DNADNA

DNA ESTRUCTURADNA ESTRUCTURA

LA LA ESTRUCTURA ESTRUCTURA DEL ADN ESTA DEL ADN ESTA DEFINIDA POR DEFINIDA POR LA SECUENCIA LA SECUENCIA DE LAS BASES DE LAS BASES NITROGENADANITROGENADAS EN LA S EN LA CADENA DE CADENA DE NUCLEOTIDOSNUCLEOTIDOS

ESTRUCTURA DE BASES NITROGENADAS ESTRUCTURA DE BASES NITROGENADAS DEL DNA Y RNADEL DNA Y RNA

A G C T

Hombre, H.sapiens 0.29 0.18 0.18 0.31

Bovino, Bos taurus 0.26 0.24 0.23 0.27

Levadura, S.cerevisiae 0.30 0.18 0.15 0.29

Mycobacterium sp. 0.12 0.28 0.26 0.11

Composición en bases del DNA en algunas especies

1. La relación purinas/pirimidinas es igual a 1 Es decir, A+G = C+T

2. En todos los DNA estudiados, la proporción molar de A es igual a la de T, y la de G igual a la de C. Es decir, A = T y G = C

Reglas de Chargaff

1. El DNA es una doble héliceplectonémica y dextrógira, con un paso de rosca de 3.4 nm

3.4 nm

Modelo de Watson - Crick, A

Modelo de Watson-Crick, B

2. Cada una de las dos hélices es un polinucleótido entrelazado conel otro de manera que su polaridad es opuesta (es decir, corren ensentido antiparalelo)

5’

3’ 5’

3’

3. El eje ribosa-fosfato se sitúahacia el exterior de la doble hélice,en contacto con el solvente

4. Mientras que las bases nitrogenadas (anillos planares) se sitúan, apiladas,hacia el interior de la estructura, en unentorno hidrofóbico

Modelo de Watson-Crick, C

5. Las bases están situadas en planos aproximadamenteperpendiculares al eje mayor de la doble hélice. La distanciaentre planos es de 0.34 nm

Modelo de Watson-Crick, D

0.34 nm

Modelo de Watson-Crick, E

N

N

N

N

NHH

N N

O

O

CH3

H

A

T

6. Cada base interaccionacon su opuesta a través deenlaces de hidrógeno, y demanera que:

(a) Adenina (A) sólo puede interaccionar con timina (T)(y viceversa), a través de dos puentes de hidrógeno, y

N

N

N

N

O

H

NH

H

N N

O

NH

H

G

C

(b) Guanina (G) sólopuede interaccionar concitosina (C) (y viceversa),a través de tres puentesde hidrógeno

3’2’

1’5’

4’

7. La base está situadaen posición anti-8. La desoxirribosa

en forma furanósica

9. El anillo furanósico estáen conformación endo-2’

Modelo de Watson-Crick, F

10. El eje de la doble héliceno pasa por el centro geométricodel par de bases. Esto determinaque la hélice presente un surcoancho y un surco estrechoSurco

ancho

Surcoestrecho

Modelo de Watson-Crick, G

Paso de rosca 3.4 nm

Distancia entre 0.34 nmplanos de bases

Pares de bases/vuelta 10

Anchura 2.4 nm

Geometría de la doble hélice (DNA-B)

0.34

3.4

2.4

Interacciones débiles que mantienen la estructura del DNA

1. Enlaces de hidrógeno entre bases complementarias

2. Interacciones hidrofóbicas entre planos de bases contiguos (int. de apilamiento, stacking)

3. Interacciones iónicas del fosfato con moléculas electropositivas (histonas, poliaminas, etc.)

1. Compatible con los datos cristalográficos

2. El modelo predice una determinada densidad lineal que se cumple para todos los DNAs conocidos

3. El DNA rico en GC debe ser más difícil de desnaturalizar que el rico en AT. Esta predicción se cumple perfectamente.

4. El estudio de frecuencias de vecino más próximo (A.Kornberg) sólo es compatible con un modelo complementario y antiparalelo

p.e.: el par AG tiene la misma frecuencia que el par CT; AT tiene la misma frecuencia que TA, y así sucesivamente.

Pruebas experimentales de la estructura del DNA

A B Z

Grosor 2.6 2.4 1.8Giro Dextro Dextro LevoBases/vuelta 11 10.4 12P.de rosca 2.5 3.4 4.5Inclinación 19º 1º 9ºplano bases

Distintas formas del DNA

DNA-A

1.Doble hélice plectonémica y dextró- gira

2. Planos de bases oblicuos respecto al eje de la doble hélica

3. Propio de RNAs en doble hélice, o de híbridos DNA-RNA

4. Más ancha y corta que DNA-B

DNA-Z

1. Doble hélice plectonémica y levógira

2. Zonas de secuencia alternante -GCGC-

3. Conformación de G es syn- en lugar de anti-

4. Más estrecha y larga que DNA-B

Desnaturalización del DNA

T, ºC

% IncrementoAbsorbancia a260 nm

La desnaturalizacióntérmica del DNA sigueuna curva sigmoide. Elpunto medio, Tm, está relacionado con el conte-nido en G+C. Así, la muestraB tiene un mayor contenidoen G+C que A.

La temperatura de fusión (Tm) necesaria para desnaturalizar la mitad del ADN de una mezcla (punto medio de la reacción ADN doble hélice → ADN hélice sencilla) esta directamente relacionada con el contenido en G+C, a mayor contenido en G+C mayor temperatura de fusión (Tm).

El estado físico de los ácidos nucleicos está relacionado con su capacidad de absorción de la luz ultravioleta (UV) a 2.600 . El menor grado de absorción se produce en estado de doble hélice, la absorción aumenta cuando se produce la desnaturalización pasando a estado de hélice sencilla (efecto hipercrómico, aumento de la absorbancia) y, por último, si degradamos este ADN de hélice sencilla a nivel de nucleótidos libres, de nuevo aumenta la absorbancia.

Efecto Hipo crómico del DNA

EFECTO HIPOCROMICOEFECTO HIPOCROMICO

¿Para qué purificar DNA?¿Para qué purificar DNA?

Aplicaciones

AplicacionesAplicaciones

ForenseForenseDx enfermedades infecciosasDx enfermedades infecciosasDx enfermedades congénitasDx enfermedades congénitasClonación de GenesClonación de GenesGenómicaGenómicaControl de calidad microbiológicoControl de calidad microbiológicoBiodiversidadBiodiversidadIdentificación de especiesIdentificación de especies

¿Cómo purificar DNA?¿Cómo purificar DNA?

Los 3 pasos básicos para purificar DNALos 3 pasos básicos para purificar DNA

Lisis celular

Fraccionamiento de los ácidos nucleicos

Concentración de los ácidos nucleicos

1.1.

2.2.

3.3.

1. Lisis celular1. Lisis celular

Lisis enzimática de tejidos animalesTampón de lisis con detergente. Algunos protocolos Con proteinasa K.

Lisis de bacterias o levaduras.Lisozima (Bacterias Gram-positivas) liticasa (levaduras).Detergente y pH alcalino para plásmidos.

Homogenizadores mecánicosAgitador mecánico, a la muestra se adicionan esferas.

Congelación descongelaciónSe usa nitrógeno liquido.

2. Fraccionamiento de los ácidos nucleicos2. Fraccionamiento de los ácidos nucleicos

Preparación de lisados crudosNo se purifica

Salting-out methodsSe precipitan las proteinas y contaminantes con sales de acetato de amonio o potasio

Fraccionamiento con solventes orgánicosFenol/cloroformo/alcohol isoamílico

3. Concentración de ácidos nucleicos3. Concentración de ácidos nucleicos

Precipitación con:

Etanol

Isopropanol

En presencia de sales

2. SEPARACION DE FRAGMENTOS DE 2. SEPARACION DE FRAGMENTOS DE DNADNA

Electroforesis

¿Cómo hacer una electroforesis de ¿Cómo hacer una electroforesis de DNA?DNA?

Electroforesis de DNAElectroforesis de DNA

Electroforesis de DNAElectroforesis de DNA

¿Cómo se ve una electroforesis de DNA en geles de Agarosa?

Electroforesis de DNAElectroforesis de DNA

1

2

3

5

4

6

7

Propiedades estructurales del DNAPropiedades estructurales del DNA

5’p OH3’

3’OH p5’

Las hebras de una molecula de DNA son Antiparalelas y complementarias

Complementaridad del DNAComplementaridad del DNA

T

A C

G T

A

T

A

C

G T

A

C

G C

GT

A

5’p

p 5’

OH3’

3’ OH

PuentesHidrógeno

95°C95°C

T G T T C A G CA

A C A A G T C GT

T

A C

G T

A

T

A

C

G T

A

C

G C

GT

A

Desnaturalización/reasociación del DNADesnaturalización/reasociación del DNA

T G T T C A G CA

AC AAG T CG T

Reasociación solo con cadenas complementariasReasociación solo con cadenas complementarias

Hibridación Hibridación

Es la unión de dos cadenas de ácidos nucleicos Es la unión de dos cadenas de ácidos nucleicos complementarias para formar un duplex o complementarias para formar un duplex o molécula de cadena doble.molécula de cadena doble.

• Posibles híbridacionesDNA-DNADNA-RNA

dsDNA ssDNA apareamiento inicial

dsDNA

DesnaturalizaciónDesnaturalizaciónReasociaciónReasociaciónRenaturalizaciónRenaturalización

T° T°

Molécula de DNAcs o RNA homóloga a una secuencia de DNAcs o RNA con la que se hibrida de forma estable y específica por asociación de bases complementarias.

Sondas Sondas

Una Una sondasonda es un fragmento de DNA que: es un fragmento de DNA que:– Se puede marcar para ser identificado y medidoSe puede marcar para ser identificado y medido– Se hibrida a un DNA gracias a su complementaridadSe hibrida a un DNA gracias a su complementaridad

Tipo de marcajesTipo de marcajes– Radioactivo (Radioactivo (3232P, P, 3535S, S, 1414C, C, 33H)H)– FluorescenteFluorescente– Biotinilación (avidina-streptavidina)Biotinilación (avidina-streptavidina)

Hibridación de DNA Hibridación de DNA inmobilizado en soportes de inmobilizado en soportes de hibridacion:hibridacion: NitrocelulosaNitrocelulosa Membranas de nylonMembranas de nylon

Southern BlotSouthern Blot

NucleasasNucleasas

Endonucleasa

5’ Exonucleasa 3’ Exonucleasa

Southern BlotSouthern Blot

Enzimas de retricción

DNA de varios tamaños

Electroforesis en gel de agarosa

gel

Denaturación y transferencia a NC

blot

Hibridación de la sonda

Visualización

Southern (and Northern) blot:Southern (and Northern) blot:1. electrophoresis1. electrophoresis

Southern (and Northern) blot:Southern (and Northern) blot:2. transfer to a filter/membrane2. transfer to a filter/membrane

Southern (and Northern) blot:Southern (and Northern) blot:3. hybridization to a labeled unique probe3. hybridization to a labeled unique probe

Test

igo

posi

tivo

Test

igo

nega

tivo

mue

stra

MUESTRA

Células,microorganismos

autoradiografía

hibridacíón

lavado

sondas

Gel de agarosaEctracción y

Denaturalización del ADN

Filtro denitrocelulosa

transferencia

Separación defilamentosde ADN

ELECTROFORESIS

Southern Blot

FILTRO DE NITROCELULOSA

COLONIAS REPLICA ENPLACA CON FILTRO

FILTRO CON COLONIAS

COLONIAS

ADN DE LAS COLONIASEN EL FILTRO

AUTORADIOGRAFÍACOLONIA

- Réplica en placa con filtro

- Lisis- Secado

- Hibridación con sonda radioactiva

Hibridacion Hibridacion in situ in situ por fluorescenciapor fluorescencia

Hibridacion Hibridacion in situ in situ por fluorescenciapor fluorescencia