1.Structura Si Functiile Proteinelor.enzimele

5/11/2018 1.Structura Si Functiile Proteinelor.enzimele - slidepdf.com

http://slidepdf.com/reader/full/1structura-si-functiile-proteinelorenzimele 1/34

r

CAPITOLUL I

Structura ~ifunctiile proteinelor. Euzimele

Partea 1. Proteinele

Din toti compusii organici proteinele au cea mai complexa structura si

prezi nta eel mal important component al materiei vii,

Proteinele sunt heteropolimeri ai ce-aminoacizilor cu 0 rnasamoleculara

mare, Legindu-se intre ei prin Iegatura peptidica ~O~NH~, ei formeaza

lanturi polipeptidice, Legatura peptidica apare ca rezultat al reactiei dintre

gruparea carboxil a unui aminoacid ~igruparea amino a altuia. Reactia este

insotita de eliminarea unei molecule de apa. La hidroliza totala a rnoleculei

proteice are loe ruperea legaturilor peptidice ~iobtinerea unui amestec de

u-aminoaeizi.

Varietatea colosala de proteine 111natura este determinata de cornponenta

am inoacida si de succesiunea am inoacizilor in catena polipeptidica. Pentru

fiecare proteins este caracteristica 0 anurnita suceesi une a resturi lor de

aminoacizi care ~ieste considerata ca structure primard a moleculei proteice,

Lantul polipeptidic de regula se rasuceste 1 1 1 forma de spirals forrnand

structura secundara a moleculei proteice, Aceasta la rindul sau se rasuceste

Intr-un mod complicat, dar strict specific, capatind 0 configuratie spatiala

numita structura tertiara.

Unele molecule proteice sunt formate din citeva lanturi polipeptidice, de

obicei perechi, identice sau diferite de structura primara, secundara si tertiara,

care poartii denumirea de subunitati sau protom eri, E le formeaza un tip de

molecule proteice cu proprietati fizico-chimice ~ibiologice specifice din punct

de vedere structuralsi functional, Acest nivel de structure a rnoleculei

proteice poarta denumirea de structura cuaternard.Pentru mentinerea configuratiei spatiale, molecula proteid mai are

nevoe de unele legaturi suplirnentare, Mal importante sunt legaturile de

hidrogen, care apar Intre atomii de hidrogen ai gruparii ~NH- (sau ~H-)

si atomii de oxigen ai gruparii ~O-, disulfidice (-S-S-) ~i ionice, care

apar intre gruparile am ino eu sarcini pozitive ale acizilor diamino-

monocarboxilici ~igruparile carboxil cu sarcini negative ale acizilor

monoaminodicarboxilici,

8



Structura rnoleculei proteice este foarte labila si se modifies user sub

actiunea factorilor tizici si chirnici. Ca rezu Itatal acestor actiuni se modifies

proprietatile fizice, chirnicesi biologice ale moleculei,

Este necesar de a putea folosi cunosti nteie despre structura, propri etati Ie

f iz ice s i chirn ice ale proteinelor, functiile lor, componen ta p ro te ic a a o rg an e lo r~itesuturilor in norma si In diferite leziuni in vederea elucidarii functiilor

organismului in n orma s i tu lb ur are a lo r In p ato lo gie ,

TEMA 1

Importaota biochimiei pentru medicina,

Aminoacizii. Reactiile de culoare ale proteinelor ~i aminoacizilor

Experienta 1. Reactia de identificare a aminoacizilor ce contin

sulf legat slab (reactia Fol).

Principiul metodel, La degradarea proteinelor si peptidelor sub

actiunea hidroxidului de sodiu din gruparile sulfhidril se elibereaza sulful sub

forma de sulfura de sodiu, care reactionind cu p lumb i tu l de sodiu, formeaza

precipitatul de sulfura de plumb (PbS) de culoare neagra sau b runa , Ecua ti a

reactiei:

1. CH1 - SHJ

CH~NHlI

COOH

+2NaOH

CH2-OR

I

+tCH ~ NH2+ Na2S+H2

J

COOH

Cisteina Serina

2. Na2S + Na2Pb02 + H20- PbS! +4NaOHJ .

plumbit de precipitat

sodiu negru

Metionina, spre deosebire de cisteina ~j cistina, nu da aceasta reactie,

deoarece sulful in acest aminoacid este legat trainic.

Mod de lucru. La 5 picaturi de ovalbumlna se adauga 5 picaturi de

reactiv Fol, Arnestecul se pune la fiert, Dupa 1~2 minute de fierbere apare

un precipitat negru sau brun de sulfura de plumb (PbS).

9



React ivul Fol

prezinta un ames-

tee de volume egale

de acetat de plumb

de 5% J' i NaOH de30%.

Exper ieuta 2.

Reactia de culoare

pentru tirozina

(reactia Millon).

Prillci.piul

metodei, Reactivu I

M illon la eald da cu

tirozina 0 coloratie

rosie. Reactia estecaracter ist ica am i~

noacizilor care au1 1 1structure un nucleu

fenolic,

Mod de lueru.

Intr-o epru beta se

iau citeva cristale de

tiroziua la care se

adauga acid sulfuric

de 2,5%. Continutul

eprubetei se agita

pina la dizolvareacomplete a cristalelor, Se adauga I ml de reactiv Millon, se agita si se lasa la

tem peratura cam erei, Peste un tim p se observa aparitia unei coloratii roz-

rosiatice sau a un u ip re cip ita t c aram iziu, Temp era tu ra r id ie ata fa ci litem aparitiacoloratiei.

Reactivul Millon prezinta un amestec de mercur cu acid azotic

concentrat J · i apa distilata tpuiin NaNO).

Experienta 3. Reactia de culoare pentru arginilli'i iReacua Sakaguciy.Principiul metodei. A rginina, fiiud tratata cu a-naftal in prezenta

hipocloritului de sodiu sau hipobromitului de sodiu, da 0 coloratie rosie

caracteristica. Reactia este specifics gruparii guanidinice din structura

argin inei, La oxidarea de ruai departe a naftolargininei se form eaza un com pus

de tip ul c h in on im in ei,

OH OH

CH2

IH· C- NH2

ICOOH

CH2

IH ~C-NH2

I

COOH

OH

CH2,H-C-~

ICOOH

Derivat al o-ehinonoximei

10



Der iva ti i ch inonim ine i (In c azu l d e fa lii n afto ch in on im i na ), la c are h id ro ge nu l

grupari iirn in ic e e ste s ub stitu it d e u n ra dic al a lc hi I s au a ril, intotdeauna sun t co lo ra ti

1 1 1 n ua nte g alb en -ro sia tic e. C ulo are a ro sie -p orto ca lie a s olu tie i In c az ul r ea ctie i

Sak ag uc i s e exp lic a p ri n apa ri ti a d er iv at ul ui n af to ch in on im i ne i.

Nl-hI

C:::NH Br

~H C Q 3NaB~ 6 y . I~ . (YI +2 . """ # yV(CH2 ) 3 BrI OH O-N-- -.. 0

I + H 20 + NaBr +

C:::NH + 2NaOHI

(CH2 ) 3

I

CH~NH2

CH-NHz

ICOOH

Arginina

M od de lucru . Intr-o eprubeta se iau 2 m l solutie de 0,01% de arginine la

care se adauga 2 m l solutie de hidrox id de sodiu de 10% ~iciteva p ica tu ri solut ie

alcoolica de a-nafto l de 0,2% . C ontinutul eprubetei se agita bine si se adauga

0,5 m l solutie de hipobrornit de sodiu si iaras i se agita, lm ediat se adauga 1 m l

so Iu tie de ure e de 4 0% p en tru stab IIiza rea co lora tie i ro s ii-po rto ca li iaparute.

Experienta 4. Reacsia de culoare pentru histidinii (reactia Pauli).

Principiul m etodei. La interactiunea aciduJui sulfanilic cu nitrit de

potasiu se produce reactia de diazotare si are lo c formarea acidului

d ia zo be nzen sul fou ic:

S03H SO)

+NH2 N-N

Acid sulfanilic Acid diazobenzensulfonic

In reactia dintre histidina si ac iduJ d iazobenzensu lfon ic format s e o btin e 0

co lo ra tie rosie -visin ie :

11



Acid Histidinadiazobenzen-sulfonic

Acid diazcbenzensulfonic

Mod de lucru, La 1 ml solutie de acid sulfanilic de 1% in solutie de

acid clorhidric de 5% se adauga 2 ml solutio de nitrit de potasiu de 0,5%.

Eprubeta se agita ~i se adauga 2 ml solulie de histidina de 0,01%. Dupaagitare se rnai a da uga 6 ml solutie de carbonat de sodiu de 10%. Apare 0

coloratie rosie-visinie,

Expe rreuta 5. Reactia de culoare pentru triptofan ireactiaA damkiew ick-Hopkins),

Principiul metodei. Solutiile de triptofan fiind tratate cu acid glioxilic in

prezenta acidului sulfuric concentrat formeaza la nivelul zonei de contact un

inel violaceu, Reactia este specifics inelului indolic.

COOH COOHI I ,CH - NH2 CH - NH2

I ICH2 CH2

0 : J i + H - ? = O + 0 : J i ·I COOH I

Triptofan H Acid glicoxilic H

12



COOH COOHI ICH - NH2 CH - NH2

I ICH2 .. CH~

~{~~N) COOH~N~

I IH Produs de H

condensare

Mod de lueru. La 5011 so lu ti e de triptafan de 0,5% se adauga 3 011de

acid acetic glacial. Pe peretii eprubetei se introduc cu atentie 2-3 ml de acid

sulfuric concentrat, astfel ca cele doua lichide sa se stratifice. La limita de

separatie dintre cele doua solutii va aparea un inel violaceu.

Experienta 6. Reactia de euloare pent ru me ti ol li nt i (dupa Mack-Karty

si Sallivan).

Principiul si modul de lucru. La 5 ml solutie de metionina de 0,02% se

adauga prin agitare m al intai 1 m l s olu tie de hidroxid de sodiu de 14,3 N , apoi

0,3 m Isolutie proaspat pregatita de n itroprusid de sodi u de 0,I%. Amestec u I se

incalzeste timp de 10 min pe baia de apii la temperatura de 35-40°C. Apoi

eprubeta se raceste sub un jet de apa. rece timp de 2 minute si se adauga

prin agitare 5 ml de amestec de acid clorhidric si fosforic. Eprubeta se agita

I minutsi se raceste 10 minute. Apare a coloratie rosie-violeta,

Experienta 7. Reactia tie culoare pentru glicinii ireactia Timermany.

Principiul .,i modul de lueru. La 2 011solutie de glicina de 0,01 % la un

pH::: 8,0, obtinut prin adaugarea solutiei de 10% de hidroxid de sodiu, se adauga

0,.5mlsolutie de dialdehida o-ftalica, Amestecul imediat se coloreaza in verde-

aprins, Peste citeva minute apare un sediment de culoare verde.

Experienta 8. Reactia de culoare pentru prolinii.

Principiul metodei, Ninhidrina interactioneaza ell aminoacidul prolina.

Produsul de eondensare are 0coloratie galben-deschisa:

13



o

o

o+HNQ

COOH

Ninhidrina Prolina

o

'0 +CO,+H,O

o

Mod de Iucru, La 3 ml solutie de prolina de 0,01% se adauga citeva

picaturi solutie de ninhidrina de 1%ln acetona de 95%. Continutul eprubetei se

agita si se incalzeste pe baia de apa la temperatura de 70°C timp de 5

minute.

'Ierne pentru autopregattre

1.Obiectu 1bioch imiei -?iimportan ta eiin med ieina practica. Metode Iede

s tud iu b ioch imice .

2. Particularitatile materiei vii.

3. Prcprietatile generate ale biornoleculelor.

4. Rolul biologic a1proteinelor.

5. Structura si clasificarea aminoacizilor; tipul de legatura in moleeula

proteica.

6. Teoria polipeptidica a structurii proteinelor, esenta ei si dovezile

experimentale,

7. Notareasi citireaarninoacizilor In peptide si proteine. Aminoacizii «N»

si «C» terminali.

8. Principiul reactiilor de euloare ale proteineior si aminoacizilor.

14



Intrebiiri pentru autocontrol ~i situatii de problema

1 . Scrieti form u lele am inoacizilor care sunt deriv ati ai: a) acidului propi-

on I C ; b ) acid u lu i b utiric; c) acidu lu iv ale ria n ic . .

2 . S crie ti fo nn ule le a m in oa ciz i lo r: a ) n ep ola ri h id ro fo bi; b ) n ep ola ri h id ro fili;

c) am inoacizilor en proprietati aeid e sl b azice.

3 . S cr ie ti ~icititi tripeptidele: a) H is-Fen-Cis; b) T yr-Pro-A rg. Care din

reactiile de euloareefeetuate vor fi po zitiv e si eare n egativ e?

4. Scrieti tetrapeptida la care am inoaeidul N -term inal sa fie prezentat

prin T rp, iar C vterm inal - prin M et. C ititi peptida scrisa,

5. Scrieti eantitatea m axim a de tripeptide care pot f com puse din tre i

am inoaeizi indicati: G 1i,A la, Ser ~ ell conditia ea fieeare am inoaeid poate sa

oeupe orieare din cele trei pozitii : ; ; i e;'i fiecare arninoacid poate fi folosit

nurnai 0 singura data. (pentru scrierea peptidelor de folosit indicarea

prescurtata a arninoacizilor - prin trei litere) , D e exem plu, G li-A la-Ser; Ser-

G li~A la ; A la -A la -G li e tc .

6 . Se poate considers ca cornpusul eercetat es te 0 peptida, daca reactiacu ninhidrina este negativ e, iar reactia biuretica ~ p ozitiv a?

7. Reactia F0I cu lich idul b iolo g ic este pozitiva, Se poate af nna di

su bstan ta este 0. proteina?

8 . P u tem id en tifica p rezen ta am in oacizilo r liberi in so lu tie av in d la d isp ozi tie

nu rna ireacti v i pentru proba cu ninh id rina? M oti v ati raspunsu I.

9. C um se poate stabil i i nehei erea h idro Iizei proteine iCll a j u t or u I r ea cti e i

biuretice? Ce euloare va aparea ~ipe baza carui cam pus?

10. Ce m ediu se va crea la dizolvarea In ap a a u rm a to arelo r trip ep tid e:

a) A la-S er-C is; b) A rg -H is-L yz; c) G lu -C is-A sp ..S crieti g ru pele fu nction ale

a le r ad ic al j lor am inoacizi lor care determ ina pH - u 1m ed iu lui. in ce m ed iu se

v a afla punctul izoelectric al aces tor peptide?1 1. A m estecul de glicina, alanina, acid glutam ic, lizina, arginina ~ i serina

a fost supus electroforezei In pH 6 ,0 . R asp un deti la u rrn atoarele intrebari si

rnotivati raspunsul: Care din arninoacizi vor m igra spre eatod? Care spre

anod? Care vor ram ine la locul de start?

12 . in ce directie va rnigra histid ine supusa electroforezei la folosirea

so lu tiei tam p on ell d iferite v alo ri ale pll-ului: a) pH = 4,0. b) pH=12,0. Scrieti

fo rm lila a m i n oa eid I I I u isi m o tiv ati raspunsu I.

15



13. Scrieti 0 tripeptide at care i punct izoelectric se vaafla in mediu alcal in.

Motivati raspunsul,

14 . Sc ri et i 0 tr ip ep ti da (d e scris formulele aminoaeizilor) a l c are i p un ct

izoelectric se va afla in mediu acid.

TEMA 2

Structura chimica 'I,j rolul biologic al proteinelor

Experienta 1. Identificarea aminoacizilor prin metoda cromato-

grafie! pe hirtie.

Principiul metodei. Metoda se bazeaza pe diferenta coeficientului de

repartitie a aminoacizilor In apa si solvent organic (butanol), care nu se

arnesteca cu apa. Viteza migrarii aminoacizilor pe hirtie este direct

proportionala cu gradul de dizolvare in butanol.

Mod de lucru. Pe linia de start a henzii de hirtie cromatografica cu

ajutorul unui capilar se aplica 0picatura mica (diametrul nu mai mare de 5mm) de hidrolizat proteic sau amestec de arninoacizi. Dupa uscare la aer

(fixare) banda se introduce in vasul el l amestecul de apa-butanol, astfel,

incit lichidul sa ajunga numai pina la linia de start (2-3 mm). Cu ajutorul

dopului, banda se fixeaza vertical rara sa se atinga de peretii vasuiui. Dupa

1,5 ore de expunere la temperatura carnerei, banda se scoate din vas, se

noteaza cu un creion simplu hotarul solventului si se usuca In termostat (10

minute la temperatura de 70-IOO°C). Apoi banda se trece prin solutie de

ninhidrina 0, 1-0,2% ~idin nou se usuca 1ntermostat latemperatura de 100°C.

Pe cromatograma apar unele pete galbene sau violete localizate la diferite

distante de linia de start. Cu ajutorul riglei se masoarii urrnatoarele distante:

I. De 1alinia de start ptna la centrul fiecarei pete (a);2. De la Iinia de start pina lahotarul solventului (b)..Raportul dintre.distantele

parcurse de aminoacid (a) ~ide solvent (b) poarta den urnirea de coeficient de

repartitie (R), specific pentru fiecare aminoacid in conditii standard.

Importanta clinico-diagnostica. Metoda pennite detenn inarea calitativa

~j cantitati va a aminoacizi lor in 0biectele biologics ceea ce are 0 importan tildeosebita in studierea rnetabolismului proteic. in diferite afectiuni ale ficatului,

rinichilor ~ialtor organe se constata modificarea continutului aminoacizi lor

in serul sanguin.

16



Experienta 2. Reactia biureticii (Piotrovschiy.

P rincipiul metodei. Legaturi Ie pept id ice (-NH-CO-) al e proteinelor 'in

mediu alcalin reactioneaza cu CuS04fonnind cornpusi cornplecsi colorati In

ro~u-vjolet.

Mod de lucru, La 5 picaturi solutie de ovalburnina de 1% se adauga 5

picaturi solutie de NaOH de 10% ~i2 picaturi solutie de CuS04

de 1%.

Eprubeta se agita. Apare culoarea violeta,

Nota: fa concentratii majore in solutie ale histidinei, serinei,

treoninei, asparaginei reactia biureticd este pozitiva. Ceilalti aminoacizi

dau reactie negativa.

Experieuta 3. Reactia cu ninhidrinii.

Principiul metodei, Ninhidrina reactioneaza cu gruparile a-amino

ale prate inelor ~i am inoacizi lor cu formarea un ui compus co lorat in albastru-

v iolet. Sch em a reactiei:

ORO RI - t - - t20 ( } t = ? ' I

=::: 0 +H:2N- CH- COOI-i---- I = N - CHII II I

o 0 OOO~

Ninhidrina

Ca rezultat al reactiilor de transpozitie, decarboxilare, scindare si conden-

sare a produsului de reactie se obtine un campus complex colorat In

albastru-violet.

Mod de Iucru, La 5 picaturi de solutie

de proteina se adauga 5 picaturi solutie

ninhidrina de 0,.5%. Continutul eprubetei se

fierbel-2 minute. Apare 0 culoare roz-

violeta, care trece apoi in albastra,

Experienta 4. Reactia xantoproteicii (Mulder).

Principiul metodei. Aminoacizii aromatici la fierbere cu HN03

concentrat se supun nitrarii, Ca rezultat solutia capita 0 culoare galbena

care trece 'in oranj la adaugarea bazei, Schema reactiei:

O~ < = O ~ . ~-N= I

\I11·,4

o 0

633728VNI'JERSI~tE'" o .e STATD E MEOIC liiA $ 1 fA R" '''C IE

· "' ICOLAE TESTE lr o tl lI !ANU·

BIBLIOTECA



OH

¢

OB

NH2I

CH1-CH

ICOOH

+HN03

NH2I

CH2-CH

ICOOH

+t

Mod de Lucru. La S picaturi solutie de ovalburnina se adauga 3 picaturi

de HNO) concentrat. In urm a fierberii, continutul eprubetei se coloreaza In

galben. Daca dupa racire In eprubeta adaugam 10-1S picaturi solutie de

NaOH de 20%, culoarea solutiei devine oranj ca rezultat al obtinerii sarii de

sad iua d in i tro ti roz ine i,

NoM: reactie pozitiva dau compusii fenolici. Gelatina, salmina,

clupeina (prolamine) dau reactie negative, cauzata de abserua acizilor

aromatici.

Teme pentru autopregiitire

I. Niveluriie de organizare a rnoleculei proteice: structura primara,

secu ndara, terti ara ~i cuaternara. Legaturile spec ifice aces tor structuri.

Foldingulsi refoldingul proteinelor, Peptidele active.

2. Principiul metodelor de descifrare a structurii primare, secundare,

tertiare ~i cuaternare a moleculei proteiee.

3 . P ri nc ip iu l metodelor de descifrare a structurii primare a rnoleculei

proteice incepind de la aminoacidul: a) N-terminal; b) C-terminal ~i modul

de realizare,

4 . C la si f ic ar ea prate in e lor.

5. Prote ine Ie sirn pie, proprieta tile, particu laritati Ie structura Ie .6. Colagenul: particularitatile componentei aminoacidice si structurale.

7. Proteinele conjugate: nucleoproteidele, fosfoproteidele, lipoproteidele

s.a, Caracteristica generala,

8. Proteinele fixatoare de Ca2+.

-18



Intrebari pentru autocontrol si situatU de problema

L Care din am inoacizi participa la forrnarea legaturilor covalente in

autostructurarea gradului trei de organizare a m o lecule] proteice (structurii

tertiare )?

2. Cu care din rnetodele analitice folos ite la lucrarile de laborator se

poate descifra com ponenta am inoacida a proteinei? (T rebuie sa se tina cont

de faptul ca proteina pura trebuie obtinuta in prealabil si ca m etoda este

fo lo sita p en tru p rim a o ara).

3 . P ri nc ip iu l chirnic al m etodelor de descifrarea structurii prim are a

proteinelor incepind: a) de la arninoacidul N sterm inal; b) de la am inoacidul

C~en n inal ; c ) p ri 1 1 hidro Iiz a p re ala b iIiia p ro te ine i $ i d ete rm i na re a succesiu n ii

f ra gm ent el or po li pe pt id ic e in m olecula proteica si al am inoacizilor In lanturi.

TEMA 3

Proprietatlle fizico-chimice ale proteineior. Metodele de

separare, purificare ~i determinare ale proteinelor

Expertenta 1. Dializa protelnetor:

D ializa (din gr. dialisis ~ separare) se num este procesul de separare a

s u b s ta n te lo r rnacrorno leculare Ij i i so Iuti ilor colo idale de su bstante

m icrom o lecu lare ell ajutoru I m em branelor sem iperm e ab i Ie (celo fan ,

pergarnent, eolodiu s.a.), D in cauza diam etrului m are, m o leeulele proteice,

coloizii, substantele m acrom oleculare nu pot trece prin porii aeestor rnern-

b ran e, sp re d eo seb ire d e su bstan tele m icro m olecu lare si saruri,

Mod de lucru, I. jn tr~ un b alo n se toarna 20 ml solutio de ovalbumina

la care se adauga 20 picaturi solutie saturata de sulfat de am oniu

(NH4 ) 2S04'

2. Dintr-o fo ita de celofan urnezita In prealabil eu apa distilata, se

confectioneaza un saculet in care se toarna continutul balonului. Saculetul

seintroduce intr-un pahar eu apa disti lata ~ i se cufunda astfel ca n i velu I d e

lichid I II saculet sa fie m ai jos de n ivelul apei in pahar.

3 . P es te 0ora de la Inceputul dial izei, in doua epru bete se iau cite 1 m I d e

lichid din pahar si se efectueaza urm atoarele reactii: a) in una din eprubete

se identifica prezenta ionuiui de sulfat adaugind 3-4 picaturi de solutie de

BaCl2de 5% (dad reactia este pozitiva, se observe aparitia precipitatu iui

19



de BaS04 sub forma de tulbureala de culoare alba); b) In a doua eprubeta se

controleaza prezenta proteinei prin reactia biuretica.

4. Solutia din saculet se toarna intr-o eprubetii si se veri fica continutul ei

prin reactia biuretica, Ne convingem e a prin mernbranele semipermeabile treesubstantele micromoleculare (NH4)2S04 si nu pot trece proteinele. Dovada

servesc reactia pozitiva eu BaCl2In prima eprubeta ~ireactia negativa biuretica,

Experienta 2. Sedimentarea proteinelor;

Denaturarea proteineior (precipitarea ireversibila) se reduce la distrugerea

structurii rnoleculei proteice (in afara de structura primara), insorita . ; ; i de

p ierderea proprietati lor b iologice. La sed imentarea ireversi b iIa prate i neIesufera modificari profunde §i nu pot fisolubilizate din nou. Din reactiile de

s ed ir nen ta re i rev er s ib iJe ale protei nelor fac parte: prec ip itarea proteine lor cu

saruri!e metalelor grele, acizi minerali si organici, reactivele alcaloide,

precipitarea prin fierbere,

a . Precipitarea proteinelor en siirurile metalelor grele.

Precipitarea proteineior cu sarurile metalelor grele, spre deosebire de

salifiere, are loc la concentratii miei. i n reactie eu sarurile metalelor grele (Pb,Cu, Ag, Hg ~ial.) proteinele ab so rb a ces te m e ta le, formind c ompu si c omp l ec si

sal! substante saliforme, care nu se m ai solubilizeaza in prezenta excesului

acestor saruri (e u excep~iaAgK03 si HgCI), dar se dizolva in apii.Solubilizarea

precipitatului proteic in exces de sare poarta denumirea de peptizare

adsorbtivd. A ce st fe nom en se d ato rea za a pa ritie i s arc in ii ele ctric e p oz itiv e in

moleculele proteice. Capacitatea proteinelor de a lega trainic ionii metaleior

grele sub forma de precipitate in so lu bile s e fo lo se ste In p ra ctic a m e dic ala c a

an t idot In caz d e in to x icatie cu saruri Ie de m ercur, eu p ru, plum b s.a, D e obicei,

imediat dupa intoxicatie, pina cind s ar ur ile n -a u r eu sit sa se a bso arba , b o ln avu lu i

i se administreaza solutie proteica si se provoaca evacuarea (vornitarea) ell

seopul de a in latura tox ina din organism.

Mod de lucru, I n trei eprubete luarn cite 5 picaturi de solutie de

oval bum ina. I n prima adaugam 1-2 picaturi solutie de CuS04; In a doua- 2

picaturi de solutie de acetat de plumb; 'in a treia- 1-2 picaturi de solutie de

nitrat de argint. In toate eprubetele apare un precipitat, care nu se dizolva in

apii. Daca in pr i ma eprubeta m ai adaugarn 5-10 Picaturi de solutie de su Ifat

de cupru, precipitatul se dizolva, La adaugarea in eprubeta a treia a 5-10

picaturi de solutie de nitrat de argint precipitatu lou se solubilizeaza.

20



l

b, Precipitarea proteinelor cu acizi minerali.

Acizii minerali concentrati, cu exceptia acidului ortofosforic, provoaca

denaturarea proteinelor cu forrnarea de saruri cornplexe,

Mod de lucru, in doua eprubete luam cite 10 picaturi de acizi

concentrati . azotic si suIfurie. jnclinind eprubetele la 450, se toarna peperetii lor un volum egaJ de solutie proteica, evitind amestecarea lichidelor,

La hotarul de separate a lichidelor apare un precipitat alb amorfin

forma de inel. La adaugarea unui exces de acid in eprubetele respective

observam ca precipitatul 5e dizolva in acid sulfuric ~i nu se dizolva in

acid azotic.

Experienta 3.Separarea albuminelor slglobulinelor din ovalbumina.

Proteinele din solutii pot fi precipitate prin salifiere (eu sotutii de saruri

neutre asa ca sulfatul de arnoniu, clorura de sodiu s.a.), Salifierea este

un proces reversibi I.Mecani smul precipitari iproteinelor din solutii prin

sal ifiere se reduce la desh idratarea macrorno lecu Ie lor proteice s i

inlaturarea sarcinii electrice. Asupra vitezei de precipitate a proteinelorprin salifiere aetioneaza un sir de factori asa ca hidrofil itatea proteinei,

masa moleculara, sarcina electrica, de aceea sal ifierea diferitelor proteine

are loc In concentratii diferite de saruri. De ex ern plu , a lb um i nele se

precipita in solutie saturata de sulfat de amoniu, iar globu linele ~ in solutie

semisaturata de aceiasi sare,

Mod de lucru. La 20 picaturi de solutio de ovalbumina nediluata se

adauga 20 picaturi de solutie saturata de sulfat de amoniu. Se obtine a solutie

semisaturata de sulfat de amoniu in care se precipita gIobulinele din

ovalburnina, Dupa 5 minute continutul eprubetei se filtreaza (hirtia de filtru

se umezeste in prealabil eu apa distilata). Pe filtru se retine precipitatul de

globuline, iar in filtrat tree albuminele. Pentru sal ifierea albuminelor, la filrrat

se adauga cristale de sulfat de amoniu pina la saturatie (pina ce rata de

sulfat de amoniu nu se dizolva). Precipitatul aparut de albumine se filtreaza,

iar filtratul se verifica ell reactie biuretica, Reactia biuretica negative indica

lipsaproteinelor.

Exper ienfa 4. Separarea proteinelor prin metoda electroforeticii

pe hirtie.Principiul metodei. Directia migrari iprate inelor in cirnpul electric depinde

depl-l-ulmediului si proteinele, fiind eleetroliti arnfoteri, in mediul acid posed a

21



sarcina pozitiv a si se m i~ca spre catod, In med iu l bazic sunt incarcate negativ

si rnigreaza spre anod. Separarea proteinelor din semi sanguin se efectueaza

folosind solutie tampon de pH-uI8,6 -8,9. In cimpul electric continuu proteinele

serului sanguin, posedind sarcina electrica negative la acest pH, rnigreazape hirtia urnectata de solutia tampon spre anod cu 0viteza care depinde de

marimea sarcinii electrice ~i de masa molecularii a particulelor. Mal repede

migreaza fractia de albumine, apoi globulinele, care se separa in fractii: ai'

u2; j3 ~iinfinal y-globulinele.

Prin metoda electroforetica pe hirtie proteinele serului sanguin se separa

In 5-9 fractii care pot f evaluate procentual.

Mod de lucru. Pe linia de start a unei fisii de hirtie de electroforeza se

aplica proba de ser sanguin cercetat. Linia de start se afla aproape de catod,

deoarece folosirn soiutie tampon cu pH-ul bazic in care proteinele mauifesta

sarcina negativa ~ise vor rnisca spre anod. Timpul de expunere se apreciaza

experimental (fractiile proteice trebuie s a se separe, dar sa 11U dispara de pe

hirtia de electroforeza, trecind In solutie tampon). Fractiile proteice de pe

electroforegrama se fixeaza

prin uscare si dupa aceea se

"developeaza" (co Ioreaza)

folosind un colorant specific

pentru proteine,

Pentru a determine conti-

nutul procentual al fractiunilor

separate, electroforegrarna se

exam ineaza prin den s i-

tometria sau colorimetria

fiecarei fractiun i, Surnaextintiei tuturor fracti ilor se va

considera ea J 00%, iar

extintia fiecarei fractiuni va

indica continutul de proteme,

Expe rleuta 5. Deter-

minarea concentratiei de

proteinii totald fn . plasma(serul) sallguinii prin

metoda refractometricii. RefractometruIIRF-22.

22



Principiul metodei. Me toda r ef ra ct or ne tr ic a se bazeaza pe capacitatea

diferitelor m edii de a reflectain m od diferit razele de lum ina ce le strabat,

Raportu I d intre s in us ul u ng h iu lu ide ine iden !A ( sin a) aI ra ze i s i s in us ul u ng h iu lu i

de refractie (sin 1 3 ) poarta denum irea de indice de refractie:

N = sina / sin~

In dicele de refractie al so lu tiei d ep in de d e can titatea, m a rirn ea si stru ctura

flzica a particulelor dizolvate, precum si de tem peratura m ediului. I n s em i

sanguin indicele de refractie depinde in prim u ! rind de cantitatea si calitatea

p ro tein elo r, saru rilo r si a alter componente,

Indicele de refractie se determ ina eu ajutorul unui aparat special -

refracto m etru - rep rezen tat ill im aginea de m ai sus .

M od de lucru, Pe prism a de jos a cam erei (5) refractornetrului s e a p li ca

2~3 picaturi de plasm a sau ser care se acopera cu prism a de sus. in tre

p risrn e s e fo rm e aza u n strat d e so lu tie proteica, Cu a ju to ru l o glin zii, in dre pta m

raza d e lu m in a 1 1 1 g hiseu l cam e rei. U itind u-rre 'in o cu lar (I) si fo lo sin d m a neta

(3), in laturam culorile spectrului la Iiu ia de separare a cirnpului optic in 2

cam p uri: unullum inat si altul iu tunecat. Cu maneta (7) instalam punctul de

incrucisare a lin iilor care se observa ill cim pul optic la linia de separare a

cim pului. Indicele de refractie se cites te dupa scara din partea stinga a

cimpului,

Nota: S en sib ilita te a rn eto de i e ste d e 0 ,5 -1 ,0% , ia r e ro are a in lim ita de 1 0% .

Importanta clinico-diagnostica a metodei. Mi cs ora re a c on tin utu lu i

de proteine totale serice (hipoproteinernie) se observa in inanitie proteid ,

tulb urarea fu nctiei p ro tein -sin tetice a ficatu lu i, in u rm a p ierd erii p ro tein elo r

in hem oragii, exsudate m asive In cavitatile sero ase, in tu lbu rarea filtru lu i

re na l (n efro ze , a m i lo id oz e).

Cresterea COil tinutu J u i de protei nil (hiperprotei nem i a) se observa com pa-

ra t IV rar - in boala rn ielornatoasa, m acroglobu Iinem ie (ca rezu Itat al sin teze i

p ro te in elo r p ato lo gic e ~ p ara pro te in e), In e xc ita tia s is te m u l uie ti cu l oe ndo te l i al ,

In infectiisi intoxicatii, H iperproteinem ia relativa se observa In hem ocon-

centratie ca urrnare a pierderii apei (diaree, sudoratie intensa, poliurie,

combust i i ) .

23



Indicele de Concentratia Indicele de Concentratiarefractie proteineiin ser % refractie proteinei in ser, %

1,33705 0,63 1,34575 3,68

1,33743 0,86 1.34612 5,90

1,33781 1,08 1,34650 6,12

1,33820 1,30 1,34687 6,34

1,33858 1,52 1,34724 6,55

1,33896 1,74 1,34761 6,77

1,33934 1,96 1,34798 6,98

1,33972 2,18 1,34836 7,20

1,34000 2,40 1,34873 7,42

1,34048 2,62 1,34910 7,63

1,34086 2,84 1,34947 7,85

1,34124 3,06 1,34984 8,06

1,34162 3,28 1.,35021 8,28

1,34199 3,50 1,35058 8,49

1,34237 3,72 1,35095 8,711,34275 3,94 1,35132 8,92

1,34313 4,16 1,35169 9,14

1,34350 4,38 1,35205 9,35

1,34388 4,60 1,35242 9,57

1,34426 4,81 1,35279 9,78

1,34463 5,03 1,35316 9,99

1,34500

I5,25 1,35352 10,20

1,34537 5,47 1,35388 10,41

Experieuta 6. Determinarea absorbante! solu(iei proteice.

Principiul metodei, Solutiile proteice poseda absorbanta in limitele

spectru Ij uIravio let, determ iata d e p rezen fa restu rilor am inoac iz i lorfen ilalan ina, t irozina ~iri pto fan . Fenia lan i na ~iirozina au absorbanta m a xim a

la lung irn ea de unda280 om, iar triptofanul- 254 nm. Gradul de absorbanta

la lungimile de unda indicate este direct proportional continutului de

fen ila lan ina, t iroz ina ~itriptofan in rno lecula pro te inei .

Mod de lucru. Eta p a I. Pentru analiza se foloseste solutia fractiunii

globulinice a ovalbuminei, capatata dupa sedimentarea alburninelor in

experienta 3 de la tema 3 si purificata de sulfat de arnoniu prin dializa in

experienta 1 de la aceiasi tema,

24



Solutia data se toarna In cuva de 1 em si se fac masurari la

spectrofotometru I automat Specord UV -vis in zona ultravioleta a spectrului

(180~340 om). Dupa graficul obtinut se determina unitatile densitatii optice

D (absorbtiei Iurn j ne i) a so Iu tiei cercetate de gJobu I in a cores punzatoare

lungim ilor de unda de 254 ~i280 nmsi se com para datele obtinute. I n baza

rezultate lor in re gis tr ate s e trag concl uzii des p re rap ortu I f en ilalan i ne i, t ir oz in ei

s i t ri pt of anul ui I n g lobul in el e din ovalburnina.

Eta p a 2. Se deterrnina eantitatea de feuilalanina, tirozinasi triptofan

ell ajutorul reactiei Pauli si Adamkiewick-Hopkins, cum a fast descris to

experien tele 4 ~i5 (terna I). Dupa aparitia in ti mpu I reacti ilor date a colorati ei

spec ifice probele se colorimetreaza, Concentratia am inoacizi lo r f en ilalan ina,

tirozina si triptofanul se determine dupa graficul de calibrate,

Se determ ina raportul dintre concentratiile de fenilalaninii, tirozina ~i

triptofan ..Raportul obtinut se compara CLl raportul absorbtiei de la etapa 1.

Experienta 7. Determinarea punctului izoelectric;

Principiul metodei. Sarcina electrica a unei proteine in solutio este

d ete rm in ata de nu m aru 1 si grad u I de disoc iere al gru pari lor acide sa u bazice

a le am in oa ciz i lor din componenta ei . in functie d e p l-l-u Imedi ul u i, am inoacizi i

se comports ca acizi sau ca baze. In functie de mediu, au loe urmatoarele

reactii:

- in mediu acid:

+ . - +H3 N - CH - COO + H

I

R

+----I ..~ H3 N - CH - COOH

I

R

- in mediu alcalin:

H;N-CH~COO-+OH - ----1 .......2N-CH-COO+H20

I I

R R

Astfella trecerea curentului electric prin solutie, aminoacizii vor migra in

mediu acid spre catod, iar in mediu alcalin - spre anod, La 0anumita valoare

a pl-l-ului, migrarea in cimpul electric nu are loc, aminoacioul gasindu-se sub

25



forma de dipo!. In aceasta stare se exercita forte de atractie reciproca

intre gruparile - COO~~i~NH)+, AreJoe 0aglomerare a moleeulelor din

s ol ut io s i s ol ub il it at ea devine min ima . Valoarea pHi-ului la care migrarea

proteinelor sau a aminoaciziior intr-un cimp electric este nuia, poarta

denumirea de punct izoelectric (pHi). EI are valori diferite pentru fiecare

arninoacid sau proteina,

Acizii rnonoaminomonocarboxilici au pHi-ul injurul valorii 6,.deoarece

disocierea gruparii - COOH este mai mare decit a gruparii - NH2•

Acizii monoaminodiearboxilici (add aspartic ~iglutamic) au pHi-ul In

zona acida 3,O~3,2 datorita celor doua grupari carboxilice, pe cind eel

diaminomonocarboxilici au p l-li-u l situ at in mediu alcalin,

Reactivele: Solutie acetal de sodiu de 0,1 N; solutio acid acetic de 0,1 N;

solutie gelatins de !; alcool metilic.

Mod de lueru. Se iau 6 eprubete si in fiecare se adauga urmatoarele

solutii dupa cum este aratat 1 1 1 tabelul de la p. 28.Du pa adaugarea aico o lu l ui rneti I ic, epru bete Ie se ag ita ~ise 1asapen tru 0

ju m a ta te de ora. in eprubeta a 4-a apare 0 tulburea la intensa, Dec! in aceasta

eprubeta s-a realizat pHi, care este de 4,7,

Teme pentru autopregatire

I . P ro prietati Ie fizico -ch im ice ale proteinelor: m asa moJeeul ar a. s ol ub i Ii ta te a,

p ro p ri e tati Ie am fotere.

2. Proprietati le h idrofi le a le prote inelorin fun ctie de p articularitati Ie

structurale si aminoacizii constituienti,

3. Factori id e s ta biliz ar e II I s olu tie a su bs tan telo r co lo id ale .

4. Sarcina electrica a proteinelor. Punetul ~i starea izoelectrica,

5. D enaturarea proteinelor, agentii ce provoaca denaturarea,

Modificarile stru cturale ale proteinei Ia denaturare,

6. Coagu larea protei nelor. Factori i care prev i n coagularea. D e ce

denaturarea este deseori insotita de coagulare?

7. Starea s ol ut ii lo r c ol oi da le : sol, gel, xerogel. Exemple ,

8. Metodele de studiere a cornponentei C~ litative si cantitative a proteinelor:

a) hidroliza; b) cromatografia; c) electroforeza; d) salifierea; e) dializa.

26



Reactivii care se Numarul eprubetelor:

adauga (ml) 1 2 3 4 5 6

Acetat de sodiu

de 0,1 N 2 2 2 2 2 1,2

Acid acetic de 0,1 N 0,25 0,5 1 2 4 4,8

Apa distilata 3,75 3,5 3 2 - -Gelatina 2 2 2 2 2 2

plli-ul ce se obtine 5,6 5,3 5,0 4,7 4,4 4,1

Alcool metilic 8 8 8 8 8 8

Tulbureala ++ +++

Intrebar] pentru autocontrol ~isituatii de problema

1. Aveti la dispozitie un sir de eprubete cu solutii colcidale. Cum se poate

identifiea in care din eprubete se contine proteina ~iin care alte substantecoloidale?

2. Cum expl icari faptul di lntr-un mediu putemic bazic sau acid proteinele

se denatureaza dar nu se precipita?

3. De ce unele produse infectate sau toxice pot fi folosite In alimentatie

dupa 0 expunere termica (fierbere), iar altele nu? Motivati raspunsul,

4. Proteins se precipita [a adaugarea etanolului. Precipitatul maxim se

observa In eprubeta cu pl-I-ul 9, I. Care aminoacizi predornina 111

componenta proteinei?

5. Cum se poate separa din arnestec prote ina eu punctul izoelectri c CUll0SCUt

avind la dispozitie acizi, baze, saruri, etanol?

6. Ce transforrnari sufera molecula proteid. la: ajhidroliza; b) salifiere;

c) denaturare. Care niveluri de structura se modifica si care din aeeste

procese sunt reversibi!e ~icare ireversibile?

7. Cum explicati actiunea denaturauta asupra proteinelor a:

a) alcoolului etilic;

b) aceton ei, saru ri lor neutre, iod ului?

8. De ce punctul izoelectric a] majoritati: proteinelor se gaseste intr-un

mediu slab acid (pl-l t= 4,5-6,0), iar a protarninelor si histonelor -Ill

mediu slab alcalin?

\27



9. Spre care electrod vor migra histonele (Iinia de start se afla la mijlocul

benzei electroforetice) cind vom foiosi solutiile tampon cu: a) pll= 4,0

b) pH = 9,0? Motivati raspunsul,

10. Cum putem trece solutia coloidala din gel In sol si invers? Motivati

raspunsul.

11. Ce numim xerogel? Enurnerati exemple de xerogel.

12. Princ i p iu 1 metodei de secare I iofi I f \ : a so lutii lor c olo id ale ; u ti Iiz ar ea a ce ste i

metode in industria medicalasi econornia nationala. Prioritatea acestei

metode la prepararea medicamentelor de origiue proteica.

13. Cu ajutorui carer metode este posibi IiIsepararea solutiilor proteice de

subst an te le m icro rno lecu la re? Care din aceste metode au fost folosite

la lu cra ri Ie d e la bo ra to r ~iin ce consta principiul lor?

l4 . C a lc ula ti masa rnoleculara a proteinei daca se stie c a ea contine 0,34%fier cu rnasa atornica de 56,0.

15. Calculati masa moleculara a proteinei care contine 0,6% triptofan cu

masa moleculara de 204.16. Argumentati biologic ~ibiochimic prelucrareacimpuJui pentru operatiisi

in je ctii e ll alcool etilic, solutie de iod.

17. Argumentati u ti Iiz ar ea p ro te in el or l ap te lu is i o ua lo r ln intoxicatiile el l saruri

ale metalelor grele,

J



Partea a II~a. Enzimele

Enzimele (sau fermentii) sunt catalizatori biologic] de natura proteid care

In anum ite condi tii accelereaza reacti ile ch imice atit in tesutu riIeorgan ism uIUI,

cit si in exteriorul lui,

Dupa structura chimica, enzirnele sunt proteine simple sau conjugate,

Enzimele - proteine simple se mai nurnesc rnonocomponente, Din aceasta

grupa fac parte hidrolazele: pepsina, tripsina, lipaza, amilaza, zaharaza s, a.

Enzimele - proteine conjugate, mai poarm denumirea de bicomponente,

deoarece constau din doua componente: partea proteica - apoenzima si

partea neproteica - coenzimd. Multe eoenzime (TOP, NAD, FAD, CoA~i

al.) sunt derivati ai vitarninelor, Coenzime pot fisi unii ioni rnetalici (Ca, ZI1,

Mn, Mo s, a.),

La interactiunea cu substratul nu participa lntreaga rnolecula de enzima,

ci numai un anum it sector al ei - centrul activ. El asigura contactul ~i

transforrnarile ulterioare ale substratului si este format din diferite gruparifunctionale: 0 H, SH, inel ulim idazo Iic ~.a, r n co mpon enta centrul uiactiv alenzimelor bicomponente pot intra si coenzimele, ionii metalelor,

Multe enzime pe liuga centrul activ, poseda ~i centrul alosteric sau

centrul de reg/are, Substantele care se cornbina cu centrul alosteric al

enzirneisi rnodifica activitatea ei poarta denumirea de efectori alosterici

(inhibitori sau activatori), Sub actiunea efectorilor se mod ifica configuratia

moleculei de enzima si simultan conformatia centrului achy, care la rindul

sal! poseda proprietatea de a reactiona cu substratul, Deci efectorii alosterici

realizeaza regiarea metabolismului.

Actualmente sunt cunoscutecirca 2000 de enzirne. Conform cfasificarii

un ice mond iaJe, enz irn ele se 1mpart in sase c lase: oxidored uctaze,transferaze, hidrolaze, liaze, izomerazesi ligaze sau sintetaze. Denumirea

clase lor prov ine de la tipu I reacti ilor catal izate de enzime Ie cores punzatoare,

Fiecare enzima este nurnerotata printr-un cod constituit din patru cifre,

separate prin punct si dispuse conform urmatoarelor principii: prima cifra

indica clasa, a doua - subclasa, a treia - subsubclasa, a patra - numarul de

serie al enzimei 'in subsubclasa. De exernplu, succi natdeh idrogenaza prezinta

nurnarul de cod EC 1.3.99,1., aspartatam inotransferaza - EC 2,6.6,1.1,

lipaza - EC 3..1.1.3,

29



U nele en zirne au citev a fo rm e m o lecu lare, fo rrn in d asa-n urn itele izo en zim e

sau izo zirn e. Izo zim e le poseda 0 specificitate identica, dar se deosebesc

dupa proprietatile fizi co-ch im ice §i im uno logice ca rezu Iat al une i d eose bi ri

In cornponenta arninoacidica a apoenzim ei.lzoform e au astfel de enzim e ca

lactatdeh idrogenaza, m a l atdeh idrogen aza, creatink inaza s. a., in to tal circa

100 de enzirne. Raportul dintre form ele deizozim e in tesuturi depinde de

virsta, starea fiz io lo gic a a o rg an is m u lu i s. a.

Enzirne Ie , in cal itate de catal izatori bio 1 0 g ici, p osed a an u m ite prop rieta ti

si anum e: a) activ itate catalitica m are; b) specificitate; c) term olabilitate; d)

dependenta activ itatii enzim ei de pH ; e) m odificarea activ itatii in prezenta

activ ato rilo r si in hib ito riJo r. P ro prietatile en zirn elo r en um e rate m a i su s in dica

n atu ra p roteica a en zim e lo r.

In tr uc at in te su tu ri ~ilic hid ele b io lo gic e a le o rg an is m u lu i e nz irn ele s e c on tin

in concentratii m ici determ inarea lor este dificila, Pentru evidentierea lor

sunt folosite de obicei m etode indirecte, Prezenta §i activ itatea enzim ei se

apreciaza dupa actiunea efectuata de enzim a, adica dupa concentratia

produselor de reactie, Prezenta si activ itatea lipazei se apreciaza dupa

cantitatea de acizi grasi liberi obtinuti ca rezultat al sciudarii grasirn ilor; a

am ilazei (sanguine, urinare) - dupa cantitatea de am idon scindata lntr-o

anum ita perioada de tim p .

V ite za re ac tie i e nzirn atic e d ep in de d e ra po rtu [ d in tre c on ce ntra ti iI e enz im e i

s i substra tului, In c on diti i n orm a le , i n r ne diu l e xt ra ce lu la r, s in ge , lic hi de b io lo gi ce

enzim ele se contin II I c an tit ati m i c i.

In d if er it e s ta ri p ato lo gic e, ill u rr na l ez ar ii o rg an elo r ~ic el ul el or , c ont in u tu l

in tracelular ajunge in singe §i alte lichide biologice provocind cresterea

continutului de enzim e. M odificarea activ itatii enzim atice din Singe §i alteIichide biologice serv este ca ind icator im p ortant In d iagnosticu Ibolilor ~ise

foloseste pe larg in rnedicina practica,



TEMA 4

Natura chimica ~i structura enzimelor.

Mecanismul actiuuii enzimatice. Clasificarea enzimelor.

Vitaminele in ealitate de coenzime

Exper-ienta 1. Demonstrarea prezentei legiiturllor peptidice in

molecula enzlmei tripsina.

Se realizeaza prin intermediul reactiei biuretice, Principiul metodei simersul

iucrarii este descris In lucrarea practica 2, experienta 2.

Experieuta 2. Demonstrarea prezentei aminoacizilor in molecula

enzimei tripsina.

Se efectueaza prin intermediul reactiilor ninhidrinice, xantoproteice ~i

reactiei Fol, Principiul metodei ~i rnersul lucrarii sunt descrise In lucrarea

practice I ,experienta 1 si In Iucrarea practica 2, experienta 3 si 4.

Experienta 3. Identificarea vitaminei BJcu ajutorul diazoreactiei.

Vitamina B]contine inelu I pirimidinic ~itiazolic si este numita tiarn ina,deoarece contine sulf si gruparea amino. Daca hidrogenul din grupa alcoolica

primara este substituit cu restul de pirofosfat (difosfat), atunci se obtine

tiaminpirofosfat (TPP) sau tiamindifosfat (TOP) care servesc drept

coenzima. Aceasta coenzima se sintetizeaza in ficat in urma transferului

restului de pirofosfat (difosfat) de la ATP, In alte tesuturi de la TTP. TPP

(TOP) participa la reactiile de decarboxilare a o-cetoaciailor si in reactia

transcetolazica fiind partea structurala a enzimelor care participa la

metabolismul glucidelor.

Carenta de vitamina B] in alimente provoaca dereglari ale sistemului

nervos periferic cunoscute sub denumirea de beri-beri sau polinevrita, i nacest caz in organism creste concentratia de acid piruvic si alti o-cetoacizi.

Principiul metodei. Tiamina in rnediu alcalin formeaza cu diazoreactivul

un compus complex de culoare oranj.

Mod de lucru. La 5 picaturi de diazoreactiv, care consta din volume

egale de solutie de acid sulfanilic de 1% si solutie de nitrit de sodiu de 5%,

se adauga 1-2 picaturi solutie de tiam ina de 5%. [nclinind eprubeta se picura

atent pe peretii ei 5-7 picaturi de bicarbonat de sodiu de 10%. La hotarul

dintre lichide apare un inel colorat in oranj.

Experfenta 4. Identificarea vitaminei B1,

31



V itam inaB j, sau rib oflav ine, consta.d in inelul izoalox azin ic si p olialcoo lu l

ri b i to [. E a este partea com ponenta a gru pari i ro stetice a en zim e lor flay inice

(flav op rotein elor), partcipin d la sinteza flav inad en ind in ucleo tid ulu i (F AD ) ~ i

flavinrnononucleotidului (FIvJN ). Flav oproteinele participa la reactiile de

d eh id ro ge na re (s cin da re a p ro to nilo r !ji electronilor de [a anum ite substrate -substante care se ox ideaza si servesc ca donatori de hidrogen). Aceste

enzirne participa la ox idarea D -am inoacizilor, acizilor grasi, N AD H, ill

oxidarea biologica s. a.

A ctiunea biologics a enzirnelor flav inice depinde de prezenta legaturilor

d ub Ie In in elu I iz oa lo xa zin ic : f la v in en zi rna ru pe de la m o lecu la care se o xideaza

do ielectron i ~i d oi p ro to n i,un in d u - i l a a tom iide azot leg ati prin legatu ri du ble.

i1 carenta de v i tam ina B2 po ate a p area cataracta (tu Ibu rarea cristal inu l ui )

si alte dereglari,

Principiul metodei, Forma oxidata a vitarninei B2 reprezinta 0 substanta

care [a iradiere cu raze u ltrav io lete d ol0flu ores cen ta d e cu lo are g alb en a. R ea ctia

d e id en tifica re a v ita m in ei B 2 este bazata pe proprietatea ei de a se reduce usor,

In form a ox idata v itam in a B2 ar e 0 culoare galbena, iar la inceputul reactiei de

redu cere d a 0 culoare roza (se obtin deriv ati in term ediari) care in cele din urm a

se decoloreaza, deoarece form a redusa a vitarninei 82e st e i nc o lo ra .

Reactia decurge conform schem ei:

R

IR x x NN 0. Ir+zn.

R ""- I~NH +2HCI

oR

IR N NH 0

+zn •.·YY J ( ; I . .'1+ZnCI,+2HCI R~ NH

NH .

o

32



Mod de lucru. jn tr~o eprubeta se iau 10 picaturi de solutie de v itam ins

82, se adauga 5 picaturi de acid clorhidric concentrat si 0 granula de zinc

m e talic. S e o bserv a d egajarea bu lelo r d e h idrog en , Iich id ul galb en s e co lo reaza

treptat In roz, dupa . ce se decoloreaza.

Experienta 5. Identificarea vitaminei PP.V itarnina PP (din

ital, pelagre ~ preven-

tive) este un deriv at aJ

iuelului piridinic. A cti-

v i ta te an tipelagroasa , I II

a fa ra d e a cid ul n ic oti nic ,

poseda si arnida lui.

N

Vitamina PP Am ida v itam inei PP

in organismul uman

~ianim al, v itam ina PP se afla in form a conjugata cu proteinele, Dill vi tamina

pp se obtin doua coenzim e - nicotinam idadenindinucleotida (NAD ) ~i

n ic ot lo am id ad en in d in uc Ie otid fo sf at (NAD P). A eestea su n t eoenzi m e ale

d eh id ro g en az elo r ca re p artie i p a . la m u Iti p I e reac ti ie ox ide- red ucere, N A 0+

~iNAD P+ ad itio neaza electro ni ~iprotoni de la substratele care se ox ideaza,

Electronii ~ip ro to nii, a dit io nin du -s e l aNAD+ ~iNADP+ , re du c in elu l p irid in ic ,

Careuta de v itarnina PP in alim ente provoaca boala pelagra,

Principiul metodei ~imodul de lucru. lntr-o eprubeta s e iau 20 p icatu ri

de solutio de v itarnina PP se agita ~ise incalzeste pina la fierbere; ca rezultat

d ispare tulbureala si solutia dev ine transparentli. Se agita solutia de acetat

de cupru de 5% si se adauga 20 picaturi la solutie fierbinte de v itam ins PP.

E prubeta se Incalze~te din nou pina la fierbere si dupa aceea se raceste intr-

un jet de apa rece. La fundul eprubetei se depune un preclpitat de culoare

albastra de sare de cupru a acidului nicotin ic.

Experientati. Identificarea vitaminei B6.

D in g ru pul v itam inei B 6 f ac p ar te p ir id ox o lu l, piridoxal ~ipir idoxamina ,

derivati ai p irid inei care poarta denum irea general a de piridoxina, A ceste

trei substante poseda activ itate de v itam ina B6.

33



~o

RO-HzC H

H 3

Piridoxel Piridoxal Piridoxamina

In organ ism , fiecare d i n acesti com pusi poate fi f os fo ri la t e u p ar ti ci pa re a

A TP eu form ar e de eoenzim e ~ fosfopiridoxalulsi fosfop iridoxam ina. Aceste

coenz ime r ep re zint a com ponente ale enzirne lo r c ar e p ar tic i p a la rnetabo Iism u I

proteic (reactiile de transaminare ~id ec arb ox ila re a a m in oa eiz iio r, reactiile

d e d es ulfu rare si d ehid ratare a am i no acizilor, reactiile de sinteza a vi taminei

PP din trip tofan ~ . a ..)

I n c ar en ta de vitamins B~ In alirn en te, la anirnale se observa tulburarea

m etabolism ului proteic; la oam eni carenta de vi tamina B 6 se observa rar.

Principiul rnetodei, Vitamina B6, reactionind cuclorura de fier,forrneaza 0 sare cornplexa de t ipul fenolatului de fier de culoare rosie.

Mod de Iucru, La 5 picaturi solutie de vitarnina B 6 de 1% se adauga un

velum egal solutie de clorura de fier de 1%. Ames tecu l se agite. Apare 0

coloratie rosie,


1 . N otiune despre enzim e, natura chim ica si rolul biologic al enzim elcr.

Deoseb iri le d intre actiunea enzi m el or ~ic ata l i za to ri l or nebio l og le i,

2 , D ov ezile n atu rii p ro teiee a en zim e lor. S tru ctu ra en zim e lo r. P ro en zirn ele

(zim o genii) . N otiune despre centrul aetiv si centrul alosteric al enzim e lor,

3, lzoenzirnelesi rolul lor.4 , C o fa eto ri i e nz im e l or , Coenzirnele s i io nii m e ta lic i, F un ctiile d e c oe nz im e

a le v itam i ne Jo r s i m i cr oe lem e nte lo r.

5, N atura chim ica (s truetura) a v itam inelor BI' B2, B

6, P P C oA , bio tin a,

acidul folic si ro lul Ior ea coenzim e.

6. M ecanism ul de actiune al enzimelor, C entrul activ al enzim elor si ro lul

lu i in form area si transform area com plecsilor in term ediari d intre enzim a ~i

su bstrat. R olu! m o dificarilo r co nfo rm a tio nale recip ro ee ale m o lecu lei en zirn ei

si substratului la favorizarea catalizei (reactiei),

34



7. Nomenclatura (denumirea) si clasificarea enzimelor. Caracteristica

generals a claselor si subclaselor principale de enzime. Numaru l de cod a!

enz 1 1 1 1 e 1.

intrebari pentru autocontrol si situatii de problema

I. Prin care experienta ~i pe exernplul carei enzime a fast demon strata la

lucrarile de laborator: a) natura proteid ..a enzirnelor; b) deosebirea In

a ct iu n ea e nz ir ne lo r ~icatal izatori lor nebiologici,

2. Care este rolul vitaminelor In metabolism ~i activitatea vitala a orga-

nismelor?

3 . Ce m o dificari m etabolice ilustreaza starile de h i po - ~iavitaminoze?

4. Centrele active pot fi separate din enzirne? Mo tiv ati ra sp un su l,

5. Care-s deosebirile in cornponenta centrelor active ale enzimelor simple

(monocomponente) §i a celor conjugate?

6. Toate enzimele poseda centre alosterice? Ce denumire mai poarta aceste

enzime? Care este rnecanismul lor de reglare?7. Determinati clasa, subclasa si subsubclasa urrnatoarelor enzime: a)

arnilazei; b) pepsinei; c) lipazei.

8 . Scrieti nomenclatura (denumirea) claselor de enzime s i sernnala t i ordinea

claselor con form Com isie i in tern atio na le p en tru en zi me din cadrul I .U .B .

(EC).

TEMA 5

Influenta factorilor de rnediu asupra activitatii enzimatice,

Determinarea activitati! enzimatiee, Efectorii enzimatici

Experienta 1. Inhibisia competitivii (concurenui) a enzimelor (pe

exempt ul succinatdeh idrogenazei),

Principiul metodei. Succinatdehidrogenaza (SDH) (EC I.J.99.2.)

catalizeaza oxidarea (dehidrogenarea) acidului succinic ~itransformarea lui

in acid fumaric. FAD~ul serveste ca coenzirna a SDH. Dupa natura chimica

aceasta enzirna face parte din grupa metaloflavoproteidelor, Activitatea ei

depinde de prezenta in components centrului activ a gruparilor sulfhidrile

libere ~SH ~ia ionilor de Fe?".

Ca sursa de enzirna este folosit omogenatul tesutului muscular spalat in

prealabil, "in care SDH este strins legata ca cornponenta structurale a

35



mem brane i interne a m itocond ri ilor cel u lare. Acti unea enzi mei se

determina in conditii anaerobe prin adaugarea solutiei de acid succinic

ca substrat, albastrului de metilen sau 2,6-diclorfenol-indofenolului ca

acceptori de hidrogen, care, reducindu-se, se transforma In leucoforma

incolora,Reactia decurge conform schemei:

Etapa I. :

COOH

ICH2

ICH2

ICOOH

+ SDH,FAD - dependenta ---l~triturat muscular

COOH

ICH

IICH

ICOOH

+ FAD . H2

acidul

SUCCinIC

acidul

fumaric

Etapa II:

FAD· H2 + acceptor de hidrogen

(albastru de metilen sau • FAD

2,6-d ic lorfeno lin dofeno I,

+ acceptorul de hidrogen

redus, leucoforma, incolora

forma oxidata, colorata)

Decolorarea amestecului (enzima, substrat si acceptor) serveste ca

dovada a activitatii SDH. Inhibitor competitiv al SDH este acidul malonic

HOOC-CH2-COOH, analogul structural al acidului succinic ..Mecanismul

de iuhibitie se explica prin aceea, c a centrul activ al SD H se combina

rnai activcu acidul malonic continut lntr-o concentratie mai mare, darcare nu se oxideaza ~isimultan impiedica interactiunea enzimei specifice

CLl substratul respectiv. De aceea, daca 'in eprubeta, in care pe Iinga

r ea ctiv ii c on tin uti in eprubeta de experienta se adauga acidul malonic,

lichidul nu se decoloreaza (reactia de oxido-reducere este blocata, nu

enzima).

Mod de lucru, Un gram de tesut muscular se marunteste cu

foarfecele si se tritureaza in mojar timp de 1 minut cu 0 cantitate mica

de apa (2-3 ml). Trituratul muscular se transfera apoi pe un strat dublu

36

r



de tifon instalat pe pilnie ~ise spala cu 15-20 ml de apa, Tifonul ell

triturat se stoarce, iar trituratul se transfera pe hirtie de filtru ~j se

usuca , 1113 epru bete se m asoara c He 3 m Id e so Iu tie tam po n fos fat

(pH=7,4) .. in fiecare eprubeta se introduc aproximativ cite 0, I g de

triturat muscular (uscat in prealabi l pe hirtie de filtru). Dupa aceasta,

in prima eprubeta (de experienta) se adauga 5 picaturi solutie de acid

succinic de 3% ~i 5 picatur i so lutie de NaOH de 0,1 N (peutru

neutralizare), in eprubeta a doua (de control) se adauga 10 picaturi de

ap a d isti lata; in eprubeta a tre ia - 5 picaturi solutie de acid succ in ic de

3%, 5 picaturi solutie de acid malonic de 3% ~i5 picaturi solutie de

NaOH de 0,1 N. Apoi In toate epru betele se adauga cite 1 m I sol utie

de 2, 6-d ic Iorfen 0Iindofeno Ide 0,00 I N. Epru betele se ag ita ~ise introd uc

In te rrno sta t s au baia de apa la temperatura de 37°C pentru 40 de minute,

D upa expirarea tim pu lui, se observa c a lichidul din prima eprubeta (de

experienta) se decoloreaza partial. Se com para coloratia prirnei eprubetecu eprubeta a doua (de control), in care se contine numai enzi rna, ~i

eprubeta a treia care contine enzirna, substrat, inhibitorul si acceptorul

de hidrogen.

Trageti concluzii referltor la rezultatele obtinute.

Experienta 2. Studierea propriettitiior generate tile enzimelor

(spe cificita tea, termolabilitatea) pe exemplul succinatdehidrogenazei.

Principiul metodei: Ramine acelasi casi in experienta l.

a) Specificitatea

Mod de lucru, in trei eprubete se introduc cite 2 ml de homogenat

muscular si se adauga: in J- 0,4 ml de apa distilata, in a IJ-a- 0,2 ml solutiede malat de 1% si 0,2 ml de apa distilata, In a III-a - 0,4 ml solutie de malat

de 1%. in toate trei eprubete se adauga cite 1ml solutie de acid succin ic de

1%, 2-3 picaturi solutie de albastru de metilen de 1% ~idupa agitare cite 3-

4 picaturi de ulei de vazelina conform tabelului.

Eprubetele se introduc In baia de apii la temperatura de 38°C. Peste 5-

10m in ute epru bete 1e se scot ~ise 0bserv it sch imbarea culorii,

37



Continutul eprubetelorNumarul eprubetei

I II T I lHomogenat muscular 2ml 2ml 2ml

!

Apa distilata 1 ml - -

Solutio de malat de 1% - 1 mlSolutie de succinat de 1% - 1ml -Solutie de albastru de meti Jen

de 1% 3 picaturi 3 picaturi 3 picaturi

Ulei de vazelina 3 picaturi 3 picaturi 3 picaturi

Rezultatele experientei se introduc in tabel si se trag concluziile necesare,

Nurn aru l e prub ete i

Sehimbarea culorii I I II I III

I Ib) Termolabilitatea succinatdehidrogenazeiPrincipiul mctodei. Metoda se bazeaza pe reducerea ferocianurii de

potasiu (KJFe(CN)6])' care are 0 euloare galbena, pina [a (K4[Fe(CN)6])'

care este incolor, de catre succinat in prezenta succinatdehidrogenazei.

Activitatea enzimei este proportionala cu cantitatea de ferocianura redusa,

Reactia are loe dupa urmatoarea schema:

Succinat + 2[Fe(CN)J]· ~~--1"' ' ' fumara! + 2.W +2[Fe(CN)6J4.

Mod de lucru. in eprubete de centrifugat se introduc cite 1ml de solutie

tampon fosfat 0, I M pH 7,4 .']i 0, t m I de solujji de acid succin ic, EDTA,

azotura de sod iu si apa d isti lata. La probe se adauga cite 0,.5 ml de suspensie

de m itocondri i,obtin utii din te su tu l c erc etat, s i se la sa Ia temperatura camerei

ti InP de 5 m j nute pentru innibarea c itocromoxidazei de catre azi d I I I de sod ill.

Pentru declansarea reactiei se adauga 0,1 rn] solutie de ferocianura de

potas ill. Probel e se incu beaza 10- 15 m j nute la tem peratu ra de J 0", 200 300,

40° ~i s o n c . Dupa incubate, reactia este stopatii prin cufundarea probelor in

gheate si adaugarea a cite 2 ml de acid tricloracetic de 20%. I n probele de

control, care contin toate componentele amestecului de incubate, acidul

tricloracetic se adauga inaintea suspensiei de m itocondrii. Astfel, in probele

de control succinatdehidrogenaza este complet denaturata din momentul

38



inceperii incubarii d in care cauza reducerea specifica a ferocianuri id e c atr e

succinat nu ar e loc.

D upa stoparea reactiei ~ i r acire, probele se centrifugheaza [a 2000 turati i

pe rn in ut tirn p de IS m inute pentru sedimentarea completa a p rot ei ne lo r

mitocondriale denaturate. Probele se fotornetreaza la spectrofotornetru(!ungim ea de unda 420 nm) contra probei de control.

A ctiv itatea enzirnei se determ ina conform curbei de calibrare,

jn baza dateJor obtin ute se constru ieste graftcu [ d e cal ibrare a dependen tei

ac t iv itati isuce in a tdeh idrogenaze i de tem perature ~i se trag concl uz i i.

Experienta 3. Actiunea pH-ului asupra activitii{ii succinatdehidro-

genazei.

Mod de lucru: I n 3 eprubete de centrifugat se introduc cite 1 m l solutie

ta m po n fo sfa t cu pH 5,5; pH 7,4 si pH 9,18 ; 0,1 m ! solutii deacid succinic,

EDTA , azid de sodiu ~ i apa distilata, La probe se adauga cite 0,5 m l de

s usp en sie d e m itoco nd rii, o btin uta d in tesu tu l cercetat, si p ro bele s e in cu beaza

la tempera tura camere i tim p de 5 m in ute p en tru inhibarea citocrornoxidazeicu azid de sodiu ..Reactia se declanseaza prin adaugarea a 0,1 m! solutie de

ferocianura de potasiu . Probe Ie se incubeaza 10·15 m inute ia tem peratura

de 3JoC.

D upa incubare, reactia este stopata prin cufundarea probelor 1 1 1 gheata si

adaugarea a cite 2 m l acid tricloracetic de 20% . In probele de control, care

contin toate com ponentele arnestecului de incubare, acidul tricloracetic se

ad au ga inain tea su sp en siei d e m i to co nd ri i. i n a sa f el , s u cc in a td eh id rog en az a

in probele de control din momen tu l inceperi i incubarii este compie t denaturata

~ireducerea specifica a fe roc ianu ri i de catre succinat nu are lac.

D upa stoparea reactie i §irae ire, probe Ie se centri fu gheaza la 2000 turati i

pe rninut tim p de 15 m inute pentru sedim entarea cornpleta a proteinelorm i to c o nd ria le denatura teo Pro be 1e se fotom etreaza Ia spectrofoto In etru

(lungirnea de unda 420 n m ) co ntra probei de cont ro l.

A ctiv itatea enzim ei se determ ina conform curbei de calibrare.

In baza rezultatelor obtinute se construieste graficul de ealibrare a

d ep en de nte i a cti vitati isu ccin atdeh id ro gen azei d e p l-l- u I r ned illIII i,

39




I.Proprietati Ie genera le ale enzirnelor (termolabilitatea, specificitatea),

actiunea pl-l-ului asupra activitati ienzimatice,

2. Activareasi inhibarea enzimelor:a) mecanismele de activare (proteoliza partiala, activarea alosterica,

autostructurarea cuaternara, fosforilarea §i defosforilarea, reactivarea),

b) mecanismele de inhibitie (specificasi nespecifica, reversibila si

ireversibila, alosterica ~icompetitiva),

3 . Organ izarea enzime lor In ce I u I a (an sam b I u rile enz imati ce,

compartimentalizarea). Reglarea activitatii enzimatice in celula.Importanta

principiului de retroinhibitie,

4 . Deosebirile til corn ponenta enzim atica a organelor §i tesuturilor, Enzimele

organospecifice. Modificarea activitatii enzimatice in diferite afectiuni

(enzimod iagnosticu I).

S. Metodele de obtinere ~i purificare ale enzimelor. Cromatografia de

afinitate.

6. Utilizarea enzimelor in practica medicala. intrebuintarea enzimelor

im o b iliz ate in m e d ic in a,

7. Unitatile de activitate ale enzimelor.

8. Metodele de deterrninare a activitati i enzimelor.

intrebari pentru autoeontrolsi situatie de problema

1. Cum putem demonstra ca speci fie itatea enzimelor este determ inata

de partea proteica (apoenzirna)? E xem p lificati raspunsul.

2. Cum se exp 1ie a varietatea spectrelor izoenzi matice a led ierite lor

organe?

3 . N u m ii ca l I e ~ii puri Ie d e a ctiv ar e ~iinh i bare aJe enzirnel or.

4. Cu care experienta si pe exemplul carei enzime a fost dernon strata la

lucrarile practice; a) actiunea ternperaturii ~ipll-ului a su pr a a ctiv ita tii

enzimatice; b) spec ific itatea actiun iienzimatice; c) inh ibitia com petiti vii

(concurenta)? Pri nc ipiu1acestor Iucrari, reacti ile ~imetabo Iitii, dupa care se

apreciaza actiunea enzimelor,

40



5. Care din metodele de separare si purificare ale enzimelor este mai

rapida, monoetapica ~i mai economics? Denumirea si principiul acestei

metode.

6. in ce consta irnportanta cliniea a determ inarii activitati ienzime lor in

lichidele biologice? In patologie are loc reducerea sau sporirea activitatii

enzimelor? Motivati raspunsul.

7. in pancreas se sintetizeaza enzime care participa 1aprocesul de digestie.

Prin metoda de uscare liofila ~itriturare ulterioara se obtine preparatui

pancreatina. Cum vom proceda pentru identificarea enzimelor care se contin

in acest preparat?

, .

Documents

1.Structura Si Functiile Proteinelor.enzimele