Upload
dionzdyonz
View
49
Download
12
Embed Size (px)
Citation preview
Kromatografi Cair (KC)
• Merupakan sistem kromatografi dengan fase gerak cairan
Bagaimana fase diamnya?
Jawab
Bisa padat bisa juga cair
Fakta: Kromatografi Cair digunakan 90%, Kromatografi Gas hanya 10%, mengapa ?
Karena Kromatografi Cair
1. Mempunyai banyak mekanisme pemisahan
2. Tidak ada persyaratan analit harus menguap, sedangkan sebagian besar senyawa mempunyai titik didih relatif tinggi
3. Jenis alat kromatografinya banyak (lihat Bagan)
4. Teknologi tidak harus tinggi: misal KLT, KKt
5. Tidak harus mahal: KLT, KKt
Pembagian Kromatografi Berdasarkan fase gerak
Kromatografi
Fase gerak gas Fase gerak cair
Kromatografi Gas
Krom. Kolom
K L T Krom. Kertas
KCKT
KK. Terbuka
KK. Vakum
Kroma-totron
Mekanisme kromatografi cair apakah dipengaruhi jenis peralatan ?
Apakah mekanisme pemisahan dalam KLT pasti berbeda dengan KCKT?
Jawab
Jenis peralatan tidak mempengaruhi mekanisme pemisahan secara kromatografi Cair
Terkadang mekanisme pemisahan dalam KLT sama dengan KCKT
KCKT
KLT
Krom. Kertas
Krom Kolom
Kolom
Mekanisme
ADSORBSI
PARTISI
PERTUKARAN ION
KROM. ION
FILTRASI GEL
PASANGAN ION
PERMEASI GEL
SIZE EXCLUSION
Mengapa begitu banyak mekanisme?
Apakah dalam satu perangkat alat kromatografi mempunyai bermacam mekanisme?
Jawab
Tidak, dalam satu kromatografi “hanya” terdapat satu mekanisme saja
Misal 1. kita bisa memilih KLT dengan mekanisme Adsorbsi
Misal 2. kita bisa memilih KLT dengan mekanisme partisi
Farktor apa yang mendasari kita memilih satu mekanisme pemisahan dalam kromatografi?
Jawab
Yang mendasari kita memilih satu mekanisme pemisahan dalam kromatografi sifat dan jenis analit yang ingin dipisahkan
KROMATOGRAFI DENGAN MEKANISME ADSORBSI ATAU DIKENAL DENGAN KROMATOGRAFI ADSORBSI
Untuk analit yang bagaimana?
Jawab: untuk analit yang polar
Bagaimana prinsipnya:
Adsorbsi dan desorbsi
Bagaimana maksudnya adsorbsi - desorbsi
Jawab
Anda ingat like disolve like, seperti itulah mekanismenya
Perjanjian: dalam kromatografi adsorbsi: fase diam selalu polar (contoh Silika, Alumina, dll)
Berdasarkan perjanjian tersebut
Jika fase diam Polar, kemudian Ada campuran analit, dengan sifat Polar dan lainnya non polar, maka yang bersifat polar akan disukai oleh fase diam (dengan kata lain teradsorbsi lebih kuat) dibanding analit lain yang kurang polar.
m = fase geraks = fase diam (polar)
Analit Lebih polar
Cerita mekanisme adsorbsi
Campuran analit pertama-tama dijerapkan pada fase diam, selanjutnya aliran fase gerak akan memaksa analit-analit tersebut untuk bermigrasi (terdesorbsi). Analit yang lebih polar akan lebih terikat kuat pada fase diam yang juga polar, akibatnya kecepatan migrasinya lambat, dibanding analit yang kurang polar.
Sehingga => terjadi pemisahan
Jadi Kromatografi dengan mekanisme adsorbsi
1. Digunakan untuk pemisahan analit yang bersifat polar
2. Fase diam yang digunakan bersifat polar: misal Silika dan Alumina
3. Mekanismenya adsorbsi dan desorbsi
4. Jadi kalau kita menggunakan fase diam silika pada KLT atau pun KCKT dll maka mekanismenya adalah adsorbsi
Kolom HPLC fase normal
Silica gel : pemakaian umum Cyano : pemakaian umum Amino : analisa gula Diol : analisa protein
Silica gel
Si
Si
-Si-CH2CH2CH2CN-Si-CH2CH2CH2NH2-Si-CH2CH2CH2OCH(OH)-CH2(OH)
Modifikasi Si
Kasus: Suatu Campuran berisi
Dilakukan KLT dengan fase diam silika (polar) dan fase gerak heksan. Mana yang akan mempunyai nilai Rf lebih tinggi??
Apa yang terjadi jika campuran analit tersebut dipisahkan dengan KCKT dengan kolom berisi silika?
OH
HO
SiOH
SiOH
kuatkuat
lemahlemah
KROMATOGRAFI DENGAN MEKANISME PARTISI ATAU DIKENAL DENGAN KROMATOGRAFI PARTISI
Untuk analit yang bagaimana?
Jawab: untuk analit yang Non-polar
Bagaimana prinsipnya:
partisi
Apa yang dimaksud dengan partisi?
Jawab: Ingatkah anda apa yang akan terjadi jika analit dimasukkan dalam corong pisah yang berisi dua cairan yang tidak saling larut? Analit tersebut setelah terjadi kesetimbangan sebagian akan masuk ke cairan satu dan sebagian lagi akan masuk ke cairan dua.
Apakah bisa fase diam berupa cairan?
Jawab: bisa
Apakah tidak terjadi abrasi jika terkena aliran fase gerak?
Jawab: bisa.
Bagaimana caranya biar tidak terkena abrasi?
Jawab: cairan tersebut ditambatkan dalam padatan
-Si-C18H35
Si
Bagaimana jika kita menginginkan cairan C18H36 sebagai fase diam?
Jawab. Cairan tersebut di reaksikan secara kimia dengan padatan silika.
Perjanjian:
Kromatografi partisi: menggunakan fase diam non polar, dan fase gerak polar
Sistem kromatografi dengan menggunakan fase diam non polar, dan fase gerak polar
dikenal sebagai fase balik
Bagaimana mekanisme partisi dalam kromatografi menjelaskan pemisahan kedua analit beikut?
Jawab:
Ingat perjanjian: fase diam adalah bersifat non polar. Fase diam adalah cairan. Jika campuran analit A dan B dimasukkan ke sistem maka keduanya akan terpartisi masing-masing ke dua cairan, yaitu fase diam dan fase gerak. Senyawa B akan terparisi lebih banyak dalam fase diam karena dia lebih non polar. Akibatnya B akan tertahan lebih lama pada fase diam
A B
Hidrofobisitas
Jika sampel memiliki– CH3CH2CH2--- : rantai karbon– : gugus aromatis
Jika sampel memiliki– -COOH : gugus karboksil– -NH2 : gugus amino– -OH : gugus hidroksil– X
HidrofobisitasHidrofobisitas
Jadi lebih kuat.Jadi lebih kuat.
Hidrofobisitas Hidrofobisitas jadi lebih lemah.jadi lebih lemah.
Bagaimana pembagian mekanisme pemisahan untuk analit ion?
Kromatografi pasangan ion
Kromatografi penekanan ion
Kromatografi pertukaran ion
Kromatografi Pasangan Ion
Apa dasar pasangan ion?
Dalam satu sistem kromatografi bisa saja terjadi beberapa mekanisme, jika hal tersebut terjadi maka dapat mengakibatkan pemisahan tidak baik, misalnya terjadi pengekoran dan atau puncak pecah.
Molekul ionik bisa dibuat non ionik dengan cara dipasangkan dengan ion lawannya, sehingga mempunyai satu mekanisme, misalnya partisi. Tidak partisi dengan sedikit adsorbsi
Untuk apa dipasangkan?
Jawab.
Agar molekul analit netral sehingga bersifat non polar. Ingat: PARTISI: Pemisahan senyawa non polar dengan fase diam non polar (misal C-18)
Reagen Ion-Pair
Untuk Analit bersifat Anion, maka pasangannya: – Tetra-n-butylammonium hydroxide (TBA)
Untuk Analit bersifat Kation, maka pasangannya:– Butanesulfonic acid sodium salt (C4)
– Pentanesulfonic acid sodium salt (C5)
– Hexanesulfonic acid sodium salt (C6)
– Heptanesulfonic acid sodium salt (C7)
– Octanesulfonic acid sodium salt (C8)
– Decanesulfonic acid sodium salt (C10)
Ion PairingSeparation of Carboxylic Acids
Column: Bonded C18
Mobile Phase: H2O/MeOH1:1 with Tetrabutyl-Ammonium Hydroxide
Pasangan IonHal yang penting
diperhatikan Tipe reagen Ion-Pair Konsentrasi reagen Ion-Pair pH solven
R-COOH RCOO- + H+
(pKa=4.5)
R-NH2 + H+ R-NH3+
(pKa=6.0)
Tipe reagen ion-pair
Mobile Phase: H2O/MeOH1:1,with 0.005M ion pairingreagent and 1% HOAc
1 Maleic Acid2 Phenylephrine3 Phenylpropanolamine4 Naphazoline5 Phenacetin6 Pyrilamine
Hexane Sulfonate Pentane Sulfonate
Mekanisme: Penukar ion
N+
R
R
R
Sampel
Kekuatan antar ion
Jika analit anion maka fase diam kation, fase gerak anion
Penukar ion
Lingkungan biologi (protein, peptide, amino acid analysis) Kromatografi ion
– Penukar kation• Strong Cation Exchange (SCX) (R-SO3-)• Week Cation Exchange (WCX) (R-COO-)
– Penukar anion• Strong Anion Exchange (SAX) (R4N+)• Week Anion Exchange (WAX) (DEAE)
Hal yang perlu diperhatikanpada Kromatografi Penukar
ion
pH larutan dapar Konsentrasi larutan dapar Metoda elusi
– Elusi Isokratik– Elusi gradien pH– Elusi gradien peningkatan kekuatan ionik
Apakah SEC ?
Size Exclusion Chromatography Size Exclusion Chromatography
(SEC)(SEC)– GPC (Gel Permeation Chromatography)
• terutama untuk sampel polimer
– GFC (Gel Filtration Chromatography)
• terutama untuk sampel biologi
Prinsip SEC
Tidak ada kekuatan interaksiTidak ada kekuatan interaksi Perbedaan waktu tempuhPerbedaan waktu tempuh
SEC
Fase diam: partikel berpori Molekul ber BM besar Molekul relatif besar tidak dapat dijebak
oleh fase diam, akibatnya waktu tambat singkat
Molekul relatif kecil dapat dijebak oleh fase diam, akibatnya waktu tambat lama
Hubungan antara Bobot molekul & waktu tambat
Ber
at m
olek
ul
(Log
MW
)
KolomGPC
Batas eksklusi
Batas permeasi
Waktu