1.propiedades fisicoquimicas del dna

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  • 1. DNADNA

2. DNA ESTRUCTURADNA ESTRUCTURALALAESTRUCTURAESTRUCTURADEL ADN ESTADEL ADN ESTADEFINIDA PORDEFINIDA PORLA SECUENCIALA SECUENCIADE LAS BASESDE LAS BASESNITROGENADANITROGENADAS EN LAS EN LACADENA DECADENA DENUCLEOTIDOSNUCLEOTIDOS 3. ESTRUCTURA DE BASES NITROGENADASESTRUCTURA DE BASES NITROGENADASDEL DNA Y RNADEL DNA Y RNA 4. A G C THombre, H.sapiens 0.29 0.18 0.18 0.31Bovino, Bos taurus 0.26 0.24 0.23 0.27Levadura, S.cerevisiae 0.30 0.18 0.15 0.29Mycobacterium sp. 0.12 0.28 0.26 0.11Composicin en bases del DNA en algunas especies 5. 1. La relacin purinas/pirimidinas es igual a 1Es decir, A+G = C+T2. En todos los DNA estudiados, la proporcin molarde A es igual a la de T, y la de G igual a la de C.Es decir, A = T y G = CReglas de Chargaff 6. 1. El DNA es una doble hliceplectonmica y dextrgira,con un paso de rosca de 3.4 nm3.4 nmModelo de Watson - Crick, A 7. Modelo de Watson-Crick, B2. Cada una de las dos hlices es un polinucletido entrelazado conel otro de manera que su polaridad es opuesta (es decir, corren ensentido antiparalelo)53 53 8. 3. El eje ribosa-fosfato se sitahacia el exterior de la doble hlice,en contacto con el solvente4. Mientras que las bases nitrogenadas(anillos planares) se sitan, apiladas,hacia el interior de la estructura, en unentorno hidrofbicoModelo de Watson-Crick, C 9. 5. Las bases estn situadas en planos aproximadamenteperpendiculares al eje mayor de la doble hlice. La distanciaentre planos es de 0.34 nmModelo de Watson-Crick, D0.34 nm 10. Modelo de Watson-Crick, ENNNNNHHN NOOCH3HAT6. Cada base interaccionacon su opuesta a travs deenlaces de hidrgeno, y demanera que:(a) Adenina (A) slo puedeinteraccionar con timina (T)(y viceversa), a travs de dospuentes de hidrgeno, y 11. NNNNOHNHHN NONHHGC(b) Guanina (G) slopuede interaccionar concitosina (C) (y viceversa),a travs de tres puentesde hidrgeno 12. 321547. La base est situadaen posicin anti-8. La desoxirribosaen forma furansica9. El anillo furansico esten conformacin endo-2Modelo de Watson-Crick, F 13. 10. El eje de la doble hliceno pasa por el centro geomtricodel par de bases. Esto determinaque la hlice presente un surcoancho y un surco estrechoSurcoanchoSurcoestrechoModelo de Watson-Crick, G 14. Paso de rosca 3.4 nmDistancia entre 0.34 nmplanos de basesPares de bases/vuelta 10Anchura 2.4 nmGeometra de la doble hlice (DNA-B)0.343.42.4 15. Interacciones dbiles que mantienen la estructura del DNA1. Enlaces de hidrgeno entrebases complementarias2. Interacciones hidrofbicasentre planos de bases contiguos(int. de apilamiento, stacking)3. Interacciones inicas del fosfatocon molculas electropositivas(histonas, poliaminas, etc.) 16. 1. Compatible con los datos cristalogrficos2. El modelo predice una determinada densidad lineal que secumple para todos los DNAs conocidos3. El DNA rico en GC debe ser ms difcil de desnaturalizar queel rico en AT. Esta prediccin se cumple perfectamente.4. El estudio de frecuencias de vecino ms prximo (A.Kornberg)slo es compatible con un modelo complementario y antiparalelop.e.: el par AG tiene la misma frecuencia que el par CT; AT tienela misma frecuencia que TA, y as sucesivamente.Pruebas experimentales de la estructura del DNA 17. A B ZGrosor 2.6 2.4 1.8Giro Dextro Dextro LevoBases/vuelta 11 10.4 12P.de rosca 2.5 3.4 4.5Inclinacin 19 1 9plano basesDistintas formas del DNA 18. DNA-A1.Doble hlice plectonmica y dextr-gira2. Planos de bases oblicuos respectoal eje de la doble hlica3. Propio de RNAs en doble hlice, ode hbridos DNA-RNA4. Ms ancha y corta que DNA-B 19. DNA-Z1. Doble hlice plectonmica y levgira2. Zonas de secuencia alternante -GCGC-3. Conformacin de G es syn- en lugar deanti-4. Ms estrecha y larga que DNA-B 20. Desnaturalizacin del DNAT, C% IncrementoAbsorbancia a260 nmLa desnaturalizacintrmica del DNA sigueuna curva sigmoide. Elpunto medio, Tm, estrelacionado con el conte-nido en G+C. As, la muestraB tiene un mayor contenidoen G+C que A. 21. La temperatura de fusin (Tm) necesaria paradesnaturalizar la mitad del ADN de una mezcla (puntomedio de la reaccin ADN doble hlice ADN hlicesencilla) esta directamente relacionada con el contenido enG+C, a mayor contenido en G+C mayor temperatura defusin (Tm). 22. El estado fsico de los cidos nucleicos est relacionadocon su capacidad de absorcin de la luz ultravioleta(UV) a 2.600 . El menor grado de absorcin se produceen estado de doble hlice, la absorcin aumenta cuandose produce la desnaturalizacin pasando a estado dehlice sencilla (efecto hipercrmico, aumento de laabsorbancia) y, por ltimo, si degradamos este ADN dehlice sencilla a nivel de nucletidos libres, de nuevoaumenta la absorbancia.Efecto Hipo crmico del DNA 23. EFECTO HIPOCROMICOEFECTO HIPOCROMICO 24. Para qu purificar DNA?Para qu purificar DNA?Aplicaciones 25. AplicacionesAplicacionesForenseForenseDx enfermedades infecciosasDx enfermedades infecciosasDx enfermedades congnitasDx enfermedades congnitasClonacin de GenesClonacin de GenesGenmicaGenmicaControl de calidad microbiolgicoControl de calidad microbiolgicoBiodiversidadBiodiversidadIdentificacin de especiesIdentificacin de especies 26. Cmo purificar DNA?Cmo purificar DNA? 27. Los 3 pasos bsicos para purificar DNALos 3 pasos bsicos para purificar DNALisis celularFraccionamiento de los cidos nucleicosConcentracin de los cidos nucleicos1.1.2.2.3.3. 28. 1. Lisis celular1. Lisis celularLisis enzimtica de tejidos animalesTampn de lisis con detergente. Algunos protocolosCon proteinasa K.Lisis de bacterias o levaduras.Lisozima (Bacterias Gram-positivas)liticasa (levaduras).Detergente y pH alcalino para plsmidos.Homogenizadores mecnicosAgitador mecnico, a la muestra se adicionan esferas.Congelacin descongelacinSe usa nitrgeno liquido. 29. 2. Fraccionamiento de los cidos nucleicos2. Fraccionamiento de los cidos nucleicosPreparacin de lisados crudosNo se purificaSalting-out methodsSe precipitan las proteinas ycontaminantes con sales de acetato deamonio o potasioFraccionamiento con solventesorgnicosFenol/cloroformo/alcohol isoamlico 30. 3. Concentracin de cidos nucleicos3. Concentracin de cidos nucleicosPrecipitacin con:EtanolIsopropanolEn presencia de sales 31. 2. SEPARACION DE FRAGMENTOS DE2. SEPARACION DE FRAGMENTOS DEDNADNAElectroforesis 32. Cmo hacer una electroforesis deCmo hacer una electroforesis deDNA?DNA? 33. Electroforesis de DNAElectroforesis de DNA 34. Electroforesis de DNAElectroforesis de DNA 35. Cmo se ve una electroforesis de DNA en geles de Agarosa? 36. Electroforesis de DNAElectroforesis de DNA 37. 1235467 38. Propiedades estructurales del DNAPropiedades estructurales del DNA5p OH33OH p5Las hebras de una molecula de DNA sonAntiparalelas y complementarias 39. Complementaridad del DNAComplementaridad del DNATA CG TATACG TACG CGTA5pp 5OH33 OHPuentesHidrgeno 40. 95C95CT G T T C A G CAA C A A G T C GTTA CG TATACG TACG CGTADesnaturalizacin/reasociacin del DNADesnaturalizacin/reasociacin del DNA 41. T G T T C A G CAAC AAG T CG TReasociacin solo con cadenas complementariasReasociacin solo con cadenas complementarias 42. HibridacinHibridacinEs la unin de dos cadenas de cidos nucleicosEs la unin de dos cadenas de cidos nucleicoscomplementarias para formar un duplex ocomplementarias para formar un duplex omolcula de cadena doble.molcula de cadena doble. Posibles hbridacionesDNA-DNADNA-RNA 43. dsDNA ssDNA apareamientoinicialdsDNADesnaturalizacinDesnaturalizacinReasociacinReasociacinRenaturalizacinRenaturalizacinT T 44. Molcula de DNAcs oRNA homloga a unasecuencia de DNAcs oRNA con la que sehibrida de formaestable y especfica porasociacin de basescomplementarias. 45. SondasSondasUnaUna sondasonda es un fragmento de DNA que:es un fragmento de DNA que: Se puede marcar para ser identificado y medidoSe puede marcar para ser identificado y medido Se hibrida a un DNA gracias a su complementaridadSe hibrida a un DNA gracias a su complementaridadTipo de marcajesTipo de marcajes Radioactivo (Radioactivo (3232P,P, 3535S,S, 1414C,C, 33H)H) FluorescenteFluorescente Biotinilacin (avidina-streptavidina)Biotinilacin (avidina-streptavidina) 46. Hibridacin de DNAHibridacin de DNAinmobilizado en soportes deinmobilizado en soportes dehibridacion:hibridacion:NitrocelulosaNitrocelulosaMembranas de nylonMembranas de nylonSouthern BlotSouthern Blot 47. NucleasasNucleasasEndonucleasa5 Exonucleasa 3 Exonucleasa 48. Southern BlotSouthern BlotEnzimas de retriccinDNA de variostamaosElectroforesis en gel de agarosagelDenaturacin y transferencia a NCblot 49. Hibridacin de la sondaVisualizacin 50. Southern (and Northern) blot:Southern (and Northern) blot:1. electrophoresis1. electrophoresis 51. Southern (and Northern) blot:Southern (and Northern) blot:2. transfer to a filter/membrane2. transfer to a filter/membrane 52. Southern (and Northern) blot:Southern (and Northern) blot:3. hybridization to a labeled unique probe3. hybridization to a labeled unique probe 53. TestigopositivoTestigonegativomuestraMUESTRAClulas,microorganismosautoradiografahibridacnlavadosondasGel de agarosaEctraccin yDenaturalizacin del ADNFiltro denitrocelulosatransferenciaSeparacin defilamentosde ADNELECTROFORESIS 54. Southern Blot 55. FILTRO DENITROCELULOSACOLONIAS REPLICA ENPLACA CON FILTROFILTRO CON COLONIASCOLONIASADN DE LAS COLONIASEN EL FILTROAUTORADIOGRAFACOLONIA- Rplica en placa con filtro- Lisis- Secado- Hibridacin con sonda radioactiva 56. HibridacionHibridacion in situin situ por fluorescenciapor fluorescencia 57. HibridacionHibridacion in situin situ por fluorescenciapor fluorescencia