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TEMA 3
MICROSCOPIO PTICO
COMPUESTO (campo claro)
INSTRUMENTOS BSICOS EN
UN LABORATORIO
MO
LUPA
CONCEPTOS ASOCIADOS AL MO
AN = n x sen
Apertura numrica (AN):
Expresa el dimetro del haz luminoso que puede recoger el objetivo.
n = ndice de refraccin del medio que se encuentra entre la muestra y el objetivo
(aire n aprox = 1; vidrio o aceite n = 1.51
sen = semi ngulo del cono de luz que entra al objetivo
Rayo de luz
Cono luminoso frente
al objetivo sen
muestra
AN
APERTURA NUMRICA
APERTURA NUMRICA
Resolucin ( R): es la capacidad de un sistema ptico discriminar como entidades distintas dos puntos muy prximos entre si.
R = / 2 AN
R (resolucin, m)
(longitud de onda de la luz empleada) 2 AN (aperturas numricas del objetivo y del condensador
(a) (b)
Comparacin entre la informacin obtenida en las imgenes tomadas con
un microscopio ptico y uno electrnico con una magnificacin
comparable
(a) Fotografa del tejido muscular esqueltico que se impregno en plstico, se corto a 1 m y se fotografi con un microscopio ptico con una lente de
objetivo para aceite de inmersin. (b) Corte adyacente al empleado para la parte a que se corto a 0.025 m y se examino al microscopio electrnico con una magnificacin comparable a la imagen en a. (CORTESA DE DOUGLAS E. KELLY Y M.
A. CAHILL.)
Lmite de resolucin (LR): Menor distancia a la
cul dos puntos A y B pueden ser observados de
manera independiente (separados).
A+B
A B
B A
A+B
LR
LR
Lmite de Resolucin= 0.61 / n x sen
AN
LR= 0.61 / n x sen
Factores que afectan el LR
LR= 0.61 / n x sen
Aumento
Longitud de onda
ndice de refraccin del medio
Apertura numrica
AN
LR depende de:
Concepto inverso al poder de resolucin = un instrumento con gran poder de resolucin
tiene un valor numrico de LR muy pequeo.
- Longitud de onda
- Apertura numrica
(objetivo-aumento)
PODER DE RESOLUCIN (PR)
Se define como el inverso de la mnima distancia
que tiene que haber entre dos puntos A y B, para que
ambos se observen como unidades independientes.
PR = 1/LR
LR, PR, R son conceptos relacionados
LR aprox. 0,1 mm
LR= 0,1- 0,2 m
Conceptos bsicos
x10
MAGNIFICACIN VS RESOLUCIN
a b
c
Magnificacin
vaca
PROFUNDIDAD DE CAMPO (PC)
Profundidad de campo: capacidad de ver enfocados
simultneamente distintos planos de la preparacin
o muestra.
PUNTO FOCAL Y DISTANCIA FOCAL
Punto focal
Distancia focal
Distancia que separa el punto focal del centro ptico de la lente.
Distancia desde la lente frontal del objetivo a la preparacin
enfocada.
Punto donde
confluyen los
rayos luminosos
refractados
despus de
atravesar la lente
Microscopio ptico compuesto
Microscopio ptico compuesto-Tipos
MO binocular de visin mltiple
Partes del Microscopio ptico compuesto
Sistema ptico: Constituido por dos
juegos de lentes
Lentes Objetivas
(primer aumento)
Lentes Oculares
(segundo aumento )
Lente objetiva
Cdigo de color en los objetivos del MO
ESTRUCTURA DE LOS
OBJETIVOS
OBJETIVOS SECOS/OBJETIVOS DE
INMERSIN
Difieren por la naturaleza del medio impuesto entre el cubre objeto de la
muestra y la lente frontal del objetivo.
OBJETIVO SECO: medio (aire, n= 1)
OBJETIVO DE INMERSIN: medio (aceite, n= 1,515, semejante al n del vidrio
del porta y cubre objeto)
Objetivo seco
Objetivo
de
inmersin
Objetivo seco
Objetivo
de
inmersin
El ndice de refraccin de un medio (n), es una medida
para saber cunto se reduce la velocidad de la luz, dentro
del medio transparente en estudio.
n= c/v n= ndice de refraccin
c= velocidad de la luz en el vaci
v= velocidad de la luz en el medio
material transparente
Aceite de cedro 1,515
Lente ocular
Aumento adicional de la imagen proporcionada por la lente objetiva.
Valores inscritos (10x, 12.5x, 15x, 20x o 25x).
Ocular Periplan. Diseo avanzado
Otras anotaciones:
UW: Ultra wide, oculares con campo de visin
amplio.
H: alto punto focal (observado con lentes)
Plan-comp: oculares que corrigen curvatura de
campo y dan campos planos
Lente ocular
CAMPO DEL MICROSCOPIO: crculo visible que se observa
a travs del ocular (general). Rectangular (hematologa y coprologa)
Sistema de iluminacin
Luz natural
Bombillas de tungsteno y halgenas
Luz artificial
Light-Emitting Diode (diodo emisor de luz)
Sistema de iluminacin
http://ofershop.com/microscopios/index.htm
Diafragma o Iris con mecanismo para variar la apertura.
Tomado de Cross M, Cole M. Modern Microscope (70).
CARACTERSTICAS DE LA
IMAGEN-MO CAMPO CLARO
Imagen plana (eje x,y)
Imagen aumentada (hasta 1000 x (2000x)
Imagen invertida
Imagen virtual
http://www.lab.anhb.uwa.edu.au/mb140/
40x
Corte transversal msculo esqueltico
Imagen plana (eje X,Y)
4 5
Y
X
Imagen aumentada
Primer aumento
(Objetivos) Segundo aumento
(Oculares)
AUMENTO TOTAL = Aumento del objetivo x Aumento del ocular x cte (1)
Imagen invertida
Que ocurre en los objetivos del microscopio ?????
El objeto (muestra) est colocado un poco ms all del foco.
La imagen ser real e invertida y cada vez ms grande
cuanto ms cerca este el objeto del foco
http://ofershop.com/microscopios/index.htm
Imagen invertida
Que ocurre en los oculares del microscopio ?????
Lente ocular: Emplea la imagen formada
por el objetivo (imagen intermedia) para
formar una imagen virtual y aumentada
del objeto (muestra).
Imagen invertida
Que ocurre en los oculares del microscopio ?????
Formacin de la imagen virtual
Son imgenes subjetivas que no podrn ser recogidas o proyectadas sobre una
pantalla o pelcula fotogrfica.
Son percibidas gracias a la posibilidad que tiene el globo ocular de seguir por detrs del objeto observado, la proyeccin de rayos divergentes y los hace
confluir en la retina para constituir la imagen virtual.
TERCER SISTEMA DE LENTES
La crnea se comporta como una lente tipo menisco y el cristalino como
una lente biconvexa.
CALIBRACIN DEL MICROSCOPIO
SE REQUIERE
Micrmetro o
retculo ocular
Micrmetro objetivo
Micrmetro ocular
Placa de vidrio
Escala de referencia
Micrmetro objetivo
Portaobjeto
5 10
10 div. pequeas
CALIBRACIN DEL MO http://users.df.uba.ar/catalina/TBM/TBM_labo2.pdf
Obj. 4x = X m
Obj. 10x = X m
Obj. 40 x = X m
Obj. 100 x = X m
Clculo de aumentos (MO y fotografa)
ESCALA
Clculo de aumentos
3 m
Microscopi invertit
MICROSCOPIO INVERTIDO
Estructura invertida en comparacin con el MO convencional.
Fuente de luz ubicada por encima de la platina.
Principio de funcionamiento y formacin de la imagen, igual que el MO convencional.
Usado en la observacin de
cultivos celulares
(clulas vivas) sin
preparacin previa.
APLICACIONES- microscopio ptico invertido
Alkaline phosphatase activity in a coculture of two intestinal cell lines. Localization
of alkaline phosphatase activity (in red) was identified by cytochemistry in a coculture
of the human intestinal cell lineages Caco-2 and HT29-5M21.
Estudios fisiolgicos 21
22
Usado en estudios FIV (manipulacin
de vulos).
APLICACIONES- microscopio ptico invertido
FIV: Microinyeccin espermtica
FIV: Microinyeccin espermtica Consiste en la introduccin mecnica de un espermatozoide dentro del ovocito
Ejemplo de microscopio invertido: Microscopio confocal
ANALISIS DE IMAGEN
+ Cmara de vdeo
+
Imagen ptica u electrnica
directa de los microscopios (imagen analgica= imagen convencional)
Imagen digitalizada
(imagen de pxel)
Sistema electrnico
Se trabaja sobre la imagen
con programas informticos
Microscopio Ordenadores
ANALISIS DE IMAGEN
Microscopa virtual: amplio uso en
el diagnstico patolgico
Microscopa virtual-Aplicaciones
Uso a distancia de recursos interactivos para el diagnstico
y la investigacin
Docencia (acceso a bases de datos remotas de imgenes
microscpicas)
Reconstruccin 3D a partir de mltiples microgrficas.
Permitir compartir bases de datos de las diversas
instituciones
Microscopa virtual-Ejemplo
MATERIAL COMPLEMENTARIO
Partes del MO. Funcionamiento
Relacin de vdeos
http://www.youtube.com/watch?v=AC_X87DexiY&feature=related
http://www.youtube.com/watch?v=0Tunrrm3OlM&NR=1
http://www.youtube.com/watch?v=KzNsuiqW1LQ&feature=related
http://www.youtube.com/watch?v=L6d3zD2LtSI
http://www.youtube.com/watch?v=-A9tVEsTi9w&NR=1
http://www.youtube.com/watch?v=XbLD2zJDEzs&NR=1
http://www.youtube.com/watch?v=dqdKGjG_nR8&feature=related
http://www.youtube.com/watch?v=KfqQErL64cY&feature=related
TEMA 4
TCNICAS DE PREPARACIN DE MUESTRAS PARA MO.
APLICACIONES ESPECFICAS DE LA MICROSCOPA PTICA EN
BIOMEDICINA
USO DEL MO COMPUESTO
Observacin de preparaciones temporales -Directamente de la muestra
clnica
-A partir de cultivos
microbianos
Observacin de preparaciones permanentes
- Citoqumica
- Histoqumica
Observacin directa de clulas vivas Cultivos celulares
Observacin de preparaciones temporales
Eje: Examen directo a partir de muestras clnicas
Espermiograma
6 7
Micosis oportunista
Candidiasis (Candida albicans)
8
Observacin de preparaciones temporales
Eje: Examen directo a partir de muestras clnicas. Se
realiza un fresco con KOH
Malassezia furfur
Pitiriasis versicolor
Observacin de preparaciones temporales
Eje: Examen directo a partir de muestras clnicas (Hongos dermatofitos de los gneros: Microsporum, Trichophyton, Epydermophytom)
9
Trichophyton mentagrophytes
Observacin de preparaciones permanentes
Eje. Tincin Gram (Citoqumica)
Bacillus brevis Bacillus anthracis
12 11
Observacin de preparaciones permanentes
Eje. Tincin Hematoxilina-eosina en sangre humana (Citoqumica)
Eje. Tincin de verde malaquita para endosporas bacterianas (Citoqumica)
Endospora
13
Observacin de preparaciones permanentes
Eje. Prueba de Papanicolau (Citoqumica)
15
14
16
Observacin de preparaciones permanentes Eje. Observacin de tejidos (Histoqumica)
Smooth muscle, muscularis externa of colon, H&E, x132 Ovary, medulla containing multiple blood vessels, H&E, x33
Heart, H&E, x130 Epidermis, H&E, x100
18
19 20
17
MICROSCOPIOS PTICOS ESPECIALES
Modifican la manera en
que incide la luz sobre el
espcimen: emplea
condensadores o filtros
1
Modifican la fuente emisora
de luz: cambia la luz
blanca por la luz ultravioleta
o rayos lser (tambin emplean filtros)
2
- Microscopio de campo oscuro.
- Microscopio de polarizacin.
- Microscopio de contraste de fases.
- Microscopio interferencial
o de ptica Kormaski.
- Microscopio de fluorescencia o de
luz ultravioleta.
- Microscopio confocal