酵素活性の低下を招いて,活性

723

酸素の産生持続に障害を与えていることが推測され

る．

　以上の実験結果より，これら３系統の免疫不全マウ

スがある種の細胞感染に対し感受性が高いことの原因

のーつとしてマクロファージからのH202産生障害が

あるのではないかと考えられた．

　マクロファージから産生される活性酵素は，基本的

には好中球とほぽ同様の機序によっておこると考えら

れている39)~叫マクロファージが食作用を開始すると

酸素消費が高まり，0i,H202などの活性酸素が産生さ

れる．０ｉ産生酵素は細胞膜に局在し食作用に伴なって

活性化されると考えられている．活性化されたOi産

生酵素は，ＮＡＤＰＨを電子供与体として酸素分子に１

電子のみ還元してOiを生成する．このようにして産

生されたOiは，自然に，あるいは細胞内に存在する不

均化酵素(ＳＯＤ)によって不均化され，H202を生ずる．

さらにOiは,･ＯＨや102の生成にも関与している．産

生された活性酸素はきわめて反応性に富み，殺菌作用

ばかりではなく腫瘍細胞を破壊することも可能であ

り，一方，炎症反応における組織障害をきたす点でも

重要な役割を果たしている．０ｉは，それ自体あまり強

力な殺菌作用をもたないが，Ｈ２０２,･ＯＨｊ０２は殺菌作

用が強力であるといわれている3).マクロファージの

抗腫瘍作用には活性化マクロファージからのリソソー

ム酵素の放出が重要との報告42)や,H202が第一義的な

役割を果たし，活性酵素による腫瘍細胞膜の脂質の酸

化や蛋白を変性させることにより作用を示すともいわ

れている43)“).また炎症巣では，細菌のみならずリソ

フォカイソや免疫複合体，補体分解産物の他，種々の

剌激によるマクロファージの活性化により活性酸素が

産生され，直接組織を障害したり，リソソーム酵素の

流出を誘導したり，膜のアラキドソ酸に働きプロスタ

グラソディソ合成を促進し好中球に対する走化性因子

産生に一役かう，といわれている45)さらに皮膚科領域

においても,活性酸素は注目を集めている46)乾癖患者

好中球の活性酸素の産生増加47)血管炎患者血清中の･

ＯＨ産生因子の増加18)治らい剤のひとつであるクロ

ファチミソ(B663, Lamprene)の･ＯＨ産生増強によ

る殺菌効果49)や好酸球におけるH202産生機序5o)など

の報告が続いている．

　このように近年関心を集めている活性酸素について

我々は, phenol redの酸化でＨ２０２の測定を行なった．

この方法は，マクロファージのような付着細胞につい

て有効な方法といわれているが，欠点としてlnmol以

文　　献

ポジウム「Immunopharmacological modulation of en-

dotoxin response」，および第604回日本皮膚科学会東京研

究地方会にて報告した．

　稿を終えるに臨み,御指導･後校閲を賜わりました自治医

科大学微生物学教室　中野昌康教授，同皮膚科学教室　矢

尾板英夫教授,そして御協力下さいました微生物学･皮膚科

学研究室の皆様に深く感謝いたします．

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724 加藤　英行

下の定量には適さず，好中球などについては

scopoletineの酸化で測定した方が良いといわれ

る18)

　我々は,H202産生を指標として免疫不全マウス群の

易感染性についての検討を行ない，マクロファージの

H202産生機構に種々の異常を認める結果を得たので

ここに報告した．

　なお本稿の要旨は，第５回国際免疫学会サテライトシソ

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