FLUORESCENCIAFenómeno físico mediante el cual

ciertas substancias absorben energía (sepuede irrdiar medinate luz ultravioleta)emitiéndola en forma de luz,normalmente de un color característico(una longitud de onda determinada). Adiferencia de la fosforescencia, lafluorescencia tiene lugar únicamentemientras dura el estímulo que la provoca.Es decir, al desaparecer la irradiación,desaparece la emisión, puesto que elproceso es extremadamente rápido

FOSFORESCENCIALas substancias absorven la

energia, almacenándola paraemitirla posteriormente enforma de luz o de otro tipode radiaciónelectromagnética. Éstefenómeno se aprovecha enlas manecillas de los relojeso de determinados juguetesque brillan en la oscuridad

INTRUMENTACIÓN

FLUORÓMETRO:emplea filtros de vidrio ofiltros interferencialespara seleccionar la longitudde onda de excitación y deemisión

VIDEO

espectofluorómetro

•: Emplea prismas o redes de difracción para seleccionar las longitudes de onda.

Ambos aparatos tienen como componentes básicos:

Fuente de energía radiante: son dos lámparas de arco de Xenón o lámparas de Mercurio. Emiten energía radiante de intensidad elevada.

Rendijas de entrada y salida (= que en el espectrofotómetro)

Monocromadores: pueden ser filtros o prismas o redes de difracción. Hay dos monocromadores: Monocromadores de excitación o primario, que selecciona las longitudes de onda de excitación.

Monocromadores de emisión o secundario, que selecciona la longitud de onda de emisión antes que la luz llegue al detector.

Cubetas: son de sílice o cuarzo. No todas las de plástico valen porque pueden originar fluorescencia adicional.Detectores: son fototubos multiplicadores. Amplíanla pequeña señal fluorescente pudiéndola cuantificar.Son muy sensibles. El monocromador secundario y eldetector están situados en ángulo recto en relaciónal haz de luz incidente para impedir que la luzprocedente de la lámpara llegue al detector. Losespectros de absorción y emisión varían de uncompuesto a otro, por lo que al hacer unadeterminación, hay que seleccionar la longitud deonda de excitación más adecuada, que es la demáxima absorción; y hay que seleccionar la longitudde onda de emisión más adecuada, que es la delmáximo de fluorescencia.

CARACTERSTICAS DE LA FLUOROMETRIA

Tiene una muy altasensibilidad. Es de 100 a1000 veces más sensibleque las técnicascolorimétricas normales.

Las medidas defluorescencia se expresanen unidades de intensidadrelativa, se emplea lo quese llama “Rendimiento deFluorescencia Relativo”.

La señal electrónicavariará para la mismaconcentración de unasustancia de uninstrumento a otro y, porlo tanto, no se podráncomparar.

Las medidas de fluorescencia se deben hacer siempre ensoluciones diluidas. La absorción debe ser como máximo del2% de la radiación incidente. Por encima de esta absorbanciano se ilumina por igual todas las partes de la solución y, por lotanto, se emitirá distinta fluorescencia en las distintas capasde la solución.

Las cubetas no deben tener ralladuras porque aumentan ladispersión de la luz; ni se deben tocar con los dedos las carasópticas de las cubetas, porque se produce fluorescenciacontaminante.

APLICACIONES

La espectrometría de fluorescencia se utilizaen análisis bioquímicos, médicos, químicos yde investigación de compuestos orgánicos.También se ha utilizado para diferenciar lostumores malignos de piel de los benignos.

FLUOROINMUNOANÁLISIS: son anticuerposmarcados con una sustancia fluorescente,específicos de la sustancia que se va aestudiar.

DETERMINACIÓN de vitaminas, fármacos,algunas enzimas

La fluorescencia también puede utilizarse para reorientar los fotones.

Fluorescencia del triptófano

Este tipo de fluorescencia es una prueba importante que puede serusada para estimar la naturaleza del microambiente del triptófano(un aminoácido). Cuando se realizan experimentos condesnaturalizantes, surfactantes u otras moléculas anfifílicas, elmicroambiente del triptófano puede cambiar. Por ejemplo, siuna proteína que contiene un único triptófano en su núcleo"hidrofóbico" se desnaturaliza con el aumento de temperatura, apareceun cambio de color en el espectro de emisión del rojo. Esto se debe a laexposición del triptófano a un medio ambiente acuoso en contraposicióna una proteína hidrofóbica interior. En contraste, la adición de untensioactivo a una proteína que contiene triptófano, que se encuentraexpuesto al solvente acuoso, causará un cambio al espectro azul deemisión si el triptófano está incrustado en la vesícula o micela desurfactante. Las proteínas que carecen de triptófano puede serenlazadas a un fluoróforo.

Bibliografía

Douglas A. Skoog,Stanley R. Crouch,F. James Holler. Principios deanalisis instrumental .Sexta edición. Cengace learning. Pagina 420.

Kennet A. RUBINSON Judith F. RUBINSON. Analisis instrumental.Pearson Education. S.A Madrid 2001 Lucas Hernández ,Claudio González. Introduccion al analisisinstrumental. Ariel Ciencia